Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Detectarea și cuantificarea speciilor de carne prin qPCR (in timp real) în alimente
prelucrate termic care conțin ADN fragmentat
INTRODUCERE
Controlul calităţii produselor alimentare de origine animală abordează aspecte legate de
calitatea cărnii/produselor din carne din punct de vedere al consumatorului, al societăţii şi
îmbunătăţirea calităţii şi siguranţei alimentelor.
O altă problemă socio-economică, cu impact major în bugetele familiale, în special în
condiţiile economice actuale, este garantarea unor produse sigure şi protecţie împotriva
practicilor comerciale neloiale, a fraudelor alimentare, care îmbracă o importanţă capitală pe
piaţa de retail.
Tehnicile de biologie moleculară vin în întâmpinarea acestor probleme, reprezentând o
metodă de control a calităţii produselor alimentare.
TEHNICILE DE BIOLOGIE MOLECULARĂ
Identificarea se realizează prin metode bazate pe ADN
Mai sigure (ADN prezintă stabilitate la temperaturi ridicate, presiune şi tratament chimic)
Printre cele mai consumate produse alimentare, in intreaga lume, sunt cele compuse din
combinatii de carne de porc si vita. Pentru a eticheta conform un produs alimentar si a se elimina
frauda cu carne, sunt necesare metode analitice precise si robuste in laboratoarele de control.
OBIECTIVUL LUCRARII: Imbunătățirea proiectării unor metode concise pentru cantificarea
s peciilor în alimentele procesate.
SCOPUL LUCRARII: Adecvarea metodelor qPCR pentru cuantificarea speciilor, chiar și
pentru produsele alimentare puternic procesate.
Până în acest moment, atât metodele PCR în timp real, cât și metodele de imunodetecție
bazate pe proteine s-au dovedit a fi cele mai bune pentru detectarea de rutină și cuantificarea
speciilor de carne din produsele alimentare.
Totusi, pentru detectarea proteinelor animale se utilizeaza frecvent ELISA, care
reprezinta o metoda rapida si ieftina pentru detectarea acestora. De asemenea, ELISA reprezinta
o metoda specifica a determinarii ADN-ului din produsele alimentare. Utilizarea acestor metode
în alimentele foarte procesate este de obicei limitată din cauza denaturării proteinelor.
Prelucrarea alimentelor la temperaturi ridicate duce, de asemenea, la fragmentarea ADN-
ului, care poate împiedica detectarea și cuantificarea prin metode PCR. Pentru a evita acest lucru,
este de obicei preferată utilizarea ampliconelor scurte, deși s-a demonstrat că ampliconii în jur de
350 de perechi de baze sunt încă adecvate pentru probele de carne foarte procesate.
In aceasta lucrare va fi determinata, pe cale experimentala, modalitatea in care se pot
depasi punctele slabe asociate frecvent cu prezenta ADN-ului in componentele alimentare, cu
scopul de a obtine informatii cantitative cu privire la factorii care afecteaza productia qPCR.
Aceste cercetari sunt efectuate deoarece metodele analitice pentru detectarea și
cuantificarea speciilor din alimentele procesate nu sunt pe deplin stabilite datorită unor efecte
negative intalnite in timpul tratamentelor termice asupra proteinelor și ADN-ului din compozitie,
fapt care compromite metode de detectare bazate pe imuno- și PCR.
De cele mai multe ori, pentru o detectie corecta, in aceasta lucrare a fost propusa
utilizarea standardelor adaptate la matrice. Aceasta nevoie aparare deoarece măsurările exacte ale
proporțiilor de carne în probe sunt compromise de varietatea tipurilor de țesuturi utilizate în
fabricarea alimentelor. Fracțiunile ADN pot să nu se coreleze cu conținutul de carne din probă
dacă metoda este calibrată cu ADN obținut din țesuturi (slănină grasă, mușchi fără grăsime, țesut
conjunctiv) diferite de cele prezente în probă.
AVANTAJELE UTILIZARII ADN-ului
Se preconizează că în următorii 50 de ani populaţia Planetei va creşte de la aproximativ
6,5 miliarde, cât măsoară astăzi, la peste 9 miliarde. Extinderea suprafeţelor cultivate nu se va
putea face astfel încât să compenseze creşterea numărului de oameni. Soluţia principală pentru
asigurarea securităţii alimentare este astfel reprezentată de creşterea producţiei la unitatea de
suprafaţă.
Micşorarea cantităţilor de erbicide, pesticide sau fertilizanţi aplicate în agricultură, în
urma utilizării plantelor transgenice, va reduce poluarea mediului.
mărirea capacităţii de producţie;
produse care să reziste mai bine la lovire, reducând pierderile înregistrate de la recoltare
până la desfacere sau procesare prin manipulare necorespunzătoare;
tipul ingredientelor;
modul de prezentare;
gradul de umiditate.
Aceste aspecte sunt importante deorece o cunoaştere cât mai bună a proprietătilor intrinseci
ale probelor ajută la alegerea celor mai potrivite metode de eşantionare, pregătire şi extractie.
OMG (Organisme modificate genetic) = organisme (respectiv plante) al caror material genetic a
fost “transformat “ prin aplicarea tehnicilor de recombinare ADN.
Procesul de eşantionare reprezintă întodeauna o sursă de eroare care apare atunci când din
lotul de dimensiuni mari se aleg obiecte pentru a constitui proba ce va fi utilizată direct în
laborator. O bună practică de eşantionare asigură reducerea erorilor, ceea ce înseamnă de fapt
creşterea gradului de reprezentativitate al probei pentru populatia din care provine.
ANALIZA PCR
PCR : Realizează copii multiple ale unei secvenţe ADN specifice prin replicări succesive având
la bază proprietate ADN polimerazelor de a sintetiza în direcţia 5’-3’ o secvenţă de nucleotide
complementară cu secvenţa ADN ţintă (matriţă) pornind de la un primer cu capăt 3’-OH liber.
Astfel, numărul de copii ale secvenţei ţintă este dublat la fiecare replicare (ciclu), acesta crescând
deci exponenţial odată cu fiecare ciclu de amplificare.
ETAPELE PCR
1. Denaturarea termică a macromoleculei dublucatenare ADN matriţă
3. Polimerizarea sau sinteza unei noi catene avănd drept matriţă catena veche ADN
dNTP: sunt livrate fie sub forma a patru soluţii stoc individuale, fie sub forma unui
amestec al celor patru nucleotide. Soluţiile sunt ajustate la o valoare optimă de pH.
Concentraţia optimă de dNTP depinde de: concentraţia de MgCl2, conc. primerilor,
lungimea fragmentului ce urmează să fie amplificat şi numărul de cicluri de reacţie.
ADN polimeraza: iniţial s-a folosit fragmentul Klenow al ADN polimerazei din E. Coli.
Ulterior au fost descoperite şi utilizate ADN polimeraze termostabile ca:
AmpliTaq polimeraza are aceleaşi proprietăţi cu Taq polimeraza dar este produsă
în E. Coli prin recombinare genetică. Reproductibilitatea şi puritatea acesteia este
mult mai mare decât a Taq polimerazei simple.
Apa ultrapură: se utilizează exclusiv apă ultrapurificată, nuclease-free, livrată de firme
specializate
primerii trebuie să conţină un număr aproximativ egal din cele patru baze azotate,
evitându-se pe cât posibil regiunile cu repetiţii de nucleotide (evitare structuri
hairpin).
distanţa dintre doi primeri la nivelul matriţei trebuie să fie mai mică de 5-10 kpb,
dar s-a observat o eficienţă foarte scăzută a reacţiei în cazul în care lungimea
produsului de amplificare depăşeşte 3 kpb.
- Probele de carne proaspătă s-au obtinut din surse comerciale și depozitate congelate la
20°C pana in momentul experimentului.
- Amestecurile binare de carne de vită și porc au fost preparate prin combinarea cantităților
adecvate de carne tocată, slabă.
EXTRACȚIA ADN-ULUI
Probele T și F au fost liofilizate și măcinate până la o pulbere fină într-un macerator
manual.
ADN-ul a fost purificat din 30 mg de carne folosindu-se o trusa de purificare a ADN-ului.
Conținutul de ADN a fost cuantificat după colorare cu reactiv de cuantificare a ADN-ului
Picogreen, utilizând un spectrofotometru de fluorescență Perkin-Elmer LS-50B și comparând
fluorescența cu cea din standardele ADN de concentrație cunoscută. ADN-ul pentru curbele
standard qPCR și digestiile ADN-ului a fost purificat din probe de carne autentificate anterior
prin secvențierea ADN a unei regiuni mitocondriale ND5-cytB.
Detectarea și cuantificarea ADN-ului a fost efectuată prin amplificare utilizând un sistem
de detectare a secvenței în timp real. Reacțiile au fost efectuate prin duplicat în plăci cu 96 de
godeuri.
Citirile au fost luate la fiecare ciclu, iar creșterea fluorescenței a fost reprezentată grafic
față de numărul ciclului. Pentru a testa amplificarea ADN-ului din specii încrucișate, toate testele
PCR au inclus cel puțin trei reacții independente de control ADN nețintă (NTD) pentru fiecare
detector, conținând 4 ng de carne de vită (sau porc), ADN de pui sau curcan. Pragul de
fluorescență a fost fixat la același nivel exponențial mediu pentru toate cursele.
CUANTIFICAREA SPECIILOR DE CARNE
Pentru a cuantifica proporția de carne de porc în carne de vită: carne de porc amestecurile
binare, curbele standard folosind diluții de ADN de carne de porc și carne de porc au fost
obținute în primul rând prin reprezentarea grafică a ADN-ului vs. pentru ambele specii.
Amplificările qPCR au fost apoi efectuate în duplicat folosind 2 ng lL-1 de ADN obținut
din amestecuri binare F și T și CT-ul mediu înregistrat de detector au fost interpolați în curba
standard corespunzătoare pentru a obține conținutul de ADN din carne de vită în eșantion.
CT înregistrat de detector nu a fost interpolat direct pe curba standard, în schimb, carnea
de vită 50:50: probele de porc au fost utilizate ca referință matricială pentru a calibra diferențele
de conținut de ADN pentru cantități egale de carne de vită și carne de porc. Această diferență, D,
a fost definită ca numărul de cicluri care trebuie adăugate la experimental și interpolate pe
curbele standard corespunzătoare pentru a obține aceeași cantitate de ADN detectat în eșantionul
50:50. Astfel, dacă curbele standard sunt definite de CT m log Nb. Pentru calcul s-au efectuat
formulele de mai jos:
- Unde, unde CTb50 și CTp50 sunt CT obținute cu detectoare și din referința matricei
50:50.
IMUNODETECȚIA CĂRNII
Identificarea cărnii de vită și de porc a fost efectuată folosind truse ELISA pentru
alimentele crude sau conform instrucțiunilor producătorului.
Înainte de extracție, probele brute și cocsificate au fost tăiate și omogenizate într-un
blender. 5 g din fiecare probă omogenizată s-au plasat într-un tub de plastic steril conținând 50
ml de NaCl 0,9% și amestecul a fost puternic zăvorât timp de 30 s.
După 10 min la temperatura camerei, extractele au fost apoi condiționate prin diluarea
1/10 (v / v) în soluție salină tamponată cu fosfat (10 mM fosfat, 137 mM NaCI, 2,7 mM KCI, pH
7,4). 100 lL din fiecare extract reconstituit a fost verificat de ELISA. Etapele de spălare au fost
efectuate cu ajutorul unui inel microplate. Absorbanța a fost citită cu un cititor de microplacă
Spectra MAX340pc la 450 nm.
REZULTATE
LINIARITATEA ȘI SENSIBILITATEA DETECTOARELOR DE CARNE PE PROBELE
PRELUCRATE
Rezultatele obtinute in partea experimentale arătat că detectoarele bazate pe anumite
principii ale producatorilor, atunci când sunt utilizate pe ADN-uri cu o singură specie sau
amestecate purificate din carne proaspătă, au dat o corelație liniară a ADN-ulu, cu o eficiență
PCR aproape de o dublare pe ciclu.
Pentru a testa efectele posibile ale procedurilor de gătire a cărnii și de sterilizare la
căldură, precum și prezența ADN-ului nețintă în eșantion, asupra răspunsului liniar al
detectoarelor, s-au efectuat noi teste de linearitate prin triplicat folosind ADN obținut din non-
probe de carne amestecate sau amestecate (50:50), atât fierte cât și sterilizate (T) sau netratate
(F).
Eficiențele PCR măsurate atât pentru detectoarele utilizate pe amestecuri 50:50 (2,2 ± 0,2
și respectiv 2,0 ± 0,3, respectiv) nu au fost statistic diferite (p> 0,05) de cele observate la carnea
pură de vită sau de porc (2,0 ± 0,1) și respectiv 2,3 ± 0,3).
În mod similar, nu s-au observat diferențe în probele de T tratate termic. Astfel, s-ar putea
concluziona că procesele de gătit și sterilizare utilizate nu afectează în mod semnificativ
răspunsul qPCR la diferite concentrații de ADN și că prezența ADN nețintă în amestecul de
carne, nu afectează eficiența PCR.
Pentru exemplificarea acestor rezultate, se vor folosii urmatoarele grafice, execuate in
momentul experimetului:
utilizând standarde de matrice 50:50 pentru calibrare. Procentul de carne de porc din probele
din seria F și T a fost calculat folosind ecuația reprezentata anterior. Rezultatele prezentate
reprezintă media a 4 teste independente ± SD.
Diferența observată, de aproximativ două cicluri, în valorile D pentru probele tratate și
netratate reflectă o scădere de patru ori a ADN-ului de porc amplificabil în amestecurile tratate în
comparație cu ADN-ul de vită. Acest lucru sugerează că procesarea căldurii poate afecta diferit
față de amplificarea fiecărei specii prezente în amestec și întărește importanța utilizării
standardelor procesate prin matrice pentru a calibra orice teste calitative sau cantitative bazate pe
qPCR.
În comparație cu alte metode raportate, care necesită producția de materiale de referință
adaptate la matrice care să cuprindă întreaga gamă de proporții așteptate ale cărnii, clonarea
secvențelor țintă ADN sau contul mărimilor genomului, utilizarea matricei de referință cu un
singur punct în testele de alimente bazate pe qPCR, așa cum se exemplifică aici, poate simplifica
configurarea experimentală și prelucrarea datelor pentru cuantificarea speciilor.
Această abordare ar putea fi transferată cu ușurință la cuantificarea altor produse
alimentare, deoarece ar necesita doar un singur set de curbe standard qPCR folosind diluții ADN
din probe de referință ale fiecărei specii, care pot fi utilizate pentru a testa diferite matrice și o
reacție qPCR într-un singur punct folosind ADN dintr-o probă adaptată la trix de compoziție
cunoscută.
Pentru a obține o indicație a deteriorării ADN-ului produs de gătit și tratament termic, a
fost conceput un experiment controlat de DNază pentru a testa efectele fragmentării ADN asupra
rezultatelor qPCR.
Gradul de fragmentare a fost confirmat prin electroforeză prin geluri de agaroză și
colorare cu bromură de etidiu, iar pentru obtinerea unor rezultate cat mai precise s-au utilizat si
alte detectoare ale ADN-ului.
Rezultatele obținute pe ADN-ul digerat arată că detectoarele BOS pot fi utilizate pentru a
obține o estimare a degradării ADN-ului în produsele din carne procesate. Pentru a testa acest
lucru, probele de carne de vită au fost gătite și tratate termic în condiții diferite, iar valorile r care
țin cont de degradarea ADN-ului au fost obținute folosind detectoarele BOS.
In Fig. 4A, este aratat ca exista posibilitatea chiar și la cea mai mică concentrație de DNază
utilizată, ca si cantitatea de ADN amplificat de detector de 204 bp a fost de aproape o pătrime
din ADN-ul amplificat în ADN-ul nedigerat.
In Fig. 4B, se indica faptul că, în timp ce prăjiți în ulei vegetal la 65 ° C, chiar și pentru
perioade lungi de timp, nu afectează în mod semnificativ amplificarea detectorului, reduce
cantitatea detectată cu detectorul. Acest lucru sugerează că, în aceste condiții, majoritatea ADN-
ului este prezent în fragmente de 200 până la 300 bp. Sterilizarea la 126 ° C, chiar și pentru
perioade scurte de timp, reduce drastic semnalul recuperat de detectoare, ceea ce sugerează
apariția fragmentării ADN sub 200 bp în medie.
FIGURA 4: Amplificarea ADN-ului prin qPCR pe probe degradate de ADN. (A) Amplificarea
pe ADN timus de vițel digerat cu DNaseI. Raportul dintre amplificarea ADN-ului digerat și cel
digerat a fost obținut după incubare cu concentrații diferite de DNaseI. (B) Amplificarea pe
probe de carne de vită prăjite în ulei vegetal la 65 ° C timp de 30 de minute. urmată de
sterilizare la B2: 126 ° C timp de 10 minute; B3: 20 min și B4: 30 min. B1: martor nesterilizat.
Raporturile r1-2 (negru) și r1-3 (gri) au fost calculate.
CONCLUZII
Rezultatele acestui experiment sunt conforme asteptarilor autoriilor, astfel reusind sa
urmeze obiectivele stabilite si sa demonstreze scopul propus. Datele colectate în acest raport
susțin adecvarea metodelor qPCR pentru cantificarea speciilor, chiar și pentru produsele
alimentare prelucrate puternic. Utilizarea standardelor matriciale controlate pentru a obține
informații cantitative cu privire la factorii care afectează producția qPCR, așa cum este
exemplificat în această lucrare, permite depășirea punctelor slabe asociate de obicei cu utilizarea
metodelor ADN pentru cuantificarea componentelor alimentare, cum ar fi ținta variabilitatea
concentrației și fragmentarea derivată din tratamentele termice.
Această abordare poate contribui la îmbunătățirea proiectării unor metode robuste pentru
cantificarea speciilor în alimentele procesate.
Pentru determinarea acestor parametrii si pentru a reusi sa se demonstreze nevoia unei
metode mai avansate, autorii au utilizat teste suplimentare pentru a putea compara rezultatele
obtinute.
B1
Csssssdwefffffffffffffffff
Afwwwww
Afwwwwwwwwwwwwwww
Awwwwwwwwwww
Awwwwwwwwwwwww
Awwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwww
wwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwww
Fffffffffffffffffffffffffffffff
Ffffffffffffffffffffffffffffff
Aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
sssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssss