Introducere

Apixabanul reprezintă o nouă moleculă de anticoagulant oral, primind autorizație de utilizare europeană în
2011, fiind aprobat pentru utilizarea în prevenirea accidentului vascular cerebral și a emboliei sistemice la
adulții cu fibrilație atrială non-valvulară și pentru tratamentul trombozei venoase profunde și emboliei
pulmonare. Apixabanul are o biodisponibilitate orală ridicată și este absorbit în tractul gastrointestinal. În
ciuda acestei caracteristici, în prezent nu există avertismente sau recomandări cu privire la utilizarea sa în
populații speciale cu risc crescut de a dezvolta tromboembolism venos.
Cromatografia lichidă cuplată cu spectrometria de masă în tandem (LC MS/MS) este metoda de referință
utilizată în monitorizarea terapeutică a anticoagulantelor orale directe noi datorită preciziei, acurateței,
sensibilității și robusteței sale. Există mai multe studii de farmacocinetică ale apixabanului și evaluări ale
diferitelor teste de laborator care au folosit Cromatografia lichidă cuplată cu spectrometria de masă în
tandem LC-MS/MS pentru cuantificarea apixabanului în plasma umană.
Obiectivul principal al studiului in discuție a fost acela de a dezvolta și valida o metodă LC-MS/MS
specifică și cantitativă de mare randament pentru analiza apixabanului în plasma umană, cu aplicabilitate în
monitorizarea clinică a medicamentelor terapeutice, farmacocinetică, precum și în studiile de bioechivalență.
Reactivi
Ca reactivi, acetonitril de grad izocratic pentru cromatografie lichidă, metanol, formiat de amoniu de grad
analitic- au fost achiziționate de la Merck (Germania). Apa a fost deionizată folosind un sistem de purificare
Milli-Q Water (Millipore, SUA). Plasma martor umană a fost furnizată de Centrul Regional de Transfuzie
Sanguină Cluj-Napoca (România) de la voluntari sănătoși, bărbați și femei.
Aparatura
Separările HPLC au fost efectuate pe un sistem de la Agilent Technologies (Darmstadt, Germania), un
model din seria 1100 constând dintr-o pompă binară, un degazator în linie, un autosampler, un cuptor
coloană și un detector cu capcană de ioni Agilent 1100 VL. Alte aparate utilizate în experiment au fost: o
centrifugă 204 Sigma (Osterode am Harz, Germania); Balanțe analitice Plus și Precision Standard (Mettler-
Toledo, Elveția); un mixer Vortex Genie 2 (Scientific Industries, NewYork, SUA); o baie cu ultrasunete
Elma Transsonic 700/H (Singen, Germania).
Condițiile LC-MS/MS
Separarea apixabanului a fost realizată la 40ºC pe o coloană cromatografică Gemini-NX (5 mm x 2 mm id, 3
μm) (Agilent Technologies) cu o fază mobilă constând din acetonitril și formiat de amoniu 1 mM în apă
(33:67, v/v). ) în condiţii izocratice, cu un debit de 0,5 mL/min. Detecția apixabanului s-a realizat prin
monitorizarea reacțiilor multiple (m/z 417,2 din m/z 460,2) cu ionizare pozitivă prin electrospray
(nebulizator 60 psi (azot), azot gazos uscat la 12 L/min, temperatura gazului uscat 350ºC). Timpul de rulare
a fost de 1 minut.
Soluțiile standard
O soluție stoc de apixaban în metanol (0,485 mg/mL) a fost diluată în același solvent (48,5 μg/mL) sau în
plasmă umană fără medicamente (0,970 μg/mL) pentru a obține soluțiile de lucru. Aceste soluții au fost
ulterior utilizate atât pentru prepararea standardelor de calibrare a plasmei cu concentrațiile de 9.70, 19.40,
38.80, 77.60, 194.00, 388.00, 582.00 și 970.00 ng/mL, cât și pentru probele de plasmă pentru controlul
calității (QC) de 38.80 ng/mL, 194,00 ng/mL și 582,00 ng/mL. Toate soluțiile preparate au fost păstrate la -
20ºC până la analiză.
Pretratarea probelor - Standardele și probele de plasmă (50 μL) au fost deproteinizate cu metanol (150
μL), amestecate (10 s) și centrifugate (6 min la 6000 rpm). Au fost analizate volume de 1 μL din
supernatanți în sistem HPLC.
Validarea metodei
Au fost evaluate selectivitatea și specificitatea metodei. Cromatogramele probelor de plasmă marcate cu
apixaban au fost comparate cu cele obținute din diferite probe martor de plasmă (n=6). Pentru a determina
sensibilitatea, au fost analizate șase alicote de plasmă intensificată cu analitul la cel mai scăzut nivel al
curbei de calibrare.
Cinci alicote diferite (n = 5) din probe de plasmă de control de concentrație inferioară, medie și, respectiv,
superioară au fost analizate în aceeași zi pentru a determina precizia intra-zi (exprimată ca și coeficient de
variație, CV %) și exactitatea (exprimată ca diferență relativă între concentrația obținută și cea teoretică,
părtinire %). O probă din fiecare probă de plasmă de control (la concentrații inferioare, medii și superioare)
a fost analizată în cinci zile diferite (n = 5) pentru a determina precizia și exactitatea între zile.
Cel mai scăzut standard de calibrare cu o acuratețe și precizie sub 20% a fost considerat a fi limita inferioară
de cuantificare (LLOQ). Recuperările absolute (la LLOQ, niveluri inferioare, medii și mai mari) au fost
calculate prin compararea răspunsului apixabanului din probele de plasmă marcate cu răspunsul acestuia în
soluții standard cu aceeași concentrație, preparate în fază mobilă și prelucrate în același mod cu proba de
plasmă. (n = 5).
Rezultate
Modul pozitiv Electrospray (ESI – ionizare de tip electrospray) a dat un răspuns mai bun la spectrometru
pentru apixaban decât modul negativ. Apixaban formează ionul molecular pozitiv [M+H]+ la (m/z 460,3)
prin acceptarea unui proton în faza mobilă acidă. Utilizarea detectiei MS tandem permite obtinerea unei mai
bune selectivitati si sensibilități prin fragmentarea ionului molecular. Acesta a fost fragmentat la energia de
coliziune optimă de 0,7 V, iar tranziția ionică m/z 460,3 → 417,3 a fost monitorizată și analizată (Fig.2). În
partea de sus a figurii 2 putem vedea spectrul de scanare completă cu ion molecular, iar în parte de jos este
spectrul obținut prin fragmentare cu o energie de coliziune de 0.7 V.
Pentru a obține peak-uri cromatografice simetrice, rezoluție bună și timp scurt de retenție pentru apixaban, o
caracteristică absolut necesară unei analize cu randament ridicat, metoda dezvoltată LC-MS/MS a fost
optimizată. Cele mai bune rezultate au fost obținute cu o coloană Gemini-NX și un amestec de acetonitril și
formiat de amoniu 1 mM în apă (33:67, v/v) în condiții izocratice la 40 °C și un debit de 0,5 mL/min.
Metoda este rapidă, cu un timp total de rulare a analizei instrumentale de 1 min și un timp de retenție a
apixabanului de 0,82 min. Analiza sextupla a probelor martor nu a arătat vârfuri endogene interferente la
timpul de retenție a apixabanului în plasma umană. (Fig.3). În Figura 3 putem observa cromatogramele
reprezentative de plasmă fără medicamente în partea de sus, la mijloc este plasma cu apixaban la limita de
cuantificare de 9.70 ng/mL, iar jos este eșantionul de plasmă obținut de la un pacient la 2 ore după
administrarea a 5 mg de apixaban.
Liniaritatea metodei a fost menținută pe tot intervalul de concentrație studiat (9,70 - 970,00 ng/mL), cu un
coeficient de corelație mai mare de 0,994 (r2 > 0,9885). Valorile obținute pentru precizia și acuratețea intra-
zi și inter-zi în timpul validării pentru plasmă sunt prezentate în Tabelul 1 și, respectiv, în Tabelul 2. Limita
inferioară de cuantificare (LLOQ) a fost stabilită la 9,70 ng/mL cu o acuratețe și precizie acceptabile
(Tabelul I și Tabelul II).
Discuții - Există puține metode descrise pentru cuantificarea apixabanului în plasma umană, singur sau
simultan cu alte anticoagulante orale noi. Gous și colab. a măsurat nivelurile plasmatice de apixaban,
dabigatran, edoxaban și rivaroxaban în plasma umană prin cromatografie lichidă în flux turbulent cu
spectrometrie de masă de înaltă rezoluție. Coloana Turbo flow pe care a utilizat-o a permis extracția online
(etapa de precipitare a proteinelor), dar această procedură nu este disponibilă în mod obișnuit în majoritatea
laboratoarelor. Intervalul de calibrare a fost 1-500 ng/mL, dar practica clinică a studiului prezentat a
demonstrat niveluri plasmatice mai mari de apixaban la pacienți după administrare repetată decât acest
interval de concentrații, după cum putem observa în Fig.4 în care este reprezentat profilul plasmatic al
apixabanului la 6 pacienți spitalizați după administrarea de doze repetate de apixaban. Volumul plasmatic
procesat a fost de 100 μL și timpul total de analiză a fost de 6 minute.
Schmitz și colab. au cuantificat dabigatranul, rivaroxabanul și apixabanul în plasmă prin cromatografie
lichidă ultra-performanță (UPLC) cuplată cu MS/MS în tandem ca metodă de referință pentru a evalua
performanța analitică a mai multor teste de coagulare. Intervalul de calibrare a fost 23-750 ng/mL, iar LLOQ
< 1 ng/mL
Metoda noastră dezvoltată și validată este foarte simplă și rapidă, necesită un volum de plasmă mai mic (50
μL) și un timp de analiză mai scurt decât alte metode raportate în literatură. Analiza instrumentală se
realizează în 1 minut și un set de 24 de probe necesită un timp de pregătire de aproximativ 15 minute.
Intervalul mare de calibrare studiat (9,70 – 970,00 ng/mL) permite analiza directă a probelor de plasmă după
precipitarea proteinei și centrifugare fără diluare suplimentară.
Rezultatele obţinute au dovedit o bună liniaritate, sensibilitate (LLOQ – limita de cuantificare de 9,70
ng/mL), exactitate şi precizie în intervalul de concentraţie studiat. Toate valorile pentru acuratețe și precizie
au fost în limitele recomandate (Tabelul 1 și Tabelul 2). Valorile de recuperare au fost între 97,4 - 104,5 %,
ceea ce înseamnă că nu există pierderi de analit în timpul preparării probei datorită adsorbției pe proteinele
precipitate.
Concluzii
În concluzie, metoda LC-MS/MS dezvoltată și validată se remarcă prin simplitate, acuratețe și accesibilitate.
Spre deosebire de alte metode LC-MS/MS raportate în literatura științifică pentru cuantificarea apixabanului
în plasmă, aceasta este mai rapidă (atât pentru pregătirea probei, cât și ca analiză instrumentală) și ieftină,
caracteristici esențiale pentru metodele cu randament ridicat utilizate în analiza de rutină.
Are aplicabilitate largă în monitorizarea la nivel clinic a apixabanului, precum și în studiile de
farmacocinetică sau de bioechivalență.