Introducere - Antibioticele sunt medicamentele care vizează componentele esențiale necesare creșterii sau

hrănirii microbilor. Au capacitatea de a inhiba creșterea sau de a ucide microorganismele. Microorganismele

importante din punct de vedere clinic patogene pentru populația umană sunt clasificate ca bacterii, ciuperci,
viruși și protozoare. De la descoperirea compușilor naturali, semisintetici și sintetici pentru tratamentul
diferitelor infecții bacteriene, omenirea s-a confruntat și cu toxicitatea și dezvoltarea rezistenței acestora.
Reacțiile alergice, hepatotoxicitatea, nefrotoxicitatea, ototoxicitatea și fototoxicitatea sunt cele mai frecvente
efecte adverse asociate cu utilizarea antibioticelor.
Clase de antibiotice - Există o gamă largă de antibiotice disponibile și variază atât în ceea ce privește
utilizarea, cât și mecanismul lor de acțiune. Această imagine rezumă clasele majore și oferă, de asemenea, o
scurtă perspectivă asupra modului în care acestea combat infecțiile bacteriene; Am să vă prezint pe scurt
doar câteva dintre clasele de antibiotice deoarece după cum puteți observa sunt destul de multe.
Beta lactame - Beta-lactamele sunt o gamă largă de antibiotice, prima descoperită a fost penicilina, pe care
Alexander Fleming a identificat-o în 1928. Toate antibioticele beta-lactamice conțin un inel beta-lactamic;
acestea includ peniciline, cum ar fi amoxicilina și cefalosporine. Acestea funcționează prin interferarea cu
sinteza peptidoglicanului, o componentă importantă a peretelui celular bacterian, și sunt utilizate în principal
împotriva bacteriilor gram-pozitive.
Aminoglicozide - Aminoglicozidele inhibă sinteza proteinelor în bacterii, ducând în cele din urmă la
moartea celulelor. Sunt eficiente doar împotriva anumitor bacterii Gram-negative, precum și a unor bacterii
Gram-pozitive, dar nu sunt absorbite în timpul digestiei, așa că trebuie injectate. Din cauza problemelor
legate de toxicitatea aminoglicozidelor, utilizarea lor în prezent este limitată. Câteva exemple ar fi
streptomicina, neomicina, kanamicina.
Tetraciclinele - Tetraciclinele sunt antibiotice cu spectru larg, active atât împotriva bacteriilor Gram-
pozitive, cât și împotriva bacteriilor Gram-negative. Ele inhibă sinteza proteinelor, prevenind creșterea
bacteriilor. Utilizarea lor este în scădere datorită creșterii rezistenței bacteriene.
Macrolide - La fel ca beta-lactamele, macrolidele sunt în principal eficiente împotriva bacteriilor Gram-
pozitive; cu toate acestea, acţionează într-o manieră bacteriostatică, împiedicând creşterea şi reproducerea
prin inhibarea sintezei proteinelor. Eficacitatea lor este puțin mai largă decât cea a penicilinelor și s-a
dovedit a fi eficace împotriva mai multor specii de bacterii pentru care penicilinele nu sunt.
Streptograminele - Streptograminele sunt neobișnuite prin faptul că sunt de obicei administrate ca o
combinație a două medicamente antibiotice din diferite grupuri din cadrul clasei: streptogramină A și
streptogramină B. Pe cont propriu, acești compuși prezintă doar activitate de inhibare a creșterii, dar
combinați au un efect sinergic și sunt capabile să ucidă direct celulele bacteriene, prin inhibarea sintezei
proteinelor.
Toxicitate - Testele de toxicitate joacă un rol esențial în asigurarea siguranței față de substanțele potențial
periculoase. Toxicitatea legată de antibiotice rezultă în principal din administrarea de doze mari,
administrarea pe termen lung de doze mari de antibiotice sau tolerabilitatea scăzută a antibioticelor la
pacienții speciali cu diferite afecțiuni, cum ar fi disfuncția renală. Deși b-lactamele sunt în general
considerate a avea o gamă largă de siguranță, ele pot duce la efecte adverse legate de doză.
Beta lactame - Toxicitatea antibioticelor b-lactamice se manifestă în principal prin reacții de
hipersensibilitate, discrazii sanguine, nefrotoxicitate și neurotoxicitate. Primul antibiotic b-lactamic care a
indus reacția alergică a fost benzilpenicilina, urmată de amoxicilină, fiind acum cel mai frecvent
medicament care provoacă reacții de hipersensibilitate.
Aminoglicozide - Utilizarea pe termen lung a aminoglicozidelor duce la dezvoltarea ototoxicității și
nefrotoxicității. Ototoxicitatea poate fi reversibilă sau ireversibilă în funcție de doza de medicament
administrată. Două zone sunt puternic afectate de toxicitatea aminoglicozidelor, cohleară și vestibulară.
Administrarea terapiei cu aminoglicozide poate duce la degenerarea neuronilor și a celulelor din zonele de
percepție senzorială din cohlee. Odată ce celulele senzoriale sunt distruse, poate apărea pierderea
permanentă a auzului.
Tetracicline - Cele mai frecvente efecte secundare asociate cu tetraciclinele sunt tulburările gastro-intestinale
manifestate prin tulburări și iritații gastrointestinale; arsuri epigastrice; dureri abdominale care duc la greață,
vărsături și esofagită. Tolerabilitatea tetraciclinei poate fi sporită prin administrarea acestor medicamente cu
alimente, cu toate acestea, administrarea cu produse lactate este contraindicată.
Macrolide - Macrolidele au fost considerate a fi unul dintre cele mai sigure antibiotice de la introducerea lor
în 1952. Diferiți membri ai acestei clase sunt eritromicina, claritromicina, azitromicina și tilozina. Cel mai
frecvent efect secundar al acestor medicamente este hepatotoxicitatea. Simptomele bolii hepatice încep de
obicei cu tulburări gastro-intestinale, inclusiv greață, crampe abdominale urmate de vărsături. Macrolidele
provoacă diverse reacții alergice, inclusiv sindromul Stevens-Johnson și necroliza epidermică toxică.
Streptograminele - Cele mai frecvente efecte secundare raportate sunt legate de perfuzie, provocând durere
și inflamație la locul injectării. Acest efect secundar poate fi minimizat prin controlul vitezei de perfuzie sau
prin perfuzarea medicamentului printr-un cateter venos central.
Metode de extracție – În ceea ce privește metodele de extracție a antiobioticelor, am găsit un studiu
interesant care are ca scop compararea mai multor abordări pentru extracția a 4 antibiotice dintr-o legumă
consumată în mod obișnuit, anume salata verde. Antibioticele investigate reprezintă 4 clase diferite de
antibiotice: sulfonamide (sulfametoxazol), tetracicline (oxitetraciclină), lincosamide (lincomicina) și
fluorochinolone (ciprofloxacină). Acești compuși au fost aleși pe baza utilizării lor pe scară largă în
agricultura animală, a utilizării lor în medicina umană și a detectării lor frecvente în mediu. Metodele de
extracție evaluate au inclus modificarea lizării celulelor prin îngheț și dezgheț, macerarea mecanică,
sonicarea țesuturilor și extracția cu solvent asistată de microunde.
Salata a fost tăiată în secțiuni de aproximativ 2,5 cm x 2,5 cm. Pentru a dezactiva bacteriile s-a adăugat
alcool izopropilic și acid citric. Fiecare probă de 2 g a fost înțepată cu 100 ng din cele 4 antibiotice:
lincomicină, ciprofloxacină, oxitetraciclină și sulfametoxazol. Probele au fost imediat depozitate la –20 ℃
timp de minim 24 de ore. Această proba surogat a fost utilizată ca control al calității pentru a confirma
comportamentul așteptat al analiților între probe și loturi. Recuperarea acesteia a fost monitorizată în toate
metodele de extracție, în timp ce adăugarea mai multor standarde interne a permis cuantificarea analiților și
a surogatului. Probele congelate au fost lăsate să se dezghețe timp de minim 1 oră, iar apoi 10 replici au fost
procesate prin 1 din 4 metode de extracție diferite: lizare prin îngheț și dezgheț, macerare mecanică, sonicare
tisulară și extracție cu solvent asistată de microunde. O reprezentare vizuală a celor 4 procese de extracție și
o comparație a timpului necesar pentru 24 de loturi de probă sunt prezentate în Figura 1. Timpii de probă
enumerați demonstrează timpul necesar pentru a genera eluantul extras. Odată decantat, prelucrarea
ulterioară a eluantului, inclusiv curățarea, a fost aceeași pentru toate cele 4 metode.
Lizarea îngheț-dezgheț. Probele de salată verde precântărite au fost lăsate să se echilibreze la temperatura
camerei și apoi au fost supuse la agitare timp de 30 de minute folosind un agitator de mână. Probele au fost
centrifugate timp de 10 minute și apoi decantate într-un tub de evaporare din sticlă.
Macerare mecanică. Probele de salată verde au fost agitate timp de 20 de minute, apoi au fost macerate cu o
tijă de agitare din sticlă prin 30 de mișcări cu mâna. Probele au fost centrifugate timp de 10 minute și
decantate în tuburi de evaporare din sticlă.
Sonicarea țesuturilor. Sonicarea a fost efectuată la o frecvență fixă de vibrație de 20 kHz la amplitudine
maximă timp de 5 minute într-o baie de apă rece pentru a minimiza încălzirea. Probele au fost apoi
centrifugate timp de 10 minute și decantate într-un tub de evaporare din sticlă. Inițial, a fost folosită o
perioadă de sonicare de 15 minute, care a dus la distrugerea completă a țesutului de salată verde și la
creșterea încorporării matricei în eluant. Curățarea ulterioară a extracției în fază solidă nu a îndepărtat în
mod eficient matricea suplimentară, rezultând zgomot crescut în cromatogramă.
Extracție cu solvent asistată cu microunde. Probele de salată verde au fost transferate în vase cu garnituri.
Vasele au fost apoi plasate în cuptorul cu microunde, care a fost setat la 100% putere, iar temperatura a fost
crescută la 60℃. Un experiment de stabilitate termică, care a măsurat recuperarea compușilor părinte în
absența matricei la 30℃, 60℃, 90℃ și 120℃, a fost utilizat pentru a confirma că temperaturile care
depășesc 60℃ au dus la degradarea antibioticelor de interes. Probele au fost lăsate să se răcească la
temperatura camerei la scoaterea din cuptor și apoi transferate în centrifugate timp de 10 minute.
Supernatantul a fost apoi decantat în tuburi de evaporare din sticlă.
Rezultate - Recuperarea medie a celor 4 analiți, precum și a surogatului a fost calculată și comparată între
cele 4 metode de extracție. Recuperarea surogat a fost relativ consistentă între cele 4 metode și a variat între
93% și 114%. Lizarea celulelor prin înghețatre și dezghețare, macerarea mecanică și sonicarea țesuturilor au
fost deosebit de consistente, cu recuperări medii între 113% și 114%. Extracția cu solvent asistată cu
microunde a oferit recuperarea cea mai apropiată de 100%, la 93%.
Metoda de sonicare a dus la cele mai mari recuperări pentru ciprofloxacină (278%) și oxitetraciclină (430%)
și cea mai scăzută recuperare a sulfametoxazolului (22%). Metoda de extracție cu solvent asistată cu
microunde a dus la cea mai mare recuperare aparentă (309%) a lincomicinei, dar a produs cea mai eficientă
recuperare a ciprofloxacinei (55%) și a sulfametoxazolului (67%). Macerația mecanică a oferit o recuperare
scăzută, dar consistentă a ciprofloxacinei (23%) și cea mai eficientă recuperare a lincomicinei (111%).
Metoda de sonicare a țesuturilor a dus la recuperări de lincomicină (139%), ciprofloxacină (43%) și
sulfametoxazol (55%).
Analiza a 12 antibiotice Beta-lactamice din plasmă umană prin HPLC cu detecție UV - O metodă
simplă și economică de cromatografie de lichide de înaltă performanță a fost dezvoltată și validată pentru
analiza de rutină a 12 antibiotice în 200 uL de plasmă umană. Metoda descrisă utilizează o metodă comună
de preparare a probei și o fază staționară pentru toți analiții. Pentru a menține forma peakului pe întreaga
gamă de analiți, analiții sunt grupați în trei seturi pe baza fazei mobile utilizate (Tabel 1). Grupul 1A este
pentru analiza Ceftazidimei, Meropenem, Ceftriaxonă și ampicilină. Analiții grupului 1B sunt Cefazolină și
Ertapenem și pentru grupul 2 avem Cephatolină, Benzilpenicilină, Flucoxacilină, Dicloxacilină, Piperacilină
și Ticarcilină.
Reactivi și chimicale - Materialul medicamentos a fost obținut sub formă de formulări pentru administrare:
Ceftazidimă pentahidrat, Meropenem trihidrat, Ceftriaxonă sodică, Ampicilină sodică, Cefazolin Sodic,
Ertapenem sodic, Cefalotina sodică, Benzilpenicilină sodică, Flucloxacilină sodică, Dicloxacilină sodică,
Piperacilină sodică, Ticarcilină sodică și Cefotaxime. Fosfatul monosodic și acidul fosforic au fost de
calitate analitică, iar acetonitrilul și cloroformul au fost de calitate HPLC. Toată apa a fost deionizată
(rezistivitate 18MOhm). Plasma martor a fost obținută de la serviciul de patologie a spitalului.
Sistemul cromatografic - Metoda a fost dezvoltată, validată și funcționează pe două sisteme separate, dar
similare, marca Waters. Sistemul primar a cuprins un modul de separare Alliance 2690, echipat cu pompă
cuaternară, degazor on-line și autosampler și un detector de ultraviolete cu matrice de fotodiode 996.
Sistemul secundar a fost o pompă, un autosampler și un detector UV 996 PDA. Controlul instrumentelor,
achiziția și prelucrarea datelor au fost realizate cu software-ul Waters Empower. Debitul a fost de 1,0
ml/min și volumul de injecție a fost de 10 uL. Detectorul a monitorizat lungimi de undă de 210, 260 și 304
nm, în funcție de analiți (Tabelul 1). Înălțimea peakului standardului intern a fost obținută la aceeași lungime
de undă ca și analitul. Au fost utilizate caracteristicile detectorului de puritate maximă și potrivirea
spectrului. Separările au fost efectuate la temperatura ambiantă pe o coloană Waters X-bridge C18 cu fază
inversă (30 mm x 4,6 mm, 2,5 m silice). Una dintre cele trei faze mobile a fost utilizată în funcție de grupul
de analiți care urmează să fie determinați. Faza mobilă pentru grupa 1A a fost acetonitril (8%) și tampon
fosfat la pH 2,4 (92%); pentru 1B a fost acetonitril (12%) și tampon fosfat la pH 2,4 (88%); iar grupul 2 a
fost acetonitril (25%) și tampon fosfat la pH 3,0 (75%). Fazele mobile au fost reciclate, adică eluentul de la
detector a fost reintrodus înapoi în rezervorul de fază mobilă. Contrapresiunea tipică a fost de aproximativ
47 atm.
Soluții - Antibioticele analit au fost dizolvate în apă deionizată apoi combinate pentru a da două stocuri
combinate: 5 ug/mL pentru grupul 1A și 1B; și 5 ug/ml în flucloxacilină, dicloxacilină, benzilpenicilină și
cefalotină și 10 g/ml în piperacilină și ticarcilină pentru grupul 2. Aceste stocuri combinate au fost diluate cu
plasmă martor pentru a da standarde de lucru care au fost depozitate la -70 ◦C pentru până la 6 luni.
Standardul intern pentru grupul 1A și 1B a fost 500 ug/mL cefotaximă. Standardul intern pentru grupul 2 a
fost 250 g/mL oxacilină. Specimenele de control al calității au fost preparate independent de standardele în
plasmă la trei niveluri de concentrație (Tabelul 2).
Prepararea probelor - Probele pentru analiză au fost împărțite în grupele 1 sau 2, în funcție de analitul care
urmează să fie determinat, și au fost utilizate standarde de potrivire, controale de calitate și standarde
interne. Pentru fiecare probă, standard și control de calitate, 200 uL de plasmă au fost plasați într-un tub de
microcentrifugă din polipropilenă de 1,8 ml, urmat de 100 uL de standard intern. S-a adăugat acetonitril
(600 uL) pentru a precipita proteinele, iar tubul a fost amestecat timp de 30 s. Proteinele precipitate au fost
separate prin centrifugare timp de 5 minute. Supernatantul a fost îndepărtat într-un tub de polipropilenă și s-
au adăugat 600 uL de cloroform. Tubul a fost amestecat în vortex timp de 30 s pentru a împărți acetonitrilul
și componentele plasmatice solubile în lipide în faza organică de cloroform și s-a centrifugat timp de 5
minute pentru a separa straturile. O alicotă (100 uL) din faza apoasă superioară a fost transferată într-un
flacon de autosampler pentru analiza cromatografică.
Rezultate și discuții
Cromatografia - A existat o separare adecvată pentru fiecare analit în condițiile specificate de fază mobilă
și lungime de undă, așa cum s-a demonstrat în cromatogramele pentru fazele mobile 1A (Fig. 1), 1B (Fig. 2)
și 2 (Fig. 3) . În figura 1 (A) putem observa că a fost detectată ampicilina dupa 5.7 minute, în figura 1(B)
observăm prezența cefdazidimei dupa 1.7 minute și a ceftriaxonei după 4.6 minute, iar în 1(C) obersvăm
meropenem dypă 2.4 minute. În figura 2 se observă detecția cefazolinei la 3.7 minute și a Ertapenemului la
4.4. minute. În figura 3 găsim Cefalotin la 2 minute, iar in 3(B) se regăsesc ticarcilina, piperacilina,
benzilpenicilina, flucoxacilina și dicloxacilina. Acești timpi de retenție tipici sunt afișați în Tabelul 1. Fazele
mobile 1A și 1B diferă numai prin cantitatea de acetonitril prezentă (8% c.f. 12%); procentul mai mare de
organic din 1B a fost important pentru a menține forma de vârf. Faza mobilă 2 (tamponată la pH 3) a fost
necesară pentru peniciline, deoarece s-a observat o retenție slabă la pH 2,4 (pH-ul în faza mobilă 1A și 1B).
Validarea - Liniile de calibrare au fost descrise în mod adecvat prin regresie liniară pe intervalul de
concentrație, deși intervalul pentru Meropenem și Ertapenem a fost trunchiat la un maxim de 250 ug/mL
(Tabelul 1). În toate standardele a existat doar o singură instanță a unui standard care nu a îndeplinit
criteriile de acceptare (adică >15% abatere de la nominal) și a fost respins din curba de calibrare. Pentru toți
analiții, abaterea procentuală medie absolută a standardelor a fost de 5% sau mai bună și în niciun caz un
standard acceptat nu s-a deviat de la nominal cu mai mult de 10%. Precizia limitelor de detecție (LOQ)
standard a fost, de asemenea, acceptabilă (toate în limita a 8%). Analiza replicată între și în decursul zilei a
controalelor de calitate a demonstrat un nivel ridicat de precizie și acuratețe a metodei (Tabelul 2). Precizia
zilnică pentru QC(quality control) scăzut al Ceftazidimei a fost deosebit de mare, deși acest lucru nu a fost
observat în datele dintre zile. Pentru reanalizarea probelor suportate, nu toți analiții au fost prezenți în
probele acumulate în perioada de 4 săptămâni. Deși numărul de reanalize a fost relativ scăzut (n = 21), toate
reanalizele au fost în limita a 20% față de original. Analiții și diferența lor medie au fost: Ceftazidimă 6% (n
= 1), Meropenem 14% (n = 6), Cefazolină 1% (n = 3), Piperacilină 10% (n = 5), Benzilpenicilină 0% (n =
3). 3) și Flucloxacilină 11% (n = 4).