Slide 2

Cipul cu flux direct de rezistență antimicrobiană (AMR) este un kit de diagnostic in vitro care oferă o
detectare rapidă la douăzeci de familii de gene de rezistență la antibiotice

asociate cu organisme rezistente la multidrog (MDRO)

Testul se efectuează direct

pe exsudate rectale, nazofaringiene exsudate/aspirate și/sau hemoculturi, la pacienții infectați

sau cu risc de a fi colonizat, ca măsură de ajutor în controlul și prevenirea acestui tip de infecții.

Metoda se bazează pe amplificarea țintelor ADN printr-o reacție PCR multiplex și ulterioară

hibridizare inversă pe o membrană care conține o sondă specifică

Slide 3

PRINCIPIUL METODEI

Kit-ul AMR Direct Flow Chip se bazează pe o metodologie constând din amplificarea simultană a S.

aureus și douăzeci de markeri de rezistență prin PCR multiplex, direct din extracte celulare, urmate de

hibridizare într-o membrană cu sonde ADN specifice folosind tehnologia DNA-Flow pentru automate sau

platforme manuale hybriSpot. Ampliconii biotinilați generați după PCR sunt hibridizați

membrane care conțin o serie de sonde specifice pentru fiecare țintă, precum și amplificare și

sonde de control al hibridizării. Tehnologia DNA-Flow permite o legare foarte rapidă între PCR

produsul și sonda sa specifică într-un mediu tridimensional poros.

Odată ce legarea a avut loc între ampliconii specifici și lor

sonde corespunzătoare, semnalul este vizualizat printr-o reacție imuno-enzimatică colorimetrică cu

Streptavidin-Fosfataza și un cromogen (NBT-BCIP) care generează precipitate insolubile pe

membrana in pozitiile in care a avut loc hibridizarea. Rezultatele sunt analizate automat

cu software-ul hybriSoft™

Slide 4

Kit-ul AMR Direct Flow Chip este comercializat în două formate principale în funcție de tipul de
hibridizare care va fi utilizată pentru analiza probelor clinice.

AMR Direct Flow Chip kit (PCR Mix) contains a PCR buffer, MgCl2, dNTPs (U/T), DNase-free and RNase-
free water and biotinylated primers
AMR Enzymes comprises two enzymes: Hot Start Polymerase and Uracil DNA Glycosylase.

Chips AMR: Setul include un total de 24 Chipsuri sau membrane

care conțin o serie de matrici de ADN specifice pentru fiecare țintă inclusă în analiză, precum și altele

matrici corespunzătoare controalelor de amplificare încorporate în acest kit.

Reactivi de hibridizare Flow Chip: conține toți reactivii necesari pentru procesul de hibridizare inversa

: All reagents are provided in a ready-to-use format, except for the reagents E1 and E2 that must be
mixed in a 1:1 proportion immediately before use in the empty vial provided for that purpose and
labelled as "Reagent E”.

Slide 5

Volumul de proba reprezitna

-Rectal exudates

- Nasopharyngeal exudates/aspirates

- Rectal exudates and nasal exudates as a single sample

- Blood cultures

Slide 7

 După dezvoltarea membranelor, în toate cinci trebuie să apară un semnal intens

pozițiile de control al hibridizării (B), care servesc drept control al calității. Acest semnal indică faptul că

reactivii de hibridizare și dezvoltare au funcționat corect. Dacă nu apare niciun semnal, asta va însemna

a existat o eroare în procesul de hibridizare sau că un reactiv nu a fost utilizat în mod corespunzător.

Mai mult, acest semnal ghidează software-ul să citească și să interpreteze corect panoul de sonde
pentru acesta

analiza ulterioară

 Probele pentru detectarea ADN-ului sintetic inclus în amestecul PCR.

Acest ADN va fi co-amplificat cu materialul genetic al probei. Două semnale pozitive în

controlul de amplificare exogen(CI) va indica faptul că reacția PCR a funcționat corect. Un rezultat
negativ în acest control nu invalidează rezultatul dacă controlul endogen a amplificat corect și/sau proba
a fost pozitiv pentru oricare dintre țintele incluse în panel
  sondă pentru detectarea ADN-ului genei beta-globinei umane

amplificat în timpul PCR. Toate probele în care ADN-ul șablon a fost amplificat corect vor avea a

semnal pozitiv în controlul de amplificare endogen (BG). Acest semnal este indicativ pentru ADN

calitate/cantitate utilizată pentru amplificare. Un semnal pozitiv indică faptul că amplificarea a

funcționat

corect și că calitatea și cantitatea ADN-ului utilizat pentru aceasta au fost optime. Lipsa semnalului
pentru

acest control indică erori în timpul amplificării, calitate/cantitate scăzută a ADN-ului utilizat în

amplificarea sau lipsa ADN-ului uman în amplificare. O absență a ADN-ului uman este posibilă cu unele

probe, în funcție de diluția la care sunt supuse exsudatele rectale pentru prepararea PCR. A

rezultatul negativ pentru acest control nu invalidează rezultatul dacă controlul exogen are corect

amplificat și/sau eșantionul a fost pozitiv pentru oricare dintre țintele incluse în panou

 incluse în kit trebuie să dea un semnal pt

unele dintre sondele specifice. Mai mult, 5 semnale de control al hibridizării (B), două semnale exogene

(CI) și două semnale endogene de control al amplificării (BG) (ca

atâta timp cât proba conține ADN uman). Dacă nu apare niciun semnal pentru comenzile de amplificare,
dar apare

apar pentru markerii de rezistență, este inclus un mesaj de absență a ADN-ului uman / prezența
inhibitorilor PCR

în raport. În acest caz, utilizatorul ar trebui să verifice calitatea probelor înainte de a valida rezultatele

 incluse în kit, vor avea cele cinci

semnale pozitive pentru controlul de hibridizare (B) și două semnale pentru controlul de amplificare
exogenă

(CI). Semnalele de control de amplificare endogenă (BG) vor apărea și dacă proba analizată conține

ADN uman.

Utilizatorul este responsabil pentru determinarea procedurilor adecvate de control al calității pentru
laboratorul său și

respectarea reglementărilor aplicabile

slide 8

Toate sondele sunt duplicate pentru a garanta fiabilitatea analizei automate a rezultatelor. The

controlul hibridizării (B) se repetă în 5 poziții și permite software-ului să orienteze corect panoul de

sonde pentru analiza lui ulterioară.