Detectia si cuantificarea fungilor micotoxigenici pe baza reactiei PCR

Micotoxinele sunt metabolite secundari produsi de majoritatea fungilor fitopatogenici si food spoilage, inclusive Penicillium, Aspergillus si Fusarium. Toxicitatea si potentialul cancerigen a multora dintre aceste micotoxine si capacitatea de a contamina alimentele si furajele, determina ingrijorari la nivel global atat din punct de vedere al sigurantei alimentare cat si din punct de vedere al comertului. De aceea este necesara identificarea rapida a fungilor micotoxigenici, pentru ca etapele de interventie rapida sa poata fi aplicate pentru a ajuta a limitarea cantitatilor de materiale consummate, in special cerealele sau produsele pe baza de cereale, avand astfel acces in lantul alimentar uman. Tinand cont de aceste lucruri, un numar de metodologii bazate pe PCR au fost dezvoltate in scopul identificarii genelor biosintetizatoare de micotoxine in diferite genuri de fungi, impreuna cu alte teste elaborate folosind alte gene sau metode de amplificare aleatorie a AND-ului polimorfic (RAPD) pentru identificarea fungilor toxicogenici specifici. In plus au fost elaborate pentru acest scop metode precum revers transcrierea (RT)-PCR, competitive PCR si Real Time Quantitative PCR. Inroducere Micotoxinele sunt metaboliti secundari produsi de fungi filamentasi care, atunci cand sunt ingerati de catre animale, produc un raspuns toxic, micotoxicoze. Principalele genuri responsabile pentru micotoxinele gasite in lantul alimentar unan sunt Aspergillus, Fusarium si Penicillium (tabel 1). Unele specii de Fusarium sunt patogene pentru plante si pot produce micotoxine in interiorul plantelor infectate. Pot de asemenea produce micotoxine in plante depozitate in anumite conditii. Oamenii pot ingera micotoxinele direct de la plantele contaminate sau indirect prin consumul de carne sau lapte de la animalele hranite cu furaje contaminate cu micotoxine. Exista peste 3000 de micotoxine raportate desi doar aproximativ 20 dintre acestea sunt considerate a avea efecte asupra sanatatii oamenilor (Geisen 1998). Micooxinele au o larga diversitate de structuri, de la inele unice heterociclice pana la sase sau opt inele neregulate unite (Ap. Sinion 1994). Acesta multitudine de structuri are ca rezultat o diversificare a efectelor toxice, cum ar fi: cele neurotoxice, nefrotoxice, hepatotoxice, imunosupresive si teratogenic (Hussein si Brasel 2001, Creppy 2002). Micotoxinele au cauzat epidemii majore in randul oamenilor si a animalelor domestice in cursul istoriei. Despre ergotism se crede ca ar fi cauzat mii de morti, capatand proportii epidemice in evul mediu (Bove 1970). Aleukia alimentara toxica a provocat moartea a mii de rusi intre 1942 si 1948 ca rezultat al

consumului de cereale infectate cu specii de Fusarium ce au fost lasate pe camp pe durata iernii (Joffe 1986). Consecintele grave ale contaminarii cu micotoxine au creat nevoia de tehnici rapide si sigure de detectie a micotoxinelor si a producatorilor de micotoxine din furaje si alimente. Un nunar de tehnici inalt sensibile au fost elaborate in scopul detectiei micotoxinelor. Acestea include cromatografia lichida de inalta performanta (HPLC), gas chromatography-mass spectrometry (GSMS) si teste imunologice precum ELISA. In contrast, detectia fungilor micotoxigenici s-a bazat pe izolari si tehnici de cultivare traditionale. Aceste tehnici sunt de lunga durata si necesita expertiza taxonomica. Chiar si cu expertiza, identificarea este dificila, inparticulat pt genul Fusarium, care contine un numar mare de specii indeproape inrudite si este clasificat in intregime pe baza caracteristicilor morfologice (Ganes si Nirenberg 1989). Acest lucru este in continuare confuz pentru numeroase tratamente taxonomice ale acestui gen (booth 1971, Gerlach si Nirenberg 1982, Nelson, Toussoun si Marasas 1983). Este clar din literatura ca izolatele de Fusarium sunt frecvent identificate gresit (Marasas, Nelson si Toussoun 1984, ODonnel 1997, ODonnel, Cigelnik si Casper 1998, Niessen si Vogel 1998. Reactia de polimerizare in lant (PCR) este o metoda eficienta care a revolutionat biologia moleculara de la elaborarea acesteia la mijlocul anilor 80 (Mullis,Ferre si Gibbs 1994). PCR permite amplificarea unor fragmente specifice de AND din probe complexe de AND. Produsul PCR rezultat poate fi observat dupa gel electroforeza si colorare cu un colorant fluorescent ce se leaga la AND, cum ar fi bromura de etidiu. Un numar mare de tehnici bazate pe PRC permit determinarea statutului taxonomic a unui izolat fungic. Amplificarea si secventierea directa a AND-ului ribosomal (ADNr) a fost una din primele aplicatii ale PCR in micologie. Micotoxinele produse de Fusarium Fusarium este important in cadrul agriculturii din moment ce include un numar important de patogeni pentru plante care produc o gama larga de micotoxine. In analiza lor despre metabolitii produsi de Fusarium, Vesonder si Golinschi (1989) au listat 48 de trichothecene, 12 zearalenone si 10 alte micotoxine. Aceasta lista nu include then , fusarochromanona recent descoperita (Pathre et al 1986) si fumonisinele (Gelderblom et al 1988) sau de atunci descoperitele micotoxine beauvericum (Gupta et al 1991, Logrieco et al 1998), sambutoxina (Kim si Lee 1994) si fusaproliferina (Santini et al 1996). Micotoxinele produse de Fusarium sunt in special gasite in cereale, unde micotoxinele predominante sunt trichothecenele, moniliformina, fumonisina si zearalenona (DMello, Pacinta si Macdonald 1999). Multe specii de Fusarium toxicogene au fost asociate c infectiile cerealelor dar patogenii predominanti din intreaga lume sunt Fusarium graminearum si Fusarium culmorum. Acesti fungi cauzeaza fusarium head blight (scab) la cerealele mici si gibberella ear rot la porumb. Aceste boli sunt asociate cu regiunile cu clima

temperata. Fusarium graminearum tinde sa domine mai mult in regiunile mai calde (America de Nord, China) si Fusarium culmorum apare mai des in zonele reci (nordul Europei) (Miller 1994, Parry, Jenkinson si McLeod 1995). Microdochium nivale (Fusarum nivale) si Fusarium poae sunt de asemenea patogeni ce produc head blight in nordul Europei (Parry et al 1995). Microdochium nivale produce micotoxine inca necunoscute (Logrieco et al 1991). Trichothecenele sunt un grup de micotixine inrudit indeaprope cu sequiterpenes. Ele sunt clasificate pe baza gruparilor funcionale in tipul A si B, in functie de prezenta sau absenta unei grupari keto la pozitia C8. Structura deoxinivalenolului (DON), o trichothecena de tip B, este aratata in figura 2. Toxicitatea lor primara este inhibarea sintezei proteice, desi efectele lor biologice sunt diverse. Este important de mentionat ca toxicitatea trichothecenelor asupra animalelor experimentale variaza mult. De exemplu, DON, care este cea mai predominanta trichothecena detectata, este de 14 ori mai putin toxica decat nivalenolul atunci cand este administrat intraperitoneal la soareci. La oameni, se considera ca trichithecenele sunt cele mai importante trichothecene produse de Fusarium. Toxicoze umane la scara larga au fost detectate in China, Rusia, Japonia si India (Yoshizawa 1983, Joffe 1986, Luo 1988, Bhat et al 1989). Simptomele includ anorexie, greata, voma, dureri abdominale, diaree si convulsii (Yoshizawa 1983). Porcii sunt cele mai senzitive animale de ferma la trichothecene, manifestandu-se prin refuzarea hranei si voma (Williams, Blancy si Magee 1989). Administratia Americana a Alimentelor si Medicamentelor a stabilit nivele limita pentru DON de 1g g-1 pentru produsele umede finite destinate consumului uman, 10 g g-1 pentru cerealele destinate alimentatii viteilor mai mari de 4 luni si puilor, si 5 g g-1 pentru cerealele destinate porcilor si celorlalte animale (Trucksess et al 1995). Monoliformina, zearalenona si fumonisinele sunt metaboliti secundari polyketide-derived, desi biosinteza lor este neclara. The recent sequencing of the fumonisin gene cluster [EMBL Accession No-AF 1557-73] ar trebui sa conduca la elucidarea etapelor biosintezei de fumonisina. Moniliformina exista fie ca sare de sodiu fie ca sare de potasiu a 1-hydroxycyclobut-1-ene-3,4-dione (fig.2). Moniliformina a fost pentru prima oara izolata dintr-o cultura de Fusarium proliferatum care a fost gresit identificata ca Fusarium moniliforme (Cole et al 1973). De atunci multe specii de Fusarium au fost identificate ca producatoare de moniliformina. Dintre acestea multe sunt patogeni importanti ai cerealelor, Fusarium proliferatum si Fusarium subglutinans fiind importante in mod particular la porumb (Marasas et al 1986, Schutt, Nirenberg si Denel 1998). Moniliformina este o potentiala micotoxina cardiotoxica cauzand insuficienta cardiaca la puii de taiat injectati cu 1g g-1 greutate corporala (Nagaraj et al 1995). Efectele acute si de lunga durata ale moniliforminei asupra sanatatii umane nu sunt cunoscute desi a fost implicata ca agent etiologic intr-o boala endemica a inimii (boala Keshan) in anumite regiuni ale Chinei (Zang si Li 1989). Zearalenona este un estrogen nonsteroid

(fig.2). si -zearalenolul se leaga la receptorii estrogenului producand hiperestrogenism cauzand astfel desechilibre ale reproducerii. Porcii sunt cei mai predispusi la intoxicatie cu zearalenona deoarece receptorii lor pentru estrogen au o afinitate mare pentru -zearalenol (Fitzpatrick et al 1989). Toxicitatea actuala a zearalenonei este foarte scazuta (Hidy et al 1997), si in consecinta s-a sugerat ca zearalenona ar trebui sa fie catalogata ca un micoestrogen si nu ca o micotoxina (Hagler et al 2001). Zearalenona este produsa in principal de Fusarium graminearum, Fusarium culmorum, Fusarium equiseti si Fusarium crookwellense si poate fi gasita in toate produsele din cereale (Placinta Dmello si Macdonald 1999). Fumonisinele constau intr-un lant alifatic cu 20 de atomi de carbon si two ester linked hydrophilic side chains (fig.2). Aceasta structura este asemanatoare cu cea a sphingosinei, o fosfolipida esentiala din interiorul membranelor celulare. Activitatea toxica este rezultatul competitiei cu sphingosina in metabolismul sphingolipidic (Riley et al 1996). Fumonisinele sunt printre cele mai recente micotoxine identificate dupa ce s-a descoperit ca fiind cauza unui sindrom fatal, leucoencephalomalacia ecvina (Kellerman et al 1990). De atunci s-au demonstrat numerase efecte toxice ale acestora asupra animalelor (Shephard 2001). Un nivel inalt de fumonisina din dieta umana a fost legat de incidenta crescuta a cancerului esofagian in Africa de Sud (Rheeder et al 1992) si China (Chu si Li 1994). Marii producatori de fumonisina sunt Fusarium moniliforme si speciile indeproape inrudite cu acesta. Porumbul este sursa alimentara contaminata in cea mai mare masura de catre aceste micotoxine (Placinta et al 1999). Recent, US Food and Drug Administration au stabilit limitele pentru concentratiile de fumonisina (Trucksess 2001). Nivelul pentru fumonisina totala (B1+B2+B3) variaza intre 2 si 4 g g-1 in functie de produs pentru alimentele destinate omului si intre 5 si 100 g g-1 pentru furaje, valoarea variind in functie de animal. Au fost dezvoltate variate tehnici bazate pe PCR pentru detectia si diferentierea speciilor de Fusarium. Acesti fungi au fost diferentiati dupa genele micotoxigenice, dupa alte gene, fie dupa benzi de AND ribosomal sau AND unic rezultat in urma amplificarii AND-ului polimorfic (RAPD). Analiza de restrictie a ADN-ului amplificat prin PCR (PCR-RFLP) s-a folosit la diferentierea unui numar mare de specii de Fusarium. Bateman, Kwasna si Ward (1996) au identificat 18 haplotypes de Fusarium folosind opt enzime de restrictie pentru a taia un produs PCR de aproximativ 600 pb constand in AND ribosomal ITS1, 5,8S si ITS2. Edel et al (1997) amplified furder 600 bp into the 5 end of the 28S rDNA gene, Which includes the variable domains D1 and D2 (fig.1), and were able to distinguish a furder five Fusarium haplotypes. Nici una dintre metode nu a putut diferentia intre ele speciile : Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum si Fusarium graminearum, indicand faptul ca sunt foarte inrudite. Schilling, Mler si Geiger (1996) au secventiat regiunile ITS si au aratat ca regiunile ITS1 ale speciilor Fusarium graminearum si Fusarium graminearum sunt identice, primeri specifici de specie fiind imposibil de

realizat doar pe baza unor diferente minore gasite in regiunea ITS2. Secventiind regiunile variabile la capatul 5 al ADNr 28S s-a determinat ca speciile de Fusarium producatoare de trichothecene pot fi impartite in doua grupuri monofiletice (Nuli et al 1997). Aceste grupuri sunt reprezentate de tipul A si de tipul B producatoate de trichothecene, ambele putand fi usor diferentiate de al treilea grup nonproducator de trichothecene. Un asemenea sistem poate fi folosit pentru identificarea rapida a producatoarelor de trichothecene dintre izolatele de Fusarium neidentificate. Deosebirea filogenetica dintre tipul A si tipul B a fost clarificata printr-un studiu tintit pe reclasificarea identitatii micoproteinei Quorn fungice.