Examenele biologice in

hematologie
Prezentari semiologie anul III
2015-2016

Hematopoieza

Celule
suse
Progenitori limfoizi

CFU-GEMM

MADUVA
OSOASA

BFU-E

CFU-E
Tpo

reticulocite

megacariocite

SANGE
eritrocite

trombocite

monocite

eozinofile
neutrofile

macrofage

bazofile

T
B
limfocite

Investigatiile utilizate in
hematologie
SANGE
Hemograma
Frotiul sanguin
GANGLION (adenopatie)
Punctie gg
Biopsie gg
BIOPSII
Chirurgicale sau cu trocar

MADUVA OSOASA
Mielograma
Biopsie medulara

Tehnici utilizate in hematologie

CITOLOGIE
Citochimie
HISTOLOGIE
sau
ANATOMO-PATOLOGIE

CITOMETRIE IN FLUX
sau
IMUNOFENOTIPARE

CITOGENETICA

BIOLOGIE
MOLECULARA

Hemograma
Hemograma este examenul elementelor figurate din
s^nge (leucocite, eritrocite, trombocite). Hemograma se
realizeaz\ `n dou\ etape una cantitativa [i alta calitativ\ :
Num\r\toarea elementelor figurate din s^nge se
realizeaz\, `n prezent, `n mod automatizat permi]^nd
ob]inerea unei hemograme cu formula sanguin\.
Hemograma con]ine
num\rul de leucocite cu formula leucocitar\,
num\rul de trombocite [i
num\rul de hematii al\turi de hemoglobin\, hematocrit
[i indicii eritrocitari.

La Numration Formule Sanguine (NFS)

Examenul morfologic al elementelor figurate din
s^nge se realizeaz\ prin examinarea la microscop a
frotiurilor de s^nge (ob]inute prin etalarea
s^ngelui pe lame) colorate tip May-GrunwaldGiemsa (MGG). Cu aceast\ ocazie se realizeaz\ o
nou\ formul\ leucocitar\, formula manual\ care
este mai fiabil\ dec^t formula automatizat\.
Puncte din sange venos sau capilar
Prelvare pe anticoagulant : EDTA
Numaratoare automata:
importanta controalelor ++

Valori normale ale hemogramei

Indicii eritrocitari
Indicii eritrocitari utilizeaza rezultatele numaratorii GR,
hematocritului si hemoglobinei - 4 parametri:
Volumul eritrocitar mediu (VEM) reprezinta volumul mediu
al GR in femtolitri (10-15 L)
Ht (in %)/GR (x 1012/L) x 10
La nastere valoarile normale sunt 98-123
La adulti valorile normale sunt intr 80-100
Volumul eritrocitar mediu este folosit pentru clasificarea
globulelelor rosii ca:
Normocitara (80-100)
Microcitara (<80)
Macrocitara (>100)

Indicii eritrocitari
Concentratie medie a hemoglobinei eritrocitare (CHEM)
reprezinta contratia media a hemoglobinei in g/dl (or %)
Hb (in g/dl)/Hct (in %)x 100
La nastere valoarea normala este 30-36
La adulti valoarea normala este 31-37
CHEM este utilizat pentru clasificarea globulelor rosii ca

Normocroma (31-37)

Hipocroma (<31)

Numarul de reticulocite
Numarul de reticulocite indica nivelul
activitatii medulare:
Se efectueaza prin coloratia frotiului de sange
periferic cu albatru de metilen pentru a vizualiza
ribozomii si reticulul endoplasmic.
Numarul de reticulocite/1000 GR este raportata
ca %.
La nastere valorile normale sunt 1.8-8%
Valorile normale l adult (la indivizii fara anemie) sunt
0.5-1.5%.

Numarul de reticulocite
Valoarea relativa a reticulocitelor
% din toate GR (normal 0.8-1.5%)
Valoarea absoluta a reticulocitelor
Valoarea relativa a reticulocitelor x Nr de GR
Normal 50,000-75,000/l
Exemplu:
1.1% x 4.96 x106 = 55,000/ml
12.2% x 2.05 x106 = 250,000/ml

Valori normale ale hemogramei

Frotiul sanguin
Tehnica
Etalarea unei picaturi de sange pe o lama
Coloratie May-Grnwald-Giemsa (MGG)
Analiza la microscop
Indicatii
Diagnosticul anomaliilor morfologice
GR
GA
Trombocite
Cautarea si identificarea de celule anormale
mielemie,
blasti
celules limfomatoase
Verificarea numarului de trombocite ++

Indicatiile hemogramei in
urgenta
Stare de soc
Paloare intensa, astenie,
Angina ulcero-necrotica sau rezistenta la antibiotice
Febra crescuta dupa administrarea de medicamente,
mai ales chimioterapie
Febra rezistenta la antibioterapie
Purpura petesiala, sindrom hemoragic
Sindrom tumoral

Valori ale hemogramei impunand

consultatie specializata de urgenta
Hematocrit peste 60 %
Anemie cu Hb sub 7 g/dl sau rau tolerata
Neutropenie sub 200/mm3 (0.2 G/L)
Hiperleucocitoza cu celule imature peste 20.000/mm3
Trombopenie sub 20.000/mm3 (20 G/L) chiar fara manifestari
hemoragice
Dupa eliminarea unei false trombopenii la EDTA

Mielograma
Punc]ia medular\ reprezit\ tehnica prin care se ob]ine
suc medular care apoi este etalat `n strat sub]ire
pe lame, colorat [i examinat la microscop
(mielograma).
Punc]ia se realizeaz\ cu un trocar special.
Punc]ia se poate executa la nivelul sternului
(manubriumul sternal, pe linia mediana, `n dreptul
primului spa]iu intercostal) sau la nivelul spinei iliace
postero-superioare,
Permite extragerea de m\duv\ osoas\ pentru a o
analiza din punct de vedere cantitativ [i calitativ.

Mielograma
Mielograma
permite
analiza
morfologiei
[i
echilibrului `ntre diferitele popula]ii celulare
prezente `n m\duv\.
Mielograma este realizat\, de principiu, `n cazurile
`n care hemoleucograma a pus in eviden]\ anomalii
cantitative [i/sau calitative ale celulelor sanguine.
Permite aprecierea cantitativ\ [i calitativ\ a diferi]ilor
precursori ai liniilor celulare sanguine [i, eventual,
punerea `n eviden]\ a unor celule anormale (celule
neoplazice metastatice sau bla[ti leucemici).

Mielograma - indicatii
anemii macrocitare
leucocitoze [i leucopenii
prezen]a de celule anormale `n s^nge
splenomegalie, adenopatie,
febr\ inexplicabil\ [i de lung\ durat\
boala Waldestrm (boala limfoproliferativ\).
mielom multiplu.
pancitopenie (scaderea tuturor globulelor din sange
anemie, leucopenia, trombocitopenie), aregenerativ\ f\r\
cauze evidente.
diagnostic de leucemie.
explorarea unei trombocitopenii sau granulocitopenii.

Mielograma
Precautii
operatii pe cord.
radioterapie care
altereaza maduva din
stern.
copii si sugari.
tulbur\ri ale
hemostazei

Trocar tip
Mallarm

Derulare
Anestezie locala
Punctie
Realizare frotiu

Trocar tip
Jamshidi

Bilant medular

Mielograma
Analiza microscopic\ a frotiului de s^nge medular se
desf\[oar\ `n c^teva etape care urm\resc:
Num\r\toarea de megacariocite : num\r\toarea de
megacariocite pe 50 de c^mpuri succesive cu obiectibul 10.
Evaluarea bog\]iei celulare a m\duvei osoase (apreciat\ prin
densitatea celular\ pe c^mp cu un obiectiv microscopic de
100 m\duva normal\ se incadreaz\ `n clasele II-III).
Propor]ia diferitelor linii celulare.
echilibrul `ntre diferitele stadii de maturare `n cadrul
fiec\rei linii celulare, adic\ raportul `ntre celulele tinere (mai
putin numeroase) [i cele mai mature (cele mai numeroase).
Prezen]a de celule str\ine (nonautohtone) `n m\duv\.
Prezen]a de celule blastice, `n propor]ie important\ `n
leucemiile acute.

Linia granulocitara neutrofilica

MB
Mieloblast

PML
Promielocit

ML
Mieocit
MML
Metamielocit

PN
Polinuclrar neutrofil

PROER
Proeritroblast

Linia eritroblastica

ERB
Eritroblast bazofil

ERP
Eritroblast
policromatofil

ERA
Eritroblast acidofil

Biopsia osteomedulara (BOM)

Biopsia osteomedular\ reprezint\ prelevarea unui
fragment osos cilindric care con]ine m\duv\ osoas\,
cu ajutorul unui trocar de la nivelul spinei iliace
postero-superioare permi]^nd un studiu histocitologic.
Se realizeaza in spina iliaca posterosuperioara
Indicatii
Numeroase
Diagnostic si Bilatn de extensie
Analize specializate
Contra-indicatii
Rare
Tulburari grave de coagulare
Trombopenii severe, trombopati

Bilant medular

Bilant medular

Bilant medular

Bilant medular

Bilant medular

Bilant medular

Bilant medular

Bilant medular

Bilant medular

Bilant medular

Adenograma
Organe limfoide
Explorarea liniilor limfoide
Punctia ganglionara
Frotiu

Usor, nedureros, informativ +/-

Biopsii ganglionare
Chirurgicale
Masa tumorala (limfoame)
Ganglion : biopsie ganglionara
Cu acul
Sub scanner
Biopsia Osteo-Medulara (BOM)

Biopsia ganglionara
Prelevarea ganglionului intreg prin tehnica
chirurgicala
Morfologie, cupe histologice
Imunomarcaj pe lame
imunohistochimie
Suspensii de celule
Examen citogenetic
Examene de biologie moleculara

Mieloperoxidaza

Esteraza nespecifica/Dubla
esteraza

Acidul periodic Schiff

Reactia PAS este
intens pozitiva cu
aspect de granule
mari sau blocuri n
limfoblasti.
Reactia PAS este
negativa
sau
pozitiva cu aspect
fin granular, difuz n
mieloblasti.

Citometria de flux

Originea citometriei de flux:

1934: aplicabila celulelor hematologice (numaratoare)

1941: dezvoltarea tehnicilor de anticorpi cuplati

1960: dezvoltarea primelor citometre

Definitie :

Citometria de flux permite studiul precis al celulelor izolate antrenate intr-un flux lichid.
Celulele aliniate una dupa cealalta sant analizate una cate una in timp ce defileaza cu
mare viteza (> 30Km/h) dprin fata unei surse luminoase (un laser).

Interesul:

Este o tehnica rapida care permite caracterizarea :

individuala a fiecarei celule

cantitativa (interes statistic)

calitativa (morfologia celulei si fenotipul sau)

Cluster of differenciation
Clusters of
differenciation (CD)
sunt antigene exprimate
de populatiile celulare ale
sistemului
imunitar
determinand tipul de
celula si eventual functia
sa

Citometria in Flux
Sistem fluidic
Amestec celular heterogen si complex
injectarea suspensiei celulare
Lichid din teaca sub presiune
Intinderea venei lichide
Alinierea si trecerea celulelor una cate una prin camera de analiza

Parametri optici
In camera de analize: impact cu un fascicol LASER
Lumina monocroma coerenta
iluminarea celulelor
Talie relativa: Forward Scatter ou FSC
Complexitate citoplasmatica: Side Scatter SSC
Excitatarea fluorocromilor cu emisia de fluorescenta

Producerea anticorpilor
monoclonali
Antigen
Fuzionarea
celulelor
HIBRIDOM

Mielom

Plasmocite
producatoare de Ac

Testarea clonelor

Cultivarea
hibridoamelor

Hibridoamele se
separa si se cultiva
Mentinerea
hibridoamelor in
soareci

Clonele
dorite se
cultiva sau
se
congeleaza
Anticorpii monoclonali
sunt purificati

Fluorocromii
AcM sunt conjugai cu fluorocromi
Spectru de absorbie (excitaie)
Spectru de emisie
Pentru 2 parametri 2 AcM cuplai cu 2 fluorocromi
cu spectre de emisie diferite:
Izotiocianat de fluorescein (FITC)
Phycoeritrin (PE)

Citometru

Aplicatii
Analiza subpopulaiilor limfocitare
Diagnosticul hemopatiilor maligne
Biologie celular
Identificarea unor molecule HLA
Determinarea unor autoanticorpi
Studiul ciclului i al funciilor celulare
Diagnosticul, evoluia, prognosticul tumorilor maligne
solide
Microbiologie

Citogenetica
Cariotip
Cultura celule
Mitoze
Clasare cromozomi

FISH
Hybridation in situ cu sonde fluorescente

LMC citogenetica
conventionala

Examenul citogenetic (ET)

Biologie Moleculara
PCR : Polymerase Chain Reaction

secventiere

pe ADN
pe ADN complmentar RT-PCR

X2
X2
X2

n Cicluri
=
2n copies

Biologie Moleculara
Cautarea unui echivalent
molecular al translocatiei

14q32
VH DH JH

IgH-Bcl1 si t(11;14)
IgH-Bcl2 si t(14;18)

11q13

120kb

PRAD1/BCL1/CCND1

Cautarea expresiei unei gene

deregulate
Ciclina D1 (t(11;14))
Cauterea unui transcript de
fuziune
BCR-Abl si t(9;22)
RT-PCR cantitativ (RQ-PCR)
pentru urmarirea pacientilor

D1
D2
D3

Cultura de progenitori
hematopoietici
100

75

50

EEC
N
PFCP

25

PV
0

CFU-E

0,001 0,01

0,1

0,2

0,5

EEC = endogenous erythroid colonies

Formarea de colonii eritroide spontane in vitro

Orientare diagnostica
Hiperlimfocitoza sau limfocite atipice

Sdr mononucleozic
Limfom T

Citometrie de flux
CD19+5+
monotipie
Scor 4-5

LLC
tipic :
diagnostic
pozitiv
Imunofenotipic

Monotipie
indoielnica
CD19+5Monotypie
Scor 0-1-2-3
Complements CMF

Scor 1-2-3

LNH de manta
SLPC CD5+
(LLC atipic sau altul)

LNH Foliculair
LNH Zona marginala
Lcu tricoleucocite
LSLV
Lmnh limfoplasmocitar
L. Prolymphocytaire B (Galton)

Examene specializate complementare

Citogenetica
FISH

Biologie
Moleculara

Anatomie
patologica

EXPLORAREA HEMOSTAZEI
PRIMARE
Timpul de sangerare
Testul de fragilitate vasculara (Rumple-Leede)
Numaratoare de plachete
Teste de functionalitate plachetara
Dozarea factorului von-Willebrand
Dozarea fibrinogenului

Timpul de sangerare
Metoda Duke - masoara durata sngerarii dupa o incizie
orizontala la nivelul lobului urechii. Normal : 2-4 minute.
Metoda Ivy-incizie - masoara durata de sangerare la nivelul a
doua incizii pe fata antero-externa a antebratului. Normal : sub 10
min.
Metoda Ivy-3 puncte - ca mai sus dar se fac trei puctii. Normal :
sub 6 minute.

Testul de fragilitate vasculara

(Rumple-Leede)
supravegherea aparitiei de petesii la nivelul
antebratului dupa aplicarea unui garou cu o
presiune egala cu media intre T.sist si T.diast
timp de 5-10 min.
aparitia de peste 10 petesii semnifica test
pozitiv.

Numaratoare de plachete
pe snge venos recoltat pe EDTA sau pe snge capilar recoltat
fara anticoagulant.
manual sau automatic
verificarea pe frotiul din snge capilar poate elimina pseudotrombopenia legata de prezenta de agregate provocate uneori de
EDTA.
pe frotiu se apreciaza morfologia trombocitara pe frotiul de sange
periferic.

Teste de functionalitate
plachetara
Studiul agregarii plachetare
Studiul excretiei granulelor dense
Studiul consumului de protrombina
Adezivitatea trombocitara
Determinarea retreactiei cheagului

Studiul agregarii
plachetare
Agregarea la
ADP
Colagen
acid arahidonic
ristocetina
Anomalii
Deficit de agregare
Deficit de excretie
Anomalia complexului Ib-IXa (Bernard Soulier)

Studiul agregarii
plachetare

Studiul agregarii
plachetare

EXPLORAREA COAGULARII
Teste globale
Timpul de coagulare (Lee-White)
Timpul de recalcifiere a plasmei (Howell)
Timpul de cefalina activata (TCA)
tromboplastina partial activata (aTTP)
Timpul de protrombina (Timp Quick)
Consumul de protrombina (TCP)
Timpul de trombina (TT)
Timpul de reptilaza
Solubilitatea cheagului

sau

timpul

de

Timpul de coagulare
masoara viteza de coagulare a sngelui total, recoltat prin punctie
venoasa ntr-un tub de sticla, in absenta unui anticoagulant.
contactul cu sticla declanseaza calea intrinseca.
normal : TC < 10 min la 37OC.
este un test putin sensibil, n general abandonat.

Timpul de recalcifiere a plasmei

timpul de cogulare a unei plasme oxalatate sau citratate, bogate n
plachete, introdusa ntr-un tub de sticla si recalcificata.
exploreaza factorii de coagulare ai caii intrinseci si commune (V,
VIII, IX, X, XI, XII, fibrinogen) si plachetele.
Normal : TH = 70-120.

Timpul de tromboplastina partial

activata
timpul de coagulare a unei plasme lipsite de plachete, recalcificate
n prezenta unui substitut al lipidelor plachetare (cefalina) si un
activator al fazei de contact (kaolin sau altele).
evalueaza ansamblul factorilor implicati n calea intrinseca.
Normal : TCA = 30+/-6 50+/-10.

Timpul de tromboplastina partial

activata
Este sensibil la

deficitul factorilor de contact (kininogen, prekalikreina, XII, XI),

deficitul n factorii VIII, X, V, II,
fibrinopenii severe,
prezenta de heparine nefractionte,
prezenta de inhibitori dobanditi ai coagularii (anticoagulanti
circulanti)

Este utila in supravegherea tratamentului cu heparine

nefractionte

Timpul de protrombina
timpul de coagulare a unei plasme fara plachete,
recalcificata
n
prezenta
factorului
tisular
sau
tromboplastinei.
Exploreaza factorii coagularii din calea extrinseca (VII) si
comune (factorii X, V si fibrinogen).
Rezultatele sunt exprimate n procent prin raportarea la un
martor indicele Quick (IQ) sau printr-un raport INR
(International Normalised Ratio).
Prezenta de heparina face rezultatul neinterpretabil.

Timpul de protrombina
Este sensibil la
deficitul n factorii VII, X, V, II ereditar/castigat sau asociat
cu deficitul in vitamina K,
fibrinopenii/patii severe,
prezenta de anticoagulante,
CID,
fibrinoliza primara.
Este un test util in supravegherea tratamentului cu
anticoagulante orale din familia anti-vitamine K.

Consumul de protrombina
timpul Quick realizat pe un ser n prezenta de
fibrinogen, la 4 ore de la coagulare.
n mod normal coagularea duce la consumul
protrombinei cu cvasi-disparitia sa din ser iar TQ
realizat mai trziu este alungit, peste 25.
Anomaliile pe calea intrinseca duc la scaderea
consumului de protrombina cu persistena ei si scurtarea
timpului Quick realizat dupa 4 ore de la coagulare.
Testul este alterat in caz de hemofilie (A si B), deficitul
in factori XII, XI, X si V, trombocitopenii/patii

Timpul de trombina

timpul de coagulare a unei plasme dupa introducerea unei

cantitati cunoscute de trombina.
exploreaza etapa finala a coagularii, fibrinoformarea, cu
scurtcircuitarea primelor etape ale coagularii.
Normal : TT = 20-30.
Este influentat de cantitatea si calitatea fibrinogenului, si de
prezenta eventuala a unui inhibitor al fibrinoformarii
(heparina, PDF).

Timpul de reptilaza

timp de coagulare a plasmei n prezenta

reptilazei (un venin de sarpe - Bothrops
Atrox) care transforma fibrinogenul n
fibrina.
spre deosebire de trombina, este insensibil la
heparina, permitnd identificarea cazurilor de
alungire TCA datorita prezentei de heparina.

Solubilitatea cheagului
cheagul rezultat din coagularea plasmei oxalatate prin recalcifiere
este introdus in solutie de uree sau acid monocloracetic.
fibrina normala este insolubila cheagul se mentine peste 24
ore.
in caz de deficit in factor XIII cheagul se dizolva complet in 2-3
ore si respectiv 15 minute.

EXPLORAREA COAGULARII
Teste specifice
dozare factorii XII, XI, X, IX, VIII:C, V, II pot fi
dozati specific n functie de activitatea lor
coagulanta.
dozarea fibrinogenului :
timpul de Stypven - apreciaza factorul 3
plachetar.
alte metode de dozaj

metode cromogene (prekalikreina, II, X, VIII:C, V,

AT III, heparina, proteina C),
metode imunologice - electroimunodifuziune (I, II,
VIII:CAg, IX, AT III, proteina C, proteina S).

EXPLORAREA FIBRINOLIZEI
Teste globale
Timpul de liza a cheagului prealabil diluat
Timpul de liza a euglobulinelor (von Kaula)

Teste specifice
Dozarea plasminogenului
Dozarea activatorilor (t-PA)
Dozarea inhibitori plasmatici ai activatorilor (PAI-1)

Teste indirecte
Dozarea PDF serici
Dozarea D-dimeri Dozarea fragmentelor D, E
Dozarea complexelor plasmina- alfa2-antiplasmina