STRUCTURA

GENELOR

Conf. dr. E.V. GORDUZA

11
 U.M.F IAI

1. GENA - UNITATE DE STRUCTUR A

MATERIALULUI GENETIC

GENA = un segment de cromozom,

precis delimitat, GENA X
continuu (indivizibil), CARACTER
ocup o poziie fix, locus
X

numit locus*
determin un anumit caracter
---------------------------
* Plural = loci Cromozom

2
 U.M.F IAI Polialelie
O gen (A) mai multe mutaii
diferite alele multiple (A1, A2, A3),
GENA
GENE ALELE. POLIALELIE cu efecte fenotipice (N sau An)
Cromozom
limitate la acelai caracter.

PROTEIN Locusul ABO :

alele A1, A2, B i O
CARACTER
mutaie 1 mutaie 2
Culoarea ochilor
(ochi negri)

Gene alele
M1 O gen normal poate M2

Variant / alel suferi o mutaie * ce

Variant / alel
normal produce o variant a anormal
genei numit alel.
ALELA este o form
alternativ a genei.
- ocup acelai locus,
OCHI ALBATRI ALBINISM OCULAR
- influeneaz acelai
caracter*

3
 U.M.F IAI

GENE ALELE. POLIALELIE

Un caracter (fenotip) va fi determinat

de o pereche de gene alele (genotip*)
situate n aceeai poziie (locus) pe
cromozomii omologi.
Genele alele segreg n meioz:
gameii (haploizi) sunt puri genetic
(posed o singur alel);
Genele alele situte pe o pereche de crz.
omologi (ex., Dd) segereg (n meioz)
independent de genele alele situate pe
alt pereche (ex., Mm) formndu-se
gamei cu combinaii genice diferite.
4
 U.M.F IAI

HOMOZIGOT. HETEROZIGOT. HEMIZIGOT

Genele alele (N sau A), ce ocup loci omologi, pot fi :

identice (NN sau AA) HOMOZIGOT
diferite (Na sau An) HETEROZIGOT
( A1A2 ) HETEROZIGOI COMPUI
La brbaii XY o gen autozomal de pe X nu are echivalent
a
pe Y genotip HEMIZIGOT (X Y)

5
 U.M.F IAI

DOMINANT. RECESIV. CODOMINANT

La heterozigoi, genele alele diferite

se pot manifesta fenotipic diferit,
n funcie de "fora" lor de expresie.
Gena i caracterul care se GenotipFenotip
manifest la heterozigoi sunt A1A1 A1
numite dominante. A1A2 A1
Na caracter N Ex., Genele ABO
A1 o A1
An caracter A [(A1>A2)=B]>0
B B B
Gena (a sau n) care NU se B o B
manifest la heterozigoi se A1B A1B
numete recesiv; A2B A2B
ea se exprim numai la
homozigoi (aa sau nn).
Dac ambele gene alele se
manifest fenotipic la heterozigoi
codominante 6
 U.M.F IAI

2. FENOMENELE DE NLNUIRE GENIC (LINKAGE) I

NCRUCIARE CROMOZOMIAL (CROSSING-OVER)

Un cromozom = mai multe gene gene

nealele A

- situate n loci distinci

B
- dispuse liniar ("n monom")
- determin caractere C

Prezena a dou sau mai multe gene

distincte pe acelai cromozom se E
cromozom
numete SINTENIE.

7
 U.M.F IAI
a). NLNUIREA GENIC (LINKAGE)

Genele nealele,
- situate foarte aproape una de alta pe
acelai cromozom, D D

- nu segreg (nu se separ) n meioz i M m

- se transmit mpreun (n bloc) de la

prini la descendeni.
meioz
D
Acest fenomen se numete NLNUIRE D
m
GENIC ("linkage") M

Fenomenul de nlnuire se refer la gamei

LOCI i nu la alele.
Ex., locusul D (pentru o boal genetic)
este nlnuit cu un locus marker (ce are
variantele alelice M i m);
n unele familii alela D este nlnuit cu
8
alela M iar n altele D cu m.
 U.M.F IAI

NLNUIREA GENIC (LINKAGE)

Genele dintr-o regiune cromozomial care se transmit

mpreun formeaz un grup de nlnuire sau un
HAPLOTIP.

gene marker

Ex., genele din

regiunea HLA
(cromozomul 6p)

9
 U.M.F IAI

DEZECHILIBRUL DE NLNUIRE

Uneori o gen mutant (morbid) (B) se

asociaz mai frecvent cu o anumit alel a
locusului marker = asociere alelic
preferenial sau dezechilibru de Hemocromatoza ereditar
nlnuire
Boal ereditar (AR)
frecvent, 1:400
Ex.: 85% dintre bolnavii cu hemocromatoz Absorbie crescut de fier
ereditar (HE) din Europa au o mutaie ce produce acumulare
unic (n codonul 282 din gena HFE) care excesiv de fier n ficat
se asociaz cu alela HLA A3 (ciroz), cord (insuficien
cardiac), pancreas
Explicaie: cei mai muli bolnavi cu HE (diabet), piele
provin dintr-un strmo comun (efect de (pigmentaie bronzat),
fondator) care a avut gena mutant glande endocrine.
asociat cu HLA A3 Gena HFE pe cromozomul
Prezena mutaiei HE a avut efecte benefice 6p lng gena HLA A
n trecut, cnd alimentaia era srac n fier
10
U.M.F IAI

APLICAII PRACTICE A FENOMENULUI DE NLNUIRE GENIC

Diagnosticul (prenatal sau presimptomatic) al

unor boli genetice
prin studiul transmiterii unei gene marker , uor de
identificat, nlnuit cu gena mutant (gena morbid)

11
 U.M.F IAI

Exemplu de DIAGNOSTIC PRENATAL prin

nlnuire genic

INTERSEXUALITATE
PHF prin deficit de
21-hidroxilaz (AR)
12
 Hipofiz Hiperplazie
suprarenalian
Secreie crescut de ACTH
Mecanism de feed-back

SUPRARENAL
negativ

Deficit de 21-hidroxilaz

Blocarea sintezei Blocarea sintezei de Conversia cvasicomplet a

de glucocorticoizi mineralocorticoizi colesterolului n androgeni

Deficit de cortizol Deficit de aldosteron Exces de androgeni

Rspuns inadecvat Pierdere renal de NaCl Masculinizare prenatal a organismelor

la infecii i stress i ap. masculine i feminine
Hipotensiune arterial

13
U.M.F IAI

DIAGNOSTIC PRENATAL
prin nlnuire genic

?
Risc 25%

INTERSEXUALITATE
PHF prin deficit de
21-hidroxilaz (AR)
14
 U.M.F IAI

Diagnosticul prenatal al unor boli genetice:

identificarea mutaiei (aa) la ft posibil dar
presupune cunoaterea prealabil a mutaiei la copilul
bolnav; laborioas i scump
studiul transmiterii unei gene marker , uor de
identificat, nlnuit cu gena mutant (gena morbid)

gena pentru enzima 21 hidroxilaz (CYP21B) este localizat

pe cromozomul 6p i se transmite strns nlnuit cu gena B
a complexului HLA (gen marker cu mai multe alele)

15
 U.M.F IAI

Transmiterea genei mutante pentru 21-hidroxilaz

ntr-o familie i diagnosticul molecular al bolii
(transmis AR) se pot stabili prin analiza genei
marker HLA-B, cu care gena mutant este strns
nlnuit.

?
Risc 25%

16
 U.M.F IAI

Transmiterea genei mutante pentru 21-hidroxilaz

ntr-o familie i diagnosticul molecular al bolii
(transmis AR) se pot stabili prin analiza genei
marker HLA-B, cu care gena mutant este strns
nlnuit.

?
Risc 25%

17
U.M.F IAI

Valoarea diagnostic a nlnuirilor genice dintre un

locus boal i un locus marker a nceput s fie larg
utilizat dup 1980 prin folosirea markerilor ADN
polimorfici .

18
 U.M.F IAI

b). NCRUCIARE CROMOZOMIAL (CROSSING-OVER)

nlnuirea genic NU este un

fenomen absolut numai
D d
genele situate foarte aproape
una de alta se transmit totdeauna
mpreun, nlnuite. M m

Genele situate la distan una

de alta, pe acelai cromozom pot CO Profaza
fi separate prin fenomenul de meioz I

ncruciare cromozomial sau

crossing-over (n profaza
d
meiozei primare). D

M
Gamei m

recombinani 19
 U.M.F IAI

NCRUCIARE CROMOZOMIAL (CROSSING-OVER)

MECANISM CO:
- sinapsa (gen la gen) a
cromozomilor omologi (n zigoten);
- ncruciarea cromatidelor (chiasm);
- ruperea lor la locul de contact +
schimb EGAL de gene
- rezult o nou dispoziie a genelor
parentale = RECOMBINARE GENIC
OMOLOAG.
Recombinarea genic omoloag SURS
IMPORTANT DE VARIABILITATE.

20
 U.M.F IAI

CARACTERISTICILE CO:
Recombinrile genice omologe,
produse n meioz prin CO, sunt
fenomene aleatorii i
imprevizibile;

frecvena de producere a CO ntre

dou gene/ loci este direct
proporional cu distana fizic
dintre ele; aplicaii n
cartografierea genic.

21
 U.M.F IAI

IMPORTANA CUNOATERII CO

CO INEGAL:
mperechere greit a unor secvene
asemntoare dar neomologe, situate
pe cromosomii omologi prin CO
schimbul inegal de segmente
deleii i duplicaii genice.
RECOMBINARE OMOLOAG NEALELIC
BOLI GENOMICE.

22
U.M.F IAI

B. CONCEPIA ACTUAL DESPRE

STRUCTURA GENEI

GENA = un ansamblu liniar de secvene

nucleotidice de ADN necesar pentru a produce
un produs funcional: un polipeptid sau o
molecul de ARN
Gena este o unitate de transcripie.
Genele :
segmente de ADN,
imprecis delimitate
divizibile = structur discontinu
ocup un locus distinct

23
 U.M.F IAI

1. ANATOMIA UNEI GENE CARE CODIFIC

PROTEINE

prezint o regiune central, transcris integral n ARN

mesager precursor, numit "cadrul de lectur" al
informaiei genetice necesar pentru sinteza proteinei;
flancat de dou pri laterale, netranscrise, cu rolul de
a regla expresia genei

24
 U.M.F IAI
ANATOMIA UNEI GENE CARE CODIFIC PROTEINE

1.1.REGIUNEA CENTRAL
Situs de
iniiere al
transcris integral n ARN transcripiei
mesager precursor (ORF*);
codon iniiator
alternana de secvene
codante = exoni i
necodante = introni
ncepe cu:
- situsul de iniiere al
transcripiei (SIR sau
INR) i
- regiunea netrasnlat
5UTR ce se ncheie cu
codonul iniiator ATG
5-CCAGCCATG-3
25
* ORF= open Reading Frame
 U.M.F IAI

REGIUNEA CENTRAL A GENEI

EXONII
secvene transcrise
n pre ARNm i
pstrate n ARNm
matur.
Regiuni codante pt
anumite pri din
protein = domenii.

26
 U.M.F IAI

REGIUNEA CENTRAL A GENEI

INTRONII
(secvene intercalare=IVS)
Secvene necodante
Transcrise iniial n preARNm i
apoi decupate precis i
ndeprtate din ARNm matur,
alctuit numai din asamblarea
exonilor (matisare)
ncep cu 5 GT i sfresc cu
AG 3 semnale pentru
enzimele implicate n matisare
decupare precis.
Rol puin cunoscut intervin
probabil n matisarea
alternativ (selecia anumitor
exoni)
27
 U.M.F IAI

REGIUNEA CENTRAL A GENEI

Regiunea central se
termin cu o secven
3UTR necodant ce
conine:
Unul din codonii stop (TAA;
TAG, TGA)
Situsul de terminare al
transcripiei (AATAAA)
Situsul de poliadenilare
locul de desprindere a
moleculei de ARNm sintetizat
i adugare unui segment
poliadenilic (rol n stabilitatea
i transportul ei din nucleu)
28
 U.M.F IAI
ANATOMIA UNEI GENE CARE CODIFIC
PROTEINE

1.2. REGIUNILE
LATERALE

Flancheaz regiunea
central (ORF)

Netranscrise

Rol de reglare a
transcripiei

29
 U.M.F IAI

ANATOMIA UNEI
GENE CARE
CODIFIC PROTEINE

a). Regiunea lateral 5' - (n amonte de ORF)

3 situsuri:
PROMOTOR
Situs de specificitate tisular
Situs de modulare a activitii genice
Servete la:
iniierea transcripiei - (fixarea ARN polimerazei)
reglarea anumitor gene n anumite esuturi (specificitate tisular),
n anumite stadii de dezvoltare (specificitate temporal) sau la
anumite semnale / stimuli din mediu (ex. hormoni)
Reglarea intensitii transcripiei 30
 U.M.F IAI
REGIUNEA LATERAL
5

PROMOTORUL conine mai multe

elemente sau module pe care se
ataeaz proteine reglatoare
(trans-activatoare) numite factori de
transcripie (TF II);

TF se fixeaz la miezul promotorului

(TATA; CAAT; GC) i are rolul s
fixeze, s poziioneze i s
activeze ARN polimeraza II, astfel
ca transcripia s nceap exact la
SIT, cu primul nucleotid (+1)
Ali TF regleaz specificitatea
tisular, rspunsul la semnale i
intensitatea transcripiei
31
U.M.F IAI

b. REGIUNEA LATERAL 3

Regiunea lateral 3' - situat n aval de cadrul de

lectur al genei.
o secven netranscris, imprecis delimitat i
cunoscut,
rol structural i funcional.
n aceast regiune se gsesc secvene semnal care
afecteaz procesarea, stabilitatea i durata de via a
ARNm.

32
 U.M.F IAI

2. TIPURI DE GENE

2.1. Gene comune i gene

2.2. Gene unice i familii de gene
specifice
Gene comune - ubicuitare
(housekeeping genes)
Se exprim n toate celulele.
Codific proteine
indispensabile funciilor celulare
fundamentale.
Trasncripie continu, la nivel
sczut.
Gene specifice:
Expresie limitat spaial
(anumite esuturi / celule) sau
temporal (anumite stadii)
Codific proteine specifice
Majoritatea genelor sunt unice,
puine sunt duplicate
Unele copii ale genelor unice
sunt nefuncionale (gene
trunchiate; fragmente de gene;
pseudogene)
Familii de gene:
Au o structur identic
Produc proteine asemntoare
Au o origine comun (prin
duplicaia unei gene ancestrale
33
 U.M.F IAI

C. METODE DE CLONARE I ANALIZ A GENELOR

(TEHNOLOGIA ADN)

Pn n 1970 genele erau entiti materiale inaccesibile analizei

directe :
dimensiuni foarte mici
imposibilitatea obinerii unei cantiti suficiente de material pentru
studiu.
Dup 1970 s-au descoperit:
enzimele de restricie, veritabile "bisturie" genetice, cu ajutorul crora
a devenit posibil secionarea ADN i izolarea genelor*.
tehnici de amplificare a unui fragment specific de ADN = clonarea
genelor (celular sau acelular PCR)**.
tehnici de analiz i secveniere*
34
U.M.F IAI

TEHNOLOGIA ADN
a ianugurat era ingineriei
moleculare cu multiple i
importante aplicaii practice:
analiza structurii, cartografierii
lu funciei genelor;
elucidarea patogeniei bolilor
genetice i dobndite (infecii,
cancere);
diagnosticul bolilor:
preimplantator, prenatal,
presimptomatic;
biosinteza unor molecule
terapeutice (insulin, hormon de
cretere, eritropoietin etc)
tratamentul bolilor genetice i
terapia genic 35
 U.M.F IAI

1. CLONAREA ADN

Clonarea ADN este amplificarea selectiv a unei

gene sau fragment de ADN prin multiple runde de
replicare care vor produce un numr mare de copii a
fragmentului respectiv, ce vor permit analiza structurii i
funciei sale.
2 tipuri majore de clonare:
Celular, in vivo, utilizeaz mecanismul natural de replicare
a unor fragmente de ADN obinute prin diferite metode i
introduse cu ajutorul unor vectori (plasmide, bacteriofagi,
cromozomi artificiali) n celule gazd (bacterii, levuri)
Acelular, in vitro, folosind o reacie de plomerizare n lan
(PCR)
36
 U.M.F IAI

1.1. OBINEREA UNOR GENE SAU

FRAGMENTE DE ADN

Trei metode:

(1). Secionarea ADN

genomic, cu ajutorul
enzimelor de restricie;

Enzimele de restricie (Pr.

Nobel, 1978) recunosc i taie
ADN la nivelul unor secvene
nucleotidice specifice
(situsuri de restricie)
producnd fragmente de ADN
cu capete adezive.
37
 U.M.F IAI

OBINEREA UNOR GENE SAU FRAGMENTE DE ADN

(2). Obinerea de ADN

complementar unei
molecule de ARNm, cu
ajutorul transcriptazei
inverse

Transcriptaza invers (Pr.

Nobel, 1975) sintetizeaz o
caten de ADNc pe baza unei
molecule de ARNm extras din
celule.

38
 U.M.F IAI

OBINEREA UNOR GENE SAU FRAGMENTE DE ADN

(3). Sinteza artificial (chimic)

a unor fragmente de ADN
prin polmerizarea dezoxiribo-
nucleotidelor ntr-o ordine
determinat anterior (de ex.,
pe baza secvenei de
aminoacizi i codului genetic).

Fragmentele de ADN vor fi

utilizate ca sonde sau amorse n
alte tehnici.

39
 U.M.F IAI

1.2. CLONAREA ADN N CELULE

Clonarea ADN in vivo utilizeaz

mecanismul natural de replicare
al ADN n celule
Ea permite multiplicarea unor
segmente de ADN introduse n
celule cu ajutorul unor vectori
formarea ADN recombinant, prin
ataarea in vitro a fragmentelor
de ADN uman la "un vector sau
replicon " capabil de replicare
independent;
transferarea moleculelor de
ADN recombinant n celule
gazd, n care vectorul
recombinant se replic
independent de cromosomul
celulei gazd;
amplificarea sau producerea de
clone celulare multiple.
izolarea clonelor de ADN
recombinant.
40
 U.M.F IAI

1.3. CLONAREA ACELULAR A ADN (metoda PCR)

Folosete tehnica "polymerase

chain reaction" (PCR) (Mullis i
Smith; Premiul Nobel, 1993)
se poate amplifica selectiv o
secven scurt de ADN sau ARN.
Amplificarea se realizeaz pe baza
principiului extensiei unei amorse
("primer").
PCR este o reacie n lan deoarece
catenele de ADN nou sintetizate
vor aciona ca matrie pentru
sinteza ADN n ciclurile urmtoare.
Amplificarea este considerabil (de
miliarde de ori) i rapid (n cteva
ore), fiind integral automatizat.
41
 U.M.F IAI

2. METODE DE ANALIZ A ACIZILOR NUCLEICI

n medicina practic analiza direct a genei sau

produselor sale este folosit pentru:

studiul patologiei moleculare;

diagnosticul genotipic prenatal sau presimptomatic al
unor boli, chiar i atunci cnd gena i efectele ei nu sunt
cunoscute sau nu sunt evidente;
recunoaterea unei infecii virale.

42
U.M.F IAI

METODE DE ANALIZ A ACIZILOR NUCLEICI:

PRINCIPII

Pentru a identifica o gen este necesar o

sond genotipic adecvat care s permit:
fie recunoaterea genei (sonde directe)
fie recunoaterea unor markeri genotipici (secvene
necodante) situai n vecintatea genei (sonde
indirecte).

Aceast recunoatere se realizeaz pe

principiul hibridizrii moleculare a acizilor
nucleici.
43
 U.M.F IAI

METODE DE ANALIZ A ACIZILOR NUCLEICI:

PRINCIPII

Hibridizarea molecular se bazeaz pe capacitatea unor

sonde monocatenare de acid nucleic de a forma, pe
baz de complementaritate, molecule bicatenare cu o
secven de acid nucleic int (monocatenar).

Fragment ADN:
...T T A T A C G G T C A T C G T C G C A T G C T A G

A T* G C C A*G T A
Sond oligonucleotidic marcat

Pentru a identifica i izola hibridul molecular sonda este

marcat cu un trasor radioactiv (32P) sau cu un compus
fluorescent.
44
 U.M.F IAI

METODE DE ANALIZ A ACIZILOR NUCLEICI:

TEHNICI

a).Analiza ADN genomic uman

prin metoda de transfer
Southern
b). Analiza cu sonde oligo-
nucleotidice specifice unei
alele (ASO) (dot blot).
c). Analiza ARNm prin Northern
blot.
d). Analiza proteinelor prin
Western blot.
e) Secvenierea unor gene
45