Cap 6

CAPITOLUL
Cap.6 REGENERAREA HEPATIC Mihaela PAN, Irinel POPESCU
REGENERAREA HEPATIC
Mihaela PAN, Irinel POPESCU
1. INTRODUCERE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .155 2. BIOLOGIA REGENERRII HEPATICE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .155 2.1. Bazele moleculare ale regenerrii hepatice . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .158 2.1.1. Expresia genic n timpul regenerrii hepatice . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .158 2.1.2. Faza precoce a activrii genice . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .159 2.1.3. Activarea factorilor de transcripie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .159 2.1.4. Genele cu expresie tardiv . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .159 2.1.5. Expresia genelor ciclului celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .160 2.1.6. Factorii de cretere i citokinele care influeneaz regenerarea hepatic . . .160 2.1.7. Factorul de cretere hepatocitar (hepatocyte growth factor HGF) . . . . . . . .161 2.1.8. Factorul de cretere transformant alfa (transforming growth factor alpha TGF ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .161 2.1.9. Citokinele . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .162 2.1.10. Iniierea hepatocitelor pentru replicare . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .162 2.1.11. Angiogeneza n regenerarea hepatic . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .162 2.2. Mecanismele de reglare a regenerrii hepatice i factorii care o influeneaz . . . .163 3. MODALITI DE EVALUARE I URMRIRE A REGENERRII HEPATICE . . . . . . . . .164 4. MODELE DE REGENERARE HEPATIC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .165 4.1. Regenerarea hepatic dup agresiunea chimic . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .166 4.2. Regenerarea dup hepatectomii . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .166 4.3. Regenerarea hepatic n cazul transplantului de ficat parial (split, living-donor) . . . .168 4.4. Anatomia vascular a regenerrii hepatice pe ficatul rezecat . . . . . . . . . . . . . . . . .169 4.5. Regenerarea hepatic dup ocluzia de ram portal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .169 BIBLIOGRAFIE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .172
ABREVIERI ALT ALRf
= alanin-aminotransferaza = factorul de amplificare a regenerrii hepatice (amplificating liver regeneration factor) AP 1 = proteina activatoare 1 (activating protein 1 ) cdk = kinaze dependente de ciclin (cyclin dependent kinases) c-fos, c-myc, c-jun = protooncogene EGF = factorul de cretere epidermal (epidermal growth factor) HB-EGF = heparin binding EGF HGF = factoruL de cretere hepatocitar (hepatocyte growth factor) HSS = substana stimulatoare hepatic (hepatic stimulatory substance) IL-6 = interleukin 6 KGF = factorul de cretere keratinocitic (keratinocytic growth factor) Ki 67 = epitop al unui antigen nuclear MAP kinaze = fosfokinaze mitogen-activate (mytogen activated phosphokinases) NFkB = factorul nuclear kB (nuclear factor kB) PCNA = antigenul nuclear al proliferrii celulare (proliferating cell nuclear antigen) REPFR = rata estimat a parenchimului hepatic funcional restant rtPCR = reacie de polimerizare n lan cu ajutorul reverse-transcriptazei (reverse transcriptase polymerase chain reaction) STAT 3 = traductorul de semnal i activatorul transcripiei (signal transducer and activator of transcription) TGF = factorul de cretere transformant (transforming growth factor) TNF = factorul de necroz tumoral (tumor necrosis factor) TNFR 1,TNFR 2 = receptori pentru TNF VEGF = factorul de cretere al endoteliului vascular (vascular endothelial growth factor) VEGFR = receptorul pentru VEGF
Irinel POPESCU - CHIRURGIA FICATULUI
1. INTRODUCERE Capacitatea ficatului de a se regenera este menionat nc din cele mai vechi timpuri. Mitul lui Prometeu, n care apare ideea regenerrii perpetue a ficatului, arat c anticii intuiau sau chiar cunoteau acest fenomen. n epoca modern, probabil Cruveilhier (1833) a fost primul care a introdus ideea regenerrii hepatice.1 Ulterior, numeroi cercettori au artat c ficatul mamiferelor are capacitatea unic de a-i regla creterea masei i dimensiunilor sale dei, din punct de vedere al diviziunii i proliferrii celulare, se afl n mod normal n stare dormant (latent). n 1886, K. Podwyssozki a creat conceptul morfologic de proliferare celular. Pe lng aprecierea secvenelor de timp n activitatea mitotic, el a observat i formarea tardiv de canaliculi biliari, n procesul de regenerare. Mai trziu, ali cercettori, printre care H. Tillmans, E. Ponfick, K. Adler i mai ales L.S. Milne, au realizat o serie de experimente care pot fi considerate baza cunotinelor actuale despre morfopatologia regenerrii hepatice.2 Desigur, cele mai multe cunotine provin din studii efectuate pe animale (n special pe oareci), avnd la baz diverse modele experimentale. Protocolul cel mai utilizat este cel n care se realizeaz o hepatectomie parial. Cercetrile moderne, bazate pe aceste modele experimentale n mare parte, se concentreaz asupra influenelor umorale, modulatorii, stimulatorii i inhibitorii, care intervin n reglarea procesului de proliferare hepatocitar.
2. BIOLOGIA REGENERRII HEPATICE Din punct de vedere anatomo-funcional, procesul de regenerare tisular semnific nlocuirea unui esut pierdut. Abilitatea diverselor specii de a-i regenera esuturile i organele este cu att mai mare cu ct poziia n schema filogenetic este mai joas. Capacitatea de regenerare a esuturilor depinde de tipul de organ implicat i este invers proporional cu vrsta individului i diferenierea tisular (cu ct esutul este mai specializat, posibilitatea regenerrii este mai mic). n cazul mamiferelor, regenerarea tisular semnific refacerea esutului pierdut printr-un proces de hipertrofie (creterea dimensiunilor celulare i a coninutului proteic n timpul perioadei prereplicative) i hiperplazie (creterea numrului de celule) a esutului restant.
Regenerarea hepatic postrezecie difer semnificativ de procesul de vindecare a plgilor din alte organe; difer i de regenerarea adevrat, ntlnit la amfibieni, dup amputarea unui membru. n cazul regenerrii adevrate la caudate, n care se reface membrul pierdut, apar fenomene de transdifereniere celular.3 n prezent exist studii asupra fenomenului de transdifereniere a celulelor stem i la mamifere, dar concluziile acestora sunt controversate. Dup rezecii, proliferarea esutului hepatic se produce prin expansiunea segmentelor restante, cu refacere funcional deplin dar cu o anatomie modificat. Pe lng hipertrofia i hiperplazia hepatocitar, creterea masei hepatice se face i pe seama tumefaciei celulelor reticuloendoteliale i a spaiului interstiial. Att la animale ct i la om, hepatocitele au, n mod normal, o rat de proliferare foarte sczut, o rat a apoptozei neglijabil i un timp de via foarte lung. Din aceste motive ficatul este considerat un esut stabil, fiind caracterizat printr-un proces redus de pierdere i rennoire celular. n schimb, n cazul unor pierderi majore care necesit refacere tisular, diferitele tipuri de celule care alctuiesc ficatul sunt capabile s se divid i s prolifereze rapid. Studiile de repopulare celular prin transplantri seriate au demonstrat c hepatocitele au o capacitate remarcabil de proliferare i pot suferi pn la 80 de diviziuni celulare. Dat fiind acest potenial de replicare, nu mai este surprinztor faptul c n anumite condiii ele pot prolifera. Regenerarea ficatului a fost studiat ndelung la animale (n special la obolani), utiliznd modele de hepatectomie parial sau de lezare toxic a ficatului. De asemenea, regenerarea hepatic mai poate aprea ca rspuns la pierderi celulare hepatice prin agresiuni fizice, infecioase sau chimice, n scopul meninerii unei funcii hepatice normale. O parte din leziunile observate la om n bolile hepatice cronice au fost reproduse experimental la obolan i la oarece. Spre exemplu, administrarea unei doze toxice de tetraclorur de carbon produce necroz central a lobulului, cu distrugerea a 1/3-1/2 din fiecare lobul. n acest caz apare numai distrugerea celulelor hepatice parenchimatoase, sinusoidele ramnnd intacte. n consecin, circulaia sngelui prin lobul este normal. Celulele centrale afectate se autolizeaz iar cele rmase prolifereaz rapid, reconstituind arhitectura normal a lobulului n 5-6 zile. Dac agentul hepatotoxic este administrat n mod repetat, n timp ce regenerarea i urmeaz cursul, se va constitui o nou leziune,
155
Mihaela PAN, Irinel POPESCU - REGENERAREA HEPATIC
nainte ca cea veche s fie vindecat. Astfel, apare fibroza extins, comparabil cu cea observat n ficatul cirotic. Experimentele efectuate argumenteaz faptul c, dup lezarea chimic sau fizic, hepatocitele din orice zon a acinului pot prolifera. Interesant este c, n acest caz, celulele stem nu par s aib un rol important. Ele intervin atunci cnd afectarea hepatic este foarte sever i cnd proliferarera hepatocitar este blocat. Se tie c la animale capacitatea de regenerare este de regul invers proporional cu mrimea corpului acestora. La roztoare, dup rezecia a 2/3 din ficat, regenerarea aproape complet are loc n aproximativ o lun. O regenerare la fel de rapid i complet are loc dup distrugerea unei pri importante a fiecrui lobul, consecutiv administrrii de hidrocarburi clorurate. La om, dei ficatul are o capacitate de regenerare important, ea este cu mult mai modest dect la animalele de laborator. Regenerarea hepatocitelor umane este mai lent, ncepe la 3-5 zile dup rezecia de ficat (sntos) i dureaz aproximativ 6 luni pentru a reface masa normal a ficatului. Unele studii raporteaz recuperarea complet chiar la 3 luni postrezecie.4 n ceea ce privete proliferarea hepatocitar n funcie de tipul celulelor implicate, nu exist diferene n potenialul de replicare. Ficatul noului-nscut conine numai celule diploide, dar celulele binucleate i poliploide apar rapid dup natere. La vrsta de trei luni, ficatul de obolan conine cel mult 10-20% celule diploide. La aceast vrst, majoritatea hepatocitelor sunt tetraploide, mono- sau binucleate dar exist ntr-un procent mic i celule octoploide binucleate. Dei pare surprinztor, hepatocitele diploide, tetraploide i octoploide au potenial identic de repopulare a ficatului distrus.5 Aceste fapte sunt argumentate de studii care au artat c proliferarea hepatocitar are loc att prin diviziunea mitotic a celulelor mononucleate ct si prin citokineza celulelor binucleate, dup replicarea ADN n ambii nuclei.6 n privina distribuiei spaiale a proliferrii hepatocitare n timpul regenerrii, observaiile experimentale au dus la concluzia c celulele periportale prolifereaz mai rapid i mai frecvent dect celulele perivenoase. Acest fenomen se datoreaz mai degrab unei mai mari capaciti proliferative intrinseci i a unui micromediu diferit, teorie susinut de experimentele n care s-a utilizat inversarea fluxului sanguin prin lobulul hepatic. Iniial, proliferarea celular este mai intens n zona I (periportal) a lobulului. S-a observat c prolifereaz n special celulele situate n apropierea, dar nu
cele adiacente tractului portal (acestea din urm au o rat sczut de replicare). Hepatocitele cu nivelul cel mai sczut de replicare sunt situate n zona III, nconjurnd vena centrolobular. Odat ce procesul de regenerare progreseaz, distribuia celulelor care prolifereaz devine ntmpltoare, desfurndu-se n ntregul lobul. Au fost sugerate mai multe modele de distribuie a proliferrii celulare. Ipoteza curentului, cea care a fost cel mai mult discutat, susine migrarea celulelor care prolifereaz din zona I ctre zona III a lobulului. Aceast ipotez este infirmat ns de observaiile experimentale recente. Explicaia cea mai plauzibil pentru distribuia zonal a proliferrii celulare n cursul regenerrii hepatice este aceea c celulele din zona I au o durat a fazei G1 a ciclului celular mai scurt dect cele din zonele II, III.7 Analiza expresiei imediate a genelor precoce a artat faptul c activarea acestora, la nceputul regenerrii hepatice, apare mai mult sau mai puin simultan la celulele din ntregul lobul. Variabilitatea lungimii fazei G1 a ciclului celular, asociat cu poziia celulei n lobul, poate fi consecina activrii intracelulare difereniate a ciclinelor i a kinazelor dependente de cicline (cdk). Aceste enzime sunt implicate n progresia ciclului celular. n ceea ce privete pierderea de esut, exist totui un prag de deficit tisular care determin proliferarea celular i regenerarea esutului. De exemplu, la obolanul adult (nu i la cel nou-nscut) acest prag de pierdere tisular este de 30%; o pierdere mai mic de 30% nu determin o regenerare rapid ci doar o proliferare uoar i o replicare hepatocitar asincron.8 La cealalt extrem, hepatectomiile care implic mai mult de 80% din esutul hepatic nu induc o regenerare eficient i sunt asociate cu o rat crescut a mortalitii, prin apariia insuficienei hepatice fulminante. Att la obolani ct i la oareci, creterea hepatic nceteaz atunci cnd masa ficatului regenerat atinge aproximativ 10% din masa hepatic iniial (nainte de hepatectomie).6 Dup o rezecie hepatic la om, ca i la animale, prile rezecate din ficatul uman nu cresc din nou ci sunt compensate de creterea segmentelor restante. Principiile care guverneaz regenerarea hepatic la om par s fie similare cu cele de la roztoare. nelegerea acestor principii a dus deja la aplicaii clinice importante, cum ar fi transplantul hepatic living-related (de la donator viu) sau transplantul split-liver (cu ficat mprit). Arhitectura esutului de regenerare este diferit de cea a esutului normal, n ceea ce privete distribuia hepatocitelor i organizarea acestora. Cordoanele hepatocitare nu mai apar cu aceeai structur ca n ficatul normal (Fig.1). Noile hepatocite replicate formea-
156
Fig.1.Preparat din esut hepatic uman adult de regenerare obinut prin rezecie hepatic iterativ. Coloraie Van Gieson; Mrire X 200; Se observ dezorganizarea complet a arhitecturii hepatocitare. (Colecia dr. V. Herlea).
Fig.2 Preparat din esut hepatic uman adult de regenerare, obinut prin rezecie hepatic iterativ. Coloraie Hemalaun-Eozina Mrire X 400 Se observ dispoziia anarhic a hepatocitelor, elemente de hematopoiez a - eritroblast policromatofil; b -eritroblast bazofil; c - limfoblast; d - eritroblast acidofil i hepatocite de regenerare, cu nucleu mare eucromatic, unele fiind binucleate. (Colecia dr. V. Herlea).
z aglomerri celulare, iniial n aria periportal i ulterior n regiunea centrolobular. Celulele endoteliale invadeaz grupurile de celule i formeaz noi sinusoide. A fost semnalat i aparitia hematopoiezei n ficatul de regenerare adult posthepatectomie, prin identificarea unor celule progenitoare hematopoietice. n Fig.2 se observ, pe lng dezorganizarea hepatocitar, i cteva elemente celulare de eritropoiez. Dup hepatectomie, pe lng modificrile hepatocitare, apar i modificri ale expresiei componentelor matricei extracelulare. Acestea preced i nsoesc proliferarea celular. Creterea plasminei i a activatorului tisular al plasminogenului, de tip urokinaz, i creterea degradrii fibrinogenului apar rapid i persist cteva ore dup hepatectomiile pariale.9,10 Transcrierea
genic a inhibitorului tisular al metaloproteinazelor de tip I crete foarte mult n timpul replicrii maxime a ADN i se produce mai ales n celulele mezenchimale portale i perisinusoidale.11 Transcrierea genic pentru procolagenul tip 1 i 2 apare dup ncetarea replicrii ADN i este asociat cu creterea seric a peptidului aminoterminal al procolagenului 3. Finalizarea sintezei de matrice extracelular se produce odat cu reapariia strii de esut dormant. Dup rezeciile hepatice apar rapid i modificri n volumul hepatocitelor restante. Se pare c acest fapt se datoreaz activrii unui sistem A de transport transmembranar al aminoacizilor, cu creterea alaninei intracelulare i a influxului de ap, concomitent cu efluxul de cloruri. Apar de asemenea i modificri ale potenialului de membran al hepa-
157
tocitelor, fiind observate att hiperpolarizarea ct i depolarizarea.12 n ciuda capacitii lor replicative n anumite condiii, hepatocitele rmn normal nite celule dormante. Astfel s-a nscut ideea c replicarea hepatocitar este supresat activ n ficatul normal i c mecanismele represorii dispar n anumite condiii (cum ar fi de exemplu rezecia hepatic). Din pcate, n ciuda progreselor fcute pentru nelegerea iniierii i ncetrii procesului de regenerare hepatic, se tie nc foarte puin despre mecanismele care le determin. nelegerea mecanismelor intime ale procesului de regenerare hepatic depinde ntr-o mare msur i de posibilitile tehnice de evideniere a acestui proces. Hipertrofia hepatic poate fi evaluat prin determinri volumetrice (tomografie computerizat), msurtori morfometrice, microscopie optic i electronic i tehnici izotopice. Diviziunea celular se poate evidenia prin aprecierea sintezei de ADN i prin identificarea mitozelor celulare. Cunotinele acumulate din analiza evenimentelor celulare i moleculare ce apar n timpul regenerrii vor fi cu siguran utile pentru intervenii terapeutice complexe. Studiul i nelegerea mecanismelor de iniiere a regenerrii hepatice i analiza efectelor factorilor de cretere vor contribui la stabilirea unor metode de accelerare a creterii ficatului transplantat (n transplantul cu ficat parial). Deja au fost nregistrate progrese n ceea ce privete transplantul de celule, terapia genic i ficatul artificial.13,14
celulare. Construcia telomerelor depinde de telomeraz, aceast enzim nefiind exprimat n mod normal de celulele hepatice adulte ci doar de cele aflate n replicare. Se tie c celulele maligne i cresc expresia telomerazei, fiind de altfel un marker al transformrii maligne precoce. n diviziunea celular apar dou evenimente distincte: diviziunea nucleului (kariokinez) i diviziunea citoplasmei (citokinez). n ceea ce privete kariokineza, ciclul celular pe care l parcurge o celul ce se divide, este format din interfaz i mitoz. Interfaza se mparte n trei stadii: G1 (first gap), S (faza de sintez) i G2 (second gap). Activitatea de sintez a unei celule nu este constant continu. Astfel, n timpul mitozei nu apare sinteza de ADN sau de proteine. Pe de alt parte, n interfaz, sinteza de ADN este limitat doar la o scurt perioad a ciclului celular, pe cnd sinteza proteic are loc permanent. Replicarea ADN are loc n faza S iar sinteza de proteine necesare mitozei (histone), are loc n faza G2. Durata ciclului celular i a stadiilor sale variaz mult n funcie de tipul celular. Celulele care se opresc naintea fazei S, deci incapabile s se divid, sunt cele aflate n faza G0 (stadiul n care se gsesc celulele dormante sau n repaus din punct de vedere al diviziunii celulare).15 Dup cum am menionat anterior, hepatocitele se afl normal ntr-un stadiu latent. Iniierea regenerrii hepatice nseamn declanarea proliferrii hepatocitelor dormante, aflate n faza G0, care sunt determinate s intre n ciclul celular. n timpul acestui proces are loc activarea i expresia mai multor tipuri de gene rspunztoare de creterea i funcia celulelor hepatice, printr-o derulare de etape, care se succed n cascad. 2.1.1. Expresia genic n timpul regenerrii hepatice Regenerarea hepatic poate fi privit simplificat ca un proces ce se desfoar n mai multe etape. Dup declanarea de ctre un stimul (spre exemplu hepatectomia parial), se activeaz un numr foarte mare de gene, printre care cele mai importante sunt: gene ale ciclului celular, gene metabolice, gene care codific proteinele matricei extracelulare, factori de cretere, citokine i factori de transcripie. Expresia genic n timpul regenerrii hepatice poate fi mprit n mai multe faze, care includ: expresia genelor precoce (imediate) cele care se activeaz primele, proteinele corespunztoare lor declannd expresia altor gene, a genelor cu activare tardiv n perioada imediat i a genelor ciclului celular.16 Expresia acestor gene este controlat de factori transcripionali, citokine i factori de cretere. Aceti factori reglatori sunt la rndul lor modulai prin ci de transducie de semnal, prin care
2.1. Bazele moleculare ale regenerrii hepatice Meninerea funciei ficatului n timpul regenerrii necesit proliferare hepatocitar, dar i susinerea funciilor celulare hepatice. Aceasta se reflect n expresia genelor rspunztoare de creterea i funcionalitatea celulelor hepatice n timpul procesului regenerativ. Dup hepatectomia parial sau lezarea toxic hepatic, rspunsul regenerativ este orchestrat de aciunea mai multor citokine i factori de cretere. Acestea duc la amplificarea expresiei genelor rspunztoare de proliferare i la creterea telomerelor (secvene repetitive de ADN aflate n poziiile terminale ale cromozomilor, i care i protejeaz de digestia enzimatic). Este prevenit astfel pierderea de ADN care ar influena negativ capacitatea de replicare. Telomerele sunt implicate n oprirea procesului de replicare i se tie c scurtarea lor este rspunztoare de mbtrnirea celular i imposibilitatea diviziunii
158
sunt recepionate i transmise semnalele necesare replicrii celulare. Factorii de transcripie sunt proteine care se leag de situsuri de recunoatere specific la nivelul genelor, pentru a iniia sau amplifica activarea acestora. O prim etap implic activarea n principal a unor factori de transcripie. Aceast etap este reversibil i nu este suficient pentru a determina replicarea ADN i proliferarea celular. O mare importan o are iniierea celular (priming); este necesar pentru a face hepatocitele complet responsive la aciunea factorilor de cretere, n special a factorului de cretere hepatocitar (hepatocyte growth factor HGF) i a factorului de cretere transformant (transforming growth factor TGF) (care se exprim intens n timpul regenerrii hepatice). Odat ce au intrat n ciclul celular i trec de punctul de restricie din G1, hepatocitele sunt angajate ireversibil ctre replicare. Expresia ciclinei D1 reprezint un marker important pentru aprecierea momentului cnd celulele capt autonomie n procesul de replicare i nu mai necesit aciunea factorilor de cretere.17 2.1.2. Faza precoce a activrii genice Genele precoce imediate sunt activate foarte rapid dup hepatectomia parial (1-3 ore) i activarea lor nu necesit sintez proteic. Printre primele gene activate se numr protooncogenele c-fos, c-myc i c-jun.18,19 Acestea acioneaz ca reglatori transcripionali. Principalii factori de cretere influenai de aceste gene sunt HGF i TGF i . Genele c-fos i c-jun, care sunt transcrise imediat n faza precoce, codific uniti proteice ale proteinei activatoare 1 (activating protein 1 AP-1). Analiza expresiei genice la nceputul regenerrii hepatice, prin metode de hibridizare, a artat c mai mult de 70 de gene pot participa n rspunsul imediat.20 Este posibil ca o mare parte din aceste gene s fie gene metabolice, nelegate direct de replicarea ADN. Reglarea genei c-myc a fost n mod particular studiat n regenerarea hepatic, n special la oarecii transgenici.21 S-a observat astfel c deficitul concomitent al genelor c-myc i c-jun determin moarte embrionar. Deficitul de exprimare numai al genei c-myc determin defecte cardiace i de tub neural, iar cel al genei c-jun, separat, determin un defect major n hepatogenez. Mai mult, deficitul homozigot c-jun previne colonizarea hepatic cu celule stem embrionare la oarecii himerici, demonstrnd faptul c c-jun are o funcie esenial n dezvoltarea hepatic.22 2.1.3. Activarea factorilor de transcripie Factorii de transcriptie care sunt rapid activai dup hepatectomie includ factorul nuclear kB (nuclear factor
kB NFkB), traductorul de semnal i activatorul transcripiei (signal transducer and activator of transcription STAT 3) i AP-1.23 Importana acestor factori deriv din capacitatea lor de a se lega de gene multiple care conin secvene specifice de recunoatere i consecutiv activeaz transcripia genelor int. n consecin, un singur stimul care acioneaz asupra unui singur factor de transcripie poate duce la activarea i transcripia mai multor gene. O importan particular pentru activarea genelor precoce o au factorii NFkB i STAT 3. Acetia sunt activai n primele ore dup hepatectomie. Factorul de necroz tumoral (tumor necrosis factor TNF) este unul dintre cei mai importani activatori ai NFkB n ficat. Translocarea n nucleu a NFkB i legarea sa de ADN determin expresia a mai mult de 12 gene implicate n rspunsul imediat. Activarea NFkB este necesar att pentru dezvoltarea ct i pentru regenerarea hepatic. n hepatocitele i celulele ovale (celule progenitoare hepatice bipotente) din culturi, blocarea factorului NFkB determin apoptoz n celulele expuse la aciunea TNF. Inhibarea NFkB n timpul regenerrii hepatice determin apoptoz masiv i inhib replicarea celular.24 Rolul esenial al NFkB a fost evideniat prin studii pe oareci knock-out pentru TNFR 1 sau TNFR 2 (receptori pentru TNF).25,26 Lipsa TNFR 2 nu a determinat modificri n legarea NFkB n sinteza de interleukin 6 (IL-6), n activarea STAT 3 sau n replicarea ADN hepatocitar, dup hepatectomie. n schimb, lipsa TNFR1 a dus la legarea deficitar a NFkB, la producie sczut de IL-6 i la nivele sczute de replicare ADN. La aceste animale, o singur injecie de IL-6 a corectat deficitul de replicare ADN i de activare a STAT 3. IL-6 este o gen int pentru NFkB, care este un inductor puternic al activrii STAT3. Aceste date sugereaz faptul c semnalizarea prin TNFR1, care duce la activarea STAT 3 i activarea NFkB cu sinteza consecutiv de IL-6, este un mecanism prin care este iniiat regenerarea hepatic dup hepatectomie.27 2.1.4. Genele cu expresie tardiv Acest grup de gene este transcris dup expresia genelor precoce dar nainte ca expresia genelor ciclului celular s fie maxim. Cele mai multe dintre acestea au fost descoperite n diverse experimente i au rmas nc necaracterizate. Dintre genele cu expresie tardiv menionm HRS/SRp40, un membru al familiei de proteine bogate n Arg-Ser i care funcioneaz ca factor de mbinare i de modulare a mbinrii alternative de ARN.28 O important gen cu expresie tardiv n ficatul murin de regenerare este bcl-x, principala gen antiapoptotic n ficat. Expresia acestei gene nregistreaz dou vrfuri la 12 i 48 de ore dup hepatectomie i are
159
Fig.3 Schema succesiunii fenomenelor ce au loc n timpul replicrii la nivel celular. o reglare dependent de ciclul celular n ficatul de regenerare. Nu se tie nc dac expresia crescut a acestei gene se coreleaz sau nu cu creterea activitii antiapoptotice.29 2.1.5. Expresia genelor ciclului celular Aceste gene, care codific cicline i kinaze dependente de ciclin (cdk), sunt exprimate n timpul parcurgerii ciclului celular de la G1 la faza S i n final spre faza de mitoz. Cele mai multe studii pe ficatul de regenerare sau concentrat asupra rolului ciclinelor D1 i E2F1 n progresia ciclului celular. Acestea sunt factori de transcripie pentru enzimele de legare a catenelor de ADN. Hiperexpresia E2F1 iniiaz proliferarea celular in vivo i in vitro. Ciclinele sunt exprimate difereniat n timpul regenerrii hepatice. n timp ce ciclinele A i B sunt exprimate foarte puin dup primul vrf al replicrii hepatocitare, ciclinele D1 i E sunt intens exprimate n timpul fazei de replicare a ADN, interacionnd cu diveri factori promotori sau inhibitori ai cdk. Ciclinele D1 i E sunt necesare pentru ca celula s depeasc punctul de restricie din G1. Expresia ciclinei D1 crete dup depirea punctului de restricie din G1 i este un marker specific al perioadei tardive din G1. Expresia maximal a ciclinei D1 coincide cu momentul n care celula capt autonomie replicativ, fr a mai fi dependent de factori de cretere.17 2.1.6. Factorii de cretere i citokinele care influeneaz regenerarea hepatic Procesul de regenerare hepatic implic aciunea unor mediatori multipli. Cele dou etape majore n acest proces sunt iniierea i parcurgerea ciclului celular.27,30 Procesul de iniiere sensibilizeaz celula pentru factorii de cretere dar, dup cum am menionat anterior, modificrile ce se produc n aceast etap nu sunt suficiente pentru replicarea hepatocitar. Parcurgerea ciclului celular, care se finalizeaz cu replicarea ADN, necesit i aciunea unor factori de cretere. Dintre acetia, cei mai importani sunt HGF i TGF. Factorul de cretere epidermal (epidermal growth factor EGF) a fost menionat i el, dar nu este clar stabilit dac nivelul su crete n ficat dup hepatectomii. Factorul de cretere al endoteliului vascular (vascular endothelial growth factor VEGF) are i el o importan deosebit n proliferarea hepatocitar dar mai ales n stimularea angiogenezei. De asemenea, sunt menionai n literatur i ali factori care particip la stimularea replicrii ADN n hepatocitele din cultur, cum ar fi heparin binding EGF (HB-EGF) i factorul de
160
cretere keratinocitic (KGF).31,32 Sunt definii i factori permisivi ai regenerrii hepatice, cum ar fi hormonii tiroidieni i paratiroidieni, ca i factori adjuvani ai regenerrii, cum ar fi insulina i norepinefrina. n contrast cu aciunea acestor factori se afl TGF beta i activina, care inhib replicarea hepatocitar.33 n ceea ce privete aciunea HGF i TGF alfa, nu s-a stabilit pn n prezent dac aceti doi factori acioneaz sinergic, n cadrul unui mecanism protector, pentru a ntri sigurana procesului de regenerare, sau acioneaz complementar, ducnd la apariia unui proces de regenerare amplificat. n culturile primare de hepatocite, de exemplu, aceti doi factori acioneaz, cel puin parial, ntr-o manier complementar. Astfel, nivelul replicrii ADN este mai mare cnd aceti factori acioneaz simultan, dect atunci cnd acioneaz succesiv.34 2.1.7. Factorul de cretere hepatocitar (hepatocyte growth factor HGF) HGF, mpreun cu receptorul su c-met, reprezint factori cheie pentru creterea i funcia hepatic. HGF (numit i scatter factor) a fost iniial identificat n serul murin, posthepatectomie, ca fiind un mitogen puternic pentru hepatocitele din cultur. El este produs de celulele nonparenchimale hepatice, n special de celulele Kupffer, de celule endoteliale sinusoidale (n ficatul de regenerare) i de celulele mezenchimale din alte organe. Nu a fost gsit n hepatocite, ceea ce sugereaz faptul c acioneaz ntr-o manier paracrin. HGF este cel mai puternic inductor al sintezei de ADN n hepatocite. Concentraia sa n snge crete mult ca urmare a rezeciei unei pri din ficat, dar mecanismul acestei creteri este nc necunoscut. HGF influeneaz i alte tipuri celulare, cum ar fi celulele epiteliale, asupra crora acioneaz diferit i anume determin disocierea i migrarea lor. Ca factor de cretere acioneaz numai asupra hepatocitelor. Este un mediator important al regenerrii hepatice i un factor esenial pentru declanarea procesului de malignizare la nivelul ficatului.30 HGF este sintetizat n celulele mezenchimale ca pro-mitogen, care necesit activare pentru a putea aciona ca mediator al creterii. HGF din snge este preluat preferenial de ctre ficat i se concentreaz n celulele periportale. Modul n care este reglat sinteza HGF ramne deocamdat neelucidat. n cursul regenerrii apar schimbri majore n exprimarea genelor hepatocitare, dar mecanismele ce controleaz aceste schimbri, ca i reglarea proliferrii i diferenierii hepatocitelor, sunt n mare parte necunoscute. Modelele experimentale la oareci transgenici au artat c supraexpresia HGF se
coreleaz cu nivele crescute ale ARNm pentru c-myc i c-jun, sugernd faptul c aceste gene sunt implicate n stimularea aciunii HGF. 2.1.8. Factorul de cretere transformant alfa (transforming growth factor alpha TGF ) TGF alfa este produs de asemenea de celulele hepatice nonparenchimale (n special de celulele Kupffer), dar i de hepatocite, acionnd printr-un mecanism autocrin. TGF alfa este sintetizat iniial sub forma unui precursor cu 160 de aminoacizi, care este de fapt o protein membranar integral. O secven de 50 aminoacizi din ectodomeniu, situat n apropierea situsurilor de clivaj proteolitic, formeaz TGF alfa solubil, acesta fiind fragmentul care difuzeaz n plasm. Att forma ancorat ct i forma solubil a TGF alfa sunt active i pot interaciona cu receptorul pentru EGF. Astfel este iniiat o important cale de transducie de semnal care implic procese de fosforilare i activare de fosfokinaze mitogen-activate (mytogen activated phosphokinases MAP), cu rol n replicarea ADN. Afinitatea TGF alfa asupra receptorului EGF este de 20 de ori mai mic dect a EGF, dar TGF alfa determin o stimulare mai susinut a MAP kinazelor implicate, ducnd la nivele mai mari de replicare a ADN-ului hepatocitar.35 Att TGF alfa ct i EGF sunt mitogeni pentru hepatocitele din cultur, iar studiile experimentale arat c EGF acioneaz ca mitogen n stadiile precoce, imediat dup hepatectomie, iar TGF alfa intervine n stadiile tardive.36 Expresia TGF alfa se coreleaz foarte bine cu proliferarea hepatocitar n timpul perioadei neonatale, n ficatul de regenerare dup hepatectomie sau dup lezarea chimic a acestuia, i n hepatocarcinogenez.30 Aceste date s-au stabilit pe baza unor studii experimentale care au evaluat expresia TGF n anumite condiii. S-a observat c n orice condiie experimental creterile expresiei TGF coincid cu replicarea ADN. Exist chiar unele studii care au artat c replicarea ADN se coreleaz mai bine cu expresia TGF alfa, dect cu cea HGF. Aceast situaie apare n cazul replicrii hepatocitare induse de galactozamin, fenobarbital ca i dup transplantul hepatic la om.37,38 Dei se cunosc multe date despre mecanismul de aciune al TGF alfa n ficatul de regenerare, se tie nc foarte puin despre semnalele care induc expresia TGF alfa dup hepatectomie sau agresiune chimic. S-a stabilit c TNF poate crete semnificativ replicarea ADN indus de TGF alfa. Acest fapt sugereaz c procesele de iniiere n timpul regenerrii hepatice au un rol esenial n creterea responsivitii hepatocitare la TGF alfa.39
161
2.1.9. Citokinele TNF, IL-1 i IL-6, citokine proinflamatorii, sunt principalele substane de acest tip implicate n procesul de regenerare hepatic. Procesul de iniiere a proliferrii, care este reversibil i care semnific trecerea celulelor din stadiul G0 n ciclul celular (G1), are loc n principal sub efectul TNF i IL-6. Aceste citokine sunt detectate n circulaie la cteva minute dup hepatectomie. Nivele crescute de IL-6 i TNF apar n snge nc din primele ore dup hepatectomie, dei sinteza de ADN apare mai trziu, chiar pn la 24 ore postrezecie.40 Ele sunt secretate de celulele non-parenchimale i stimuleaz hepatocitele s secrete proteinele de faz acut. Efectele proliferative i anti-apoptotice ale acestor citokine apar numai n anumite condiii, ca acelea existente dup hepatectomii. n ficatul de regenerare, expresia IL-6 este esenial pentru iniierea hepatocitar. La animalele knock-out pentru gena ce codific IL-6 regenerarea dup hepatectomii pariale este deficitar, ajungndu-se chiar la necroz hepatic masiv. Exist studii care arat c IL-6 are i o aciune de inhibare a apoptozei indus de TGF (un important factor antiregenerativ). 2.1.10. Iniierea hepatocitelor pentru replicare Provocarea major n studiul regenerrii hepatice o reprezint stabilirea modului de iniiere a acestui proces. Nici unul dintre factorii de cretere sau citokinele amintite mai sus nu sunt suficiente pentru a induce proliferarea celulelor hepatice normale in vivo. Pentru a avea un efect deplin, aceti mitogeni necesit prezena unor semnale de priming (iniiere), care s acioneze asupra hepatocitelor restante dup hepatectomie. Asemenea semnale de priming includ degradarea matricei extracelulare, cu convertirea formei inactive de HGF asociat matricei extracelulare, n forma sa activ, capabil s interacioneze cu receptorii specifici.36 n ultimul deceniu, n replicarea hepatocitar dup hepatectomii, un accent deosebit a fost pus pe rolul factorilor de transcripie, al protooncogenelor i factorilor de cretere. Date recente indic ns faptul c TNF i IL-6, citokine care pot avea un efect nociv asupra ficatului, sunt de asemenea componente importante ale mecanismului de iniiere a regenerrii hepatice. La oarecii modificai genetic la care s-a indus lipsa de TNFR 1 i imposibilitatea sintezei de IL-6, regenerarea hepatic a fost afectat sever i chiar inhibat.41,42 Pe baza acestor experimente s-a stabilit faptul c pentru iniiere sunt necesari mai muli factori care se intercondiioneaz: TNF, TNFR 1, NFkB, IL-6 i STAT 3. Desigur, aceast cale de activare a NFkB nu exclude
existena altor ci de activare necesare iniierii procesului proliferativ. Dup hepatectomie, masa celular restant trebuie s se adapteze necesitilor metabolice crescute, deoarece fluxul sanguin rmne nemodificat. Suprancrcarea metabolic, astfel aprut, determin apariia n exces a radicalilor liberi de oxigen ca urmare a creterii fosforilrilor oxidative i depirii capacitii celulare de neutralizare a acestora. Exist studii care arat c radicalii liberi de oxigen cresc activarea NFkB, crescnd n consecin capacitatea acestuia de activare genic.43 Astfel, radicalii liberi de oxigen, generai de suprancrcarea metabolic a hepatocitelor, contribuie la activarea unei cascade de evenimente, care n final determin proliferarea hepatocitelor aflate n repaus. 2.1.11. Angiogeneza n regenerarea hepatic Angiogeneza este un proces complex, de formare a noi vase sanguine, care intervine ntr-o multitudine de procese fiziologice i patologice. Este intens studiat n procesele de tumorigenez i i se atribuie un rol important n creterea tumoral. n ultima vreme, numeroase studii se concentreaz asupra rolului angiogenezei n procese fiziologice, cum ar fi repararea tisular i, n spe, n regenerarea hepatic. Numeroi factori de cretere care sunt implicai n regenerarea hepatic sunt cunoscui ca avnd proprieti angiogenice in vivo. HGF, al crui nivel crete dramatic dup hepatectomie, este un important factor angiogenic in vivo, stimulnd producia de proteaze de ctre celulele endoteliale, motilitatea, proliferarea i diferenierea acestor celule.44 El este un mediator paracrin derivat din celulele endoteliale sinusoidale hepatice care stimuleaz, dup cum s-a precizat mai sus, creterea hepatocitar. De asemenea i VEGF crete mult dup hepatectomia parial. Este un factor proangiogenic major i se pare c este implicat n mbuntirea reconstruciei sinusoidale n timpul regenerrii hepatice. Importana stimulrii prin VEGF a fost semnalat de numeroase studii efectuate la oareci. S-a observat c administrarea de VEGF a crescut masa hepatic n timpul regenerrii, dar nu a avut efect asupra creterii hepatocitelor in vitro, dect dac n cultur erau prezente i celule endoteliale sinusoidale hepatice.45 Acest fapt semnaleaz importana cooperrii celulare i a implicrii VEGF (prin activarea VEGFR) n comunicarea celulelor endoteliale cu celulele stromale nconjurtoare (prin secreia factorilor de cretere care acioneaz paracrin). S-a observat, de asemenea, c activarea selectiv a receptorului VEGFR-1 stimuleaz proliferarea hepatocitar in vivo dar nu i pe cea endotelial. Concluzia acestor studii a fost c, dup
162
activarea VEGFR-1, endoteliul este determinat s produc o serie de factori mitogeni care s protejeze celulele parenchimale i s iniieze regenerarea. Dei era cunoscut de mult faptul c unii factori proangiogenici majori sunt intens exprimai n regenerarea hepatic, nu exist o dovad clar c angiogeneza intrahepatic apare n timpul regenerrii. Un studiu recent, care investigheaz relaia dintre regenerarea hepatic i angiogenez, folosete administrarea la animalele de experien a angiostatinei, cel mai puternic factor antiangiogenic cunoscut.46 Autorii au artat c regenerarea hepatic dup hepatectomia parial 70% este asociat cu angiogeneza (pe baza creterii densitii microvascularizaiei). Inhibarea acestui proces a dus la o ntrziere n regenerare, sugernd c, cel puin parial, fenomenul regenerrii depinde de angiogenez. Acest fapt, bazat pe creterea microvascularizaiei n timpul regenerrii, susine conceptul general c formarea de noi vase sanguine este necesar pentru repararea tisular adecvat.
2.2. Mecanismele de reglare a regenerrii hepatice i factorii care o influeneaz Mecanismul exact al iniierii i finalizrii procesului de regenerare hepatic nu este n totalitate elucidat. Se cunosc mai muli factori care influeneaz aceste procese, dar secvena real a desfurrii lor nu este pe deplin reconstituit. Exist numeroi factori care pot induce sau pot crete replicarea hepatocitar att in vivo ct i in vitro. Mitogenii complei i comitogenii acioneaz prin activarea diverselor ci intracelulare de transducie de semnal, implicate n replicarea celular. Mitogenii complei sunt cei care pot stimula replicarea hepatocitar in vitro n absena altor factori. Printre cei cunoscui i utilizai n diverse modele experimentale se numr: HGF, TGF alfa, EGF, substana stimulatoare hepatic (hepatic stimulatory substance HSS, un factor de progresie pentru replicarea hepatocitar care acioneaz numai asupra hepatocitelor aflate n G1), HB-EGF, OK-432 (un imunostimulator obinut din streptococ, care crete activitatea sistemului reticuloendotelial) i prodiosaina (un polizaharid derivat din Serratia marcescens). Modul de aciune al ctorva dintre mitogenii complei a fost amintit anterior, la fel i importana acestora. Proliferarea hepatocitar poate aprea ns i n absena unui deficit tisular sau a unei injurii celulare. Un numr mare de substane, denumite ageni mitogeni direci, pot determina acest tip de proliferare. Printre acestea se afl nitratul de plumb, bromura de etil, acidul
9-cis retinoic, triiodotironina i diveri stimulatori ai proliferrii peroxizomilor cum ar fi TNF n doze mari. Mecanismele prin care aceti mitogeni acioneaz sunt diferite. n cazul administrrii lor, rspunsul proliferativ nu a fost asociat cu modificri semnificative ale nivelelor hepatice de HGF i TGF. Exist ns o cretere rapid a concentraiei TNF n ficat, n aceste condiii. Mai mult, tratamentul cu dexametazon sau inhibitori de TNF inhib creterea hepatic indus de mitogenii direci. Cea mai probabil explicaie pentru aciunea acestor mitogeni este c ei funcioneaz ca promotori ai ciclului celular la nivelul stimulrii ciclinei D1, prin intermediul receptorilor nucleari hormonali, ceea ce explic de fapt excluderea fazei de iniiere a regenerrii hepatice.6 Factorii care amplific efectul mitogenilor complei in vitro, dar nu au efectul acestora cnd acioneaz singuri, se numesc mitogeni incomplei sau comitogeni. Printre acetia se numr: insulina, glucagonul, epinefrina, norepinefrina, factorul de amplificare a regenerrii hepatice (amplificating liver regeneration factor ALRf), hormonii tiroidieni, parathormonul, prolactina, estrogenii i TNF alfa. Experimental s-a observat c hipofizectomia, tiroidectomia i paratiroidectomia, tratamentul cortizonic i dieta fr proteine la animalele de experien tinere, meninut trei zile naintea rezeciei pariale hepatice, ntrzie rata maximal de sintez a ADN cu 16-20 ore n timpul regenerrii, dar nu o inhib total. Efecte asemntoare (de intrziere a regenerrii) au fost observate i la administrarea de lovastatin, actinomicin, tamoxifen, colchicin, indometacin i radioterapie experimental.47 Pe de alt parte, s-a observat c stresul chirurgical sau injeciile cu hormoni de cretere, administrate naintea hepatectomiei pariale, cresc sinteza de ADN sau pot scurta intervalul prereplicativ din timpul regenerrii hepatice. S-a observat c administrarea factorilor de cretere, precedat de administrarea TNF alfa (intrahepatic de preferat), crete efectul EGF, TGF alfa, i HGF asupra proliferrii hepatocitare n cazul unor transplante hepatice small for size sau n cazul repopulrii hepatocitare dup leziuni acute majore.27 Exist numeroi factori care inhib sinteza ADN-ului indus n hepatocite. Dintre acetia cei mai importani sunt TGF beta 1, TGF beta 2, TGF beta 3 i activina.47 Dieta pare a avea i ea un rol n influenarea procesului regenerativ. La animalele de experien s-a observat c proliferarea hepatocitar prezint variaii circadiene, n funcie de comportamentul nutriional. Astfel, proliferarea a fost inhibat de deprivarea de alimente i stimulat de ingerarea lor. Este posibil ca acest efect s apar sub influena unor aminoacizi specifici.
163
Despre stimulii de blocare a regenerrii se tie prea puin. Acest proces ar putea fi dependent de dispariia semnalelor pozitive sau de un sistem independent de factori reglatori. Dup hepatectomia parial, creterea hepatic este iniiat de mediatori secretai sub influena necesitilor metabolice. Este posibil ca ncetarea proliferrii celulare s depind de aceleai semnale, care apar i la restabilirea masei i funcionalitii normale hepatice. n consecin, nelegerea mecanismelor exacte de reglare a creterii hepatice depinde de identificarea interaciunilor dintre cile metabolice i cele mitogenice.
3. MODALITI DE EVALUARE I URMRIRE A REGENERRII HEPATICE Regenerarea hepatic poate fi apreciat prin diverse teste. Unele sunt bazate pe analiza esutului hepatic, cum ar fi: volumul i greutatea ficatului, indicele mitotic, rata de sintez i coninutul de ADN, identificarea imunohistochimic a antigenelor nucleare; altele se bazeaz pe determinarea n serul pacientului a nivelelelor unor enzime specifice sau ale unor markeri de proliferare. Volumetria ficatului (determinat imagistic prin tomografie computerizat sau RMN) i greutatea ficatului estimat n funcie de volumul hepatic. Rezultatele sunt uneori ns influenate de depozitarea diverselor substane fr legtur cu regenerarea (lipide, glicogen .a.), sau de acumularea de celule inflamatorii i snge, ceea ce modific determinarea dimensiunilor reale hepatice. Avantajul const n faptul c este simplu de efectuat, folosindu-se mai ales n studiile experimentale dar nu ca singur parametru. Tehnici de biologie celular i molecular care s evidenieze pe esut:48 A. Coninutul de ADN celular i rata de sintez ncorporarea timidinei radioactive este un marker bine standardizat i reproductibil, fiind relativ uor de realizat. Aceast metod este limitat ns de imposibilitatea folosirii in vivo la om i de nespecificitatea ncorporrii timidinei (reflect nu numai sinteza de ADN dar i repararea ADN; este ncorporat i n lipide).49 La om evaluarea in vitro se poate face pe esut hepatic recoltat prin biopsie sau pe hepatocite izolate. Metodele de detectare sunt: autohistoradiografia, tomografia cu emisie de pozitroni i detectarea scintilaiilor beta. ncorporarea bromdeoxiuridinei poate fi detectat imunohistochimic folosind anticorpi speci-
fici sau prin citometrie n flux.50 Principalele avantaje ale acestei metode constau n posibilitatea folosirii la om in vivo i n timpul scurt (fa de timidin) necesar obinerii rezultatelor. B. Numrul de mitoze este o tehnic limitat de mai multe probleme: esutul obinut prin biopsie hepatic percutanat poate fi insuficient mitozele sunt observate rareori la microscop, datorit duratei scurte a acestei faze a ciclului celular numrul de mitoze depinde de regiunea din care este prelevat biopsia, innd cont c activitatea de regenerare este diferit n zona periportal de zona lobular mijlocie i de cea centrolobular.51 identificarea mitozelor depinde de abilitile n microscopie ale observatorului C. Colorarea imunohistochimic a antigenelor nucleare, precum antigenul nuclear al proliferrii celulare (proliferating cell nuclear antigen PCNA), ADN polimeraza alfa, Ki 67 i proteinele de organizare nucleolar (NOR). cea mai simpl, exact i reproductibil metod este msurarea nivelului PCNA. Este o protein asociat ADN polimerazei delta, esenial pentru replicarea ADN. Este detectat n hepatocite prin tehnici de imunohistochimie. Expresia sa este maxim n faza S a ciclului celular. Avantajele determinrii PCNA sunt: o bun corelare cu ali markeri ai proliferrii (ncorporarea timidinei, activitatea timidin kinazei) i mai ales posibilitatea efecturii studiilor retrospective, detectarea PCNA fiind posibil i pe esutul pstrat la parafin.52 Dezavantajele determinrii PCNA constau n variabilitatea intralobular, variabilitate n intensitatea de colorare (dat de diminuarea rapid a imunoreactivitii cnd specimenele sunt expuse la lumin i la uscare), variabilitatea exprimrii PCNA n diferite tipuri celulare.53 ADN polimeraza este o enzim implicat n sinteza de ADN, care apare n fazele G1, S, G2 ale ciclului celular i n mitoz dar nu n faza G0. Este detectat cu ajutorul anticorpilor monoclonali prin tehnici de imunohistochimie. Este uor de testat, ns exist dezavantajul c apare n multe faze ale ciclului celular. Indexul de etichetare este dat de procentul hepatocitelor pozitive pentru ADN polimeraz la 1000 de celule. Ki 67 - reprezint un epitop al unui antigen
164
nuclear care apare n toate celulele aflate n cursul proliferrii i este absent n celulele dormante. Apare n toate fazele ciclului celular cu excepia G0 i G1 foarte devreme. Este maxim n faza S i n mitoz.54 Se identific prin imunohistochimie cu ajutorul unui anticorp monoclonal MIB-1.52 Indexul de etichetare este dat de procentul hepatocitelor Ki 67 pozitive la 1000 de celule. Avantajul major al determinrii acestui antigen este c poate avea aplicabilitate clinic i rezultatele se coreleaz i cu ali indici de proliferare. Dezavantajul acestei metode const n faptul c este necesar esut proaspt sau ngheat rapid, pentru c antigenul este sensibil la fixare i se poate deteriora n timp. Exist ns o metod de pstrare a antigenului dup fixarea n formaldehid, prin expunerea prealabil a materialului la microunde.55 proteinele NOR reprezint un grup de proteine acide nucleolare. Nucleolina i B 23 sunt principalele componente. Iniial, o cretere marcat a acestor proteine n hepatocite a fost asociat cu riscul de dezvoltare a carcinomului hepatocelular la pacienii cu boli hepatice cronice. Studiile ultimilor ani au artat c o cretere marcat a acestor proteine apare n hepatocite i la obolanii supui la hepatectomii pariale, sugernd faptul c aceste proteine pot fi folosite ca markeri pentru proliferarea hepatocitar.56 Aceste proteine sunt detectate prin diferite metode: impregnare argentic, Western blot i citometrie n flux. Pot fi identificate i pe seciuni din blocuri incluse la parafin. D. Expresia genelor i nivelul anumitor proteine sau enzime histona H3 este o component major a nucleosomilor. Transcripia ARNm histon H3 este maxim la nceputul fazei S i nceteaz odat cu terminarea proliferrii. ARNm este detectat prin hibridizare in situ i prin rtPCR. Este o tehnic laborioas, sofisticat i mai puin sensibil dect determinarea altor markeri ai proliferrii. Principalul avantaj este acela c rezultatele se coreleaz strns cu sinteza ADN de novo.57 timidin kinaza este o enzim care acioneaz numai n timpul sintezei de ADN care fosforileaz timidina i ajut la incorporarea sa n ADN-ul celulelor aflate n proliferare. Pentru punerea n eviden a enzimei, esutul hepatic este omogenizat i incubat cu timidin radio-
activ. Se msoar ulterior radioactivitatea. ornitin decarboxilaza i putresceina reprezint enzima i proteina de a crei sintez este responsabil. Putresceina este o poliamin esenial pentru regenerarea ficatului. Enzima este detectat n homogenatul hepatic prin msurarea 14CO2 eliberat din substratul marcat cu C14.58 Putresceina se msoar prin cromatografie cu schimb ionic. Avantajele determinrii lor constau n corelarea bun cu extinderea rezeciei hepatice, restituirea masei hepatice i ncorporarea de timidin. Teste serologice determinri de enzime sau markeri ai proliferrii, cum ar fi ornitin decarboxilaza, timidin kinaza, fibronectina, alfa-fetoproteina timidin kinaza i ornitin decarboxilaza; metodele folosite la detectarea acestor enzime n snge sunt similare cu cele folosite la detectarea lor n esut. Avantajul acestei metode este c ofer posibilitatea practic i non-invaziv de a studia regenerarea hepatic la om. Sensibilitatea lor este mai sczut fiind necesari stimuli regenerativi majori (cum ar fi rezecia hepatic major) pentru a detecta schimbri apreciabile n activitatea enzimatic din ser. fibronectina - este o glicoprotein solubil n plasm, sintetizat de hepatocite i celule endoteliale. Studiile de pn acum sunt neconcludente n ceea ce privete valoarea fibronectinei, n unele corelndu-se foarte bine cu activitatea regenerativ iar n altele nu.59,60 alfa-fetoproteina - rolul ei n determinarea activitii de regenerare este controversat. Exist totui o corelare pozitiv ntre nivelul seric al alfa fetoproteinei i indexul PCNA la pacienii cu insuficien hepatic acut.61 Dezavantajul major este c nu prezint specificitate pentru proliferarea hepatocitar. n concluzie, nu exist un marker ideal care s aprecieze regenerarea ficatului; fiecare metod prezentat are inconvenientele ei i chiar pot aprea rezultate discordante ntre metode. De aceea, din testele prezentate anterior se utilizeaz cel puin dou n studiul regenerrii hepatice.
4. MODELE DE REGENERARE HEPATIC Unele dintre leziunile observate la om n bolile hepatice au fost reproduse i la animalele de laborator prin diverse experimente. Pentru studiul regenerrii n aceste cazuri, s-au utilizat diverse modele de afectare hepatic.
165
4.1. Regenerarea hepatic dup agresiunea chimic Exist numeroase toxine i substane chimice folosite n modelele de regenerare, care pot determina leziuni hepatice i moarte celular, urmate de un anume tip de proliferare. Modelele experimentale hepatice au un rol limitat n studiul regenerrii deoarece efectele locale i sistemice ale toxinelor folosite depind de doza i calea de administrare, de specia animalului folosit, de vrsta i statusul nutriional, precum i de ali factori. Extinderea necrozei hepatice este greu de prezis deoarece exist o variabilitate semnificativ de la un caz la altul. Regenerarea tisular implic att replicarea ct i repararea de ADN iar toxina poate interfera direct cu mecanismele celulare i moleculare implicate n aceste procese. Pot aprea distrucii de membrane celulare (cu dispariia interaciunii factor de cretere receptor), tulburri ale expresiei genice i sintezei proteice necesare rspunsului inflamator, activarea celulelor hepatice non-epiteliale cu creterea TGF-1 i produciei de matrice extracelular. Dat fiind faptul c cele dou procese (distrucia celular i reparaia tisular) se intercondiioneaz, studiul regenerrii ca atare este destul de dificil n acest caz.62 Regenerarea hepatic aprut n urma leziunilor toxice difer n unele privine de cea care survine n urma hepatectomiilor. Replicarea hepatocitar are loc ca rspuns la moartea celulelor, determinat de substana toxic. Dup hepatectomii structura acinilor rmne intact, n timp ce n cele mai multe forme de boal hepatic prin lezare toxic apare distrucie periportal (zona I) sau centrolobular (zona III). Rezeciile hepatice sunt urmate de un proces de regenerare care apare pe un esut cu o mas redus, dar intact din punct de vedere al structurii celulare. n modelele experimentale ale regenerrii hepatice dup lezarea chimic parenchimatoas, se folosesc diverse substane, cum ar fi: brombenzen, tetraclorura de carbon i alil-alcool care produc, la rndul lor, diverse tipuri de afectare lobular. Studiul regenerrii hepatice dup lezarea chimic cu tetraclorura de carbon a artat c mecanismele fundamentale ale replicrii celulare, comparativ cu regenerarea posthepatectomie, nu sunt foarte diferite, n esen. Rspunsul de activare genic precoce apare n primele ore dup administrarea de tetraclorur de carbon, odat cu activarea factorilor de cretere HGF i TGF. Diferena major dintre cele dou tipuri de regenerare apare ns n momentul iniierii replicrii ADN. Saltul celulei n faza G1 a ciclului celular se produce mai lent n cazul replicrii hepatocitare indus de substana toxic. Motivele pentru care apare aceast
diferen nu au fost nc identificate (se presupune apariia unei refractaritii celulare n ceea ce privete intrarea n ciclul celular, sau intensitii reduse ori alterate a stimulilor pentru regenerare).6 Multe dintre studiile efectuate n ncercarea de a clarifica mecanismele de regenerare dup agresiunile chimice s-au concentrat asupra rolului TNF i IL-6 n stimularea regenerrii. Aceste studii utilizeaz diverse toxine hepatice care induc creterea de TNF. Substanele toxice, cum ar fi alcoolul i tetraclorura de carbon, sunt administrate la oareci cu diverse modificri genice induse (knockout), precum deficitul n receptorul de tip 1 pentru TNF sau n expresia de IL-6. Extinderea leziunilor cauzate de toxice se evalueaz prin examinri histologice i dozare de transaminaze. Concluziile celor mai multe studii au fost c semnalizarea TNF prin intermediul receptorului su TNF-R1 este necesar pentru o replicare hepatocitar eficient n cazul lezrii toxice cu tetraclorur de carbon. Similar, la oarecii deficitari n expresia de IL-6 a fost observat o afectare hepatocelular mai sever i o rat crescut de apoptoz, indicnd faptul c IL-6 are un rol important n protecia mpotriva agresiunii toxice i n procesul de reparare tisular.63
4.2. Regenerarea dup hepatectomii Cel mai studiat model animal de regenerare hepatic este cel bazat pe experimentele efectuate de Higgins i Anderson, care implic ndeprtarea chirurgical a 2/3 din ficatul de obolan. Apare astfel un deficit hepatic standardizat de 68% iar rspunsul de regenerare poate fi rapid cuantificabil i reproductibil. Dup hepatectomia standard 2/3 apare o cretere marcat a replicrii ADN i a mitozelor celulare hepatocitare. Proliferarea celulelor non-epiteliale este mult redus, comparativ cu cea a hepatocitelor. Iniial, ciclurile de proliferare celular nu sunt att de evidente i nici sincronizate, datorit faptului c replicarea celulelor apare progresiv. Etapele celulare n timpul proliferrii se mpart astfel: o faz prereplicativ (de la 0-12 ore), n timpul creia hepatocitele trec din stadiul G0 n stadiul de sintez proteic G1 i o faz replicativ (12-30 ore) n care se produce sinteza ADN (S), urmat de mitoza celulei (M). Dup hepatectomia standard (2/3) i n condiii optime, vrful replicrii ADN apare la 24 de ore. Diviziunea mitotic are aceeai evoluie, decalat cu 6 ore mai trziu, fiind caracterizat de o periodicitate diurn n primele 6 zile. Durata fazei prereplicative, intensitatea i momentul sintezei maxime de ADN,
166
Fig.4 Regenerare cvasicomplet dup hepatectomie dreapt pentru carcinom fibrolamelar: a) aspect CT preoperator (colecia Prof.dr. . Georgescu); b) pies de hepatectomie dreapt reglat; c) aspect CT la 4 ani de la rezecie: ficat regenerat n ntregime; metastaz ganglionar retroperitoneal (colecia Prof.dr. . Georgescu) d) aspectul normal al ficatului la reintervenie, ficat regenerat n ntregime: aspect intraoperator. precum i faza mitotic variaz dup hepatectomiile pariale, n funcie de speciile animale folosite, vrsta animalului, statusul nutriional, ritmul diurn, balana hormonal i, nu n ultimul rnd, amploarea hepatectomiei. Masa hepatic este n relaie de proporionalitate direct cu greutatea organismului. n cazul unui esut normal, rspunsul de regenerare este maxim atunci cnd se ndeprteaz 2/3 din masa hepatic (Fig.4). Cnd este rezecat o cantitate mai mic de parenchim, procesul de regenerare este mai lent. Pe de alt parte, rezecia care depete 2/3 din masa hepatic diminueaz att sinteza de ADN ct i activitatea mitotic. Hepatectomia subtotal (90%) duce invariabil la deces, fr apariia procesului de regenerare.64 Teoretic, hepatectomia subtotal poate fi un model ideal de studiu al mecanismelor de inhibiie a rspunsului regenerativ, la subieci cu o mas hepatocitar critic, foarte sczut. n practic ns efectele adverse i complicaiile legate de procedur (incluznd staza venoas portal, edemul cerebral, hipotermia, hipoglicemia, endotoxemia, sepsisul, proteinuria i apoptoza) pot interfera cu constantele metabolice, celulare i moleculare, necesare studiului.
167
4.3. Regenerarea hepatic n cazul transplantului de ficat parial (split, living-donor) Principiile care guverneaz regenerarea hepatic la animale, deduse din observaiile experimentale, sunt respectate i n cazul regenerrii la om. Aceste principii sunt bine ilustrate n cazul transplantului hepatic ortotopic la om, de tipul small for size i large for size. Raportul dintre mrimea ficatului i restul masei corporale rmne constant pe tot parcursul vieii. n cazul transplantrii unui ficat prea mic, apare creterea hepatic n concordan cu mrimea primitorului. Acest proces nceteaz atunci cnd raportul mas hepatic/mas corporal atinge o valoare optim. Pe de alt parte, atunci cnd se transplanteaz un ficat prea mare pentru primitor, acesta nu va crete n noua gazd ci chiar descrete n mas, prin fenomenul de apoptoz. Aadar, pentru un ficat sntos, fr steatoz, fr acumulri de glicogen sau alte procese patologice, indicele optim mas hepatic/mas corporal constituie punctul final al procesului ce corecteaz deficitul sau excesul de mas hepatic. n transplantul hepatic, dou tehnici folosite n clinic se bazeaz pe capacitatea ficatului de a se regenera (de a-i regla creterea): tehnica split-liver (cu ficat mprit) i transplantul living-donor (de la donator n via).65 Spre exemplu, n cazul transplantrii lobului drept de la adult la adult, ritmul regenerrii hepatice, att la donator ct i la primitor, este rapid i se estimeaz prin volumetrie TC sau rezonan magnetic nuclear volumetric. Figura 5 ilustreaz imaginile tomografice ale unui donator de hemificat drept, nainte i la 9 zile dup hepatectomie. Volumul segmentelor I-IV restante este de 505 cc iar la 9 zile de la hepatectomie acesta ajunge la 800 cc. Unele studii afirm c volumul hepatic se dubleaz la 7 zile postoperator n cazul donatorului i n 7 pn la 14 zile n cazul primitorului. La 60 zile postoperator, volumul hepatic atinge aproape parametrii iniiali. O cretere la fel de rapid a fost obinut i n cazul transplantrii de hemificat stng de la donator n via.66 n general exist ns o variabilitate n ceea ce privete creterea volumului hepatic postoperator n funcie de timp, fapt datorat unor condiii biologice diferite. Aceste rezultate sunt extrem de interesante deoarece segmentele hepatice umane, care sunt de 200-400 de ori mai mari dect la oricei, cresc doar cu puin mai lent dect ficatul acestora, dup hepatectomii. Exist ns un raport optim ntre masa grefei hepatice i greutatea corpului primitor, care permite creterea adecvat a ficatului transplantat. Valoarea minim a acestui raport trebuie s fie ntre 0,8% i 1%. HS
505 cm3
HD
1076 cm3
Fig.5 Imagini tomografice ale unui donator de hemificat drept, nainte i la 9 zile dup hepatectomie. a) Volumetrie CT nainte de recoltare (segmentele V-VIII 1076 cm3 planul lateral de VHM, segmentele II-IV - 505 cm3 ); b) Volumetrie CT a ficatului restant la donator i creterea sa n volum (regenerarea) la 9 zile postoperator (segmentele IIIV - 800 cm3); c) volumetrie hepatic - reconstrucie 3D; maro - HS nainte de hepatectomie, verde - HS la 9 zile post operator. (colecia Prof.dr. . Georgescu). HD - hemificatul drept; HS - hemificatul stng.
168
Concluziile care se desprind din aceste date trebuie interpretate cu atenie, deoarece msurtorile clinice ale creterii hepatice dup transplantul de ficat de la donator n via se bazeaz pe determinri volumetrice realizate prin TC i RMN. Nu se poate spune foarte clar dac exist o corelaie strns ntre volumul hepatic estimat prin aceste metode i indicii de proliferare celular. O problem ar fi dac nu cumva creterea rapid de volum, observat imagistic att la donator ct i la primitor, nu reflect mai curnd prezena edemului tisular. n orice caz, funcia hepatic este rapid restaurat n timpul perioadei n care exist o cretere de volum maximal i nu sunt decelate imagistic anormaliti la nivelul ficatului. Invers, atunci cnd se transplanteaz un ficat mai mare dect dimensiunile fosei hepatice a primitorului (situaie care, de regul, trebuie evitat prin evaluarea preoperatorie a dimensiunilor ficatului donator i alegerea receptorului n funcie de acestea) abdomenul se las deschis, cu o plas sintetic ce se sutureaz la marginile tegumentului. Ulterior, sub plasa respectiv ficatul transplantat va ajunge aproximativ la forma i dimensiunile adaptate fosei hepatice a primitorului.
cu formarea unui ram drept i stng hepatic, acestea provenind de fapt doar din vascularizaia segmentelor restante. Spre exemplu, n cazul unui pacient care a suferit anterior o hepatectomie stng, la o rezecie iterativ se pot observa vase portale care se ndreapt ctre stnga i care pornesc din ramuri portale ce vascularizeaz segmentele V i VIII. Segmentele VI i VII sunt marcat hipertrofiate i sunt vascularizate din ramurile portale segmentare corespunztoare. Se creeaz astfel impresia existenei unui nou hil format dintr-un ram portal stng i un ram portal drept.
4.5. Regenerarea hepatic dup ocluzia de ram portal n anul 1861, Frerichs a observat c obliterarea sifilitic a unui ram portal determin atrofia lobului afectat (atrofie portal), n timp ce segmentele hepatice restante creteau mult n dimensiuni. Aceast observaie a rmas un subiect de disput, pn la clasicele experimente efectuate de Rous i Larimore. n 1920, ei au artat c ligatura de ram portal la iepuri determin atrofia lobului hepatic ipsilateral i hipertrofia lobului controlateral. n urma acestui studiu, au considerat c rspunsul hiperplazic ce apare dup ligatura de ram portal este stimulat de factori umorali prezeni n sngele portal.65 Tot ei au efectuat un alt experiment n care, pe lng ligatura de ram portal, realizau i ligatura de canal hepatic pentru segmentele hepatice restante. n condiiile de apariie a colestazei, rezultatul consta n rspuns hiperplazic mai mic n lobul restant i rspuns atrofic mai mic n segmentele corespunztoare ramului portal ligaturat. Ulterior, muli cercettori au confirmat acest fenomen, pe diverse modele clinice i experimentale (Schalm n 1956, Starzl68 n 1976). n ceea ce privete patogeneza acestui fenomen, prerea unanim a fost c sngele portal controleaz mrimea hepatocitelor, iar deprivarea portal duce la pierderea masei citoplasmatice hepatocitare, prin mecanisme nc neclare. Dup Starzl, rolul determinant n acest proces l are insulina din sngele portal.68,69 Exist i n prezent numeroase studii pe acest model. Ele confirm prezena proliferrii compensatorii induse n lobii restani i faptul c intensitatea acesteia este proporional cu cantitatea de esut hepatic deprivat de vascularizaia portal.70 Rspunsul hiperplazic este ns mai slab dect cel obinut n urma hepatectomiilor corespunztoare. Pe baza observaiilor exprimentale, ligatura i embolizarea percutanat de ram portal se utilizeaz i n clinic. Embolizarea portal n prealabil, urmat ntr-un al doilea timp de rezecie hepatic major, a fost
4.4. Anatomia vascular a regenerrii hepatice pe ficatul rezecat La anumii pacieni, la care s-a practicat hepatectomia parial pentru cancer hepatic primitiv, poate fi indicat uneori o hepatectomie iterativ pentru recidive sau tumori metastatice. n aceste cazuri pot fi necesare rezecii extinse. Efectuarea unei hepatectomii iterative extinse, ntr-un ficat restant hipertrofiat, necesit cunoaterea anatomiei vasculare a acestuia. Dup cum s-a menionat anterior, regenerarea funcional a ficatului rezecat apare numai prin creterea segmentelor hepatice restante. Anatomia vascular a ficatului restant a fost studiat pe diverse preparate hepatice corodate, n care pot fi evideniate ramurile portale. S-a demonstrat c n procesul de regenerare nu apare fenomenul de neoangiogenez i, n consecin, nu apare o nlocuire real a vaselor secionate. Ceea ce se produce de fapt este creterea n lungime i maturizarea colateralelor din ramurile portale ale segmentelor restante, ca i ramificarea acestora.67 Astfel, efectuarea unei rezecii hepatice iterative pe criterii anatomice pornete de la o arhitectur vascular modificat, creat din structurile vasculare ale ficatului restant. Aparent poate fi vzut un nou hil hepatic
169
introdus n practic de Makuuchi.71 Ocluzia selectiv a venei porte naintea unei hepatectomii majore este actualmente o metod de a reduce morbiditatea i mortalitatea postoperatorie. Practicarea ocluziei portale naintea hepatectomiei permite efectuarea rezeciei hepatice extinse n timpul secund, dup obinerea hipertrofiei lobului controlateral (cel care nu conine tumor). n acest fel crete nu numai volumul ficatului restant, dar i rezerva hepatic dup hepatectomia care depete lobul cu ramul portal ligaturat.72 Cel de-al doilea timp, de rezecie hepatic, nu poate fi efectuat ns ntotdeauna. Uneori, nici hipertrofia indus n ficatul controlateral nu este suficient pentru evitarea insuficienei postoperatorii.73 Rezecia hepatic efectuat pe ficat normal este de obicei bine tolerat, permind ablaia pn la 75% din parenchim. n schimb, la cirotici, chiar i rezeciile foarte limitate pot duce la insuficien hepatic grav i deces. Insuficiena hepatic postoperatorie este o complicaie foarte grav a hepatectomiilor extinse, uneori fatal, mai ales la pacienii care au o boal cronic hepatic asociat. Unii autori sunt de prere c nu exist regenerare eficient dup rezecia ficatului cirotic, probabil pentru c este nevoie de o arhitectur normal a fibrelor de reticulin, astfel c rezecia la cirotici produce frecvent insuficien hepatic i moarte. Rezultatele unor studii clinice i experimentale (cu embolizare de ram portal) sunt ns pozitive i ncurajatoare n cazul unor carcinoame hepatocelulare asociate cu ciroz hepatic, lrgind indicaia acestor manevre preoperatorii n cazurile respective.74 n cazul ocluziei selective portale, hipertrofia lobului controlateral se datoreaz procesului de regenerare hepatic, iar atrofia lobului ipsilateral apare ca urmare a proceselor de necroz i apoptoz celular. Factorii care stimuleaz hipertrofia sunt de origine hepatic i extrahepatic. Sngele portal are un rol foarte important n procesul de regenerare. Aceste observaii au la baz diverse experimente pe modele animale. Mecanismele fiziologice implicate n declanarea hipertrofiei, ca i cele implicate n procesul de stopare a acestui fenomen, nu sunt complet elucidate. Exist studii care arat c iniirea rspunsului proliferativ ce apare dup ligaturarea unui ram portal precede i, n consecin, este independent de atrofia lobului corespunztor ramurii ligaturate. De fapt, rspunsul proliferativ care apare dup ligatura unui ram portal, poate fi mprit n dou faze: una precoce, care apare independent de apariia atrofiei, i o faz tardiv dependent de reducerea masei lobului nesupleat.75 Probabil, n prima etap, fluxul portal crescut prin ramura neligaturat, este rspunztor de iniierea proliferrii celulare. Cea de-a doua faz, tardiv, reprezint
proliferarea celular compensatorie, iniiat de atrofia hepatocitar din lobul corespunztor ramurii ligaturate. Dei au fost descrise modificri de structur celular importante n hemificatul deprivat portal, cum ar fi: depleia reticulului endoplasmic rugos i reducerea numrului poliribozomilor, mecanismul prin care atrofia iniiaz sinteza compensatorie de ADN hepatic este necunoscut. S-a observat ns c n lobul deprivat portal nu exist o reducere semnificativ a cantitii totale de ADN. Acest fapt a dus la concluzia c stimulii de iniiere a sintezei ADN nu depind de reducerea materialului nuclear ci mai degrab de o component plasmatic existent n hepatocitele atrofiate.76 n timpul regenerrii hepatice sunt reglate att proliferarea ct i apoptoza. Se pare c rolul cheie n procesul de atrofie hepatic dup ocluzia de ram portal l joac apoptoza. Acest fenomen de moarte celular programat difer de procesul de necroz prin aceea c este controlat activ i este nensoit de prezena necrozei. Se pare c gradul de obstrucie al venei porte influeneaz declanarea procesului de necroz sau de apoptoz. Un studiu experimental efectuat la obolani arat c ligatura parial de ven port induce atrofie prin reducerea volumului hepatocitar i prin apoptoz, semnalnd apariia necrozei numai la grade severe de ligatur (> de 68%). Acelai studiu arat c exist o relaie direct ntre creterea masei lobului ce se hipertrofiaz i reducerea masei celui ce se atrofiaz, iar gradul modificrilor de mas hepatic se coreleaz bine cu gradul de obstrucie portal.77 Assy i Minuk48 consider c rata de hipertrofiere a segmentelor hepatice fr ligatur se coreleaz cu gradul de cretere a fluxului portal. Acesta poate fi estimat prin ecografie Doppler la o zi dup embolizare. Pentru a obine un rspuns regenerativ bun trebuie ca fluxul prin ramul neocluzionat s se dubleze cel puin. Acest lucru se ntmpl chiar din a doua zi postligatur, fluxul portal rmnnd semnificativ crescut timp de dou sptmni. La pacienii la care se obine doar o cretere uoar a fluxului portal, hepatectomia trebuie practicat mai trziu, dup ce se obine un rspuns regenerativ suficient. Msurtorile volumetrice prin tomografie computerizat se efectueaz nainte i dup ocluzia portal. Se obin seciuni transverse seriate la intervale de 1 cm, ncepnd cu domul hepatic i terminnd cu extremitatea inferioar a ficatului. Se folosete substan de contrast i poziia pacientului cu respiraia oprit n expir. Fiecare seciune este delimitat apoi cu ajutorul cursorului iar aria hepatic este calculat de computer. Vena hepatic medie (VHM) i vezica biliar sunt folosite ca repere pentru delimitarea hemificatului drept de cel stng. Pentru calculul segmentului IV hepatic se folosesc ca
170
repere vena hepatic medie i poriunea ombilical a venei porte stngi. Volumul total se calculeaz apoi multiplicnd aria fiecrei regiuni calculate cu grosimea seciunii i adugnd toate volumele interval ale fiecrei pri. Rata estimat a parenchimului hepatic funcional restant (REPFR) se calculeaz dup formula:
Procentul de cretere a ficatului restant, dup ligatur sau ocluzie de ram portal se calculeaz astfel:78
Se consider c decizia de rezecie hepatic trebuie luat atunci cnd REPFR a crescut la mai mult de 40% i cnd testele funcionale hepatice au valori comparabile cu cele anterioare ocluziei portale. n figurile 6 i 7 sunt exemplificate dou cazuri la care s-a practicat ligatur de ram portal prehepatectomie, evaluate prin TC nainte i dup ligatura de ram portal. Insuccesul obinerii hipertrofiei adecvate n cazul ligaturii de ram portal poate fi explicat prin existena colateralelor porto-portale intrahepatice.79 Acesta este unul din motivele pentru care embolizarea portal este mai avantajoas. De asemenea, embolizarea portal nltur stress-ul chirurgical, putnd fi realizat prin puncie percutanat sub ghidaj ecografic, transhepatic, prin abord direct al venei porte. Un alt avantaj al embolizrii este i faptul c ea este urmat n timp de repermeabilizare, ceea ce mpiedic arterializarea ficatului cu obstrucie portal. De asemenea, procedeul poate fi repetat. Ligatura chirurgical a venei porte ofer avantajul explorrii i aprecierii exacte a leziunii i parenchimului normal hepatic, dar embolizarea se realizeaz printr-o tehnic mai uoar i nu determin modificri adereniale la nivelul hilului, cum se ntmpl dup ligatur. Unii autori iau n calcul anumite criterii, n vederea embolizrii portale, prehepatectomie. n cazul hepatectomiilor majore la pacieni cu boli hepatice severe, aceste criterii sunt urmtoarele: vrsta mai mic de 70 ani rata reteniei de verde indocianin (ICG) la 15 minute de la injectare 10% sau mai mic teste funcionale hepatice normale albumina seric cel puin 3 g/dL i bilirubina total sub 20 mmol/L
Fig.6 Tomografie computerizat. a) nainte de ligatura de ram drept portal ; Segm. IV, V, VI, VII, VIII - 1885 cm3; Segm. I, II, III - 493 cm3; b) La 3 luni de la ligatura de ram drept portal; Segm. IV, V, VI, VII, VIII - 1056 cm3; Segm. I, II, III - 516 cm3; (colecia Prof.dr. .Georgescu). timpul de protrombin s fie cel puin 80% din normal REPFR mai mare de 40% Urmrirea pacientului postembolizare se face monitoriznd: testele funcionale hepatice, AST, ALT i timpul de protrombin, rata reteniei de verde indocianin i volumetria TC. Pentru embolizare se folosesc diverse substane. Cele mai multe studii folosesc combinaii de substane embolizante (fie materiale trombozante i sclerozante asociate ntre ele, fie asocieri ntre acestea i substane radioopace). Printre substanele astfel folosite se numr: enbucrilatul (Histoacryl, Braun), gelul de fibrin, gelasponul, trombina, polidocanolul, etanolul, lipiodolul. n funcie de substana folosit, sunt publicate rezultate diferite n ceea ce privete mrimea hipertrofiei obinute.
171
comparaie cu alte substane, dei induce, n acelai timp, o cretere marcat a transaminazelor serice i o scdere a trombocitelor la mai puin de 50% din valoarea iniial. Un studiu recent folosete ca material de embolizare o mixtur format din gelaspon i polidocanol, injectat n vena port. Polidocanolul este o substan folosit n scleroterapia varicelor esofagiene, care determin tromboz i inflamaie cu necroz a venelor submucoase. n cazul ocluziei portale se pare c asigur o embolizare perfect, fr o recanalizare ulterioar. Compararea efectelor date de diverse substane embolizante este dificil de fcut deoarece patologia de baz i cea asociat hepatic, precum i vrsta pacienilor, difer in studiile efectuate. Probabil c, totui, diferii ageni embolizani sunt asociai cu efecte diferite de hipertrofiere a hemificatului neembolizat. Tolerarea mai bun a ligaturii de ram portal, cu evitarea sindromului de necroz tumoral (manifestat clinic prin dureri, grea, vrsturi i febr i paraclinic prin valori crescute ale enzimelor hepatice), se poate obine prin metode de ocluzie gradat a ramului portal (n cteva zile). Unii autori au aplicat aceast metod n cazul unor tumori hepatice nerezecabile la copii, asociat cu chimioterapie sistemic i intraarterial i cu ligatur de arter hepatic.82
BIBLIOGRAFIE
1. Cruveilhier LJB: Anatomie pathologique du corps humain, ou description, avec figures lithographies et colories, des diverses alterations morbides dont le corps humain est susceptible. J. B. Baillire. Paris.1829. 2. Rozga J: Animal models of liver regeneration. n Surgical Research. Souba WW, Wilmore DW (eds.). Academic Press. San Diego. 2001, cap. 50, 703-704. 3. Brockes JP, Kumar A: Plasticity and reprogramming of
Fig.7 Tomografie computerizat. a) nainte de ligatura de ram drept portal Segm. IV, V, VI, VII, VIII - 1535 cm3 Segm. I, II, III - 477 cm3 b) la 6 sptmni de la ligatura de ram drept portal Segm. IV, V, VI, VII, VIII - 1520 cm3 Segm. I, II, III - 503 cm3 (colecia Prof.dr. .Georgescu) Ishikawa i col.80 comunic obinerea unui raport ntre volumul hemificatului hipertrofiat i volumul total hepatic de la aprox. 30.8% la aprox. 39,8% dup embolizare, prin utilizarea combinaiei de gelaspon i trombin. Shimamura i col.81 obine o modificare a acestui raport de la 32,2% la 48,1% dup embolizare, utiliznd alcool absolut, pentru un efect permanent. De asemenea accentueaz faptul c alcoolul absolut pare s induc o regenerare mai rapid a lobului neembolizat, n
differentiated cells in amphibian regeneration. Nat Rev Mol Cell Biol 3:566-574, 2002. 4. Nagasue N, Yukaya H, Ogawa Y et al: Human liver regeneration after major hepatic resection. A study of normal liver and livers with chronic hepatitis and cirrhosis. Ann Surg 206:30-39, 1987. 5. Weglarz TC, Degen JL, Sandgren EP: Hepatocyte transplantation into diseased mouse liver. Kinetics of parenchymal repopulation and identification of the proliferative capacity of tetraploid and octaploid hepatocytes. Am J Pathol 157:1963-1974, 2000. 6. Fausto N: Liver regeneration. n The Liver: Biology and Pathobiology. Arias I (ed.). Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. 2001. 7. Gebhardt R: Metabolic zonation of the liver: regulation and implications for liver function. Pharmacol Ther 53:275-354, 1992. 8. Bucher NLR, Swaffield MN: The rate of incorporation of labeled thymidine into the deoxyribonucleic acid of regenerating rat liver in relation to the amount of liver excised. Cancer Res 24:16111625, 1964. 9. Mars WM, Liu ML, Kitson RP et al: Immediate early
172
detection of urokinase receptor after partial hepatectomy and its implications for initiation of liver regeneration. Hepatology 21:16951701, 1995. 10. Kim TH, Mars WM, Stolz DB et al: Extracellular matrix remodeling at the early stages of liver regeneration in the rat. Hepatology 26:896-904, 1997. 11. Rudolph KL, Trautwein C, Kubicka S et al: Differential regulation of extracellular matrix synthesis during liver regeneration after partial hepatectomy in rats. Hepatology 30:1159-1166, 1999. 12. Freeman TL, Ngo HQ, Mailliard ME: Inhibition of system A amino acid transport and hepatocyte proliferation following partial hepatectomy in the rat. Hepatology 30:437-444, 1999. 13. Davern TJ: Molecular therapeutics of liver disease. Clin Liver Dis 5:381-414, vi, 2001. 14. Kay MA, Fausto N: Liver regeneration: prospects for therapy based on new technologies. Mol Med Today 3:108-115, 1997. 15. Grays Anatomy. Williams PT, Warwick R, Dyson M et al (eds.). Churchill Livingstone. Edinburgh, London, Melbourne, NewYork. 1989, cap. 1, 37-38. 16. Fausto N: Hepatic regeneration. In Oxford Textbook of Clinical Hepatology. Bircher J, Benhamou JP, McIntyre N (eds.). Oxford University Press. Oxford. Ediia 2. 1999, 189-202. 17. Albrecht JH, Hansen LK: Cyclin D1 promotes mitogenindependent cell cycle progression in hepatocytes. Cell Growth Differ 10:397-404, 1999. 18. Thompson NL, Mead JE, Braun L et al: Sequential protooncogene expression during rat liver regeneration. Cancer Res 46:3111-3117, 1986. 19. Morello D, Fitzgerald MJ, Babinet C et al: c-myc, c-fos, and c-jun regulation in the regenerating livers of normal and H-2K/cmyc transgenic mice. Mol Cell Biol 10:3185-3193, 1990. 20. Haber BA, Mohn KL, Diamond RH et al: Induction patterns of 70 genes during nine days after hepatectomy define the temporal course of liver regeneration. J Clin Invest 91:1319-1326, 1993. 21. Lavenu A, Pistoi S, Pournin S et al: Both coding exons of the c-myc gene contribute to its posttranscriptional regulation in the quiescent liver and regenerating liver and after protein synthesis inhibition. Mol Cell Biol 15:4410-4419, 1995. 22. Hilberg F, Aguzzi A, Howells N et al: c-jun is essential for normal mouse development and hepatogenesis. Nature 365:179-181, 1993. 23. Taub R: Liver regeneration 4: transcriptional control of liver regeneration. FASEB J 10:413-427, 1996. 24. Iimuro Y, Nishiura T, Hellerbrand C et al: NFkappaB prevents apoptosis and liver dysfunction during liver regeneration. J Clin Invest 101:802-811, 1998. 25. Yamada Y, Webber EM, Kirillova I et al: Analysis of liver regeneration in mice lacking type 1 or type 2 tumor necrosis factor receptor: requirement for type 1 but not type 2 receptor. Hepatology 28:959-970, 1998. 26. Yamada Y, Fausto N: Deficient liver regeneration after carbon tetrachloride injury in mice lacking type 1 but not type 2 tumor necrosis factor receptor. Am J Pathol 152:1577-1589, 1998. 27. Fausto N: Liver regeneration. J Hepatol 32:19-31, 2000. 28. Du K, Leu JI, Peng Y et al: Transcriptional up-regulation of the delayed early gene HRS/SRp40 during liver regeneration. Interactions among YY1, GA-binding proteins, and mitogenic signals. J Biol Chem 273:35208-35215, 1998. 29. Tzung SP, Fausto N, Hockenbery DM: Expression of Bcl2 family during liver regeneration and identification of Bcl-x as a
delayed early response gene. Am J Pathol 150:1985-1995, 1997. 30. Fausto N, Laird AD, Webber EM: Liver regeneration. 2. Role of growth factors and cytokines in hepatic regeneration. FASEB J 9:1527-1536, 1995. 31. Tanahashi T, Imamura T, Suzuki M: Re-evaluation of FGF1 as a potent mitogen for hepatocytes. In Vitro Cell Dev 30A:139-141, 1994. 32. Ito N, Kawata S, Tamura S et al: Heparin-binding EGF-like growth factor is a potent mitogen for rat hepatocytes. Biochem Biophys Res Commun 198:25-31, 1994. 33. Michalopoulos GK: Liver regeneration: molecular mechanisms of growth control. FASEB J 4:176-187, 1990. 34. Webber EM, Fitzgerald MJ, Brown PI et al: Transforming growth factor-alpha expression during liver regeneration after partial hepatectomy and toxic injury, and potential interactions between transforming growth factor-alpha and hepatocyte growth factor. Hepatology 18:1422-1431, 1993. 35. Thoresen GH, Guren TK, Sandnes D et al: Response to transforming growth factor alpha (TGFalpha) and epidermal growth factor (EGF) in hepatocytes: lower EGF receptor affinity of TGFalpha is associated with more sustained activation of p42/p44 mitogenactivated protein kinase and greater efficacy in stimulation of DNA synthesis. J Cell Physiol 175:10-18, 1998. 36. Cotran RS: Cellular Pathology II: Adaptations, Intracellular Accumulations and Cell Aging. n Robbins Pathologic Basis of Disease. Cotran RS, Kumar V, Collins T et al (eds.). W. B. Saunders Company. 1999, cap. 19, 31-38. 37. Tomiya T, Ogata I, Fujiwara K: Transforming growth factor alpha levels in liver and blood correlate better than hepatocyte growth factor with hepatocyte proliferation during liver regeneration. Am J Pathol 153:955-961, 1998. 38. Tomiya T, Ogata I, Yamaoka M et al: The mitogenic activity of hepatocyte growth factor on rat hepatocytes is dependent upon endogenous transforming growth factor-alpha. Am J Pathol 157:1693-1701, 2000. 39. Webber EM, Bruix J, Pierce RH et al: Tumor necrosis factor primes hepatocytes for DNA replication in the rat. Hepatology 28:1226-1234, 1998. 40. Court FG, Wemyss-Holden SA, Dennison AR et al: The mystery of liver regeneration. Br J Surg 89:1089-1095, 2002. 41. Cressman DE, Greenbaum LE, DeAngelis RA et al: Liver failure and defective hepatocyte regeneration in interleukin-6-deficient mice. Science 274:1379-1383, 1996. 42. Yamada Y, Kirillova I, Peschon JJ et al: Initiation of liver growth by tumor necrosis factor: deficient liver regeneration in mice lacking type I tumor necrosis factor receptor. Proc Natl Acad Sci U S A 94:1441-1446, 1997. 43. Meyer M, Pahl HL, Baeuerle PA: Regulation of the transcription factors NF-kappa B and AP-1 by redox changes. Chem Biol Interact 91:91-100, 1994. 44. Aoki M, Morishita R, Taniyama Y et al: Therapeutic angiogenesis induced by hepatocyte growth factor: potential gene therapy for ischemic diseases. J Atheroscler Thromb 7:71-76, 2000. 45. LeCouter J, Moritz DR, Li B et al: Angiogenesisindependent endothelial protection of liver: role of VEGFR-1. Science 299:890-893, 2003. 46. Drixler TA, Vogten MJ, Ritchie ED et al: Liver regeneration is an angiogenesis - associated phenomenon. Ann Surg 236:703-711, 2002. 47. Kountouras J, Boura P, Lygidakis NJ: Liver regeneration after hepatectomy. Hepatogastroenterology 48:556-562, 2001.
173
48. Assy N, Minuk GY: Liver regeneration: methods for monitoring and their applications. J Hepatol 26:945-952, 1997. 49. Schneider WC, Greco AE: Incorporation of pyrimidine deoxyribonucleosides into liver lipids and other components. Biochim Biophys Acta 228:610-626, 1971. 50. Gratzner HG: Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science 218:474-475, 1982. 51. Rabes HM: Kinetics of hepatocellular proliferation after partial resection of the liver. Prog Liver Dis 5:83-99, 1976. 52. Hall PA, Levison DA, Woods AL et al: Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) immunolocalization in paraffin sections: an index of cell proliferation with evidence of deregulated expression in some neoplasms. J Pathol 162:285-294, 1990. 53. Wolf HK, Michalopoulos GK: Hepatocyte regeneration in acute fulminant and nonfulminant hepatitis: a study of proliferating cell nuclear antigen expression. Hepatology 15:707-713, 1992. 54. Gerdes J, Lemke H, Baisch H et al: Cell cycle analysis of a cell proliferation-associated human nuclear antigen defined by the monoclonal antibody Ki-67. J Immunol 133:1710-1715, 1984. 55. Shi SR, Key ME, Kalra KL: Antigen retrieval in formalinfixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. J Histochem Cytochem 39:741-748, 1991. 56. Sirri V, Roussel P, Trere D et al: Amount variability of total and individual Ag-NOR proteins in cells stimulated to proliferate. J Histochem Cytochem 43:887-893, 1995. 57. Feinberg AP, Vogelstein B: A technique for radiolabeling DNA restriction endonuclease fragments to high specific activity. Anal Biochem 132:6-13, 1983. 58. Minuk GY, Gauthier T, Benarroch A: Changes in serum and hepatic polyamine concentrations after 30%, 70% and 90% partial hepatectomy in rats. Hepatology 12:542-546, 1990. 59. Kwon AH, Inada Y, Uetsuji S et al: Response of fibronectin to liver regeneration after hepatectomy. Hepatology 11:593-598, 1990. 60. Chijiiwa K, Nakano K, Kameoka N et al: Proliferating cell nuclear antigen, plasma fibronectin, and liver regeneration rate after seventy percent hepatectomy in normal and cirrhotic rats. Surgery 116:544-549, 1994. 61. Kayano K, Yasunaga M, Kubota M et al: Detection of proliferating hepatocytes by immunohistochemical staining for proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in patients with acute hepatic failure. Liver 12:132-136, 1992. 62. Czaja MJ: Liver regeneration following hepatic injury. n Liver Growth and Repair. Strain AJ, Diehl AM (eds.). Kluwer Academic Publishers. Dordrecht. 1997, 28-49. 63. Kovalovich K, DeAngelis RA, Li W et al: Increased toxininduced liver injury and fibrosis in interleukin-6-deficient mice. Hepatology 31:149-159, 2000. 64. Eguchi S, Kamlot A, Ljubimova J et al: Fulminant hepatic failure in rats: survival and effect on blood chemistry and liver regeneration. Hepatology 24:1452-1459, 1996. 65. Kremer BC, Henne-Bruns D, Koonstra G: Atlas of liver, pancreas and kidney transplantation. Kremer BC, Henne-Bruns D, Koonstra G (eds.). Thieme. New York .1994. 66. Kawasaki S, Makuuchi M, Matsunami H et al: Living related liver transplantation in adults. Ann Surg 227:269-274, 1998. 67. Koeckerling F, Schneider C, Scheuerlein H et al: Intrahepatic vascular anatomy of the liver after regeneration. n Liver surgery. Koeckerling F, Schwartz SI (eds.). Barth JA. Heidelberg. 2001, cap. 5, 47-50.
68. Starzl TE, Porter KA, Putnam CW: Insulin, glucagon, and the control of hepatic structure, function, and capacity for regeneration. Metabolism 25:1429-1434, 1976. 69. Starzl TE, Porter KA, Francavilla A: The Eck fistula in animals and humans. Curr Probl Surg 20:687-752, 1983. 70. Rous P, Larimore LD: Relation of the portal blood to liver maintenance. A demonstration of liver atrophy conditional on compensation. J Exp Med 31:609-632, 1920. 71. Makuuchi M, Thai BL, Takayasu K et al: Preoperative portal embolization to increase safety of major hepatectomy for hilar bile duct carcinoma: a preliminary report. Surgery 107:521-527, 1990. 72. Kameoka N, Chijiiwa K, Saiki S et al: Advantage of preoperative portal vein occlusion for hepatectomy that exceeds portal vein occluded lobes. Surgery 123:545-553, 1998. 73. Popescu I, Ionescu M, Sirbu-Boeti P et al: Rezecie hepatic seriat - ligatur de ven port urmat de rezecie hepatic n timpul doi. Chirurgia (Bucur ) 97:459-470, 2002. 74. Lee KC, Kinoshita H, Hirohashi K et al: Extension of surgical indications for hepatocellular carcinoma by portal vein embolization. World J Surg 17:109-115, 1993. 75. Lambotte L, Li B, Leclercq I et al: The compensatory hyperplasia (liver regeneration) following ligation of a portal branch is initiated before the atrophy of the deprived lobes. J Hepatol 32:940945, 2000. 76. Fausto N, Hadjis NS, Fong Y: Liver hyperplasia, hypertrophy and atrophy and the molecular basis of liver regeneration. n Surgery of the liver and biliary tract. Blumgart LH, Fong Y (eds.). W.B. Saunders Company Ltd. London. 2001, cap. 3, 65-84. 77. Bilodeau M, Aubry MC, Houle R et al: Evaluation of hepatocyte injury following partial ligation of the left portal vein. J Hepatol 30:29-37, 1999. 78. Azoulay D, Castaing D, Krissat J et al: Percutaneous portal vein embolization increases the feasibility and safety of major liver resection for hepatocellular carcinoma in injured liver. Ann Surg 232:665-672, 2000. 79. Denys AL, Abehsera M, Sauvanet A et al: Failure of right portal vein ligation to induce left lobe hypertrophy due to intrahepatic portoportal collaterals: successful treatment with portal vein embolization. AJR Am J Roentgenol 173:633-635, 1999. 80. Ishikawa M, Yogita S, Iuchi M et al: Experimental and clinical studies on liver regeneration following transcatheter portal embolization. Hepatogastroenterology 47:226-233, 2000. 81. Shimamura T, Nakajima Y, Une Y et al: Efficacy and safety of preoperative percutaneous transhepatic portal embolization with absolute ethanol: a clinical study. Surgery 121:135-141, 1997. 82. Ikeda K, Hayashida Y, Suita S et al: Gradual occlusion of the portal branch with hepatic artery ligation for unresectable hepatic tumour in children. Z Kinderchir 32:121-128, 1981.
174

Cap 6

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Cap 6

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

CAPITOLUL

Cap.6 REGENERAREA HEPATIC Mihaela PAN, Irinel POPESCU

ABREVIERI ALT ALRf

Irinel POPESCU - CHIRURGIA FICATULUI

Mihaela PAN, Irinel POPESCU - REGENERAREA HEPATIC

Irinel POPESCU - CHIRURGIA FICATULUI

Mihaela PAN, Irinel POPESCU - REGENERAREA HEPATIC

Irinel POPESCU - CHIRURGIA FICATULUI

Mihaela PAN, Irinel POPESCU - REGENERAREA HEPATIC

Irinel POPESCU - CHIRURGIA FICATULUI

Mihaela PAN, Irinel POPESCU - REGENERAREA HEPATIC

Irinel POPESCU - CHIRURGIA FICATULUI

Mihaela PAN, Irinel POPESCU - REGENERAREA HEPATIC

Irinel POPESCU - CHIRURGIA FICATULUI

Mihaela PAN, Irinel POPESCU - REGENERAREA HEPATIC

Irinel POPESCU - CHIRURGIA FICATULUI

Mihaela PAN, Irinel POPESCU - REGENERAREA HEPATIC

Irinel POPESCU - CHIRURGIA FICATULUI

Mihaela PAN, Irinel POPESCU - REGENERAREA HEPATIC

Irinel POPESCU - CHIRURGIA FICATULUI

Mihaela PAN, Irinel POPESCU - REGENERAREA HEPATIC

Irinel POPESCU - CHIRURGIA FICATULUI

Mihaela PAN, Irinel POPESCU - REGENERAREA HEPATIC

S-ar putea să vă placă și