STREPTOCOCCACEAE

VASILICA UNGUREANU

MINIDEFINITIE
Microorganismele desemnate clasic ca aparinnd familiei Streptococcaceae, reprezint un vast ansamblu heterogen de coci : - sferici sau ovali, - gram(+), asezai in lanuri de diferite lungimi sau n perechi, - imobili sau rareori mobili, - nesporulai, - pretenioi nutritiv, - aerobi, cresterea poate fi favorizata de atm. de CO 2, facultativ anaerobi, - catalazo- si oxidazo-negativi, nu reduc nitraii, - fermenteaz glucoza cu producere de ac. lactic, fr gaz.

TAXONOMIE
Dupa 1980 noi criterii de taxonomie molecular au determinat i vor determina modificri importante n clasificare. Astfel, din genul Streptococcus s-au desprins urmtoarele genuri : - Enterococcus streptococii enterici - Lactococcus - streptococii din produsele lactate - Vagococcus streptococii mobili - Abiotrophia streptococii simbiotici dependeni de gruprile thiol, vitamina B6 sau piridoxal). Alte genuri nrudite cu streptococii sunt : - Aerococcus cu specia tip A. viridans - Gemella cu specia tip G. haemolysans - Leuconostoc - cu specia tip L. mesenteroides - Pediococcus - cu specia tip P. cerevisiae - Globicatella - Helcococcus

CLASIFICARE(1)
1. Dupa aspectul hemolizei: - streptococii -hemolitici coloniile sunt nconjurate de o zon bine delimitat de hemoliz complet; diametrul coloniilor, variabil n funcie de grupul antigenic, este de 4-5 ori mai mic dect diametrul zonei de hemoliz gr. A, C, G - streptococii `- hemolitici coloniile sunt nconjurate de o hemoliz incomplet, bordat de o zon ngust de -hemoliz gr. B - streptococii - hemolitici - coloniile sunt nconjurate de o zon de nverzire a mediului, prin hemoliza parial a hematiilor asociat cu reducerea Hb. eritrocitare - streptococii viridans i S. pneumoniae. - streptococii -hemolitici streptococii nehemolitici enterococii i unii streptococi orali

CASIFICARE (2)
2. Pe baza prezenei sau absenei antigenului specific de grup (poliozidul C din peretele celular, cu excepia grupului D la care antigenul specific este acidul glicerol-teicoic) streptococii se mpart n : - Streptococi grupabili Rebeca Lancefield : grupele AW, cu excepia literelor I i J - Streptococi negrupabili lipsii de antigenul specific de grup.

CLASIFICARE (3)

3. Pe baza analizei comparative a secvenelor ARNr 16S s-au conturat 6 grupri de specii, cu anumite corelaii patogenice i ecologice : 3.1. Grupul piogenic predomin specii patogene pentru om i diferite animale. Au semnificaie clinic deosebit pentru om. - SGA , Str. pyogenes -hemolitic, patogen prin excelen pentru om. - SGB, Str. agalactiae `-hemolitic, cu importan deosebit n patologia materno-fetal. - SGC, -hemolitic, determin infecii similare celor post S. pyogenes; specia dysgalactiae cu subspeciile dysgalactiae si equisimilis (poate avea antigen de gr A,C,G); specia equi cu subspeciile equi si zooepidemicus, avnd ca habitat variate animale i omul. - SGG, Str. canis- -hemolitic, determin infecii similare celor post S. pyogenes; avnd ca habitat variate animale. Aceste specii pot determina : - -hemoliza cu colonii minut, care pot exprima antigene de grup 3.2. Grupul anginosus, cu speciile : A, C, G si F (VP +) -hemoliza, sunt negrupabili. - Str. anginosus Microorganismele din acest grup fac parte din microflora oral, a tractului gastrointestinal i genital; pot determina infecii ale tractulu - Str. constellatus respirator superior, ale sistemului nervos central, a tractului digestiv i genito-urinar etc. - Str. intermedius

CLASIFICARE (4)
3.3. Grupul mitis - specii care fac parte din microflora oral si a tractului respirator super - include speciile : - S. mitis - S. oralis - S. sanguinis si parasanguinis (fost sanguis si parasanguis) - S.pneumoniae (dup structura molecular pneumococii sunt mai apropiai de gr. mitis dect de gr. piogenic). 3.4. Grupul salivarius specii care fac parte din microflora oral : - S. thermophilus - S. vestibulis - S. salivarius 3.5. Grupul bovis populeaza tractul intestinal al catorva specii animale si uneori la om; poate determina endocardita i meningita. 3.6. Grupul mutans specii care colonizeaz exclusiv suprafaa dinilor ( placa dentar) la om i unele animale ; sunt streptococii cariogeni.

CARACTERE MORFOTINCTORIALE
- Coci gram (+), sferici sau ovoizi, dispui n perechi (pneumococii) sau n lanuri lungi (din culturi n mediul lichid) sau mai scurte (din culturi pe mediul solid). - Din prelevatele patologice pneumococii se prezint sub forma cocilor gram (+), ovoizi sau lanceolai, dispui n diplo, nconjurai de capsul. - n culturi vechi pot deveni coci gram (-). - n mediile de cultur deficitare streptococii pot prezenta anomalii morfologice : coloraia gram va putea releva coci gram (+) i gram (-), celulele pot fi grupate n lanuri i pot prezenta aspecte normale, cocoide i ovalare, precum i forme bacilare sau chiar globuloase.

CARACTERE DE CULTURA
1.Aspectul creterii : pe mediile solide : - colonii S (smooth) mucoide, matt i glossy determinate de tulpini n ordinea scderii virulenei - colonii R(rough)-determinate de tulpini mai puin virulente - n mediile lichide : streptococii cresc - cu depozit i supernatant clar - cu depozit i tulburare omogen a mediului ( n cazul tulpinilor f. virulente sau streptococilor de grup B si D). 2. Aspectul hemolizei: 2.1. Pe geloza-snge de oaie streptococii dezvolt : - hemoliza (gr. A,C,G si uneori D) - hemoliza ` (gr. B) - hemoliza (str. viridans, pneumococii, streptococii din gr. D) - hemoliza (str. nehemolitici gr. D) 2.2. Pe geloza cu snge de cal unii streptococi hemoliza . -hemolitici pot determina

CARACTERE BIOCHIMICE
Aceste caractere sunt importante pentru identificarea streptococilor negrupabili i a enterococilor, ca de ex. : - fermentarea zaharurilor - hidroliza amidonului - hidroliza argininei - hidroliza esculinei - cresterea pe mediu cu bilesculin ( 40% bila) - cresterea pe mediu cu 6,5% Na Cl - dezvoltarea pe mediu cu trifenil tetrazolium clorid (TTC) - dezvoltarea pe mediu cu telurit de K

COMPONENTE ANTIGENICE - RASPUNS IMUN(I)

Localizare A. Endocelular Determinant antigenic 1. Proteinele M Raspuns imun Ac. anti M - ac. specifici de tip, protectori, apar trziu i asigur imunitate de lung du rat Celular Ac. anti MAP - apar tardiv, n complic. poststrept. tardive i n inf. strept. repetate Celular Ac. anti A CHO semnificaie i evoluie similar cu Ac. antiMAP Ac. anti prot. citoplasmatica Ac. anti ESS Celular Metode de detectare Testul bactericid in vitro; HAP; Lx-A ELISA; RIA

2. MAPprot. asociat proteinei M, nespecific de tip

in vivo IDR in vitro TTL, TIM Lx A RFC

3. A CHO carbohidratul specific de grup

in vivo IDR in vitro TTL, TIM Lx A HAP ELISA; RIA RFC ELISA in vivo IDR in vitro TTL, TIM

4. Proteina citoplasmatica 5. ESS 6. Celule strept. integrale

COMPONENTE ANTIGENICE - RASPUNS IMUN (II)

B. Exocelular 1. SLO Ac ASLO Celular R. de neutralizare Lx A; RFC in vivo IDR in vitro TTL, TIM R. de neutralizaretest de culoare substrat ADN R. de neutralizare substrat cheag de fibrina in vitro TTL R. de neutralizare substrat ac. hialuronic R. de neutralizare-in vivo R. Dick in vitro TTL R. de neutralizare substrat cazeina

2. DN-aza B

Ac anti DN-aza B

3. SK

Ac. anti SK

Celular 4. Hialuronidaza Ac. anti H

5. Eritrotoxina

Ac. antieritrotoxina Celular

6. Proteinaza

Ac. antiproteinaza

FACTORII DE VIRULENTA
1. F. aderen : prot. M fibrilar

- ALT - prot. de legare a fibronectinei (prot. F) 2. F. de invazie: - hialuronidaza - proteaza - streptokinaza 3. F. antifagocitari: - prot. M - capsula de ac. hialuronic - C5a peptidaza - leucocidinele SLO i SLS proteine secretate de streptococ, care omoar fagocitele

A. Prelevarea produselor patologice

1.

DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC (1) I. IZOLAREA

2. 3. 4.

In infectiile determinate de streptococii -hemolitici produsele patologice ce pot fi recoltate sunt f. variate : - exsudat faringian si nazal - sputa - l.c.r., lichid pleural, pericardic, peritoneal, periarticular - puroi - secreii vaginale, conjunctivale si auriculare - urina - snge etc. Prelevarea este difereniat pentru fiecare produs patologic n parte, cu respectarea normelor de asepsie. Recoltarea exsudatului faringian se efectueaz cu ajutorul unui tampon de vat montat pe o tij de lemn, sticl sau metal inoxidabil steril. Sputa necesit o preparare obligatorie : 2-3 splri n ser fiziologic steril pentru ndepartarea florei de asociaie oro-faringian.

DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC (2)

B. Transportul produselor patologice , cand nsmntarea nu se poate face imediat sau n timp de 2 4 h dup prelevare, se realizeaz cu ajutorul unui mediu selectiv i de mbogire ( bulion care conine azid de Na i cristal violet, la care se adaug n momentul folosirii 5% snge). Este un mediu n care produsele patologice se pot menine pn la 2 zile; nainte de nsmnare pe geloza snge se incubeaz 3-4 h la 37oC. C. Examenul direct al produsului patologic - examenul macroscopic (ex. : sputa, pentru a fi luat n lucru, trebuie s prezinte particule muco-purulente, fibrinoase, cu sau fr striaii sanghinolente etc.) - examenul microscopic : - nu este obligatoriu pentru exs. faringian pentru c nu ne poate da informaii asupra prezenei streptococilor -hemolitici, nsa se poate face diagnosticul diferenial cu angina difteric, fusospirilar sau candida. - este obligatoriu pentru produsele prelevate din situsuri anatomice, care n mod normal sunt sterile (l.c.r., lichid pleural, lichid articular etc. ), i din diferitele puroaie.

DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC (3)

D. Cultura nsmnarea se face direct pe geloza cu 5% snge de berbec sau cal pentru majoritatea produselor patologice, sau n bulion de hemocultur pentru snge. Incubarea se face n aerobioz; pentru produsele patologice recoltate din situsuri mai profunde se prefer incubarea n atmosfer de CO 2; timpul de incubare : 18 24 h, la 35 37oC. Citirea : prezena unor colonii cu diametrul de 0,5 mm, transparente, nconjurate de o zon bine delimitat de hemoliz total (-hemoliza), al crei diametru este de 3-4 ori mai mare dect diametrul coloniei ( streptococi de grup A, C sau G) prezena unor colonii cu diametrul de 1-2 mm, opace, gri-laptoase, bombate, cu o margine regulat, nconjurate de o hemoliz incomplet ( flu, estompat) ( streptococi de grup B) E. Izolarea n cultur pur Coloniile descrise mai sus se repic i se nsamaneaza pe geloz snge n vederea obinerii unei culturi pure, folosit mai departe pentru identificare

DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC (3) II. IDENTIFICAREA

Pe baza urmtoarelor caractere : 1. Caractere de cultur - pe geloz snge : colonii descrise mai sus - n mediu lichid : cretere cu depunere la fundul tubului, supernatantul rmnnd limpede (pentru str. de grup A, C i G); streptococii de grup B cresc cu tulburarea supernatantului. Tulburarea mediului se mai produce i n cazul tulpinilor de streptococi -hemolitici foarte viruleni. 2. Caractere morfotinctoriale : Coci gram (+), sferici sau ovoizi, dispui n lanuri lungi ( din culturi n mediul lichid) sau mai scurte ( din culturi pe mediul solid).

STREPTOCOCI

DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC (4)

3. Identificarea preliminara 3.1. Testul la bacitracin este un test screening pentru diferenierea prezumtiv a streptococilor de grup A de ceilali streptococi -hemolitici, tiind c streptococii de grup A sunt sensibili la bacitracin, iar cei non-A sunt rezisteni. Poate fi detectat sensibilitate la bacitracin i la anumite tulpini de streptococi -hemolitici de grup non-A (C si G ). 3.2. Testul CAMP (dup numele autorilor : Christie, Atkins i Munch-Petersen). Majoritatea streptococilor de grup B produc o protein difuzibil (factorul CAMP) care acioneaz sinergic cu -lizina stafilococic i determin liza complet a hematiilor de berbec sau de bou din mediul de cultur. 3.3. Testul PYR identific streptococii de grup A mai specific i tot aa de sensibil ca i testul la bacitracin. Substratul PYR (L-pyrrolidonyl-naphtylamida) este hidrolizat de 100% din streptococii de grup A, dar de nici unul din streptococii non-A. Enterococii dau de asemenea testul PYR pozitiv. 3.4. Testul SXT (sulfamethoxazol-trimethoprim) este un test de sensibilitate, folosit pentru diferenierea prezumtiv a streptococilor de grup A i B de ceilali streptococi -hemolitici. Majoritatea streptococilor de grup A i B sunt rezisteni la SXT atunci cnd culturile sunt incubate n atmosfer normal.

TEST LA BACITRACINA

STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE
Hemoliza Test la optochin

DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC (5)

4. Identificarea definitiva (pe baza caracterelor antigenice) 4.1. Identificarea de grup Rebecca Lancefield a fcut mprirea streptococilor n grupuri, notate cu literele alfabetului (de la A la W, cu excepia literelor I i J), pe baza polizaharidului (poliozid C) din peretele celulei streptococice , exceptnd streptococii de grup D al cror antigen specific de grup este acidul glicerol teicoic i care se afl in profunzimea celulei. Poate fi realizat prin metode diferite : 4.1.1.Reacia de precipitare interfacial ( n inel) - se efectueaz cu ajutorul serurilor hiperimune specifice pentru grupurile A, B, C, G etc. i a extractului antigenic. 4.1.2. Reacia de aglutinare pe lam este o reacie rapid i specific pentru serogruparea streptococilor -hemolitici aparinnd grupurilor A, B, C, D, F i G. Pentru aceasta pot fi efectuate dou metode de aglutinare: Latex agutinarea ( LA) Coaglutinarea (CoA) 4.2. Identificarea de tip Importan epidemiologic - pentru cunoaterea : - circulaiei germenilor ntr-o anumit perioad i zon; - filiaiei cazurilor ntr-un focar streptococic.

DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC (6)

4.2.1.Serotiparea streptococilor de grup A Serotipajul M : se realizeaz prin reacia de precipitare n tuburi capilare, ntre antigenul M (extras prin metoda Lancefield), i serul hiperimun specific anti M (peste 80 tipuri M). Serotipajul T : se realizeaz prin reacia de aglutinare pe lam ntre serurile hiperimune specifice anti T (~ 30 tipuri) i aceeai suspensie bacterian obinut pentru identificarea serogrupului streptococic, care a dat o reacie pozitiv cu reactivul CoA pentru grupul A. 4.2.2.Serotiparea streptococilor de grup B (S. agalactiae) Se poate realiza prin dou metode * : - Precipitare n inel - CoA

METODE MOLECULARE PENTRU CARACTERIZAREA STREPTOCOCILOR -HEMOLITICI ( S. pyogenes)

Tiparea emm tipare moleculara realizata prin amplificarea PCR si secventierea regiunii variabile 5` a genelor emm, gene care codifica proteina M MLST (Multilocus Sequence Typing) o metoda de caracterizare a tulpinilor bacteriene, utilizand secvente ale fragmentelor interne a sapte gene housekeeping; furnizeaza un important marker epidemiologic. PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) realizeaza analiza profilului de restrictie a ADN cromozomal prin electroforeza in gel de agaroza sub actiunea unui camp electric pulsat. Instrument de investigare a relatiilor genetice intre tulpini bacteriene apartinand aceleiasi specii. Detectarea factorilor de virulenta la S. pyogenes : detectarea genelor care codifica eritrotoxinele (speA, B, C, F, G, H, J, K, ssa si smeZ) Detectarea genelor de rezistenta la antibiotice prin hibridizarea ADN cu sonde specifice, PCR cu amorse specifice.

DIAGNOSTICUL IMUNOLOGIC
1. Investigarea rspunsului imun umoral 1.1.Decelarea anticorpilor fa de antigenele exocelulare:ASLO i Anti DN -az B, metodele cele mai frecvent folosite, care au la baz o reacie de neutralizare, caracterizate prin capacitatea anticorpilor din serul de bolnav de a neutraliza efectul biologic activ al antigenului corespunztor, care nu va mai aciona asupra substratului introdus n reacie. Titrarea acestor anticorpi are importan diagnostic n infeciile acute streptococice, ca i n puseele acute ale complicaiilor tardive nesupurative, decelarea Ac. ASLO avnd i valoare prognostic i de evaluare a eficacitii tratamentului, iar Ac. anti DN -az B au valoare diagnostic n infeciile streptococice cutanate i n complicaiile acestora GNA. Mai puin utilizat este decelarea celorlali Ac. antiproteine exocelulare: anti Hialuronidaz, anti Streptokinaz i anti NAD-az. 1.2.Decelarea anticorpilor fa de antigene streptococice endocelulare: ac. anti M, anti MAP i anti ACHO. Metodele cele m ai utilizate pentru titrarea acestor anticorpi sunt : Lx A i HAP; nivele crescute ale acestor anticorpi sunt ntlnite n special n complicaiile tardive poststreptococice, susinnd teoriile privind patogenia autoimun a acestor complicaii. 2. Decelarea rspunsului imun celular la diverse antigene streptococice endo- i exocelulare prin metode in vitro sau in vivo nu este realizat dect n scop de cercetare sau n cadrul unor contexte eseniale clinice (alergie sau sindroame cronice).

REACTIA ASLO
- Metoda Rantz i Randeall modificat - Principiu : reacie de neutralizare, bazat pe capacitate a Ac ASLO de a neutraliza activitatea hemolitic a SLO - Tehnica de lucru : - Tratarea serurilor de cercetat pentru ndeprtarea inhibitorilor nespecifici ai SLO: 0,2 ml ser de cercetat + 0,7 ml rivanol 0,4% agitare, 10 min. la temp. cam.; se adug apoi 1,1 ml soluie clorurat izoton - Centrifugare supernatantul reprezint diluia 1 / 10 a serului de cercetat - Se realizeaz diluia 1 / 100 : 0,5 ml din dil. 1/10 + 4,5 ml soluie clorurat izoton - se realizeaz diluia 1 / 500 : 1 ml din dil. 1/100 + 4 ml soluie clorurat izoton - din diluiile 1/100 i 1/500 se repartizeaz n tuburi, conform tabelului - Pstrare la +40C peste noapte. - Citirea i interpretarea rezultatelor : titrul este dat de diluia cea mai mare de ser care a inhibat total activitatea hemolitic a SLO. Titrul normal este considerat pn la 200 ui / ml

REACTIA ASLO*

Dilutii ser Ser bolnav diluat Sol. clorurata izotonica SLO 1 u c / ml 0,8 0,2 0,5

1/10 0,2 0,8 0,5 1 0,5 0,8 0,2 0,5

1/100 0,6 0,4 0,5 0,4 0,6 0,5 0,3 0,7 0,5 1 0,5 0,8 0,2 0,5

1/500 0,6 0,4 0,5 0,4 0,6 0,5 0,2 0,8 0,5

M hem. 1,5 0,5

M. SLO 1 0,5

Agitare, 15 min. la 37oC Hematii iepure 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Agitare, 45 min. la 37oC Titru ui ASLO/ml 12 50 100 125 166 250 333 500 625 833 1250 2500 hemoliz a absenta hemoliz a

* Pentru scopuri uzuale clinice se poate folosi o schema redusa, cu 5 tuburi, reprezentata de coloanele marcate cu rosu