Dioxidul de carbon supercritic (SC-CO2) Extragerea compuilor flavonoidici bioactivi din frunzele de iarb crea (Mentha spicata L.

)
Abstract
Compuii flavonoidici au fost extrai din frunzele de iarb crea (Mentha Spicata L.), folosind extracia cu dioxid de carbon supercritic (SC-CO2). Parametrii de presiune, temperatur i timp de extracie dinamic au fost studiai ntr-un aranjament factorial complet ntr-o aranjare complet fortuit. Rezultatele au artat c presiunea, temperatura i timpul de extracie dinamic au avut un efect semnificativ asupra eficienei extraciei. Cea mai mare eficien a extraciei (60,57 mg/g) a fost obinut la 200 de bari, 60 C i 60 de minute. Cmpurile extrase au fost apoi analizate prin cromatografie lichid de nalt performan (HPLC), pentru cuantificarea compuilor flavonoidici bioactivi majori. Compoziia cmpurilor extrase a fost puternic influenat de condiiile de operare. n cele mai bune condiii de extragere (200 de bari, 60 C i 60 de minute), luteolina prezenta cea mai nalt concentraie (0,657 mg/g) dintre toi ceilali compui flavonoidici detectai. Descoperirile actuale au demonstrat c iarba crea este o surs potenial de compui flavonoidici bioactivi. n plus, extragerea de dioxid de carbon supercritic este un proces promitor i alternativ pentru recuperarea compuilor flavonoidici bioactivi din frunzele de iarb crea (Mentha spicata L.) cu nalt concentraie. Cuvinte cheie: Iarba crea (Mentha spicata L.), Flavonoid bioactiv, Dioxid de carbon supercritic (SC-CO2) Extragere, Luteolin, HPLC 1. Introducere n mod tradiional, extragerea de compui bioactivi din ierburi a fost ndeplinit prin distilarea cu aburi i extragerea de solveni organici utiliznd filtrarea, macerarea i tehnicile Soxhlet. Totui, utilizarea acestor tehnici implic un timp lung de extragere, o eficien sczut, reziduuri toxice de solveni, o operare laborioas i o degradare a compuilor termosensibili. Aceste dezavantaje pot fi evitate utiliznd procesul de extragere cu fluid supercritic (SFE). SFE este o metod aflat ntr-o rapid dezvoltare de a produce compui bioactivi prin pur tehnologie, n condiii neprefereniale. Caracteristica unic a acestui sistem este utilizarea de gaze aflate dincolo de punctul critic pentru a extrage compui selectiv solubili

dintr-un material brut. Dioxidul de carbon este cel mai utilizat solvent in SFE, de vreme ce este fiziologic inofensiv, sigur din punctul de vedere al mediului, non-exploziv, repede disponibil i uor de nlturat din produse. n ultimii ani, civa cercettori au studiat extragerea de componente naturale din matricea plantelor utiliznd dioxid de carbon supercritic. Astzi, extragerea prin fluide supercritice, care a fost dezvoltat n 1960, este n mod larg utilizat ca o metod atractiv de extragere alternativ fa de extragerea prin lichid convenional ntr-o gam variat de domenii, incluznd industriile alimentare, farmaceutice i ingineria mediului. Optimizarea condiiilor experimentale reprezint un pas important n dezvoltarea unui proces SFE de succes, datorit efectului avut de diverse variabile asupra eficienei extragerii. Optimizarea metodei analitice poate fi ndeplinit folosind cteva tehnici statistice, ca, de exemplu, optimizarea simpl sau design-ul factorial. Antioxidanii naturali din plantele surs pot pur i simplu inhiba oxidarea n produsele alimentare. Flavonoidele au fost studiate amnunit, de vreme ce sunt nite antioxidani foarte eficieni i mai puini toxici dect antioxidanii sintetici, precum BHA, BHT i aa mai departe. Aceti compui sunt foarte des ntlnii n fructe, legume, ceaiuri i plante medicinale. Iarba crea aparine genului Mentha, familia labiateae (Lamiaceae). Genul Mentha, care const din aproximativ 25-30 de specii, incluznd iarba crea, izma, ment slbatic, menta american, menta coreean, dintre care iarba crea este cea mai cunoscut. Menta are un efect digestiv pozitiv i potenial caloric, iar gustul este neptor. Ierburile din familia Lamiaceae au fost indicate ca o surs potenial de antioxidani naturali. Prin urmare, este interesant s descoperim o metod eficient i optimizat pentru izolarea compuilor flavonoidici bioactivi din frunzele de iarb crea. Obiectivele prezentei lucrri au fost de a investiga efectul ctorva parametri SFE (presiune, temperatur i timp de extracie dinamic) asupra extragerii de dioxid de carbon supercritic al compuilor flavonoidici bioactivi din frunzele de iarb crea. Acest studiu a fost fcut cu urmtoarele scopuri: (i) descoperirea parametrilor potrivii de extragere pentru izolarea compuilor flavonoidici, (ii) extragerea i determinarea compoziiei profilului compuilor flavonoidici. SFE a uleiului esenial de iarb crea a fost anterior studiat, dar, din ceea ce se cunoate, nu exist niciun raport n ceea ce privete extragerea compuilor flavonoidici ai ierbii cree malaeziene cu ajutorul fluidelor supercritice. 2. Materiale i metode 2.1 Materiale i reactivi

Frunzele de iarb crea au fost obinute din Cameron Highlands, Pahang, Malaezia. Dup recoltare, frunzele au fost separate i splate sub jet de ap. Frunzele au fost uscate la 40 C, ntr-un cuptor de uscare cu ventilaie (1350 FX, USA) vreme de 24 de ore, apoi depozitate la temperatur ambiental ntr-un loc ntunecos. Pentru a evita degradarea, materialul biologic uscat a fost presat chiar nainte de extragere. Frunzele uscate ale plantei au fost mrunite ntr-un blender vreme de 10 secunde, pentru a se obine o pudr cu dimensiunea aproximativ a particulelor de 0,53 mm. 2.2 Extragerea cu dioxid de carbon supercritic (SC-CO2) Experimentele de extragere cu dioxid de carbon supercritic au fost efectuate folosind un extractor de fluid supercritic (ABRP200, Pittsburgh, PA, USA) cu un volum al vasului de extracie de 500 ml. Debitul de CO2, temperatura de extracie i presiunea au fost ajutate folosind software ICE, iar timpul de extracie a fost msurat. S-a furnizat CO 2 dintr-o butelie de gaz. nainte ca dioxidul de carbon lichid s treac n vasul de extracie, a fost presurizat la presiunea dorit i nclzit la temperatura specificat, prin intermediul unei pompe (P-50, Pittsburg, PA, USA), pentru a atinge starea supercritic. Etanolul absolut a acionat ca modificator. Debitul de dioxid de carbon supercritic a fost meninut la 15 g/min i, de asemenea, durata perioadei de extracie static a fost fixat la 30 min. Pudra din frunze de iarb crea (30 g) a fost amestecat cu 90 g de mrgele de sticl (2,00 mm n diametru) i plasat n vasul extractor. S-a executat, apoi, extracia n condiii experimentale variate n conformitate cu gradul factorial integral al design-ului complet fortuit. Toi compuii extrai au fost colectai cu ajutorul etanolului. Pentru ndeprtarea etanolului, compuii extrai au fost evacuai prin vacuum, utiliznd un evaporator rotativ la 40 C. Apoi, extrasul a fost aezat ntr-un cuptor, la 40 C, vreme de 30 de min, nainte de a fi transferat ntr-un exsicator, pentru greutatea constant final. A fost apoi utilizat o msurtoare gravimetric, pentru a obine greutatea extrasului total. n final, substanele extrase obinute n condiiile optime i de control SFE au fost transferate n recipiente din sticl maro i depozitate ntr-un congelator pn la analiza HPLC. Extraciile au fost fcute n duplicat. Diagrama schematic a extractorului cu fluid supercritic a fost prezentat n figura 1. Figura 1: Diagrama schematic a extractorului cu fluid supercritic 2.3 Analiza prin cromatografie lichid de nalt performan Substanele extrase, care au fost obinute din condiiile SFE optime i controlate, au fost analizate folosind cromatografia lichid de nalt performan (HPLC), care const dintr-o pomp de control a apei Water 600, un detector de absorbie a razelor UV cu cadran, echipat

cu o coloana de faz reversibil Eclipses XDR C18. Volumul injectrii era de 20 l. A fost utilizat un software clasic Millenium 2010 pentru manipularea procesrii datelor. Faza mobil utilizat pentru analiz a fost solventul A: TFA 2,5 pH n ap deionizat, iar solventul B const din 100% metanol (HPLC). De asemenea, a fost necesar metanol 70% pentru splarea sistemului. Flavonoidele au fost detectate la 280 mm. Toi principalii compui flavonoidici au fost identificai comparnd timpul lor de retenie cu cel al compuilor standard. Temperatura a fost setat la temperatura camerei, iar debitul a fost setat la 1,0 ml/min. Calculele cantitative au fost fcute n conformitate cu calibrarea linear a curbelor de standarde. 2.4 Analiza statistic Optimizarea metodei poate fi ndeplinit pas cu pas sau utiliznd un design experimental. n aceast lucrare, SFE a frunzelor de iarb crea a fost planificat conform CRD, pentru un cmp de extracie mai larg. Factorii i nivelurile investigate au fost prezentate n tabelul 1. Datele au fost supuse unei analize de varian (ANOVA) i multiple teste de comparare au fost ndepilnite utiliznd diferena cel mai puin semnificativ (LSD), la un grad de credibilitate de 95%. Toate analizele au fost efectuate utiliznd software statistic. O valoare probabilistic de <0,05 a fost considerat semnificativ. Tabelul 1: Niveluri experimentale ale factorilor utilizai n CRD complet factorial. 3. Rezultate i discuie 3.1 Efectul condiiilor de extracie a dioxidului de carbon supercritic asupra cmpului de extracie al frunzelor de ment Optimizarea condiiilor experimentale reprezint un pas important n dezvoltarea unei metode SFE de succes, datorat efectului diverilor parametri asupra cmpului de extracie. n mod general, presiunea de extracie, temperatura i timpul dinamic sunt considerate a fi cei mai importani factori. n acest studiu, factorialul complet cu CRD a fost folosit pentru a optimiza condiiile de extracie. O evaluare complet a efectului a trei factori selectai de pe trei niveluri i experimente duplicate asupra cmpului de extracie au necesitat 54 (3 x 3 x 3 x 2) experimente. Rezultatele cmpului de extracie au fost exprimate ca fiind cmpul extrasului brut dup cum urmeaz: Y extract (mg/g) = m extract / m herb 1000 Unde m extract este masa extrasului brut (g) i m herb este masa materialului verde extras. Figura 2 prezint variaia cmpurilor de extracie, obinut n diverse condiii experimentale. Valorile medii ale celor trei niveluri ale fiecrui parametru au artat cum se modific cmpul de extracie atunci cnd nivelul acelui parametru este modificat. Cea mai

ridicat valoare medie a cmpului de extracie a fost obinut la 200 de bari, 60 C, semnificativ, n conformitate cu testul t (valoarea P > 0,05). Prin urmare, lund n considerare costurile economice i degradarea compuilor sensibili ntr-un timp de extracie lung, 60 min timp dinamic de extracie (cu un cmp de extracie de 60,57 mg/g) a fost preferat altor niveluri testate de timp dinamic pentru extracia cu dioxid de carbon supercritic a flavonoidelor din frunzele de iarb crea. Rspunsul mediu al fiecrui nivel pentru cmpul de extracie este prezentat n tabelul 2. Valoarea K, care este menionat n tabelul 2, reprezint aria dintre trei rspunsuri medii ale fiecrui nivel al cmpului de extracie. Din valoarea K se poate trage concluzia c temperatura (cu o valoare a K de 10,58) a avut un efect dominant asupra cmpului de extracie, dup care a fost urmat de presiune (cu o valoare K de 10,38) i timp dinamic (cu o valoare K de 8,12). Figura 2: Cmpurile de extracie cu ajutorul dioxidului de carbon supercritic sub CRD factorial complet. Tabelul 2: Rezultatele obinute la condiionarea experimental folosind CRD complet factorial. 3.1.1 Efectul temperaturii Figura 3 arat efectul temperaturii asupra cmpului de extracie a frunzelor de iarb crea ntr-o extracie cu dioxid de carbon supercritic, la trei niveluri de temperatur, de 40, 50 i 60 C. Densitatea dioxidului de carbon la presiune constant este redus o dat cu creterea temperaturii i duce la scderea puterii de dizolvare a dioxidului de carbon supercritic. Efectul temperaturii asupra solubilitii este diferit la presiunile aflate n limita critic. n apropiere de presiunea critic de sistem, densitatea fluidului este foarte sensibil la temperatur. Acesta ar putea fi motivul pentru care cmpul de flavonoide s-a modificat n mod semnificativ atunci cnd temperatura a trecut dincolo de limita de 40-60 C. O cretere moderat a temperaturii poate duce la o extins descretere n densitatea fluidului, avnd drept consecin reducerea solubilitii. Totui, creterea temperaturii va accelera, de asemenea, transferul de mas i va mbunti cmpul de extracie. Creterea temperaturii poate duce la creterea presiunii gazoase a compuilor extractabili. Astfel, tendina compuilor de a fi extrai este mrit, pentru a ajunge n faza de fluid supercritic. Pentru un solubil volatil, exist o competiie ntre solubilitatea sa n dioxid de carbon supercritic i volatilitatea sa. Prin urmare, este dificil de prezis efectul temperaturii. n prezentul studiu, cmpul de extracie a crescut o dat cu temperatura, iar cel mai ridicat cmp de extracie

(60,57 mg/g) a fost obinut la 60 C. n acest fel, presiunea vaporului solubil a jucat un rol cheie, ducnd la creterea cmpului de extracie. Figura 3: Efectul temperaturii asupra cmpului de extracie a extrasului brut la presiune constant. 3.1.2 Efectul presiunii Figura 4 prezint efectul presiunii asupra cmpului de extracie al frunzelor de iarb crea n dioxid de carbon supercritic, folosind trei niveluri de presiune, de 100, 200 i 300 de bari. Conform rezultatelor obinute, cmpul de extracie a crescut o dat cu presiunea de la 100 la 200 de bari, acest lucru datorndu-se creterii densitii dioxidului de carbon supercritic la presiuni mai ridicate. Totui, o cretere a nivelului de presiune la peste 200 de bari a dus la o neateptat reducere a cmpului de extracie. Acest rezultat neateptat poate fi legat de ratele reduse de difuzare a compuilor extrai din matricea plantei, aflat ntr-un mediu de fluid supercritic. Prin urmare, n acest studiu, cel mai mare cmp de extracie a fost atins la 200 de bari i, la o presiune mai ridicat de 200 de bari, s-a obinut o eficien mai sczut a extraciei, mai sczut dect cea ateptat de mbuntirile solubilitii existente la presiuni mai mari (peste 200 de bari). O mrire a presiunii poate duce la o cretere n ce privete densitatea fluidului, care altereaz solubilitatea materiaului solubil. Gomes et al. (2007) au indicat faptul c se obine o mai mare recuperare a fraciilor volatile i o mai redus recuperare a fraciilor nonvolatile, la presiune mare. Prin urmare, este interesant s controlm compoziia extractului utiliznd presiunea. n acest studiu, cmpul de flavonoide a crescut o dat cu creterea presiunii pn la o anumit valoare. Dincolo de aceast valoare de presiune, densitatea mai crescut a fluidului se presupune a fi principalul mecanism care duce la obinerea unui cmp mai mare de flavonoide. Dincolo de aceast limit de presiune, s-a observat o descretere a cmpului de flavonoide o dat cu creterea presiunii. Volatilitatea i polaritatea analiilor extrai ar putea fi responsabile de rezultat. Figura 4: Efectul presiunii asupra cmpului de extracie al extrasului brut. 3.1.3 Efectul cmpului de extracie dinamic Figura 5 prezint efectul timpului dinamic asupra cmpului de extracie al frunzelor de iarb crea, cu ajutorul dioxidului de carbon supercritic, la aplicarea a trei niveluri diferite de timp dinamic inclus: 30, 60 i 90 de min. La presiunea de 100 de bari, cmpul de extracie a crescut o dat cu timpul dinamic pn la 90 de minute. Totui, la presiuni mai ridicate (200 i 300 de bari), cmpul de extracie a crescut o dat cu timpul de extracie dinamic pn cnd a ajuns la 60 min. Se poate trage concluzia c puterea de dizolvare a densitii de dioxid de

carbon supercritic este redus la 100 de bari presiune datorit unei densiti mai reduse de dioxid de carbon, iar cmpul maxim a fost obinut la 90 min. Totui, la presiuni mai ridicate (200 i 300 de bari), rata de extracie este mai ridicat i, n consecin, cmpul de extracie a continuat s creasc, dar, dup 60 min de timp de extracie, cmpul de extracie a sczut. Prin urmare, aa cum se arat n figura 5, cel mai mare cmp de extracie a fost atins la un timp dinamic de 60 min. Figura 5: Efectul timpului de extracie dinamic asupra cmpului de extracie a extrasului brut la presiune constant 3.2 Identificarea i cuantificarea compusului extras Conform testelor preliminare, condiiile optime pentru extragerea flavonoidelor din iarba crea au fost: presiune 200 bari; temperatur de extracie, 60 C; timp dinamic, 60 min. Produsul acestor condiii optime a fost analizat prin HPLC , pentru a determina coninutul principalilor compui flavonoidici din extrasele de iarb crea. De asemenea, produsul celorlalte dou condiii SFE, care au inclus nivelul minim (100 bar, 40 C, 30 min) i maxim (300 bar, 60 C, 90 min.) ale fiecruia dintre parametrii studiai ca sisteme de control a fost analizat prin HPLC. n acest studiu, a existat o problem n ceea ce privete aplicarea metodei standard de hidrolizare a glicozidelor flavonoide n extrasele de iarb crea. Chiar i atunci cnd s-au folosit condiii dure de hidroliz (refluxare vreme de dou ore cu 6 M HCL, metanol pur i ap), nu a fost posibil s crem o hidroliz complet pentru a produce tot agliconul liber pentru cuantificare. Toi compuii flavonoidici au fost identificai asociind timpul de retenie i caracteristicile lor spectrale cu cele standard. Cuantificarea coninuturilor flavonoidice menionate n diverse extracte brute de iarb crea, obinute n condiii optime i controlate a fost calculat din curbele de calibrare ale compuilor standard. Identificarea i cuantificarea detaliate ale compuilor extrai prin SFE n diverse condiii au fost prezentate n Tabelul 3. Figura 6 ilustreaz separarea mixturii standard a opt flavonoide. O bun separare ar putea fi obinut ntr-un timp de reparare scurt, de 40 min. Extractele au fost analizate utiliznd HPLC: figurile 7-9 reprezint trei cromatografe, care prezint compui flavonoidici n cmp, atunci cnd sunt extrai cu SFE la: 100 bar, 40 C, 30 min (condiia minim ca variant de control). 200 bar, 60 C, 60 min (condiia optim). 300 bar, 60 C, 90 min (condiia maxim ca variant de control).

Conform rezultatelor, variaiile n concentraia compuilor flavonoidici au fost evidente. Condiia optim a fost mai eficient dect parametrii studiai la nivelurile minim i maxim, pentru obinerea compuilor flavonoidici bioactivi din frunzele de iarb crea. Sub nivelul minim al fiecrui parametru, patru compui flavonoidici incluznd (+) catechin, (-) epicatechin au fost extrai cu o concentraie mai mare i au exista multe reziduuri. Totui, folosind condiia optim, apte bioflavonoide active, incluznd (+) catechin, (-) epicatechin, rutin, miricetin, luteolin, apigenin i naringenin au fost detectai ca avnd o bun separare i o nalt concentraie. n produsul obinut n condiii optime, luteolina (0,66 mg/g) a avut cea mai ridicat concentraie ntre flavonoide. Determinarea a apte flavonoide, incluznd (+) catechin, (-) epicatechin, miricetina, luteolina, apigenina, naringenina i kaempferolul a fost fcut n extrasul obinut la niveluri maxime pentru fiecare parametru. Pe baza rezultatelor pentru extracia kaempferolului, comparat cu celelalte flavonoide studiate, au fost necesare o presiune mai mare i un timp de extracie mai lung. Prin urmare, ar putea exista un nou compus flavonoidic al ierbii cree, obinut prin utilizarea unei presiuni mai ridicate sau a unui timp de extracie mai lung. Utiliznd doar HPLC, nu a fost posibil s identificm toi compuii flavonoidici n extractul de iarb crea. Izolarea i identificarea suplimentar Tabelul 3: Identificarea i cuantificarea compuilor extrai prin SFE n diverse condiii Figura 6: HPLC Cromatogram a mixturii standard Figura 7: HPLC Cromatogram a nivelului minim (40 C, 100 bar i 30 min) ale fiecruia dintre parametrii studiai. Figura 8: HPLC Cromatogram a nivelului optim (60 C, 200 bar i 60 min) ale fiecruia dintre parametrii studiai. Figura 9: HPLC Cromatogram a nivelului maxim (60 C, 300 bar i 90 min) ale fiecruia dintre parametrii studiai. 4. Concluzie Recuperarea n numr mare a compuilor bioactivi din frunzele de iarb crea poate fi fcut prin extracia cu dioxid de carbon supercritic. Potrivit rezultatelor, condiia optim pentru SFE a compuilor flavonoidici a fost gsit a fi la 200 bari, 60 C i 60 min. Cel mai mare efect asupra cmpului de extracie i selectivitii extraciei a fost observat ca avndu-l temperatura, urmat de presiune i timpul de extracie dinamic. S-a demonstrat c iarba crea este o surs potenial de compui flavonoidici; de exemplu, la condiia SFE optim, componentelor chimice din iarba crea a necesitat munc

luteolina (0,657 mg/g) a avut cea mai ridicat concentraie printre ceilali compui flavonoidici detectai. Pentru extragerea celorlali compui fenolici este posibil s fie nevoie de presiuni mai ridicate i de timpi de extracie mai mari. De asemenea, sunt n desfurarea alte studii, menite a evalua cantitativ puterea antioxidant a extractului i mbogirea antioxidanilor n diverse condiii de extracie.