Universitatea Lucian Blaga Sibiu, Facultatea de tiine, Profil Biologie Aplicat

Bacterii modificate genetic Detergeni i alte

aplicaii

Bacterii modificate genetic Detergeni i alte aplicaii Bacteriile sunt microorganisme monocelulare de tip procariot cu un cromozom unic, cu dimensiuni medii ntre 0,5 i 8 nm, care se nmulesc asexuat prin sciziune binar, izomorf. Sunt rspndite pe cele mai diverse medii, ca urmare a producerii de enzime inductive, care le permit utilizarea n nutriie a compuilor organici macromoleculari (celuloz i alte poliglucide, protide, lipide). n raport cu temperatura, bacteriile se dezvolt ntr-un domeniu larg, (10C i +90C); majoritatea bacteriilor-ageni de alterare a alimentelor, sunt bacterii mezofile i dau alterri la temperatura camerei (bacterii de putrefacie). Bacteriile n forma vegetativ sunt inactivate pe cale termic la temperaturi de pasteurizare, iar sub form de endospori, la temperaturi de sterilizare. n raport cu oxigenul, majoritatea bacteriilor sunt aerobe (bacterii acetice), altele care cresc n semiaerobioz (bacterii lactice), iar un grup restrns de bacterii sunt adaptate s creasc n strict anaerobioz (bacterii butirice). Bacteriile se pot dezvolta n domeniu de pH = 1-11, cu zone optime la valori acide pentru bacterii acidotolerante (bacterii acetice, lactice) sau la valori neutre pentru bacterii de putrefacie. Ele sunt lipsite de nucleu i membran nuclear, cu un singur cromozom de tip liniar sau circular, alctuit dintr-o macromolecul de ADN dublu-catenar. n celula bacterian s-a realizat o cretere substanial a cantitii de informaie genetic comparativ cu formele acelulare de via, datorit complexitii structurilor i funciilor sale. De exemplu, la bacteria Escherichia coli, foarte utilizat n cercetrile de genetic, numrul de gene al genomului su este de aproximativ 3 000, aproximativ jumtate din genom fiind deja decodificat, iar harta genetic a bacteriei, n mare parte realizat. Escherichia coli este o bacterie care triete n intestinele organismelor cu snge cald. Este o bacterie lactozo-pozitiv (descompune lactoza), gram-negatiz, oxidazo-negativ, ce apare la microscop sub form de bastonae. Bacteriile E. coli nu sunt ntotdeauna limitate la intestin, i abilitatea lor de a supravieui pentru perioade scurte de timp n afara corpului ce le face un organism-indicator ideal pentru a testa probe de mediu de contaminare fecal. Bacteria poate fi, de asemenea, cultivat cu uurin i genetica sa este relativ simpl i uor de manipulat sau duplicat printr-un proces mutagenic, fcndu-l unul dintre cele mai

bine studiate organisme procariote model, i o specie important n domeniul biotehnologiei i microbiologie. Ageni chimici care acioneaz prin alterarea permeabilitii peretelui celular. Aceste substane cu aciune de suprafa distrug semipermeabilitatea membranei celulare, provocnd dereglarea permeabilitii i alterarea coninutului protoplazmatic cu pierderea N i P din corpul bacterian, cu scderea concentraiei de metabolii intracelulari, unelori liza peretelui celular. Detergenii sintetici sunt substane valoroase, cu aciune de suprafa; au n molecula lor dou grupri: una solubil n grsimi (hidrofob) i alta solubil n ap (hidrofil). n general grupele hidrofile sunt polare, ionizabile, sau molocula este electric asimetric; grupele hidrofobe sunt electric simetrice i nu ionizeaz, exemplu radicalii hidrocarburi. Activitatea de suprafa prin micorarea tensiunii superficiale nu apare dect in compui cu catene hidrocarbonate (-R) mai lungi de C8, grupul cel mai important este format din baze cuaternare cu lanuri lungi de carbon cu o grupare activ, hidrofil, care este cationul de amoniu cuaternar. Cei patru atomi de hidrogen sunt nlocuii cu radicali arilici sau alifatici de diferite lungimi (R4N+). n soluii apoase, ca rezultat al disociaiei, se formeaz cationi cu ncrctur pozitiv (radicalul amoniu), care migreaz si se adsorb pe suprafaa membeanei celulare. Se constat o pierdere a ncrcturii negative, fiind nlocuit cu ncrctura pozitiv a cationilor. Rezult distrugerea semipermeabilitii membranei celulare cu pierderea din celul a N i P i cu ptrunderea n interior a substanei, care va determina denaturarea proteinelor active, disocierea proteinelor conjugate i liza peretelui celular. La St. marcescens marcat cu C14, supus aciunii compuilor cuaternari de amoniu, s-a vzut c efectul bactericid este cauzat de ruperea i liza membranei celulare. La o concentraie joas se constat o interferen cu reacii productoare de energie, precum i cu creterea i reproducerea bacterian. Agenii cationici sunt mai activi la pH alcalin, unde vor precipita proteinele care au punct izoelectric negativ. Detergenii cationici sunt activi la o concentraie de 1:3000 pn la 1:30000, cu eficacitate egal fa de germenii gram-pozitiv si gramnegativ. Au o larg utilizare n industria textil, alimentar, de buturi etc., datorit lipsei lor de toxicitate. Zefirolul (alkildimetilbenzilamoniu clorur, Domagk, 1955) este primul compus dintr-o clas foarte numeroas a detergeniilor sintetici cu o activitate de suprafa. Este folosit n seciile chirurgicale, n concentraie de 1:1000, ca antiseptic al pielii. Detergenii anionici sunt spunurile (sruri de Na i K ale acizilor grai) i acizii grai. Acizii grai nesaturai, cu lan lung oleic, linoleic, liber sau ca spun, au aciune bactericid sau bacteriostatic asupra

multor bacterii. Spunurile de K sau Na ale acizilor oleic sau linoleic n concentraie de 1:500 - 1:5000 lizeaz pneumococul. Streptococii, bacilii difterici, bacilii tuberculoi au o sensibilitate asemntoare. Au eficacitate mai mare fa de germenii gram pozitivi, acioneaz mai bine la pH acid, unde proteinele au o sarcin pozitiv i agenii anionici reacioneaz cu proteinele pe care le precipit. Detergenii sunt substanele care faciliteaz emulsionarea murdriei. Enzimele amplific efectul detergenilor descompunnd petele din interiorul esturii. n substanele pentru splat se conin, de asemenea, i fosfai pentru dedurizarea apei. Ei previn formarea calcarului, evitndu-se astfel blocajul aciunii detergentului. Dar fosfaii au o aciune nefast asupra mediului, iar enzimele permit splarea fr adaosul fosfailor. Enzimele sunt produse de microorganisme. Eficacitatea acestora este constant ameliorat, astfel nct ele sunt active la temperaturi joase si rezist la aciunea altor componente. Cu toate ca exist detergeni de origine vegetal (spun n baz de ulei de msline etc.), dou treimi sunt de genez petrolier, utilizate nc din 1980. Spunurile prezint o puternic aciune selectiv fa de bacterii; majoritatea germenilor patogeni, izolai din aparatul respirator, sunt omori mai uor de spunurile acizilor grai nesaturai, pe cnd majoritatea germenilor patogeni intestinali sunt mai sensibili fa de spunurile acizilor saturai. Se consider c spunurile acioneaz asupra poriunii lipidice a membranei semipermeabile a celulelor. Fenolii i crezolii se obin din gudronul rezultat din distilarea crbunelui. Fenolul (C6H5OH) este unul din cei mai vechi dezinfectani, dar nu este prea des folosit. n soluie de 1-2% omoar cele mai multe forme vegetative, n concentraie de 0.5% este folosit la conservarea vaccinurilor i serurilor; ClNa i mrete eficacitate, iar alcoolul etilic i-o reduce. Prin introducerea de grupri alifatice n inelul benzenic se obin crezolii cu eficacitatea crescut. De asemenea, dac n inelul benzenic se introduc halogeni, prin substituie, crete activitatea bactericid; aceeai aciune se obine prin adaos de spun de K. Aceste substane dezinfectante adsorbite pe suprafaa celulei bacteriene n concentraie mare produc liza peretelui celular, cu pierderea aminoacizilor i a altor metabolii principali. Alte cercetri arat c aceti compui pot inactiva sistemul enzimatic, mai ales de hidrogenazele i oxidazele. Impactul sistemelor de detergeni asupra supravieuirii bacteriei pe materialele textile splate. Conform unui studiu realizat de JAMES M. JASKA i DALE L. FREDELL s-a observat supravieuirea lui Staphylococcus aureus pe mostrele inoculate splate cu un detergent pe baz de fosfat sau substitut de fosfat. ntr-un studiu de design

Plackett-Burman, variabilele independente ale tipului de detergent, ale concentraiei i ale variaiei, ale temperaturii apei de splare, ale gradului de murdrie, ale timpului de splare i a duritii apei au primit valori maxime i valori minime. S-a folosit ap cu temperaturile de 27, 38, 49 i 600 C. S-a recuperat bacterie viabil de pe mostrele macerate. Analiza statistic a relevat c nu a existat nicio diferen practic n capacitatea detergenilor pe baz de fosfat sau nlocuitor de fosfat de a reduce nivelul de S. aureus de pe mostrele splate n acest design controlat. Analizele au dezvluit, totui, c temperatura apei a reprezentat cea mai important variabil independent. Celelalte variabile se pare c nu au avut nicio semnificaie practic asupra reducerii bacteriei. Acest studiu bacteriologic nu a evaluat alte caracteristici eseniale ale detergentului. Bacteriile - primele organisme care au fost modificate genetic sunt folosite pentru replicarea i modificarea genelor care sunt ulterior introduse n plante sau animale. Sistemele bacteriene se preteaz la manipulare genetic n parte datorit ratelor lor de reproducere rapide. Este uor de a produce o populaie identic genetic - o clon de bacterii - toate coninnd gena de interes ntr-o perioad scurt de timp. Celulele pot fi apoi lizate i ADN-ul poate fi izolat n scurt timp. A devenit o rutin utilizarea bacteriilor, pentru producerea proteinelor nebacteriene. Un exemplu este producerea de proteine pure pentru folosirea lor la vaccinuri. Astfel de proteine pot fi sigure i la fel de eficiente ca i vaccinurile care conin (ageni) patogeni inactivi sau atenuai (slbii). Ingineria genetic poate produce, de asemenea, schimbri importante n metabolismul bacteriei. De exemplu, bacteriile pot primi diferite gene, enzime (codificate) care permit producerea de alcool carburant din lemn. Cercettorii au profitat de natur pentru a modifica bacteria. Plasmidele sunt molecule de ADN cu capacitate de autoreplicare. Aceast capacitate de replicare este dat de prezena unui segment iniiator care este recunoscut de ADN polimeraza. De exemplu, o plasmid care conine un antibiotic permite acestei bacterii gazd de a contracara microbi concureni. Alternativ, o bacterie ar putea s posede o plasmid care conine rezistena la antibiotice. Plasmidele sunt uor izolate din celulele bacteriene i pot fi modificate in vitro prin introducerea sau eliminarea unor secvene specifice de ADN. Deoarece ele pot fi folosite pentru a crea clone de gene, plasmide sunt numite vectori de clonare. Transferul artificial al unei gene care aparine unei specii ntr-un alt organism poart numele de tehnologia ADN recombinant sau manipulare genetic. Un important moment n dezvoltarea manipulrii genetice l au enzimele de restricie. Ele au proprietatea de a recunoate o anumit secven i de a tia ADN-ul la nivelul acestora.

Este important deoarece prin utilizarea unei enzime de restricie specifice putem modela locul n care este tiat o caten sau molecul de ADN. Exist unele enzime care n funcie de locul unde vor tia, vor genera aa numitele "capete lipicioase", adic extremiti complementare. Exprimarea genelor eucariote n bacterii prezint alte probleme. Dup ce proteinele sunt asamblate n celulele eucariote, sunt adesea modificate. De exemplu, diverse zaharuri pot fi ataate la polipeptid, astfel nct s se formeze glicoproteine. Bacteriile sunt, n general, incapabile de a realiza astfel de modificri post-translaionale, iar genele eucariote exprimate n bacterii pot s nu funcioneze corect. Incapacitatea bacteriilor de a efectua astfel de modificri a condus oamenii de tiin s foloseasc drojdia de bere (Saccharomyces cerevisiae) i culturi de celule eucariote pentru a produce unele produse de recombinare. Preocupri legate de sigurana utilizrii bacteriilor recombinante au aprut odat cu dezvoltarea tehnologiei. Unii se tem c noi ageni patogeni umani netratabili ar putea fi generai n mod neglijent. n 1974, cercettori de marc i-au impus o amnare privind anumite experimente pn cnd au putut evalua pericolele. Dup multe discuii, oamenii de tiin au dezvoltat nite proceduri de izolare biologic. Acestea includ generarea de ADN recombinant numai n bacterii care au mutaii care s mpiedice supravieuirea lor n afara laboratorului. Eliberarea de microbi recombinani n mediu rmne controversat. Bacteriile modificate genetic sunt folosite acum n diferite scopuri, i sunt importante, n special, n producerea cantitilor mari de proteine umane pure folosite n medicin. Primul exemplu de acest gen a avut loc n anul 1978, atunci cnd Herbert Boyer, pe cnd lucra n laboratoarele Universitii din California, a luat o variant a genei insulinei umane i a introdus-o n bacteria Escherichia coli, pentru a produce insulin uman sintetic. Patru ani mai trziu, a primit avizul F.D.A. al S.U.A. Industria de medicamente s-a folosit de aceast descoperire, n ncercarea sa de a produce medicamente pentru diabetici. Bacterii similare au fost folosite pentru a produce factori de coagulare pentru tratarea hemofiliei i hormoni de cretere umani, pentru tratarea diferitelor forme de nanism. Aceste proteine recombinante sunt mai sigure dect produsele pe care le nlocuiesc, din moment ce produsele vechi au fost purificate din cadavre i puteau transmite diverse boli. ntr-adevr, proteinele derivate de la oameni au provocat multe cazuri de SIDA i hepatit C hemofilicilor, i boala Creutzfeldt-Jakob, n cazul hormonului de cretere. Spre exemplu, bacteria care provoac cariile dentare poart denumirea de Streptococcus mutans. Aceast bacterie consum zaharurile rmase n cavitatea bucal, producnd acid lactic care

corodeaz smalul dinilor i, n consecin, provoac cariile. Recent, oamenii de tiin au modificat Streptococcus mutans astfel nct s nu mai produc acid lactic. Aceast bacterie transgenic, colonizat adecvat n cavitatea bucal a unei persoane, ar putea reduce apariia cariilor dentare. Microbi transgenici au mai fost folosii n cercetri recente n ncercarea de a distruge sau de a opri dezvoltarea tumorilor, i n ncercarea de a lupta cu boala Crohn. Bacterii modificate genetic mai sunt folosite n unele soluri pentru a ajuta dezvoltarea culturilor, i mai pot fi utilizate la producerea unor chimicale toxice pentru duntorii culturilor agricole. Bacterii modificate genetic au mai fost folosite i la extragerea cuprului din minereuri, la curarea mercurului n caz de poluare i la detectarea arsenicului n apa potabil. Alte utilizri ale bacteriilor modificate genetic: Particip la prevenirea transmiterii malariei de la nari Cercettorii de la Johns Hopkins Malaria Research Institute au modificat genetic o bacterie ntlnit n intestinul narului, descoperind c parazitul care provoac malaria la om nu supravieuiete n narii cu respectiva bacterie modificat genetic. Bacteria respectiv, Pantoea agglomerans, a fost modificat pentru a secreta proteine toxice parazitului productor de malarie, ns aceste toxine nefiind duntoare narului sau omului. Conform unui studiu publicat de PNAS, bacteria modificat a avut efect n procent de 98% la reducerea parazitului provocator de malarie din nari. n acest studiu, Marcelo Jacobs-Lorena i colegii si au descoperit c tulpini modificate de P. agglomerans au inhibat dezvoltarea celui mai mortal parazit provocator de malarie pentru om, Plasmodium falciparum, i a parazitului provocator de malarie la roztoare, Plasmodium berghei, cu pn la 98%, n interiorul narului. Proporia narilor purttori ai parazitului a sczut cu pn la 84%. Malaria ucide peste 800.000 de persoane anual, la nivel global. Muli sunt copii. Cercetarea a fost sprijinit de ctre National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Bill & Melinda Gates Foundation, Johns Hopkins Malaria Research Institute i Bloomberg Family Foundation. Particip la fabricarea biocombustibilului Cercettorii au proiectat o ntreag "linie de producie molecular" n celule bacteriene care pot astfel produce un fel de alcool care nu este produs n mod normal de ctre organismele vii. Acest alcool ar putea servi drept un biocombustibil eficient deoarece, spre deosebire de etanol, are o energie mare i ar putea fi utilizat n benzin i n combustibilul de avioane. Dei bacteriile modificate genetic nu sunt nc suficient de eficiente pentru producerea de biocombustibil la scar comercial, cercetarea arat c microbii pot fi proiectai pentru a produce

produsele chimice care nu sunt n repertoriul naturii. Informaia a aprut n Proceedings of the National Academy of Science. ncepnd cu anii 1970, oamenii de tiin au fost capabili de a modifica celule, prin introducerea de gene strine n ADN-ul celulei. Aceast gen poate purta codul genetic pentru o protein - poate insulin uman sau o protein care duce la obinerea unor plante rezistente la boli. Dar aceast abordare de bioinginerie funcioneaz doar pentru obinerea unor proteine, care sunt molecule mari, complexe. Pentru a produce molecule mici, cum ar fi cele ale unor alcooli, celulele utilizeaz n mod normal mai multe proteine ca pe nite "roboi" ntr-o linie de asamblare, care, pas cu pas, transform alte molecule n moleculele alcoolului dorit. Liao i colegii si au proiectat trei proteine "robot" care prelungesc liniile de asamblare metabolice ale bacteriei E. coli, astfel nct aceasta poate produce molecule de alcool. Cnd echipa a introdus genele artificiale ce codeaz aceste proteine n bacterii, bacteriile au nceput s produc alcooli cu molecule ce conin ntre cinci i opt atomi de carbon (pentanoli-octanoli). Alcoolii cu molecule mai mari conin mai mult energie dect cei cu molecule mici (cum este etanolul) i sunt, de asemenea, mai uor de separat de ap, care este mediul n care triesc bacteriile vii, un element important pentru producia industrial la scar mare. Proiectarea de gene artificiale pentru a obine astfel de linii de producie este mult mai dificil dect nserarea doar a unei gene de la specii diferite. Aceast form mai ambiioas de inginerie genetic este adesea numit inginerie metabolic, o parte a unui domeniu larg numit biologie sintetic. Aceast cercetare este o mare dezvoltare n biologia sintetic, i o minunat demonstraie a modului n care bioingineria poate fi pus n practic. Utiliznd catalizatorii fizici se pot obine de asemenea molecule de alcooli cu mase moleculare mai mari din zaharurile plantelor, dar o abordare biologic are cteva avantaje. Metodele biologice sunt de obicei mult mai specifice i mai bine controlate. n plus, reaciile biologice au loc n condiii blnde, la o temperatur mai mic de 30 37 grade Celsius i la presiune sczut, n comparaie cu conversiile chimice tipice, care au loc la temperaturi i presiuni nalte. Aceti bioalcooli cu molecule mai mari dect etanolul ar putea servi de asemenea drept materie prim regenerabil pentru industria chimic, care n prezent utilizeaz petrol ca materie prim, pentru a face de toate, de la mase plastice la ngrminte. n agricultur Un grup de studeni ai Universitii din Bristol a folosit o secven de ADN, special creat n laborator, pentru a modifica bacteria E. coli n beneficiul agriculturii.

Acest organism nou creat, intitulat "agrEcoli", va fi util fermierilor din ntreaga lume. Astfel, microcapsule ce conin bacteria E. coli urmeaz s fie pulverizate pe terenurile cultivate. Bacteria modificat a fost "programat" s detecteze nivelul de nutrieni din sol, reacionnd printr-o strlucire fluorescent ce arat cultivatorului dac zona respectiv necesit mai mult ngrmnt sau dac exist suficiente substane nutritive. Aceste inovaii agricole, ce devin posibile pe msur ce tehnologia permite modificarea genetic a microorganismelor, constituie o veste bun n perspectiva creterii populaiei planetei.

Bibliografie
1) Petru Raicu, 1997 Genetica general, editura Humanitas, Bucureti; 2) Prof. N. Nestorescu, 1965 Bacteriologie medical, editura medical, Bucureti; 3) James M. Jaska, Dale L. Fredell, 1980 - Impact of Detergent Systems on Bacterial Survival on Laundered Fabrics, Research and Development, Economics Laboratory, Inc., St. Paul, Minnesota 55118 4) http://ro.wikipedia.org/wiki/Escherichia_coli 5) http://en.wikipedia.org/wiki/Genetically_modified_bacteria 6) http://www.learner.org/courses/biology/textbook/gmo/gmo_2.htm l

7) http://www.revista-informare.ro/showart.php?id=109&rev=4 8) http://www.jhsph.edu/news/news-releases/2012/jacobs-lorenabacteria.html