RAPORT TIINIFIC ASUPRA UNOR EFECTE BIOLOGICE ALE PRODUSULUI DE BAZ PULBERE NANOSOF 1.

Experimente pe cord izolat de obolan perfuzat n sistem Langendorff Studiul a urmrit decelarea de efecte aritmogene sau antiaritmice, efecte asupra contractilitii miocardului ventricular, aspra debitului coronarian, i asupra capacitii de refacere dup ischemie ntr-un model de ischemie global ale suspensiei produsului pulbere de baz Nanosof la diferite diluii, administrat la nivelul unui preparat de cord izolat. Soluia folosit pentru perfuzie a fost de tip Krebs-Henseleit (n mM: CaCl 2 1.75, KCl 4.70, KH2PO4 1.2, MgSO4 1.2, NaCl 118, NaHCO3 25, D-glucose 11), filtrat steril prin aspirare cu vacuum cu filtre de acetat de celuloz cu diametrul porilor 0.45 m, saturat cu carbogen (95% O2 5% CO2) i stocat n pungi de perfuzie etane. Aparatul Langendorff conine 3 ci de administrare a soluiilor, un ventil superior de eliminare a bulelor de gaz, un corp de sticl termorezistent cu perei dubli constituind o camer umed termostatat pentru gzduirea cordului izolat. Circuitul de nclzire a fost asigurat print-un sistem de termostatare cu refrigerare Haake K15 cu pomp de recirculare. Temperatura soluiei la nivelul cordului izolat a fost msurat cu un termocuplu de tip T IT-18 (Physitemp Instruments, Clifton, NJ) i a fost setat la 37 C. Presiunea de perfuzare a fost reglat prin nlimea coloanei de lichid (~100 cm H 2O). n majoritatea experimentelor de ischemie-reperfuzie global cordul a fost complet imersat n soluie Krebs-Henseleit degazat prin fierbere pe durata ischemiei. Experimentele au fost realizate pe cord izolat de obolan Wistar adult mascul (300-350 g). Dup anestezie cu eter, a fost deschis larg cavitatea toracic. Cordul a fost recoltat, canulat pe ghea i montat n sistemul de perfuzie Langendorff. ntr-un set de experimente s-a realizat o dubl monitorizare: a presiunii ventriculare stngi cu un cateter cu balona de construcie proprie cuplat la un traductor de presiune cu punte conductimetric SensoNor840, i a unei derivaii electrocardiografice cu un set de doi electrozi: canula metalic implantat n segmentul ascendent al aortei i un fir de Pt-Ir cu diametrul de 0.1 mm implantat n grosimea peretelui ventricular. Ambele semnale electrice au fost amplificate i filtrate cu amplificatoare de instrumentaie AC/DC Grass CP122 i convertite numeric cu o unitate Digidata 1440A (Axon Instruments, part of Molecular Devices, Sunnyvale, CA) comandat de pClamp10. Agentul farmacologic de testat n suspensie la diferite diluii a fost aplicat direct n sistemul de perfuzie, momentele schimbrii soluiilor fiind marcate cu tag-uri. Prepararea suspensiei din produsul pulbere de baz Nanosof s-a realizat prin amestecarea unei cantiti de 25 mg produs (forma oxigenat, de culoare ruginie, cu proprieti paramagnetice, ultrasonat) n 25 ml soluie Krebs-Henseleit filtrat i tratat cu carbogen, suspendare prin agitare mecanic, urmat de centrifugare la 2000 rcf timp de 2 min fr frn pe o centrifug Heraeus Labofuge 400R cu rotor swing-out, i colectarea doar a supernatantului. Diluia primar, folosit n majoritatea experimentelor, a fost obinut prin diluie 1:100 a supernatantului (de exemplu 5 ml adugai ntr-o pung de perfuzie cu 500 ml soluie Krebs-Henseleit). ntr-un experiment separat au fost testate direct efectele supernatantului n diluii zecimale succesive pn la 10-7 pe un preparat de cord izolat fr ischemie global.

Tabel 1. Sumarul experimentelor de testare a efectelor suspensiei produsului pulbere de baz NANOSOF pe modelul de cord izolat de obolan n sistem de perfuzie Langendorff Nr. Cod identificare Descriere experiment exp. nregistrare (xx-x-xx=an-luna-zi) #7 11 1 03 000 ischemie global 30 min (CONTROL) #8 a1 1 03 000 ? (ischemie regional) #9 11 1 10 000 ? (control) #10 11 1 14 000 ischemie global (CONTROL) #11 a1 1 14 000 NANOSOF diluii progresive #12 11 1 20 000 NANOSOF concentraii progresive (fr TAG-uri) 001 002 #13 11 1 22 000 NANOSOF 1:100 fr ischemie (efect bradicardizant, debit coronarian redus; stimulare mecanic) #14 a1 1 22 000 ischemie-reperfuzie 30 min cu NANOSOF 1:100 (refacere spectaculoas a activitii electrice i mecanice dup ischemie artefact de obstrucie temporar a cateterului de monitorizare LVP ?) #15 11 1 25 001 ischemie-reperfuzie 30 min (CONTROL) #16 a1 1 25 000 ischemie-reperfuzie 30 min (NANOSOF 1:100 pe toat durata) #17 b1 1 25 000 ischemie-reperfuzie 30 min (NANOSOF 1:100 pe toat durata) #18 experiment ratat #19 11 2 04 000 ischemie-reperfuzie 30 min (NANOSOF 1:100 n reperfuzie tardiv la 30 min dela reperfuzie - duce la repornirea cordului !) #20 11 2 04 001 ischemie-reperfuzie 30 min (NANOSOF 1:100 n reperfuzie) #21 11 2 18 000 ischemie-reperfuzie 45 min (CONTROL) #22 a1 2 18 000 ischemie-reperfuzie 45 min (NANOSOF 1:100 n reperfuzie) Tabel 2. Debite coronariene nregistrate n experimentele de testare a efectelor suspensiei produsului pulbere de baz NANOSOF pe modelul de cord izolat de obolan n sistem de perfuzie Langendorff Nr. Cod identificare Timp Debit coronarian Observaii exp. nregistrare (ml/min) (xx-x-xx=an-luna-zi) #13 11 1 22 000 2:30 2.3 2:31 NANOSOF 1:100 2:37 2.5 2:42 stimulare 2:45 1.8 mecanic 2:58 1.4 2:45 schimbare Krebs normal

#14 a1 1 22 000

#15 11 1 25 001

#16 a1 1 25 000

#17 b1 1 25 000

3:10 3:25 3:29 3:31 3:35 3:45 3:47 Reperfuzie 1 4 6 8 13 15 18 21 24 27 30 33 39 45 51 58 17 26 40 50 60 Reperfuzie 64 (10) 69 (15) 76 83 90 5 30 36 40 Reperfuzie 5 10 20 25 30 10

6.8 6.4 6.8 6.2 5.8 4.0 4.0 1.6 2.6 1.8 1.6 1.6 1.6 1.6 1.4 1.4 1.2 1.2 1.2 1.2 1 1 1 6.5 6.8 9.0 7.9 6.2 8 8.5 8.0 6.5 5.6 4 9.4 12 10 7 6.3 6.0 5.2 6.0 11

37.8 C *

Schimbare normal

Krebs

crash Record #2 54=12:24

NANOSOF

#19 11 2 04 000

#20 11 2 04 001

20 30 40 Reperfuzie 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 10 15 20 25 30 Reperfuzie 2 5 10 15 20 25 30 45 47 50 53 59 10 15 20 25 30 Reperfuzie 2 5 10 15 20 25

10, 10.6, 10.4, 10.8 10.4 9.8, 8.8 5 4.3 4.3 4.2 4.2 4.0 4.0 nu s-a msurat nu s-a msurat 3.8 3.6 15 13 12 5.5 6 6 5 6.5 6 6 5.5 4.5 22 22.5 19 17 17.5 17 12.5 11.5 9 8.5 8

cobort de 3 ori

end-distolic

NANOSOF

Tratament reperfuzie

numai

NANOSOF

Min 12 normal

Krebs

#21 11 2 18 000

#22 a1 2 18 000

30 35 45 50 60 Reperfuzie 2 5 10 15 20 25 30 30 40 50 Reperfuzie 2 5 10 15 20 25 30
3 1 2 4

7.5 6.8 10 10 6.5 5.8 4.75 4.25 8.5 7.2 10 5.5 5.7 5.75 5.75 Fixare NBF

NANOSOF

300

200 Tag 1 2 4 . 0 3 2 0 0 m in <none>

LV P (c m H 2O )

100

-10 0 6 Tag 2 4 9 . 2 9 0 6 7 m in <none>

2 E C G le a d (m V )

-2

-4

-6 0 20 40 T im e ( m in ) 60 80 100

11103000.abf: 1/3/2011 12:08:59

ischemie global 30 min (CONTROL)

13 300

42

200 Tag 1 1 4 . 7 2 8 5 3 m in <none>

LV P (c m H 2O )

100

-100 Tag 2 4 8 . 3 3 2 8 0 m in <none>

10

E C G le a d (m V )

-5

-10

20

40 T im e ( m in )

60

80

a1103000.abf: 1/3/2011 15:06:42 ? (ischemie regional)

3 1 2 4

300

200 LV P (c m H 2O )

100

Tag 1 1 2 . 1 0 6 6 7 m in <none>

100

50

E C G le a d (m V )

-50

-100 0 20 40 T im e ( m in ) 60

11110000.abf: 1/10/2011 16:17:59 ? (control)

13 300

42

200 Tag 1 2 1 . 1 1 7 8 7 m in <none>

LV P (c m H 2O )

100

-100 100 Tag 2 5 0 . 7 7 1 2 0 m in <none>

50

E C G le a d (m V )

-5 0

-100 0 20 40 T im e ( m in ) 60 80

11114000.abf: 1/14/2011 11:34:32

ischemie global (CONTROL)

3 1 2 4

150 Tag 1 4 . 6 7 4 1 3 m in <none> Tag 2 3 0 . 5 9 6 2 7 m in <none> Tag 3 3 5 . 6 6 2 9 3 m in <none> Tag 4 5 2 . 3 2 8 5 3 m in <none> Tag 5 8 1 . 5 8 7 2 0 m in <none> Tag 6 8 4 . 4 9 4 9 3 m in <none> Tag 7 9 2 . 6 0 1 6 0 m in <none> Tag 8 1 0 7 . 4 5 8 1 3 m in <none>

100

LV P (c m H 2O ) E C G le a d (m V )

50

-50 100

50

-50

-100 0 20 40 60 T im e ( m in ) 80 100

a1114000.abf: 1/14/2011 13:46:55

NANOSOF diluii progresive

40

LV P (c m H 2O ) E C G le a d (m V )

20

0 100

50

-5 0

-10 0 0 5 10 15 T im e ( m in ) 20 25 30

11120000.abf: 1/20/2011 12:07:21

1 200 2 3

NANOSOF concentraii progresive (fr TAG-uri)

4

150

LV P (c m H 2O ) E C G le a d (m V )

100

50

0 100

50

-50

-100 0 20 T im e ( m in ) 40 60

11120001.abf: 1/20/2011 12:55:12

NANOSOF concentraii progresive (fr TAG-uri)

1 100

23

80

60 LV P (c m H 2O ) E C G le a d (m V )

40

20

0 100

50

-50

-100 0 50 100 150 T im e ( m in ) 200 250 300

11120002.abf: 1/20/2011 14:04:45

1 2 3 4

NANOSOF concentraii progresive (fr TAG-uri)

100

LV P (c m H 2O ) E C G le a d (m V )

50

-50

100

50

-50

-100 0 50 T im e ( m in ) 100 150

11122000.abf: 1/22/2011 11:03:48

NANOSOF 1:100 fr ischemie (efect bradicardizant, debit coronarian

redus; stimulare mecanic)

11122000.abf: 1/22/2011 11:03:48 (detaliu bradicardie reversibil la aplicarea NANOSOF 1:100)

300

200 LV P (c m H 2O ) E C G le a d (m V )

100

100

50

-50

-100 0 20 40 60 T im e ( m in ) 80 100 120 140

ischemie-reperfuzie 30 min cu NANOSOF 1:100 (refacere spectaculoas a activitii electrice i mecanice dup ischemie artefact de obstrucie temporar a cateterului de monitorizare LVP ?)

a1122000.abf: 1/22/2011 15:03:16

1 200

150

LV P (c m H 2O ) E C G le a d (m V )

100

50

0 100

50

-5 0

-1 0 0 0 20 40 T im e ( m in ) 60 80

11125001.abf: 1/25/2011 11:38:26

ischemie-reperfuzie 30 min (CONTROL)

300

200 LV P (c m H 2O ) E C G le a d (m V )

100

40

20

-2 0

-4 0

20

40

60 T im e ( m in )

80

100

a1125000.abf: 1/25/2011 13:45:46

ischemie-reperfuzie 30 min (NANOSOF 1:100 pe toat durata)

300

200 LV P (c m H 2O ) E C G le a d (m V )

100

40

20

-2 0

-4 0

20

40

60 T im e ( m in )

80

100

120

b1125000.abf: 1/25/2011 16:39:51

ischemie-reperfuzie 30 min (NANOSOF 1:100 pe toat durata)

1 300

200

LV P (c m H 2O ) E C G le a d (m V )

100

100

50

-5 0

-10 0 0 20 40 60 T im e ( m in ) 80 100 120

11204000.abf: 2/4/2011 14:53:59

ischemie-reperfuzie 30 min (NANOSOF 1:100 n reperfuzie tardiv duce la

repornirea cordului !)

1 300

200 LV P (c m H 2O ) 100 0 100 50 E C G le a d (m V ) 0 -5 0 -10 0 0 20 40 60 T im e ( m in ) 80 100 120

11204001.abf: 2/4/2011 17:55:23

ischemie-reperfuzie 30 min (NANOSOF 1:100 n reperfuzie)

1 300

200

LV P (c m H 2O ) E C G le a d (m V )

100

-100 100

50

-50

-100 0 20 40 60 T im e ( m in ) 80 100

11218000.abf: 2/18/2011 16:42:21

ischemie-reperfuzie 45 min (CONTROL)

1 300

200 LV P (c m H 2O ) 100 0 100 50 E C G le a d (m V ) 0 -5 0 -10 0 0 20 40 60 T im e ( m in ) 80 100 120

a1218000.abf: 2/18/2011 19:05:18

ischemie-reperfuzie 45 min (NANOSOF 1:100 n reperfuzie)

Concluzii suspensia produsului pulbere de baz NANOSOF administrat n experimente pe cord izolat n diluii de 1 pn la 10-7 exercit o serie de efecte temporare reversibile: bradicardie i creterea debitului coronarian cu pn la 30-50%; suspensia NANOSOF administrat n diluie 1:100 pe ntreaga durat a experimentelor de ischemie-reperfuzie global duce la o accelerare a instalrii contracturii ventriculare, la creterea gradului de contractur (la 100-120 cm H 2O fa de 60-80 cm H2O n experimente de control); de aceea nu se recomand adminstrarea intravenoas a unei astfel de perfuzii dect n perioada de reperfuzie, dup dezobstrucia coronarian prin diferite procedee; suspensia NANOSOF administrat n diluie 1:100 n perioada de reperfuzie poate produce o serie de efecte benefice, posibil prin neutralizarea efectelor toxice i aritmogene ale radicalilor liberi de oxigen acumulai n esutul ischemiat pe perioada ischemiei: limitarea fenomenelor de fibrilaie supraventricular/ventricular i accelerarea reinstalrii ritmului sinusal, stabilizarea acestui ritm i reducerea frecvenei extrasistolelor ventriculare; ntr-un experiment izolat administrarea tardiv de suspensie NANOSOF n perioada de reperfuzie (la 30 min de la nceperea reperfuziei) a dus la repornirea activitii electrice i contractile.

N.B. Concluziile se bazeaz pe un numr limitat de experimente; pentru o validitate crescut aceste experimente ar trebui repetate pe eantioane de dimensiuni extinse.

2. Experimente de viabilitate i apoptoz pe un model in vitro de apoptoz indus de capsaicin Am folosit o linie celular uman diploid: HEK293 (human embryo kidney 293) transfectat persistent cu receptorul vaniloid 1 (TRPV1 transient receptor potential vanilloid 1), un canal ionic ce acioneaz ca integrator de stimuli nociceptivi, fiind activat de cldura nociv (prag de activare termic 42 C), de aciditatea extracelular (pH de semiactivare 5.2, coeficient Hill 1.8), de capsaicin i ali activatori vaniloizi sau nevaniloizi (EC50 pentru capsaicin: 0.5 M, coeficient Hill 2.0-2.85), i de compui endovaniloizi (de exemplu anandamida). Aceast linie celular reprezint un cadou din partea Prof. Makoto Tominaga, Section of Cell Signaling, Okazaki Institute for Integrative Bioscience, National Institutes for Natural Sciences, Okazaki, Japan. Celulele se cultiv n DMEM suplimentat cu 10% ser fetal de viel i 1% penicilin-streptomicin, i sunt pasate sptmnal prin detaare cu tripsin-EDTA, centrifugare, resuspendare n mediul de cultur i nsmnare n vasul de cultur. Pentru experimentele de viabilitate i apoptoz am utilizat 12 vase Petri cu diametrul de 35 mm nsmnate cu cantiti egale dintr-o suspensie omogen de celule, cultivate n condiii identice (incubator umidificat la 37 C, 5% CO2). Vasele Petri au fost mprite n 4 categorii supuse unor tratamente diferite; astfel, fiecare experiment a fost repetat n triplicat. Grupul 1 (vasele 1,2,3): grupul de control Grupul 2 (vasele 4,5,6): s-a administrat capsaicin 0.1 M cu 2 ore nainte de experiment Grupul 3 (vasele 7,8,9): s-a adugat suspensie Nanosof 0.5 mg/10 ml mediu de cultur cu 24 ore nainte de experiment Grupul 4 (vasele 10,11,12): s-a adugat suspensie Nanosof 0.5 mg/10 ml mediu de cultur cu 24 ore nainte de experiment i s-a administrat capsaicin 0.1 M cu 2 ore nainte de experiment La concentraia de 0.1 M este de presupus un efect activator al capsaicinei asupra receptorilor vaniloizi TRPV1 din linia celular cultivat, care s duc la un influx semnificativ de Ca2+ n celule cu declanarea cascadei de evenimente moleculare a apoptozei. Pentru fiecare din cele 12 eantioane de celule din cele 4 grupuri au fost aplicate protocoale de detecie a apoptozei i a viabilitii celulare cu iodur de propidiu (PI), bazate pe experimente de flow citometrie, folosind un instrument Beckman-Coulter FC 500 Series. Pentru fiecare eantion au fost analizate 30000 celule. Celulele din fiecare eantion au fost detaate cu EDTA, centrifugate 5 min la 1000 rcf, resuspendate n 1 ml PBS, apoi cantiti egale (cte 0.5 ml) au fost utilizate pentru cele dou protocoale experimentale.

Protocolul de viabilitate 0.5 ml suspensie celular n PBS a fost tratat cu PI g/ml 15 min la ntuneric. Eantioanele au fost centrifugate 5 min la 1000 rcf, supernatantul a fost nlturat i sedimentul a fost resuspendat n PBS pentru flow-citometrie. Protocolul de analiz a coninutului DNA pentru detectarea apoptozei 0.5 ml suspensie celular n PBS a fost adugat n 10 ml etanol 70% inut la rece (pe ghea) i celulele au fost fixate timp de 2 ore. Celulele au fost centrifugate 2 min la 2000 rfc. Sedimentele celulare au fost resuspendate n 50 L soluie tampon de extragere a DNA (tampon 0.2 M fosfat citrat pH 7.8: 683.48 mg Na2HPO4 i 16.81 mg acid citric la 20 ml). Tuburile au fost agitate mecanic (shaker) 30 min la 37 C. Suspensiile celulare au fost centrifugate 10 min la 1500 rfc. Sedimentele au fost resuspendate n 1 ml PBS cu PI 5 g/ml i Triton X-100 0.1 % (din pcate nu am putut aduga i RNase A) i incubate 30 min la temperatura camerei. Rezultatele testului de viabilitate Eantion nr. Grup 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 control Capsaicin 0.1 M 2 ore Nanosof 0.05 mg/ml 24 ore Nanosof 0.05 mg/ml 24 ore + Capsaicin 0.1 M 2 ore Viabilitate (% celule PI negative) 75.00 65.16 66.04 56.36 54.22 46.55 57.69 67.61 61.30 81.82 63.29 58.40

Rezultatele analizei coninutului de DNA pentru detectarea apoptozei

Calitatea Proba analizei Model fit %G1 %S %G2 G1 G2 G1 cv G2 cv %Apoptoza %Neapoptotice nr. OK 0.26 15.8 44.2 27.3 235 486 10.1 16.3 35 65 1

OK OK OK OK OK Slab Slab OK OK OK OK

0.47 0.83 0.28 0.63 0.63 0 0 0.21 0.29 0.19 0.45

57 4.18 25.5 20.1 13.7 15.5 4.2 29.2 23.4 21.7 24.6

16.4 82.3 60.9 62.2 31 54.6 71.1 38.2 45.4 67.9 61.9

27.3 0 11.3 11.2 52.6 0 0 28.7 28.4 7.05 13.7

321 266 263 224 235 227 206 261 262 260 258

609 519 564 562 460 460 460 492 529 550 525

24.8 5.05 12.3 10.8 14 12.5 2.01 10.3 13.3 8.86 12.7

19.5 8.28 8.82 7.88 29.4 0 0 17.5 28.8 6.83 8.34

5.26 6.42 24.8 12.9 7.2 20.5 33 14.7 15.8 11 8.45

94.74 93.58 75.2 87.1 92.8 79.5 67 85.3 84.2 89 91.55

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Observaii Calitatea analizei: Slab = rezultate incerte Model fit: ct de bine se potrivete modelarea matematic a fazelor cu curba real; cu ct valoare e mai mic, cu att mai bine %G1, S, G2: procentele de celule neapoptotice care se gsesc n fazele respective ale ciclului celular %G1, 2: canalul de fluorescen n care se gsete vrful corespunztor fazei respective a ciclului %G1, 2 cv: coeficientul de variaie al datelor din fazele G1, G2 %Apoptoz: procentul de celule apoptotice din totalul celulelor identificate prin dimensiune i granularitate %Neapoptotice: procentul de celule neapoptotice din totalul celulelor identificate prin dimensiune i granularitate Concluzii Pretratamentul culturii liniei celulare HEK293 transfectat stabil cu TRPV1 cu o suspensie 0.05 mg/ml din produsul pulbere de baz Nanosof pe o durat de 24 ore poate preveni inducerea apoptozei prin influx intracelular de calciu declanat de expunerea celulelor la capsaicin 0.1 M timp de 2 ore, ntr-un model experimental de apoptoz in vitro. Rezultatele analizei coninutului de DNA pentru detectarea apoptozei sunt mai puin valide datorit dimensiunii reduse a eantionalor pe care s-au realizat msurtorile. Dr. Sorin Muat Dr. Bogdan Amuzescu