L3. INSAMANTAREA CULTURILOR DE BACTERII, DROJDII SI MUCEGAIURI Principiul met !

ei" Microorganismele pot fi cultivate pe medii de cultura in placi Petri sau in tuburi, atat pentru studiul lor, pentru conservarea lor prin refrigerare, cat si pentru obtinerea culturilor stoc si de lucru, in diversele procese biotehnologice. Operatia de trecere # unei culturi dintr-un vas de cultura in altul se numeste repicare sau trecere, iar fragmentul de cultura ce se trece pe alt mediu se numeste inoculum. In $urul %l#c#rii &ecului !e '#( exista ( n# )teril# cu !i#metrul !e #pr *im#ti+ ,- cm, in lip)# curentil r !e #er. T #te m#nipul#rile c#re nece)it# !e)c.i!ere# recipientel r )terile )#u c ntin#n! culturi tre&uie e%ectu#te in #ce#)t# ( n# !e pr tectie// 0. INSAMANTAREA IN TUBURI M#teri#le utili(#te" - culturi de MO pe agar nutritiv; - fir de inoculare; - bec de gaz; - eprubete cu mediu sterilizat si inclinat (nutrient-agar / extract de malt-agar / extract de cartofdextroza-agar ; - termostat la !" #$; - lampa bactericide. M ! !e lucru" In)#m#nt#re# cu #n)# %e sterge suprafata din interiorul nisei de lucru cu un tampon imbibat cu alcool &'(. %e aprinde lampa bactericide si se lasa )' minute pentru sterilizarea incintei de lucru. %e spala mainile cu sapun, apoi se clatesc cu alcool. %e aprinde becul de gaz si se regleaza flacara, care trebuie sa aiba conul de culoare albastra. %e tine eprubeta in care exists cultura ce trebuie repicata cu mana stanga, in pozitie oblica sau chiar orizontala. *n mana dreapta se tine acul de repicat. +cesta se arde in flacara becului de gaz, tinandu-) in pozitie verticals pentru ca flacara sa. cuprinda o portiune cat mai mare din el, %e tine in flacara pana ce mai mult de ,umatate din ac se inroseste, apoi se plimba de - -! ori si restul acului

pana la maner, in flacara. .upa aceea se apropie gura eprubetei de flacara si, cu degetul mic de la mana dreapta indoit, se trage afara dopul de vata din gura eprubetei, apucandu-l de capatul ramas afara. /u i se da drumul dopului pe masa ci se tine tot timpul in mana. %e trece gura eprubetei de - -! ori prin flacara. %e introduce acul fierbinte in eprubeta si se raceste, nu in cultura, ci alaturi, pe o portiune de agar fara cultura. %e ia apoi o foarte mica portiune (de ) - - mm din cultura pe varful acului (se alege portiunea cea mai tipica si mai curata a culturii respective . %e scoate acul din eprubeta, se arde din nou gura eprubetei si se astupa cu dopul de vata din mana dreapta. %e lasa ,os eprubeta si se ia, tot cu mana stanga, o alta eprubeta cu mediu steril. +cul de repicat cu fragmentul de cultura, se tine mai departe in mana dreapta ferindu-) acum de flacara. %e procedeaza cu eprubeta a doua la fel cum s-a procedat cu prima, adica0 se tine in pozitie orizontala sau putin oblica in mana stanga, se scoate dopul cu degetul eel mic de la mana dreapta indoit, tinandu-se tot timpul operatiei de repicare in mana. %e trece gura eprubetei prin flacara, se introduce acul de repicare cu fragmentul de cultura, atingand usor mediul (in central eprubetei , pana ce partea din cultura ramane pe mediu. 1neori este bine ca fragmentul de cultura sa fie putin afundat in mediu, pentru a face un contact mai strans cu el. %e scoate acul de repicat din eprubeta, se arde din nou gura eprubetei si se astupa cu dopul din mana dreapta. %e trece si capatul dopului care a fost tinut cu mana prin flacara, dar foarte rapid. %e arde din nou acul in flacara pana. la rosu. +ceasta operatie este absolut necesara si trebuie facuta cu rabdare, pentru a se evita infectarea mediilor urmatoare. .upa arderea acului se ia din nou eprubeta cu cultura ce trebuie repicata si se repeta. operatia de repicare cu o alta eprubeta sterila. 2oate miscarile descrise mai sus, din care consta operatia de repicare, trebuie executate destul de repede pentru a nu permite infectarea mediilor sterile din eprubete. 3le trebuie facute cu o oarecare ritmicitate si nu prelungite prea mult. .e asemenea trebuie respectate o serie de indicatii, care la prima vedere par minore, dar de care depinde foarte mult reusita unei repicari. +stfel, trebuie avute in vedere0 - tinerea eprubetei in pozitie orizontala in timpul repicarii pentru a evita caderea sporilor de ciuperci si bacterii din atmosfera pe mediu; - tinerea acului de repicat in pozitie verticala in flacara si nu orizontal, pentru ca arderea sa se faca pe o portiune cat mai mare; - scoaterea dopului de vata cu degetul mic al mainii drepte si tinerea lui tot timpul in mana, pentru a-) feri de contaminari secundare; arderea gurii eprubetei la scoaterea si introducerea dopului de vata, deoarece pe marginile .upa. dezvoltarea culturii se observa aspectul, culoarea, tipul coloniilor, precum si eventuala exterioare ale eprubetei pot exista germeni de infectie secundara.

prezenta a contaminarii cu alte microorganisme. In)#m#nt#re# cu pipet# P#)teur )#u cu pipet# 'r#!#t# Pentru pregatirea pipetei Pasteur, se ia un tub de sticla obisnuita, cu diametrul exterior de 4 mm si cel interior de 5 mm, care se taie la o lungime de -' cm, se rotun,esc marginile la flacara, se astupa cu dopuri de vata, se ambaleaza si se sterilizeaza. *n momentul utilizarii, partea mediana a tubului se mentine in varful conului albastru al flacarii, se roteste usor si, cand sticla s-a inmuiat, se indeparteaza din flacara si se efileaza dupa lungimea dorita. .upa solidificare, se separa in cele doua ,umatati cu care se poate lucra. *nsamantarea cu pipeta se practica. atunci cand se doreste recoltarea unui inocul lichid. Pipeta se trece rapid prin flacara, iar pipeta Pasteur se sparge in dreptul mi,locului efilat. .in tubul ce contine cultura se preleveaza cateva picaruri sau un volum determinat de inocul, care se pipeteaza in mediul proaspat, steril. $ulturile se termostateaza. timpul necesar dezvoltarii fiecarui tip de microorganism. E)te inter(i) )# )e pipete(e !irect cu 'ur#//