1.

Metode de marcare molecular bazate pe restricie enzimatic

2. Migrarea produilor in gel de poliacrilamid

Genomul uman: 46 perechi de cromozomi Componentul principal al cromozomilor: AND (conine informaii pentru producerea proteinelor necesare vieii)
din cele 3 mld. de perechi de baze (pb) circa 4% codific proteine restul sunt adesea doar de umplutur secvene repetitive organizate n aglomerri (clusters) De ex: secvena D1S80, (AGGACCACCAGGAAGG)n)
ADN este identic n cea mai mare parte, variabilitatea gsindu-se mai ales n aceste secvene repetitive

Secvenele (10-100 pb per repetiie), pot fi analizate folosind enzime de restricie, - funcioneaz ca foarfeci moleculare i taie ADN-ul la nivelul unor secvene specifice

Enzimele de restrictie (ER)

sunt endonucleaze bacteriene care scindeaz moleculele

ADN (prin hidroliza legturilor fosfodiester dintre nucleotide) la nivelul unor zone strict specifice genernd fragmente de lungimi variabile fragmente de restrictie (FR)

Enzimele de restrictie
Numrul si dimensiunea fragmentelor generate depind:

- frecvena cu care apar situsurile de recunoatere ale enzimei respective

Enzimele de restrictie
Nomenclatura numr mare de enzime de restricie a impus adoptarea unei nomenclaturi universale: - un cod de 3 litere (italic) prima litera semnificnd genul - celelalte 2 specia bacterian de la care a fost izolat enzima (spre exemplu, Eco Escherichia coli); - poate fi o a patra liter (n format normal) indic tulpina bacterian (ex: EcoR); - dac are mai mult de 1 sistem de restricie-modificare, apar numere romane: I, II, III
EcoRI : GAATTC

BglI BglII (Bacillus globigii): AGATCT HindIII (Haemophilus influenzae) : DNA sequence AAGCTT TaqI (Thermus aquaticus): 5'TCGA 3'AGCT

Enzimele de restrictie

Marcarea RFLP
n ntregul genom uman, o secven de recunoatere de 6 pb apare de circa 730 000 de ori dac se taie genomul cu o anumit enzim de restricie, se obin aproximativ 730 000 fragmente de restricie de lungimi diferite - ceea ce nseamn c i lungimea fragmentelor respective de restricie este diferit ntre indivizi Numim acest fenomen polimorfismul lungimii fragmentelor de restricie (RFLP - restriction fragment length polymorphism).
Tehnica se bazeaz pe proprietatea endonucleazelor de a recunoate

secvene specifice scurte de ADN (4-8 pb) i de a rupe molecula de ADN la nivelul acestor secvene Datorit faptului c secvenele recunoscute de endonucleaze se repet aleatoriu de mai multe ori de-a lungul genomului, vor rezulta n urma digestiei enzimatice cu o (anumit endonucleaz) mai multe fragmente de lungimi diferite Scopul analizei RFLP este obinerea de amprente genetice Marcarea RFLP se bazeaz pe tehnica Southern Blot dezvoltata de E. Southern

Principiul tehnicii Southern Blot

-Extragerea ADN; -Restricia AND -Electroforeza produsilor PCR -Gel incubat in NaOH 0,5 M cu scopul obtinerii de lanturi de ADN monocatenare; - transfer pe o membrana de nitroceluloza Dupa uscarea ei, membrana se aseaza pe un film de raze X -imersata intr-o solutie care contine un singur lant de AND complementar cu secventa ADNului de analizat -proba radioactiva este indicata prin aparitia unui spot alb pe film

Exemplu: enzima RsaI in cazul RFLP

Migrare in agarosa The diagnosis of Plum Pox virus in 10 infected leaves, using P1 and P2 primers

Migrare in poliacrilamida
PPV-D strain: 61 pb 182 pb PPV-M strain: 243 pb
61 pb

243pb 182 pb

PPV-Rec strain: 61 pb 182 pb 243 pb

Viral strain differentiation with RsaI, using RFLP technique

Alte tehnici bazate pe digestia enzimatica

Markerii AFLP
- bazat pe amplificarea selectiv a o parte din fragmentele de ADN, obinute n urma digestiei enzimatice - produii de amplificare vor fi migrai electroforetic n gel de poliacrilamid - polimorfismele sunt date de lungimea fragmentelor amplificate, metoda fiind foarte sensibil adaptai pentru studierea speciilor neexploatate

Gelul de poliacrilmida
se obin prin polimerizarea a dou componente acrilamid i metilen

bis-acrilamid mai frecvent se folosesc geluri n care concentraiile celor dou componente sunt 16% (acrilamida) i 0,4% (metilen-bis-acrilamida). reacie este iniiat de persulfatul de amoniu, (NH4)2S2O8 - (PSA) ca si catalizator se folosete N,N,N,N-tetrametilendiamina (T-EMED) naintea polimerizrii amestecul este a ezat ntre dou plci de sticl Se las gelul la polimerizat timp de 20-30 min Gelul astfel polimerizat este ataat la un sistem de separare vertical. sistem ce permite contactul cu ambele capete ale gelului prin intermediul unor camere destinate soluiilor tampon (n care se afl electrozii). probele (proteinele) denaturate sunt amestecate cu un colorant, albastru de bromfenol, ncrcat negativ Tampon pentru electroforez : TBE 1x Dupa migrare gelul de coloreaza prin metoda (argentica - AgNO3)

Tehici care se folosesc de migrarea in gel de poliacrilamida

Tehnica PCR, bazat pe primerii SSR (Simple sequence repeat)

pentru a putea fi utilizai ca markeri trebuie cunoscut localizarea lor n genom - prezint un grad ridicat de polimorfism - secvene scurte (1-10 pb, de obicei 2-3 pb) de nucleotide ce se repet n tandem - majoritatea markerilor SSR - constituii din repetiii dinucleotidice [(AC)n, (AG)n i (AT)n] abundente i prezint un grad ridicat de polimorfism

Identificarea polimorfismului se face prin electroforez n gradient de denaturare (DGGE denaturing gradient gel electrophoresis)

- Gel de agaroz pt. produii ce difera ntre ei ca mrime prin fragmente mai mari de 20 pb - gel de 6%poliacrilamida pt produi ce difera intre ei ca marime prin fragmente mai putin de 10 - 20 pb
Markerii SSR i gsesc aplicabilitate n:

- genotipizarea indivizilor, - evaluarea germoplasmei, a diversitii genetice, - cartarea genomului, - amprentarea genetic, - studii de filogenie i de evoluionism.

Amprenta genetic realizat la varieti de cire cu primerul SSR - UCDCH17

186pb 188pb 190 pb

Markerii SRAP (Sequence-related amplified polymorphism)

identificare

germoplasmei, construcia de harti cromozomale, amprentarea genomice SRAP technology is used to analyze genetic similarities among genotypes and genetic differentiation between the species