Capitolul

pROpRIElASrlr FIZICO-CH1MICE ALE ACIZILOR NUCLEICI.

3.1. Denaturarea gi reaaturarea

Mdrimea acizilor nucleici vatiazd

enorm. Cei mai mici acizi ribonucleici sunt

vascozitdlii etc.), MM a ADN a fost g5siti

egald cu

106

d. S-a demonstrat insl cf, un

ARN', care conlin aproximativ 80

de

nucleotide gi au mase moleculare (MM) in

ADN rnic, cum ar ADN-ul monocatenar circular al fagului 'pXl74 conline 5,5'103
nucieotide gi are o lvIM de 1.700.000 d., in

jurul valorii de 30.000 daltoni. Macromoleculele ARN. sunt mult mai mari,
conlindnd cdteva mii de nucleotide, iar N{lvl
poate deplqi valoarea de i.000.000 d. ARN-

timp ce ADN-u1 din cromosomul bacteriofagului T, conline 2'l0s perechi de nucleo-

tide, ceea ce corespunde unei MM

de

ul virusului mozaicului tutunului, de exem-

130.000.000 d. Cromosomul de E. coli este

plu, conline aproximativ 6.500 nucleotide,

ceea ce corespunde unei

o macromoleculi. bicatenar5 circulard (frr5

capete) con1inend aproximativ

MM mai mari de

4'106

pe-

2.000.000 d, dimensiuni comparabile chiar

qi cu cele ale ARN* policistronic.

reciri de nucleotide 5i avAnd, deci, o MM

de orrlinul

a2

pdnd' la

3.

10e d.

lvloleculele native

de ADN
in

animal,

Celulele eucariotelor conlin un num[r variabil de cromosomi, in funcJie de specie.

Fiecare cromosom pare a fi constituit dintr-o

vegetal gi bacterian au dimensiuni qi tvlM

mari qi nu pot

fi

oblinute

stare intact5,

din cauza instabilit5lii lor. Simpla agitare sau pipetare determinf, depolimerizatea
materialului nativ qi formarea de fragmente

singurf, moleculf, de ADN (avAnd

un

conlinut de ordinul a 108 perechi de nucleotide) asociatd proteineior bazice qi histone-

cu

masf, molecularf, cuprinsf, intre

qi

lor, pentru a forma cromatina, care este

constituitl dintr-o inlSnluire flexibil5
de

10.000.000 d. Determinarea exactf, a MlvI,

prin metode clasice, este prejudiciatd gi

de

faptul cd in celuli se gdsesc mai multe tipuri

unitlii repetitive - nucleosomii (vezi structura terfiar[ a ADN-ului). Nucleosomul,

unitate structuralS. fundamentalf, a cromo-

de ARN diferite ca secventri a

narea vitezei sedimentare,

bazeior

azotate. Prin metodeie obignuite (determi-

somului (nucleosomul este constituit

Cin

densit[trii,

proteinele histonice menlionate anterior), are

46

Ion I. BXra, O'ridiu C. Toma, Smaranda C. Vdntu permite apoi calcularea IvIM pornind de la
valoarea S).

infEguratd,

in jurul sdu, o porliune clin macromolecula ADN, pe lunginea a

aproximativ 140 perechi de nucleotide. In

final se formeazl, deci, un lanf nucleosomic

Adesea,

in

scopuri preparative

sau de

anaiitice, se face apel

la

echilibr:ul

(ADN

nucleosomi). Lan;ul nuclecrsomic,

s5.u, se ri.suceEte

sedimentare intr-un gradient de CsCl - care

se stabilegte dup6

ia rindul

in spirall incdt,
ori mai scurtX

centritugare. Se obline, de

in final, Iungimea unui cromosom meiafazie

este de aproximativ 8.000 de dec6.t cea

asemenea,

un gradient de densitate de
g/ml. ADN-ul
se

aproximativ 1,55-1,75

a ADN-ului pe care

il

conline.

concenffeazi. intr-o bandi, in pozilia in care densitatea solrrjisi de CaCi este egalf, cu a

Proteinele nonhistonice (proteine "acide")

sunt in aceeaqi m5surf, iegate de crtlmatinS.

s&, iar aceastA densitate este

densitate cunoscuti, centritugat

in
in

general

Unele dintre ele joacd, probabii, un rol in

determinat5 prin comparalie cu un ADN de

acelaqi

reglarea expresiei geneiice

la

nivelul

procesului de transcriplie. De altfel, trebuie

gradient" Densitatea la echilibrul de sedimentare

notat ci. ADN-ul din organitele celulare

a unui r\DN

este cu at6t mai

G

(mitocondrii, cloroplaste), diferd dupl

mS.rimea qi compozilia macrornoleeulei, de

ridicat[ cu c6t procentui perechilor

= C in

respectivui ADN este mai rnare (perechile

G

ADN-ul din nucleul respectivei celule.

Masele moleculare ale ADN-ului din

= C sunt mult mai dense decit perechile

3.1. 1. Denaturarea

A:T).
ADN-ul nativ prezintd un spectru
absorblie
de

diferite surse, se pot determina fie prin

examen molecular, prin

lungime

intermediul

microscopului eiectronic (se apreciazl cf, o

in U.V. cu un maximum la 26A

de

1y" corespunde unei

mase

nm. Dacf, soluliile de ADN sunt incdlzite,

sau sunt supuse unei mari varialii de pH,

moleculare de 106 d qi de 2r106d pentru o structurS, bicatenarf,),

fie pornind de la

sau se modificd constanta

lor

dielectricf,

constanta

de
in

sedimentare

ADN-ului,
de

(prin ad[ugarea de cetone sau alcooli, in soluliile lor apoase), sau se adaugd uree, amide, siruri ale metalelor grele
etc.

obtrinutl prin compararea vitezei sale

sedimentare

gradient de zaharozd, (5%

c5.rui

pdn[ la 20%) cu cea a unui ADN a

structura regulati a ADN-ului este distrus[

constant5 este cunoscuti ( o ecuarie empiricS.

qi are loc fenomenul de denaturare. in

Acizii nucleici
timpul denaturf,rii, legf,turile covalenie din
structura ADN-ului r[m6.n intacte, dar sunt

47
gi

ADN-ului, efectul hipocrom dispare

absorbtria

la 260 nm cre$to propor1ional

cu

distruse at6t legXturile de hidrogen dintre

catenele polinucleotidice c6t qi interactriunile

conJinutul perechilor rie baze

A:T.

Tabelul 5.
Confinutul procentual al G qi C in diferite preparate de ADN

de naturd hidrofob[ dintre bazele azotate

molecula nativd de ADN iqipierde structura

sa dublu-elicoidald qi trece intr-o formf,

dezordonatd ('rrandom coil").

Organismul sau lesutul

Animale

G+C
wo)

Aceast[ modificare atrage dupX

modificarea unor proprietSji frzice

sine

cregte-

timus de vi{el

39 40 44
4L

rea absorbliei la 260 flffi, modificarea

rotatriei optice, diminuarea vascozitf,Jii,
cre$terea coeficientului de densitate etc.

ficat de goarece

splini de goarece
sperrnl de taur
lV{icroorganisme

Cregterea absorbtriei

la

264 nm pentru

soluliile de ADN denaturat, a fost definit5

ca efect hipercrom qi el este reprodus in

laborator, indeosebi sub acJiunea tempera-

Escherichia coli
?seudomonas aerugino sa
fuIycobucterium phlei
S

50
68

turii. Temperatura la care absorblia preparatelor de ADN cre$te brusc a fost denumitf, temperaturS.

73
33

taphylo

co

cctts &ure us

de fuziune (T,,

melting

temperature"). Expiicalia efectului hiper-

Temperatura de "topire" a ADN-ului este funcJie liniar[ de conlinutul perechilor

de baze G = C, fapt justificat de existenla a

crom constd

in aceea cf, bazele azotzte

la

purinice gi pirimidinice, in stare liberf,, sub

trei punli de hidrogen intre aceste doui baze

care aparlin la doul catene polinucleotidice

forml de nucleotide gi nucleozide, absorb

260 nm, dar valoarea absorbliei, la aceeagi

iungime de undd, de c5.tre preparatele native
de

diferite,

fatr5 de doud

punli de hidrogen care

se formeaz[
moleculare
c5.

intre A:T.

Diverse specii
surse

ADN nu reprezintl

o insumare aritmeticd

de ADN, izolate din

a absorbliilor parliale ale bazelor azotate ci

diferite au T* caracteri3tice datoritd taptuiui

este mai mici. Acest fenomen

a fost

au un conlinut procentual distinct in

(tabel 5).

denumit hipocromie. Dup[ denaturarea

G+C

48

Ion

L B[ra, Ovidiu C. Toma, Smaranda C. VAntu

G=C de

Cu ci.t conJinutul procentual al este mai mare,

streazf,,

cu atAt temperatura

fuziune este mai inaltX, ceea ce demon-

#t6
I.
)'

inc[ odat[, c[

perechea de baze

G=C
srab

conferd. moleculei ADN o mai mare

I
n
U

l)

'i {

ilitate.

I
,

,e t..

t)

incf,lzire

3.1.2 Renaturarea

DacX preparatele

de ADN (l)

sunt

il
)) t:
r5cire lentS
t,,

inci.lzite brusc la tempelatr.rri mai mari dec6t

T*, cele doud catene

polinucleoliciice

se

despart riatoritS. miqc[rii browniene (II). R[cirea lent[ , progresiv[, a unei astfel
de a

'l
ii

?,

tt
DacI acest procedeu se aplicS. soluliilor
care conlin catone polinucleotidice, prove-

solulil ccnduce la recombinarea specificd

celor doud catene

spirale

, cu refacerea dublei
duce

(II$, in timp ce rf,cirea bruscl

la

menlinerea separatS

douf,

in soiulie a celcr catene polinucieotidice 0V). Acest

nite din macromolecule diferite de ADN

(dar de la specii inrudite, pentru ca lanJuriie

proces de renaturare (#15) duce la obtrinerea

si prezinte un gracl de analogie suficient

(1961), reludnd experimentele efectuate Meselson

de

unui ADN cu densitate opticX normal5 gi in

CaCl prezintX aceeagi densitate ca
,gi

mare), se oblin hibrizi de ADN (#16). Doty

de

ADN-ul

nativ (Doty, 1961).

#ts

ill

qi Stahl, a reuqit sf, elucideze condiJiile in care se formeazf, hibrizii, izol6.nd (chiar prin centrifugare in gradient
de CsCl) mai multe forme hibride de ADN
rzolat din E . c o li. S ch ildkraut qi colaborator i i

[-] ]4E^
II
IV

(1961) au demonstrat cX formele hibride de

acizi nucleici se pot oUiir" qi intre o catend

poliribonucleotidicl (provenitd, deci, de la un ARN) qi o eaten[ polidezoxiribonucleo-

tidicd (provenitl de la un ADN). Hall

qi

Acizii nucleici
Spiegelman (1964) presupun

49

c[ posibilitatea
un

cromatografie pe hidroxiapatit5., sau rezis-

formiriide hibrizi ADN - ARN prezintl

cle transcriplie ADN.

tent[ la nucleaze, sau fixatd pe membrana de nitrocelulozi., permite detectarea prezenlei

sau mdsurarea cantitElii de secvenle de sau

interes deosebit pentru studiul mecanismului

a informaliei genetice din o

metodd universalf,,

ADN

ARN complementar "sondei". Metoda hibridlrii se foloseqte pentru

Hibridarea este

utilizati in toate studiile referitoare la acizii

nucleici, fiind folositi fie pentru reperarea,
identificarea sau cuanlificarea unei molecule

cercetarea.

poziliei taxonomice gi inrudirii

genetice a diferitelor organisme (in fapt, a

anumitor specii), permipnd elucidarea unor probleme diflcile ale taxonomiei 5i chiar ale

de ARN sau ADN, fie pentru compararea

secvenlelor a

doui molecule de ADN

sau

evoluJiei. Hibridarea moiecularS.

dat

ARN. Practic, molecula sau ansamblul

de

impulsui iniiial investigaliilor de perspectiv[

molecule de ARN sau ADN, inainte de a

fi

in

domeniui ingineriei genetice, urmS-rind

supus[ detectlrii sau m[sur{rii (aga numita "sondd"), este marcatd cu un izotop radio-

construirea

(in

afara organismului) unor

molecule recombinate (hibride),'biologic

active, de ADN.

activ (cel mai adesea 32P), dupa care atdl

"sonda"

cit qi moleculele de studiat

incilzite peste T* qi

sunt apoi

amestecate,

incubate la o teinperaturi cu puJin inferioarf,

3.2 Hidroiiza acizilor nucleici, cu acizi qi

baze

T*. tn aceste conditrii, moleculele

compie-

mentare se pot reasocia. Moleculele non-

hibride sunt apoi eliminate, fie prin cromatografie pe hidroxiapatit[, tie prin hidroliz6, de c5.tre nucleaze specifice acizilor nucleici
monocatenari. Adesea, ADN-ul sau ARN-ul

Hidroliza blindi a ADN-ului, la PLI

3,0 ,

determini eliberarea hidrolitic[

tuluror bazelor sale purinice, f5rd

seiectivS. a

a afecta leglturile piriinidind-dezoxiriboz5,

de studiat sunt fixali pe o membran5.

de

nitrocelulozd. Aceast5 membranf,

incubat5 odati cu
nsonda"

este

sau leglturile fosfodiesterice din catena principal5... Derivatul de ADN rezultat in' urma hidrolizei acide, care nu
contrine

al c[rei exces este

apoi eliminat prin spllarea membranei.

purine,se numeqte acid apurinic. indep[r-

Radioactivitatea, seleclionati prin

tarea selectivd

bazelor pirimidinice,

50

Ion

I. B[ra,

OvidiLr C" Tonia, Smaranda C. VAntu oarecum

realizatfl

in condilii chimice

3.3 Flidroliza enzimatici a acizilornucleici

ciit'erite, duc la aciC aspirimitlinic.

Desfacerea selectivS. a polinucleotidelor,

Acizii nucleici ingerali de animale hidrolizali enzimatic

nucleaze,

sunt
c5.tre

in

intestin, de

prin

metocle enzimatice sau chimice, este o

nucleazele secretate de pancreas. Aceste

tehnicf, folositir penlru a determina secvenla

ca gi alte enzirne capabile sI

bazelor

in acizii nucleicl, care ?n princlpiu o logic5 identic[ cu

cea a

hidrclizeze acizii nucleici, sunt instrumente

valoroase irr arraiiza secvenlei nucleoiidelor

se aborCeaz5. cu

tietermindrii secvenlei proteinelor.

(tabel 6)

Tabelul

6 Specificitatea unor enzime care acfioneazl asupra acizilor nucleici

Enzima

Acid nucleic
Nucleaze din clasa a (3')

Speciticitate

Exonucleaze Fosfodiesteraza din veninul de viperS.

Endonucleaze

ADN si ARN

incepe ia cap5tul 3'

Dezoxiribonucleaza I

ADN

Unele legdturi 3'

Nucleaze din clasa b (5') Exonucleaze

Fosfod iesteraza splenicd Endonucleaze

ADN

ii

ARN

tncepe la capEtul 5'

Dezoxiriboirucleaza
Ribonucleaza

I1

ADN
ARN ARN

Unele legituri 5' Legdturile 5';legdtura 3' este o pirimidin nucleotidl Legf,turile nucleotidl

(pancreas)

Ribonucieaza

T, (fungicd)

5'; leg[tura 3'

este o guanin