MICROORGANISMELE EXTREMOFILE.

GRUPE, CARACTERIZARE, IZOLARE N CULTUR PUR

Cuprins

1.Utili !r"! #i$r%%r&!nis#"l%r "'tr"#%(il" )n *i%t"+n%l%&ii. N%iuni intr%,u$ti-"..... / 0.Cl!si(i$!r"! #i$r%%r&!nis#"l%r "'tr"#%(il"......................1 /. Mi$r%%&!nis#" t"r#%(il" i +ip"rt"r#%(il"....................1 2. Mi$r%%&!nis#" psi$+r%(il".......................... 11 3. Mi$r%%&!nis#" !l$!l%(il"...........................10 4. Mi$r%%&!nis#" !$i,%(il"............................1/ 1. Mi$r%%&!nis#" +!l%(il"............................................................................................................12 5. Mi$r%%&!nis#" *!r%(il"...........................................................................................................13 6. Mi$r%%r&!nis#" r" ist"nt" l! r!,i!7ii....................................................................................13

18. Mi$r%%&!nis#" %li&%tr%(".....................................................................................................13 1. Utili !r"! #i$r%%r&!nis#"l%r "'tr"#%(il" )n *i%t"+n%l%&ii.

N%iuni intr%,u$ti-"
n lumea vie, exist o serie de microorganisme care pot popula medii extreme. Aceste microorganisme au dezvoltat de-a lungul timpului o serie de adaptri, de ordin structural i chimic, ce le permit dezvoltarea i supravieuirea n medii extreme. Mediile extreme includ mediile cu temperaturi, p , presiuni, concentraii de sare ridicate i pe cele cu temperaturi, p , concentraii de nutrieni i disponi!ilitatea apei sczute. "easemenea, n categoria mediilor extreme sunt incluse i cele cu nivele ridicate de radiaii, metale grele i compui toxici. n ultima perioad, !iotehnologia a demarat o intens cercetare asupra microorganismelor extremo#ile, datorit numeroaselor aplica!iliti din industrie. $nul dintre cele mai !une exemple l constituie extremoenzimele, care sunt de%a #olosite pe pia. &ele mai cunoscute extremoenzime sunt proteazele alcaline din detergeni. Acestea au o pia de des#acere #oarte mare, lu'nd n considerare piaa mondial de detergeni. ( alt aplica!ilitate important o constituie o!inerea de A)" polimeraze, cu aplica!ilitate n tehnica *&+ ,o!inute de la tulpini de Thermococcus littoralis, Thermus aquaticus, Thermotoga maritime, Pyrococcus woesii i P. furiosus -. ( inovaie important o constituie deasemenea enzimele termosta!ile, care conduc hidroliza amidonului, precum .amilaze care nu necesit ionul de &a/0, amilopululanaze, glucoamilaze i glucozo-izomeraze, care sunt active la p -ul la care are loc hidroliza amidonului. 1ilanazele termosta!ile i alcaline sunt #olosite n tratamentul de prenal!ire a co%ilor, pentru a reduce cantitatea de clor necesar etapei de nal!ire. 2erg3uist et al au reuit s introduc i s exprime dou xilanaze din Dictyoglomus thermophilum, n Kluyveromyces lactis i Trichoderma reesei. Dunaliella bardawii, o alga verde extremo#il, este #olosit la o!inerea de !eta-caroten4 Marinobacter hydrocarbonoclasticus, o halotolerant, este capa!il s degradeze o varietate de hidrocar!uri ali#atice i aromatice. )icholson si 5athepure au pus la punct o cultur halo#ilic capa!il s degradeze n 1-/ sptm'ni un amestec de !enzen, toluen, etil!enzen i xileni. n acest #el se poate pune la punct o metod cu cost redus cu aplica!ilitate n amelioarea solurilor i prote%area acvi#erelor. n ta!elul 1 sunt prezentate potenialele aplica!iliti ale extremo#ilelor. 6a!elul 1. Aplicaii ale microorganismelor extremo#ile

7ursa T"r#%(il" A")-polimeraze A)"-ligaze 5os#ataza-alcalin *roteaze i lipaze 8ipaze, pululanaze, amilopululanaze i proteaze .-amilaze, glucoamilaze, .-glucozidaze, amilopululanaze, izomeraze Alcool dehidrogenaz 1ilanaze Anti!iotice Microorganisme ce degradeaz petrolul /

$tilizarea *&+ 8&+ "iagnostic *roduse lactate *ani#icaie, producerea !erii *rocesarea amidonului, #olosirea glucozei i #ructozei ca ndulcitori 7inteze chimice nl!irea h'rtiei 5armaceutic 7ur#actani

Microorganisme sul#-oxidante Psi$+r%(il" 5os#ataza alcalin *roteaze, lipaze, celulaze i amilaze 8ipaze i proteaze *roteaze Acizi grai polinesaturai 9-galactozidaz "ehidrogenaze (xidaze Microorganisme :ice minus; 9!l%(il" 2acteriorhodopsina *olihidoxialcanoai *olimeri reologici 8ipide 8ipide 7olui compati!ili "i#erite enzime Acid =-linoleic, 9-caroten i extracte celulare Microorganisme Microorganisme Mem!rane Al$!l%(il" *roteaze, celulaze, xilanaze, lipaze i pululanaze >lastaze, ?eratinize &iclodextrine 1ilanaze i proteaze *ectinaze Microorganisme alcalo#ile A$i,%(il" Microorganisme sul#-oxidante Microorganisme acido#ile B

"esul#urizri 2iologie molecular "etergeni *roducerea !r'nzeturilor 7oluii pentru curarea lentilelor de contact Aditivi i suplimente alimentare idroliza lactozei din produse lactate 2iotrans#ormri 2ioremedieri, !iosenzori *rotectia plantelor sensi!ile mpotriva ngheului <eneratori de curent n !ioelectronic *lastic de uz medical +ecuperarea petrolului 8ipozomi pentru medicamente i cosmetice nclzirea uleiului *rotectori ai proteinelor i celulelor n di#erite procese ,nclzire, ngheare"i#erite utilizri ,ageni de arom7uplimente alimentare, hran dietetic, colorani Modi#icatori ai aromei i texturii produselor alimentare i #ermentarea sosurilor de pete "egradarea i trans#ormarea deeurilor 7ur#actani pentru produse #armaceutice

"etergeni ndeprtarea pielii@prului $tilizri n #armaceutic, industria chimic i alimetar nl!ire Andustria h'rtiei, degomare i tratarea deeurilor *roducere de anti!iotice +ecuperare de metale i desul#urarea cr!unelui Acizi organici i solveni

Mi$r%%r&!nis#" t%l"r!nt" l! s%l-"ni %r&!ni$i

2ioconversia compuilor insolu!ili n ap ,exemplu steroli-, !ioremediere, !iosur#actani "egradarea puluanilor organici din mediile poluate cu deeuri radioactive m!untairea procesului de recuperare a petrolului
( avicchioli, !., "###$

Mi$r%%r&!nis#" r" ist"nt" l! r!,i!ii :!r%(il"

Microorganismele care sunt capa!ile s supravieuiasc n mediile extreme poart denumirea de microorganisme extremo#ile. Aceste microorganisme, nu numai c tolereaz aceste medii, dar in mod normal aceste condiii de medii sunt eseniale pentru supravieuirea i dezvoltarea lor. &ondiiile normale de cretere sunt considerateC p apropiat de neutru, temperatura ntre /D i EDo&, presiunea aerului aproximativ 1 atm i nivele corespunztoare de nutrieni, sruri i ap. (rice mediu care este n a#ara acestor parametrii este considerat extrem ,7atFanaraFana, /DDG; . n 6a!elul / sunt prezentate :recordurile; microorganismelor extremo#ile. "atele sunt adaptate dupa 5erreira et al. ,1HHI-, Madigan ,/DDD- i 7ec?!ach i (ren ,/DDE-. 6a!elul /. :+ecorduri; ale microorganismelor extremo#ile 5actor de mediu 6emperatura ridicat (rganism Pyrolobus fumarii Polaromonas vacuolata Picrophilus oshimae %atronobacterium gregoryii 6ulpina M6E1 a!itat &rpturi oceanice hidrotermale ap de mare nghetat izvoare acide 6olerana la #actorul de stres Maxim 11B(& (ptim 1DJ (& Minim HD (& Minim D(& (ptim E (& Maxim 1/ (& p minim D.DJ p optim D.I p maxim E p maxim 1/ p optim 1D p minim K.G Maxim L1DD M*a (ptim ID M*a Minim GD M*a MaximC)a&l la saturaie (ptimC /GD g sare@l MinimC 1GD g sare@l +ezistent la 1.G ?<F

sczut

sczut

ridicat

lacuri !azice

*resiune hidrostatic

<roapa Marianelor

&oncentraia de sare

&alobacterium salinarum Deinococcus E

lacuri sarate, saraturi, peste sarat carne tocat,

$ltraviolete i radiaii

ionizante

radiodurans

secretii nazale, deeuri radioactive

radiaii gamma i la 1GDD M@m/ $N (!ainey, '., "##($

"easemenea, exist i microorganisme poliextremo#ile, capa!ile s supravieuiasc n condiii limitate de mai muli #actori ,com!inai-. n ta!elul B sunt prezentate o serie de microorganisme adaptate la com!inaii de medii extreme. 6a!elul B. Microorganisme poliextremo#ile 5actorii de mediu p sczut, temperatur ridicat (rganism Picrophilus oshimae )ulfurisphaera yanidium caldarium p ridicat, concentraie de sruri mare 6emperatur ridicat, p ridicat 6emperatur ridicat, presiune ridicat 6emperatur ridicat, radiaii nalte %atronobacterium gregoryi Thermococcus alcaliphilus Thermococcus barophilus Deinococcus geothermalis a!itat Azvoare termale acide Azvoare termale acide Azvoare termale acide 8acuri !azice 6olerana la #actorul de stres p minim O D.DJ temperatura max. JG(& p minim O 1 temperatura max. H/(& p minim O D./ temperatura max. GI(& p maxim 1/ )a&l la saturaie

Azvoare hidrotemale temperatura max. HD(& marine p maxim 1D.G &ureni termali, lanul muntos al Atlanticului Azvoare termale temperatura max. 1DD(& presiunea 1G-1I.G M*a temperatura max. 1DD(& rezist la radiaii gamma de peste 1D?<F (!ainey, '., "##($

>xistena vieii n condiii extreme este intens studiat, concentr'ndu-se pe diversitate i pe mecanismele moleculare i de reglare implicate. *roteinele, enzimele sau alte su!stane !iocompati!ile produse de extremo#ile prezint un interes #oarte mare pentru !iotehnologie. "easemenea, studiul extremo#ilelor ale aplicaii i n astronomie, urmrindu-se existena vieii pe alte planete.

/. Cl!si(i$!r"! #i$r%%r&!nis#"l%r "'tr"#%(il" n #uncie de parametrii care variaz n mediu, microorganismele extremo#ile se clasi#ic nC A$i,%(il"C microorganisme care au un p -ul optim su! valoarea B4 Al$!l%(il"C microorganisme care au un p -ul optim peste valoarea H4 :!r%(il"< microorganisme capa!ile s supravieuiasc n medii cu presiune hidrostatic ridicat4 9!l%(il"< microorganisme ce necesit concentraii de sare de cel puin D./M4 9ip"rt"r#%(il"< microorganisme care se dezvolt la temperaturi ridicate KD-1// o&4 9ip%lit"< microorganisme care se dezvolt su! rocile deerturilor reci4 Lit%!ut%tr%("< microorganisme a cror surs de car!on este &(/4 M"t!l%t%l"r!nt"C microorganisme capa!ile s tolereze concentraii ridicate de metale precum cuprul, cadmiu, zinc sau arsenic4 Oli&%tr%("C microorganisme capa!ile s se dezvolte n medii limitative4 Os#%(il"< microorganisme capa!ile s se dezvolte n medii cu concentraii ridicate de zaharuri4 P%li"'tr"#%(il"4 Psi$+r%(il"< microorganisme care sunt capa!ile s se dezvolte, s supravieuiasc i s se nmuleasc la temperaturi sczute ,-1G o&- 4 R" ist"nt" l! r!,i!7ii4 T"r#%(il"C microorganisme care sunt capa!ile s se dezvolte, s supravieuiasc, s se dezvolte i s se nmuleasc la temperaturi cuprinse ntre JD-KDo&4 T"r#%!$i,%(il"C se dezvolt la temperaturi ntre JD-ID o& i p ntre / i B4 X"r%(il"C microorganisme care se pot dezvolta n condiii cu umiditate #oarte sczut. ,httpC@@en.Pi?ipedia.org@Pi?i@>xtremophile-

/. Mi$r%%&!nis#" t"r#%(il" i +ip"rt"r#%(il"

6ermo#ilele sunt microorganisme care sunt capa!ile s se dezvolte, s supravieuiasc, s se dezvolte i s se nmuleasc la temperaturi cuprinse ntre JD-KD o&. ipertermo#ilele sunt microorganisme capa!ile s se dezvolte la temperaturi superioare celei de KD (&. Marea ma%oritate a hipertermo#ilelor a #ost identi#icat n zonele vulcanice continentale i oceanice i n sol. n a#ara interesului ecologic i evoluionist pe care l au, microorganismele termo#ile prezint un interes deose!it datorit #aptului c sunt surse excelente de !iomolecule utile cu aplicaii !iotehnologice ,+aineF, 5., /DDJ-. Microorganismele termo#ile aparin at't procariotelor, c't i eucariotelor. n sol, compost, rumegu sau n cui!urile psrilor au #ost identi#icai #ungi termo#ili, care aparin QFgomFcetes ,!hi*omucor miehei, !. pusillus-, AscomFcetes , haetomium thermophile, Thermoascus aurantiacus, Dactylomyces thermophilus, Melanocarpus albomyces, Talaromyces thermophilus, T. emersonii, Thielavia terrestris-, 2asidiomFcetes ,Phanerochaete chrysosporium- i FphomFcetes ,+cremonium alabamensis, +. thermophilum, Myceliophthora thermophila, Thermomyces lanuginosus, )cytalidium thermophilum, Malbranchea cinnamomea-. "intre algele care se dezvolt la temperaturi ridicate putem amintiC +chanthes e,igua, Mougeotia sp. i yanidium caldarium, iar ca protozoareC othuria sp., -,ytricha falla, ercosulcifer hamathensis, Tetrahymena pyriformis, yclidium citrullu i %aegleria fowleri. J

n #uncie de temperatura optim de dezvoltare, !acteriile i arhe!acteriile au #ost clasi#icate n termo#ile moderate ,.acillus caldolyticus, /eobacillus stearothermophilus, Thermoactinomyces vulgaris, lostridium thermohydrosulfuricum, Thermoanaerobacter ethanolicus, Thermoplasma acidophilum-, extreme ,Thermus aquaticus, T. thermophilus, Thermodesulfobacterium commune, )ulfolobus acidocaldarius, Thermomicrobium roseum, Dictyoglomus thermophilum, Methanococcus vulcanicus, )ulfurococcus mirabilis, Thermotoga mritima- i hipertermo#ile ,Methanoccus 0annaschii, +cidianus infernos, +rchaeoglobus profundus, Methanopyrus 1andleri, Pyrobaculum islandicum, Pyrococcus furiosus, Pyrodictium occultum, Pyrolobus fumarii, Thermococcus littoralis, 2gnicoccus islandicum, %annoarchaeum equitans-. Acestea au #ost izolate din surse caC composturi, soluri expuse la radiaii solare, izvoare termale terestre, crpturi su!marine hidrotermale sau rezerve geotermale de petrol. 6ulpini extremotermo#ile de /eobacillus thermooleovorans au #ost izolate din izvoare #ier!inti4 deasemenea, Rasheri i 8ovelF au izolat o tulpin ce reduce 5e,AAA- la 5e,AA- din crptura izotermal Mothra ,*aci#icul de )ord-, care poate rezista la 1/1(&, aceasta #iind temepratura cea mai ridicat la care poate supravieui un microorganism ,7atFanaraFana, /DDG;. n mod normal proteinele, acizii nucleici sau lipidele din structura microorganismelor se deterioreaz la temperaturi nalte4 dar nu este i cazul termo#ilelor. 8ipidele mem!ranare ale termo#ilelor conin o cantitate mai mare de acizi grai nesaturai i cu catena nerami#icat dec't cele ale mezo#ilelor. Acest lucru permite termo#ilelor s se dezvolte la temperaturi ridicate, asigur'nd gradul de #luiditate necesar !unei #uncionri a mem!ranei. Multe specii de termo#ile prezint un strat paracristalin la supra#a, alctuit din proteine sau glicoproteine i care #unctioneaz ca o !arier protectiv. "intre hipertermo#ile, cel mai intens au #ost studiate speciile de termoacido#ile aparin'nd ordinului )ulfolobales, metanogenele i c'teva specii aparin'nd ordinului Thermococcales. *rincipala limitare n studiul acestor microorganisme o constituie cantitatea mic de !iomas care poate #i o!inut. Thermococcalele au #ost izolate din ecosisteme marine, excepie #c'nd Thermococcus sibiricus, izolat dint-un zcm'nt de petrol cu temperatur ridicat i Thermococcus *illigii i Thermococcus waiotapuensis, am!ele izolate din izvoare geotermale continentale. (rdinul cuprinde trei genuriC Thermococcus, Pyrococcus i Palaeococcus, care sunt anaero!e, utilizeaz peptidele ca surs de car!on i ma%oritatea lor se dezvolt #oarte !ine n prezena sul#ului, produc'nd o cantitate mare de hidrogen sul#urat. *entru cultivarea acestor microorganisme se pre#er utilizarea !ioreactoarelor din sticl, cu !ule de gaz. n #igura 1 este prezentat un !ioreactor utilizant pentru cultura termo#ilelor.

5igura1. 2ioreactor cu !ule de gaz utilizat pentru cultura hipertermo#ilelor. A-schema !ioreactorului, 2-imagine lateral, &-imagine a prii superioare (/odfroy, +., "##($. +ecoltarea pro!elor pentru termo#ilele marine se #ace n general #olosind sonde care sunt acionate de la supra#a, procedeul #iind destul de anevoios. *entru colectarea di#eritelor pro!e din izvoare termale de ad'ncime sunt necesare aparate speciale pentru colectare- "7N ,:"eep 7u!mergence Nehicles;- i +(N ,S+emotelF (perative Nehicles;-. *ro!ele conin #ie lichide, #ie poriuni solide ,structuri ale courilor vulcanice, roci, sedimente, vieuitoare, etc.-. *ro!ele lichide sunt colectate in #loacoane )is?in, seringi de titan sau tu!uri (+A. *ro!ele solide sunt colectate cu echipamentele "7N sau +(N, care au in componen un compartiment steril de colectare a pro!elor. "up colectare, pro!ele tre!uiesc procesate imediat, datorit #aptului c ma%oritatea termo#ilelor sunt anaero!e sau #acultativ anaero!e ,excepie #c'nd Marinithermus hydrothermalis, +eropyrum amini i c'teva tulpini de Thermus - . n mod normal pro!ele sunt pstrate n sticle cu dop de cauciuc impermea!il la gaze, n atmos#er de azot. Mediile de cultur #olosite di#er n #uncie de necesitile nutritive ale microorganismului. 6ermo#ilele marine pot #i clasi#icate nC microorganisme #ermentative, metanogene, heterotro#e aero!e, reductoare autotro#ice sau heterotro#ice de nitat, sul#at, sul# sau #ier. n ta!elul E sunt prezentate principalele tipuri de termo#ile marine, n #uncie de meta!olism.

6a!el E. Microorganismele termo#ile n #uncie de meta!olism. 6ipul meta!olic 5ermentative (rdinul ,<enul7u!strat sau donor de eMaterie organic Aceptor de e-,
0

Metanogene CO2

Thermococcales (Thermococcus, Pyrococcus, Palaeococcus$, Thermotogales (Thermosipho i Marinitoga$, lostridiales (Tepidibacter, aminicella, aloranaerobacter$ i Desulfurococcales ()taphylothermus$ Thermoanaerobacterales ( aldanaerobacter$ /(, Methanococcales (Methanocaldococcus, Methanotorris, Methanothermococcus) i Methanopyrales (Methanopyrus)

materie organic H2(format) H2

&(,-

CO2 Heterotrofe aerobe O2

Desulfurococcales (Aeropyrum)

Materie organic Materie organic O2 Materie organic H2 7D ,)(B-, 7/(B/- , 7(B/-7(E/(S0, 7/(B/- )

Thermales (Marinithermus) Thermales (Vulcanithermus i

O2, NO3&hemolitoautotro#e o!ligate

Oceanithermus) Desulfurococcales (2gnicoccus$, Desulfurobacterium group (Desulfurobacterium, .alnearium, Thermovibrio$ 3i %autiliales (4ebetimonas$ Thermodesulfobacterales (Thermodesulfobacterium 3i Thermodesulfatator$ +quificales (Persephonella 3i +quife,$

H2 H2 H2 H2

O2,NO3-,(S0)
%autiliales ( aminibacter$

NO3 ,S , O2 5acultativ chemolitoautotro#e +rchaeoglobales (+rchaeoglobus 7(E/-, 5eAAA

0

, Materie organic 7/(B/- ,7(B/-

3i /eoglobus$ Deferribacterales (Deferribacter$

H2, Materie organic NO3-,5eAAA S0, arsenat

%autiliales ( aminibacter and %autilia$

H2, Materie organic S , 7/(B , S

0 /-

NO3-,S0, 7(B/2-

Thiotrichales (Thiomicrospira)

O2 eterotro#e o!ligat
Desulfurococcales (Pyrodictium$

H2, Materie organic

S0, 7/(B/-

anaero!e NO3-,5eAAA

Desulfuromonadales (Geothermobacter)

Materie organic (Naka a!a,"#, "##($

Ma%oritatea termo#ilelor necesit cultivarea n condiii anaero!e. &ulturile se realizeaz n mod normal n tu!uri ungate sau n !aloane de 1DD-/GD ml, nchise cu dopuri de cauciuc. Nolumul mediului de cultur tre!uie s #ie cel mult /DT din volumul !aloanelor sau tu!urilor. Nolumul li!er de gaz tre!uie s #ie /, /@&(/ ,KDC/D-, )/ sau )/@&(/. &el mai #olosit mediu de cultur este mediul salin !azal ,ap de mare sintetic-, care are urmatoarea compoziie, raportat la un litru de ap deionizat i distilatC )a&l /G g Mg&l2 x J 2( E./g Mg7(4 x I 2( B.Eg R&l 0.5 g ) 4&l D./G g R2 *(4 D.1E g &a&l2 x / /( D.Ig 5e7(4 x I 2( D.D/g 7oluie mineral 1D ml.

7oluia mineral are urmtoarea compoziie ,per litru de ap distilat i deionozat-C Acid nitrilotriacetic ,)6A- 1.Gg Mg7(4 x I 2( Bg Mn7(4 x G 2( D.G g )a&l 1.D g 5e7(4 x I 2( D.1 g &o7(4 x I 2( D.1K g &a&l2 x / /( D.1 g Qn7(4 x I 2( D.1K g &u7(4 x G 2( D.D1 g RAl ,7(4-/ x1/ 2( D.D/ g D.D1 g B2(B )a/Mo(E x / 2( D.D1 g )i&l/ x J 2( D.DIG g )a/7e(B x G 2( D.DG g Acest mediu este adaptat n #uncie de necesitile speciale ale microorganismului de interes. Ancu!area se #ace #ie n incu!atoare, #ie n !aie de ulei, care pot atinge temperaturi de peste 1BD o& i presiune de EDD?*a. Azolarea n culturi pure se #ace #olosind tehnica diluiilor repetate. *rimul pas l reprezint determinarea densitii celulare din cultura ce va urma s #ie supus diluiilor. n continuare se realizeaz diluii seriale 1C1D p'n c'nd densitatea celular a%unge la aproximativ 1D/1DB celule@ml. "in ultima diluie se #ac diluii de 1C/ p'n c'nd #actorul total de diluie depete densitatea celular iniial cu cel puin dou ordine de mrime. ntreaga operaie de diluie este necesar s #ie repetat de B-G ori (Nakagawa, S., /DDJ-.

1D

2. Mi$r%%&!nis#" psi$+r%(il"
*'n la ora actual, s-au raportat numeroase specii de microorganisme psichro#ile ,peste 1DD-, at't <ram pozitive, c't i <ram negative. Acestea au #ost identi#icate n sol, nisip, ape dulci, ape marine sau n ghearele mrilor i oceanelor. *sichro#ilele aparin genurilor +lcaligenes, +lteromonas, +quaspirillum, +rthobacter, .acillus, .acteroides, .revibacterium, /elidibacter, Methanococcoides, Methanogenium, Methanosarcina, Microbacterium, Micrococcus, Moritella, -ctandecabacter, Phormidium, Photobacterium, Polaribacter, Polaromonas, Psychroserpens, )hewanella i 5ibrio. <enul Morritella este compus n totalitate din psichro#ile. *rimele psichro#ile identi#icate n Antarctica au #ost 4eifsonia aurea, )porosarcina macmurdoensis i Kocuria polaris. Ast#el n orice mediu cu temperaturi sczute, cea mai mare parte a microorganismelor izolate sunt psichro#ile. "easemenea, au #ost identi#icate numeroase psichro#ile n peterile reci din *irinei, Alpi, &arpai, 8apland sau Arctic. &ea mai mare parte a lor aparine genurilor +rthrobacter, Pseudomonas si 'lavobacterium, predomin'nd genul +rthrobacter. &ele mai multe microorganisme izolate din solurile acestor peteri sunt similare +rthrobacter glacialis. n locurile unde zpada se topete sau unde supra#aa zpezii este colorat n rou, verde sau gal!en, se gsesc alge. Ma%oritatea acestora sunt psichro#ile4 speciile reprezentative suntC hloromonas brevispina, . pichinchae, . rubroleosa, . polyptera i hlamydomonas nivali ,7atFanaraFana, /DDG-. "intre toate componentele celulare ale psichro#ilelor, cele mai importante sunt proteinele. n ta!elul G sunt prezentate principalele proteine o!inute #olosind psichro#ilele. 6a!elul G. Microorganisme psichro#ile productoare de proteine utile *roteina Microorganismul productor .-amilaz Pseudoalteromonas haloplan1tis *roteaz alcalin Pseudomonas aeruginosa 6riozo-#os#at izomeraz Moritella marina &itrat-sintaz 6ulpina !acterian "7/-B+ ,AntarticaMalat-dehidrogenaz +quaspirillium arcticum 1ilanaz Pseudoalteromonas haloplan1tis Adenilat-?inaz )porosarcina globispora *rotein-tirozin#os#ataz )hewanella sp. 2005) +e#erine Agha%ari et al. ,1HHJ, 1HHKAgha%ari et al. ,/DDBAlvarez et al. ,1HHK+ussell et al. ,1HHKRim et al .,1HHHNan *etegem et al. ,/DD/, /DDB2ae i *hillips ,/DDE!"r"ta et a#. (2002, ($a%icchioli, &#, '(()) 7upravieuirea psichro#ilelor la temperaturi sczute servete ca model excelent pentru studierea adaptrii organismelor la temperaturi sczute. &ultivarea acestor extremo#ile se #ace n incu!atoare la care se seteaz temperatura minim. n general aceasta este de G o&, dar poate #i sczut prin plasarea incu!atorului n camere cu temperaturi sczute sau prin a%ustarea incu!atorului prin adugarea de rcitoare cu recircularea apei. n general, extremo#ilele nu au necesitti nutritive ridicate, datorit condiiilor naturale din care sunt recoltate, excepie #c'nd cele care se dezvolt n #ecalele pinguinilor. ( atenie sporit n alegerea mediului de cultur pentru speciile de psichro#ile tre!uie acordat salinitii mediului ,n special pentru speciile recoltate din ap marin sau din solul Antarticii-. *entru speciile recoltate din zpad sau gheat se poate #olosi ca mediu zapada sau gheaa topit i sterilizat, la care se adaug agar pentru a o!ine un mediu solid, #ar a se adauga surs de car!on. *ot #i #olosite i medii comerciale 11

diluate 1 la / sau 1 la 1D, precum tripton- soia- agar sau 8uria-2ertani agar, la care se adaug canti mici de extract de dro%dii ,D.D1-D.DD1T-. nsm'narea se #ace pe mediul rcit n preala!il la temperatura optim #iecarui microorganism. *entru izolarea psichro#ilelor marine, cel mai #recvent se utilizeaz mediul comercial Marine //1H agar, dar se poate #olosi i mediu pe !az de ap de mare sterilizat ,pre#era!il prin #iltrare; =$"!!e## , N., /DDJ-.

3. Mi$r%%&!nis#" !l$!l%(il"
"escoperirea alcalo#ilelor s-a #cut relativ recent. $lilizarea acestor microorganisme are o istorie lung in Maponia, #iind #olosite nc din antichitate n industria indigoului4 ast#el, indigoul, provenit din #runzele de indigo este redus n procesul de #ermentaie al indigoului, care are loc n condiii puternic alcaline ,httpC@@mm!r.asm.org-. Alcalo#ilele se mpart n dou mari grupuri #iziologiceC alcalo#ile si haloalcalo#ile. Alcalo#ilele necesit un p mai mare de H pentru cretere, optimul #iind de 1D4 haloalcalo#ilele necesit n a#ara p -ului peste H i o salinitate crescut ,BBT )a&l-. *rima grup are cerine minime de )a&l n mediu de cretere. Acestea se gsesc n sol, sedimente marine sau n apele cu coninut ridicat de &a/0 . aloalcalo#ilele sunt prezente n mod #recvent n lacurile !azice sau n deerturile !azice. Ma%oritatea haloalcalo#ilelor izolate din aceste medii aparin grupului Archaea. "intre genurile care cuprind alcalo!acterii pot #i amintiteC Pseudomonas, Paracoccus, Micrococcus, +eromonas, orynebacterium, +ctinopolyspora , .acillus, 5ibrio, 'lavobacterium, yanospira, hlorococcum, Pleurocapsa, )pirulina, 6ctothiorhodospira si Methanohalophilus. &ele mai cunoscute haloalcalo#ile suntC %atronobacterium pharaonis, %. gregoryi, %atronococcus occultus, Methylobacter alcaliphilus, Methylomicrobium alcaliphilum, )pirochaeta alcalica, ). asiatica, Desulfonatronovibrio hydrogenovorans, lostridium, Thermoanerobacter sp., i Thermopallium natronophilum ,7atFanaraFana, /DDG-. Azolarea alcalo#ilelor se #ace #olosind metode convenionale, cea mai important pro!lem luat n considerare #iind mediul de cultur. &ea mai #olosit tehinc este cea a diluiilor repetitive, pe plci cu mediu solid ,%e!ba&, N., /DDJ-. n mod normal, pentru cultivarea alcalo#ilelor se #olosete mediu pe !az de )a &( B)a/&(B, a%ust'nd p -ul n %urul valorii de 1D.G prin adugare de )a/&(B 1T. 7e #olosesc n principal dou mediiC mediul ori?oshi ,1HI1-, dezvoltat iniial pentru izolarea alcalo#ilelor din sol, i mediul 6indall et al. ,1HKE-. &ompoziia mediului ori?oshi ,1HI1- este urmtoarea ,grame per litru-C <lucoz 1D.D *epton G.D >xtract de dro%dii G.D R /*(E 1.D Mg7(E x I /( D./ )a/&(B 1D.D. &ompoziia mediului 6indall et al. ,1HKE-, exprimat n grame per litruC >xtract de dro%dii 1D.D Acizi casaminici I.G &itrat trisodic B.D R&l /.D Mg7(E x I /( 1.D Mn&l/ x E /( D.DDDBJ 5e7(E x I /( D.DG 1/

 )a&l /DD )a/&(B 1D.D 8a preparare, mediul poate prezenta precipitai i are p -ul cuprins ntre 1D.G i 11, dar dup turnarea n plci, p -ul scade la H.G-1D, datorit a!soriei de &(/ ('ra(t,)., 200*).

4.Mi$r%%&!nis#" !$i,%(il"
Acido#ilele sunt microorganisme capa!ile s supravieuiasc n medii cu p sczut. "in aceste medii au #ost izolate !acterii chemoautolitotro#e, care oxideaz mineralele ce conin #ier i sul#. &ele mai studiate suntC +cidithiobacillus ferroo,idans, 4eptospirillum spp., +cidithiobacillus thioo,idans, Acidithiobacillus caldus, "ulfobacillus !++. i *erroplasmaceae !++# ,ea!eme(ea a" fo!t i-o#ate mi.roorga(i!me &eterotrofe a.i/ofi#e .e a+ar0i( ge("#"i +cidiphilium i heterotro#e #acultative, ca +cidimicrobium spp., Desulfosporosinus spp. i 'errimicrobium spp.. ( parte important a microorganismelor acido#ile aparine domeniului Archaea. Acestea pot #i mprite n dou ordine #ilogeneticeC )ulfolobales i Thermoplasmatales. "intre reprezentanii )ulfolobales pot #i amintiteC +cidianus ambivalens, +cidianus brierleyi, Metallosphaera spp., )ulfolobus acidocaldarius, )ulfolobus solfataricus i )ulfolobus metallicus. (rdinul Thermoplasmatales are n componena reprezentani ai Thermoplasma spp., Picrophilus spp. i 'erroplasma spp. , <onzalez-6oril, >., /DDJ-.

1. Mi$r%%&!nis#" +!l%(il"
Microorganismele halo#ile au capacitatea de a se dezvolta la concentraii ridicate de sare, de la 1DT )a&l, p'n la saturaie, iar unele microorganisme pot supravieui chiar i n cristale de sare ,8itch#ield, &., /DDJ-. %a1oritatea mi.roorga(i!me#or &a#oto#era(te a fo!t i-o#at2 /i( a+a !2rat2, mari(2 !a" /i( #a."ri. 3( %area %oart2 a" fo!t i/e(tifi.a0i f"(gi &a#oto#era(0i, .e a+ar0i( ge("ri#or 45gom5.oti(a ,+bsidia glauca-, AscomFcotina , haetomium aureum, . flavigenum, 6mericella nidulans, 6urotium amstelodami, /ymnoascella marismortui, Thielavia terricola- i #ungi mitosporici ,+cremonium persicinum, )tachybotrys chartarum, 7locladium chlamydosporum-. "in lacurile cu salinitate ridicat au #ost izolate ciano!acterii halo#ile, ca +phanothece halophytica, Microcoleus chthonoplastes, Phormidium ambiguum, -scillatoria neglecta, -. limnetica -. salina i Dactylococcopsis salina. "intre !acteriile organotro#e <ram negative halo#ile pot #i amintiteC +cinetobacter, +lteromonas, Deleya, 'lavobacterium, Marinomonas, Pseudomonas i 5ibrio. "in solurile srturate i saline au #ost izolate specii halo#ile aparin'nd genurilor Marinococcus, )porosarcina, )alinococcus i .acillus. n apa de mare sunt rsp'ndite numeroase halo!acterii aparin'nd genului ArchaeaC &aloarcula, &alobacterium, &alofera,, &alorubrum, &alococcus, &alobaculum, &aloterrigena i &alorubrum. ( alt categorie a halo#ilelor este reprezentat de halo#ilele metanogene4 ast#el, din lacurile srate i oceane au #ost izolate Methanohalophilus mahii, M. evestigatum i M. &alophilus ,7atFanaraFana, 6., /DDG-. Azolarea i cultivarea halo#ilelor la nivel de la!orator prezint anumite di#iculti, derivate din compoziia n sare a mediului de cultur. 6emperatura de incu!are i salinitatea ridicat pot determina #ormarea de precipitai ai srii i limiteaz utilizarea anumitor aditivi precum agenii de geli#icare ,gelan sau <elriteU - sau indicatori ,laptele pra# degresat #olosit pentru detectarea activitii proteolitice, care coaguleaz n mediu cu salinitate ridicat-. n cazul microorganismelor care necesit perioade lungi de incu!are, tre!uie s se ai! n vedere #aptul c salinitatea se modi#ic n timp i acest lucru poate diminua creterea micro!ian. Azolarea n culturi pure este un #actor 1B

esenial n studiul microorganismelor. &ultivarea halo#ilelor izolate din ap se #ace pe medii ce au la !az o soluie salin, asemnatoare apei de mare concentrate. n plus, tre!uie s se in cont de necesitile speci#ice ale #iecrei !acterii, n #uncie de mediul din care a #ost izolat. 7pre exemplu, !acteriile izolate din Marea Moart, precum &alorubrum sodomense i &alobaculum gomorrense necesit o concentraie mare de ioni de Mg /0 n mediu. Ast#el, se recomand ca mediul de cultur s imite c't mai !ine condiiile naturale de unde au #ost prelevate microorganismele. 7e recomand chiar, dac se poate, s se #oloseasc chiar apa din mediul de unde au #ost izolate microorganismele, sterilizat n preala!il. *rincipalul mediu pe care se cultiv halo#ilele la nivel de la!orator este mediul M<M ,Modi#ied <roPth Medium-, care are n compoziie soluie de ap srat i o alt surs nutritiv !ogat ,G g per l de pepton i 1 g per l extract de dro%dii-. nsm'narea mediului se #ace dup realizarea unei serii de diluii, ast#el nc't numrul de colonii s #ie cuprins ntre BD i BDD. Ancu!area se #ace la n general la BIo&, la ntuneric. 6otui, temperatura optim pentru multe halo#ile este mai ridicat4 spre exemplu &alofera, volcanii are o rat de cretere mult mai mare la EGo& dec't la BIo& ,2urns, "., /DDJ-.

5. Mi$r%%&!nis#" *!r%(il"
2aro#ilele sunt microorganisme capa!ile s supravieuiasc n medii cu presiune hidrostatic ridicat. Aceste tipuri de microorganisme se gsesc n general n mri i oceane ad'nci, unde sunt ntalnite condiii de nalt presiune hidrostatic. &ele mai multe dintre !acteriile !aro#ilice i !arotolerante #ac parte din categoria 8-*roteo!acterii. "intre acestea putem amintiC Photobacterium, )hewanella, olwellia i Motiella. n cazul !aro#ilelor a #ost studiat e#ectul presiunii asupra mem!ranei celulare, a proteinelor i a expresiei genelor. &a rspuns al presiunii ridicate, cantitatea relativ de acizi monounsaturai i poliunsaturai cresc n mem!ran. ( +lteromonas sp. !arotolerant a artat proporii ridicate de acizi grai nesaturai n mem!rana celular. &antitatea mai mare de acid nesaturat produce mai mult #luid mem!ranar i contracareaz e#ectul creterii v'scozitii cauzat de presiunea ridicat. 2aro#ilele sunt extrem de sensi!ile la lumina $N i aadar, pentru dezvoltare, au nevoie de un mediu ntunecat sau cu lumin redus, ca cele din mediul maritim ad'nc. *resiunea poate sta!iliza proteinele i nt'rzia denaturarea termic ,7atFanaraFana, 6., /DDG-.

6. Mi$r%%r&!nis#" r" ist"nt" l! r!,i!7ii

&apacitatea de supravieuire a microorganismelor la doze ridicate de radiaii este n general redus. >xist totui anumite microorganisme care s-au adaptat i sunt capa!ile de supravieuire n ast#el de condiii. +ezistena la doze ridicate de radiaii este o trstur ce a #ost do!andit accidental de microorganisme, n condiii naturale dozele de radiaii #iind destul de sczute. "oar o mic parte a microorganismelor poate supravieui acestor condiii. &ele mai cunoscute suntC Methylobacterium radiotolerans, Kocuria rosea, +cinetobacter radioresistens, Kineococcus radiotolerans, &ymenobacter actinosclerus, hroococcidiopsis spp., !ubrobacter ,ylanophilus, Deinococcus radiodurans, Deinococcus proteolyticus, Deinococcus radiophilus, Deinococcus radiopugnans, Deinococcus grandis, Deinococcus geothemalis, Deinococcus murrayi, Deinococcus hoho1amensis, Deinococcus nava0onensis, Deinococcus hopiensis, Deinococcus apachensis, Deinococcus maricopensis, Deinococcus pimensis, Deinococcus yavapaiensis, Deinococcus papagonensis, Deinococcus sonorensis, Truepera radiovictri,, Pyrococcus abyssi, Pyrococcus furiosus, Thermococcus gammtolerans i Thermococcus radiotolerans (4immerma(, 6, 200*).

1E

18. Mi$r%%&!nis#" %li&%tr%("

Microorganismele oligotro#e sunt acele microorganisme capa!ile s se dezvolte i s supravieuiasc ntr-un mediu ce conine o cantitate de D./-1J.K mg de car!on organic per litru. &ea mai important caracteristic a oligotro#elor este aceea c dein un sistem de preluare al nutrienilor din mediul nco%urtor dezvoltat, care le #avorizeaz supravieuirea. Ast#el, oligotro#ele au un raport supra#a@volum mare, sisteme de preluare a nutrienilor #oarte dezvoltate i rezisten natural la #actorii de stres din mediu ,temperatur, peroxid de hidrogen sau etanol-. +eprezentani C aulobacter, &yphomicrobium, Prosthecomicrobium, +ncalomicrobium, 4abrys i )tella ,7atFanaraFana, 6., /DDG-.

:i*li%&r!(i"
1. 2urns, ". V "Fall-7mith, M.. Culti-!ti%n %( 9!l%!r$+!"!. AnC+aineF, 5. V (ren, A ,ed.Methods in Micro!iologF, Nolume BG, >xtremophiles, Academic *ress, /DDJ, pp.GBJ-GE/4 /. &avicchioli, +. V 6homas, 6.. E'tr"#%p+il"s. AnC M. 8eder!erg. ,ed.- >ncFclopedia o# Micro!iologF, 7econd >dition, Nol. /, Academic *ress, 7an "iego, /DDD, pp. B1IOBBI4 B. &avicchioli, +., &urmi, *., 7iddi3ui, R.V 6orsten, 6.. Pr%t"ins (r%# Ps>$+r%p+il"s AnC+aineF, 5. V (ren, A ,ed.- Methods in Micro!iologF, Nolume BG, >xtremophiles, Academic *ress, /DDJ, pp. EDJ-EDI4 E. <od#roF, A., *ostec, A. V +aven, )., Gr%?t+ %( 9>p"rt+"r#%p+ili$ Mi$r%%r&!nis#s (%r P+>si%l%&i$!l !n, Nutriti%n!l Stu,i"s. AnC+aineF, 5. V (ren, A ,ed.- Methods in Micro!iologF, Nolume BG, >xtremophiles, Academic *ress, /DDJ, pp. HB-HI4 G. <onzalez-6oril, >., <omez, 5., Mal?i, M. V Amils, +.. T+" Is%l!ti%n !n, Stu,> %( A$i,%p+ili$ Mi$r%%r&!nis#s, AnC+aineF, 5. V (ren, A ,ed.- Methods in Micro!iologF, Nolume BG, >xtremophiles, Academic *ress, /DDJ, pp. EI14 J. <rant, @.. Culti-!ti%n %( A"r%*i$ AlA!lip+il"s. AnC+aineF, 5. V (ren, A ,ed.- Methods in Micro!iologF, Nolume BG, >xtremophiles, Academic *ress, /DDJ, pp. EEB-EEE4 I. 8itch#ield, &., 7i?aroodi, M. V <illevet, *.. C+!r!$t"ri !ti%n %( N!tur!l C%##uniti"s %( 9!l%p+ili$ Mi$r%%r&!nis#s, AnC+aineF, 5. V (ren, A ,ed.- Methods in Micro!iologF, Nolume BG, >xtremophiles, Academic *ress, /DDJ, pp. G1B4 7. %e!ba&, N. 8 )iege#, 6.. Isolation, Cultivation and Characterization of Alkalithermophiles. AnC+aineF, 5. V (ren, A ,ed.- Methods in Micro!iologF, Nolume BG, >xtremophiles, Academic *ress, /DDJ, pp. EG/-EJ14 9. Nakagawa,S. 8 akai, :.. The Isolation of Thermophiles from Deep-sea Hydrothermal Environments, AnC+aineF, 5. V (ren, A ,ed.- Methods in Micro!iologF, Nolume BG, >xtremophiles, Academic *ress, /DDJ, ++.55-;7 1D. +aineF, 5. V (ren, A.. E'tr"#%p+il" Mi$r%%r&!nis#s !n, t+" M"t+%,s t% 9!n,l" T+"# AnC+aineF, 5. V (ren, A ,ed.- Methods in Micro!iologF, Nolume BG, >xtremophiles, Academic *ress, /DDJ, pp. G-1D4 11. $"!!e## , N. 8 Cowa(, ,.. Handlin of psychrophilic !icroor anisms. AnC+aineF, 5. V (ren, A ,ed.- Methods in Micro!iologF, Nolume BG, >xtremophiles, Academic *ress, /DDJ, pp. BI1-BKK4 1G

1/. 7atFanaraFana, 6., +aghu?umar, &. V 7hiva%i, 7.. E'tr"#%p+ili$ #i$r%*"s< Bi-"rsit> !n, p"rsp"$ti-"s, &urrent 7cience, N(8. KH, )(. 1, 1D MulF /DDG, pp.IK-KK4 1B. Qimmerman, M. V 2attista, M.. M"!surin& Sur-i-!l in Mi$r%*i!l P%pul!ti%ns F%ll%?in& E'p%sur" t% I%ni in& R!,i!ti%n. AnC+aineF, 5. V (ren, A ,ed.- Methods in Micro!iologF, Nolume BG, >xtremophiles, Academic *ress, /DDJ, pp.IEJ-IEI4 1E. httpC@@mm!r.asm.org@cgi@content@#ull@JB@E@IBGW7>&14 1G. httpC@@en.Pi?ipedia.org@Pi?i@>xtremophile.

1J