1.

Definitie
2.Elemente biologice
3.Metode de imobilizare a elementului biologic
4.Traductori
5.Aplicatii


CE ESTE UN BIOSENZOR?
Un biosenzor este un dispozitiv format dintr-un element biologic (enzim,
biomolecul, anticorp, celule microbiane, esut, etc) ce este imobilizat n
vecintatea unui traductor (electrochimic, optic, termic, etc) ce transform un
semnalul chimic rezultat n urma interaciei analitului cu elementul biologic
ntr-un rspuns msurabil, de obicei ntr-un rspuns electronic.
Analiti
microorganisme
anthrax, tularemia, E. coli, Candida
molecule mici
glucoza, alcool, CO, CO2, agenti paralizanti, uree, pesticide,
aspirina, paracetamol, penicilina, TNT, colesterol, aminoacizi
biomacromolecule
DNA, RNA, enzime, proteine, hormoni, virus
Analit / bioreceptor / traductor / procesor
1) ENZIME
- cele mai utilizate in constructia biosenzorilor - catalizatori ai unor
reactii- se poate utiliza o enzima sau se pot cupla doua saumai multe
reactii enzimatice cu producerea unui compus cepoate fi determinat prin
diverse metode
Elemente biologice
Enzime utilizate in biosenzori
- cele mai multe sunt enzime REDOX (reductaze, oxidaze) producatoare
/consumatoare de electroni: detectie amperometrica sau colorimetrica
- enzimele hidrolitice (proteaze, lipaze, esteraze) producatoare
/consumatoare de electroni: detectie
potentiometrica sau conductometrica- sisteme enzimatice cuplate, cum ar fi
peroxidaza cuplata cu luciferazace duce la obtinerea unui produs colorat sau la
emisia de fotoni: detectie optica

2) ANTICORPI / ANTIGENI
Anticorpii- proteine ce pot recunoste in mod specific o substanta specifica
(antigen) ca mijloc natural de aparare- caracterizati de interactii extrem
de selective si puternice cu antigenii specifici- pot fi obtinuti anticorpi
pentru aproape orice antigen
Anticorpii in biosenzori
Avantaje:
- selectivitate foarte inalta; realizare de legaturi
puternice
Dezavantaje:
- nu prezinta efect catalitic, fiind necesara
determinarea lor indirecta prin marcarea lor cu
diversi agenti de marcare. Agenti de marcare:
radio-izotopi, enzime, fluorofori, compusi
chemiluminiescenti
Observatie.
In cazul traductorilor
Piezoelectrici
se poate face o determinare directa datorita
modificarilor in frecventa de vibratie
a cristalului in urma legarii antigenului


Legarea antigen
Lant de
retea

Lant
durabil
3) PROTEINE RECEPTOR
- proteinele receptor se afla de obicei la suprafata celulei sau
in membrana celulara.
- pot fi utilizate in special la determinarea neuro-
transmitatorilor, hormonilor, medicamentelor neuro-
active,anestezicelor, etc.
- extrem de selective, dar adesea greu se izolat, putandu-se
utiliza si biomembrane intacte sau celule intregi.
4) ACIZI NUCLEICI
- ADN-ul si ARN-ul pot fi utilizati pentru realizarea
unor senzori in format chip
- biosenzorii bazati pe ADN si ARN se utilizeaza pentru
detectia mutatiilor genetice si pentru determinarea nivelurilor
de expresie a proteinelor.
5) CELULE / TESUTURI
- biosenzorii bazati pe celule sau tesuturi sunt mai putin
selectivi - utilizati in special pentru determinari semicantitative;
pentru determinarea indicilor de toxicitate
Metode de imobilizare a componentei biologice
IMOBILIZARE
FIZIC
CHIMIC
Absorbie
Reinere fizic n spatele
unei membrane pentru
molecule mici
nglobarea n reeaua
unui polimer
Legare covalent
Legare ncruciat
Imobilizare eficient
Orientare corect a elementului biologic
Accesibilitatea analitului la elementul biologic
Reinerea activitii biologice
Difuziune uoar a analitului ctre ele,entul biologic
Stabilitate operaional i durata de via


In cazul imobilizrii chimice este necesara prezena unor grupri funcionale la
nivelul elementului biologic sau funcionalizarea acestuia.
In cazul imobilizrii proteinelor pot fi exploatate urmtoarele grupri
funcionale ale aminoacizilor
Lizina(NH2) Cisteina (SH) Serina(OH) Acid Aspatic(COOH)
IMOBILIZAREA FIZIC
+ Nu este afectat structura elementului biologic
+ Limiteaz contaminarea cu prteine prezente n prob
+ Limiteaz biodegradarea elementului biologic

- Difuzia analitului ctre elementul biologic poate fi ncetinit
- Reinerea unor molecule nedorite (interferente) n spatele membranei sau n
reteaua polimerului
- Pierderea elementului biologic
IMOBILIZAREA CHIMIC
+ Stabilitate mrit
+ Un bun control asupra orientrii elemntului biologic n cazul imobilizrii
covalente
+ n cazul utilizrii unui electrod ca traductor, la imobilizare se poate utiliza
un agent de legare conductor de electroni ducnd la o efiecien mai mare a
semnalului electronic

- Afectarea structurii elementului biologic i pierderea selectiviii/activitii
catalitice n timpul reaciilor chimice de imobilizare (n special n cazul
legrii ncruciate)
- Rezistena mecanic a sistemului paote fi slab
IMOBILIZAREA BAZAT PE AFINITATE BILOGIC
Elemnet biologic
Biotina
Avidina (proteina tetrameric)
Biotina
Traductor
Element biologic
Antigen
Anticorp
Traductor
1. Sistemul
avidina-biotin
2. Sistemul
antigen-anticorp
Imobilizarea celulelor bazate pe afinitatea biologic
Celule cu integrine de suprafa
Matrice extra-celular (EMC)
Fibronection tri-peptida RGD (arg-Gly-Asp) in EMC
Repdite RGD
Integrine (factori de ataare)
Traductor
Timp de via
Absorbie 1 zi
nglobarea n polimer 1 sptmn
Legare ncruciat 3-4 sptmni
Imobilizare covalent 4-14 luni
Afinitate biologic sptmni-luni (variabil)
Funcionalizarea suprafeei traductorului
1. Monostraturi auto-asamblare (Self-assembled Monolayers - SAMa)

Se formeaz prin absorbia pe suprafee de aur a unor derivai alcan-
tiolici X(CH2)n
Sunt caracterizate printr-o orientare foarte precis
Tiol dizolvat n etanol
Suprafa de aur
imersat n soluie
Grup funcional:
OH, NH2, COOH
Alcan
SH
Monostrat auto-asamblat
2. Silanizarea oxizilor metalici
Grup funcional
Alcan
Si
+ H2O +
Hidroliza
Condensare
C2H5O
C2H5O
C2H5O
Sticla (SiO2) sau alt
oxid metalic
Ageni pentru prevenirea adsorbiei non - specifice
PEG (poli-etilenglicol)
Fosfocolina
- Component a membranelor biologice
Albumina seric
- proteina seric neadeziv


Heparina
- Zahar c previne coagularea sngelui

TRADUCTORI
1. Traductori electrochimici
a) Poteniometrici:
- Se msoar potenialul celulei electrochimice la curentul zero. Potenialul
celulei este proporional cu concentraia ionilor.
- n construcia biosenzorilor poteniometrici intr de obicei enzime ce
determin schimbri semnificative ale pH-ului: penicilina, ureaza, estereza.
Electrod de
referin
Electrod de lucru
Proba
Enzima imobilizat la
suprafaa electrodului
Punte de sare
b) Amperometrici
- Se aplic un potenial ntre un electrod de lucru i
un electrod de referin, msurndu-se n mod
continuu curentul din celul;
- Cele mai utilizate enzime sunt oxidoreductazele:
glucozoxidaza, colesterol oxidaza, aminoacid
oxidaza, etc.
c) Conductometrici

- Se msoar conductaa/rezistena unei soluii
- Se pot utiliza cnd n timpul conversiilor enzimatice
sunt sunt generate sarcini electrice (amidaze, esterase,
kinaze).
Exemplu: determinarea ureei (n urin) utiliznd ureaza:
Urea + 2H2O 2NH4 + HCO3
ureaza
(Dez)avantaje ale biosenzorilor electrochimici
+ Uurin n operare
+ Interfa direct cu sistemul electronic
+ Posibilitate de miniaturizare
Selectivitate limitat, fiind necesar utilizarea mediatorilor pentru mbuntirea
acesteia
Poate fi aplicat numai sistemelor la care particip specii electrochimic active


Dispozitive necesare: tuburi fotomultiplicatoare, spectrofotometre,
fluorimetre, fibre optice, ghiduri de und
Traductori optici
Tehnici optice ce pot fi utilizate n domeniul biosenzorilor
Absorbia n UV/Vizibil,
Emisie de fluoriscen (fosforosiscen),
Bio-luminiscen,
Chemi-luminiscen,
Spectroscopie de Reflexie Intern (IRS),
Metode bazate pe dispersia luminii.
FLUORISCENA
Proprietatea unor molecule (fluorofori) de a absorbi
lumin la o anumit lungime de und (de obicei n UV)
urmat de emisia de lumin la o alt lungime de und
(n vizibil).

Aplicaii: chip-uri ADN, imunoanaliza

Fluoriscena de transfer a energie de rezonan (FRET)
FRET const intr-o interacie, dependent de
distana, dintre doi fluorofori, n care energia de
excitaie a unuia (donor) este transferat la celalalt
(acceptor) fr emisie de fotoni.

Eficiena FRET este dependent de distana
intermolecular i sete util la distane comparabile
cu dimensiunea macromoleculelor biologice.
(Dez)avantajele traductorilor optici

+ Usurin n operare
+ Pot rspunde simultan la analii diferii
+ Precizie inalt
+ Posibilitatea utilizrii fibrelor optice pentru un transport al
fotonilor mai eficieni
+ Extrem de sensibili (n special n cazul celor bazai pe
fluoriscen i luminescen)

- Depind de disponibilitatea compusului cu proprieti optice
- Domeniu dianmic de aproximativ 100 (n cazul n care se aplic
legea Lambert-Beer)
- Dificulti n miniaturizare
- Timpul de rspuns poate fi mare
- Interferena altor compui prezeni la matrici complexe
- Interferena luminii exterioare n cazul traductorilor
luminesceni.
Traductori termici
- formarea/ruperea legturilor chimice n reaciile enzimatice duc la modificri de
entalpie,
-Pot fi detectate modificri ale temperaturii soluiilor de aproximativ 1000 K,
- pentru o detectare mai bun reaciile de interes pot fi cuplate cu alte sisteme
enzimatice ce produc mai mult cldur (de exemplu, glucozoxidaza poate fi cuplat cu
cataliza)
- +pot fi utilizate pentru majoritatea reaciilor
- - selectivitate sczuta
- - dificulti in miniaturizare
Traductori piezoelectrici
Frecvena (f) oscilaiilor cristalului depinde de masa cristalului
(m) i de cea a oricrui material adsorbit pe suprafa sa (A).
Frecvena oscilaiilor descrete cu masa adsorbit.
Materiale pieyoelectrice: Cuar, materiale ceramice, polimeri
organici
+extrem de sensibili (determinarea antigenului n domeniul picogramelor)
+ posibilitatea de determinare a antigenului att n faz gzoas, ct i lichid
+portabilitate
+timp scurt de rspuns
+nu necesit marcare

- adsorbia nespecific a proteinelor poate duce la rezultate false
Membrane conductoare (polipirol)
Membrane ne+conductoare (politriamin)
Biosenzori amperometrici bazai pe
imobilizarea componentei biologice/n
membrane obinute prin
electropolimerizare direct la suprafaa
electrodului de lucru
RE
CE
WE
1 cm
BIOSENZORI BAZAI PE ELECTROZI SERIGRAFIAI
Producie de serie
Pre de cost cszut
Uor de locuit
Necesit volume mici de prob
Potrivii pentru determinri pe teren
Factorii de mediu biointeraciunea i performanele
biosenzorilor
Prezena moleculelor de interferen (adic, inhibitori ai
enzemei)
Ageni de denaturare (solveni organici i detergeni)
Suprafee hidofobe
rezisten ionic, pH nefavorabil
Concentraie analitic (Saturaie; adic, toate tipurile de
anticorpi )
Aceti factori pot afecta n mod semnificativ selectivitaea,
specificitatea i etanietatea.
Prin urmare, soluii ale analitului de obicei trebuie s fie pregtite
nainte de a analiza (pH neutru, fr detergeni, i aumite
concentraii).
DOMENIILE DE APLICARE
medicin
glucoza, alcool, ADN, RNA, proteine, hormoni, aspirina, paracetamol, penicilina

bio-procese industriale
aminoacizi, drogdie de bere, acid lactic, etanol, etc.
mediu nconjurtor
pesticide, ngrminte, esterogen mimiks, CO, CO2

sisteme de protectie/criminalistic
antrax, variola, ageni nervoi, cocain
Test de sarcin
Antrax
Glucoza