UNIVERSITATEA DE MEDICIN I FARMACIE

DIN CRAIOVA




TEZ DE DOCTORAT

REZUMAT


STUDIU HISTOLOGIC AL DEZVOLTRII FETALE A ORGANULUI ADIPOS I AL
ROLULUI SU N PATOGENIA INFLAMAIEI DIN OBEZITATE






Conductor tiinific
Prof. univ.dr. tefania Crioiu


Doctorand
ANA MARINA FUSARU



2012










Investete n oameni!
FONDUL SOCIAL EUROPEAN
Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007 2013



Axa prioritar: 1
Educaia i formarea profesional n sprjinul creterii economice i dezvoltrii
societii



Domeniul Major de Intervenie: 1.5
Programe Doctorale i Post-Doctorale n spijinul cercetrii



Titlu proiect:
Spijnirea tinerilor doctoranzi cu frecven prin acordarea de burse doctorale


Cod Proiect:
POSDRU/88/1.5/S/52826



Beneficiar:
Universitatea de Medicin i Farmacie din Craiova.












3

Cuprins
LIST DE ABREVIERI
INTRODUCERE
STADIUL CUNOATERII
8
11
1. HISTOLOGIA I HISTOFIZIOLOGIA ORGANULUI ADIPOS
1.1. Conceptul de organ adipos i depozitele adipocitare
1.2. Heterogenitatea depozitelor adipocitare
1.2.1. Histologia depozitelor adipocitare multiloculare
1.2.1.1. Adipocitele multiloculare
1.2.1.2. Fracia stromovascular
1.2.2. Histologia depozitelor adipocitare uniloculare
1.2.2.1. Adipocitele uniloculare
1.2.2.2. Fracia stromovascular
1.3. Histofiziologia organului adipos
1.3.1. Rolul metabolic al esutului adipos
1.3.1.1. BAT - organ al termogenezei
1.3.1.2. WAT - organ de stocare a energiei
1.3.2. Plasticitatea organului adipos
2. DEZVOLTAREA ESUTULUI ADIPOS
2.1. Etapele dezvoltrii esutului adipos
2.1.1. Etapa determinant
2.1.1.1. Teorii privind originea adipoblastelor
2.1.2. Etapa de difereniere terminal
2.2. Factori de transcripie implicai n adipogenez
2.3. Controlul fraciei stromovasculare asupra diferenierii
adipocitare
2.4. Adipogeneza uman
2.4.1. Adipogeneza fetal
2.4.2. Adipogeneza adultului
3. ORGANUL ADIPOS LA ADULT I IMPLICAIILE SALE N
PATOGENIA INFLAMAIEI DIN OBEZITATE
3.1. esutul adipos multilocular la adult
3.1.1. Identificarea i localizarea BAT la adult
3.1.2. Implicaii terapeutice ale BAT n tratamentul non invaziv al
obezitii.
15
15
16
17
18
19
21
22
22
25
25
25
30
31
34
34
35
36
38
38
41

42
42
44

45
45
45
48

4

3.2. esutul adipos unilocular la adult
3.2.1. Organul adipos-organ endocrin
3.2.1.1. Adipokine cu funcie hormonal
3.2.1.2. Citokine proinflamatorii
3.2.2. Adipogeneza la adult
3.2.2.1. Hipertrofia i hiperplazia esutului adipos
3.2.2.2. Distribuia esutului adipos la adult-implicaiile n
obezitate
3.3. Influena dietelor alimentare asupra morfologiei esutului adipos

CONTRIBUII PERSONALE
Motivarea studiului i ipotezele de lucru
Obiectivele i designul studiului
4. MATERIAL I METODE
4.1. Studiul histogenezei adipocitare fetale
4.1.1. Materialul biologic studiat
4.1.2. Metodele utilizate
4.1.2.1. Prelevarea i fixarea probelor pentru studiul de
microscopie optic
4.1.2.2. Tehnica de includere n parafin
4.1.2.3. Secionarea blocurilor de parafin
4.1.2.4. Coloraii histologice uzuale
4.1.2.5. Tehnica imunohistochimic
4.1.2.6. Tehnica de microscopie electronic de transmisie
4.2. Studiul implicrii esutului adipos n patogenia inflamaiei din
obezitate
4.2.1. Materialul biologic studiat
4.2.2. Metodele utilizate
5. STUDIU HISTOLOGIC AL ADIPOGNEZEI FETALE
5.1. Rezultate
5.1.1. Grupul foarte precoce
5.1.2. Grupul precoce
5.1.3. Grupul intermediar
5.1.4. Grupul tardiv
49
49
51
53
55
55

57
58


60
62
65
65
65
66

66
66
67
68
69
76

79
79
80
82
83
83
84
99
110
5

5.2. Discuii
5.3. Concluzii
6. STUDIU IMUNOHISTOCHIMIC AL ADIPOGENEZEI FETALE
6.1. Rezultate
6.1.1. Studiul imunohistochimic al UCP1
6.1.1.1. Grupul precoce
6.1.1.2. Grupul intermediar
6.1.1.3. Grupul tardiv
6.1.2. Studiul imunohistochimic al CD31
6.1.2.1. Grupul precoce
6.1.2.2. Grupul intermediar
6.1.2.3. Grupul tardiv
6.2. Discuii
6.3. Concluzii
7. STUDIU IMUNOHISTOCHIMIC AL IMPLICRII ESUTULUI ADIPOS N
PATOGENIA INFLAMAIEI DIN OBEZITATE
7.1. Rezultate
7.1.1. Studiul imunohistochimic al CD68
7.1.2. Studiul imunohistochimic al TNF
7.1.3. Studiul imunohistochimic al TLR
7.1.4. Studiul imunohistochimic al CD31 i VEGF
7.2. Discuii
7.3. Concluzii
Concluzii generale
Bibliografie

116
131
132
132
132
132
133
138
141
141
143
144
145
151

153
154
156
156
158
159
162
171
173
175


Cuvinte cheie: esut adipos, adipogenez fetal, obezitate, sindrom metabolic,
imunohistochimie, TNF, TLR, VEGF, UCP-1, microscopie electronic.








6

INTRODUCERE

Obezitatea reprezint una dintre cele mai mari probleme de sntate cu care se
confrunt n prezent att rile dezvoltate, ct i cele n curs de dezvoltare.
Dezvoltarea esutului adipos i corelarea funciilor sale n cadrul organului
adipos - noiune integrativ, recent acceptat de tot mai muli specialiti morfologi - a
devenit o prioritate n studiile actuale ntreprinse de cercettori aparinnd unei plaje
largi de specialiti medicale.
Persist totui numeroase neclariti i controverse tiinifice n legtur cu
originea embrionar i modul de difereniere al esutului adipos la om, cunotinele
actuale bazndu-se pe extrapolarea rezultatelor obinute la animalele de laborator
sau n culturi de celule.
Cercetrile din aceast lucrare s-au concentrat pe completarea datelor
referitoare la originea, diferenierea i dezvoltarea organului adipos la ftul uman,
prin abordarea ntr-o manier sistematic a aspectelor histologice care definesc
fiecare depozit adipos pe parcursul dezvoltrii sale fetale. Analiza rezultatelor ne-a
permis definirea noiunii de lobulogenez, formarea i edificarea lobulilor adipoi n
interiorul unui depozit considerat, i cea de adipogenez, apariia i diferenierea
celulelor liniei adipocitare propriu-zise n cadrul unui lobul adipos. Studiul histologic i
ultrastructural au fost urmate de cel imunohistochimic, urmnd aceeai logic a
edificrii structurilor lobulare.
Artm pentru prima oar la ftul uman modul n care celule prezente n
depozitele brune (BAT) exprim UCP1 - molecula responsabil de funcia
termogenic a esutului adipos. n contextul oferit de demonstrarea prin tehnici
actuale de diagnostic imagistic PET-CT a existenei BAT funcional la adult i
corelarea sa cu statusul fiziologic al indivizilor, studiul histofiziologiei BAT la ft
efectuat n prezenta lucrare contribuie n mod relevant la nelegerea originii i
modului de formare i funcionare a depozitelor adipocitare n cadrul integrat al cilor
metabolice proprii organului adipos.
Excesul ponderal atrage dup sine o serie de complicaii clinice redutabile, nu
doar de natur metabolic ci i afeciuni biliare, boala Alzheimer i chiar unele
cancere. Obezitatea abdominal este considerat metabolic activ n urma
identificrii a numeroase molecule cu rol proinflamator - adipokinele, denumite
generic ca urmare a complexitii lor biologice secretom adipocitar (Trayhurn, 2005,
Gesta i colab., 2007).
Al doilea obiectiv major al studiului nostru a fost evaluarea implicrii prezenei
tisulare a unor adipokine cu rol n dezvoltarea sindromului metabolic la adult.
Rezultatele obinute n urma studiului imunohistochimic efectuat pentru exprimarea
TNF i a TLR2 i TLR4 arat c receptorii imunitii nnscute sunt direct implicai
n ntreinerea cilor patogenice din sindromul metabolic. Studiul VEGF a artat nu
doar variaii de exprimare imunohistochimic n raport cu depozitele considerate, dar
i faptul c hiperexprimarea sa n localizrile centrale ale esutului adipos se nscrie
n tendina amplificrii reaciei inflamatorii locale prin vasodilataie. Diferenele majore
constate ntre exprimarea acestor molecule n raport cu depozitele considerate -
periferice i centrale - au explicaie n modul de evoluie al adipogenezei fetale, aa
dup cum au artat rezultatele noastre. Studiul nostru arat importana cunoaterii
dezvoltrii organului adipos pentru nelegerea funcionrii sale n condiii normale i
patologice la adult. n acelai timp rezultatele obinute deschid noi ci de abordare a
cercetrii organului adipos prin studii de biologie molecular i genetic molecular.
Studiul histogenezei organului adipos la ft a fost efectuat n cadrul
Laboratorului de morfologie uman al Departamentul de medicin experimental i
clinic a Universitii din Ancona (Politecnica delle Marche), Italia n cadrul bursei
7

doctorale obinut prin Contractul POSDRU/88/1.5/S/52826. Studiul implicrii
esutului adipos n patogenia inflamaiei din obezitate a fost efectuat n cadrul
Laboratorului de Biochimie al Facultii de Farmacie precum i n cadrul
Laboratorului de Histologie al Facultii de Medicin, UMF Craiova
Materialul biologic a provenit de la Spitalul Clinic Municipal Filantropia din
Craiova, Serviciul de Anatomie Patologic, i de la Clinica de Chirurgie Nr.1 a
Spitalului Clinic de Urgen Craiova.
S St tu ud di iu ul l a a f fo os st t a av vi iz za at t d de e c c t tr re e C Co om mi is si ia a p pe en nt tr ru u P Pr ro ob bl le em me e J Ju ur ri id di ic ce e, , E Et ti ic ce e i i
D Di is sc ci ip pl li in n U Un ni iv ve er rs si it ta ar r , , a av vi iz zu ul l n nr r. .4 4- -0 01 1- -2 20 01 11 1. .

STADIUL CUNOTERII

Capitolul I
HISTOLOGIA I HISTOFIZIOLOGIA ORGANULUI ADIPOS
1.1. Conceptul de organ adipos i depozitele adipocitare
Organul adipos este alctuit la mamifere din dou tipuri majore de esut - alb
denumit i unilocular (WAT) i brun sau multilocular (BAT). Cele dou esuturi dein
roluri diferite direcionnd energia stocat sub form de triacilgliceroli fie ctre
termogenez - BAT fie ctre alte funcii metabolice - WAT (Cinti 1999, Cinti, 2001a)
O a treia component a organului adipos este reprezentat de fracia
stromovascular - esut conjunctiv constituit din celule cu fenotip i funcii variate,
bine vascularizat i inervat (Hauner, 2005, Gesta i colab., 2007).
1.2. Heterogenitatea depozitelor adipocitare
La toate mamiferele organul adipos este distribuit n mai multe depozite
subcutanate i viscerale a cror structur histologic variaz n raport cu vrsta,
sexul i statusul metabolic al individului. Att depozitele adipoase uniloculare, ct i
cele multiloculare pot conine un numr redus de celule caracteristice celuilalt tip de
esut adipos (Nedergaard i colab., 2007). Prezena adipocitelor brune n depozitele
uniloculare ale omului adult (brown in white) a fost demonstrat la nivel cervical,
supraclavicular, axilar i paravertebral, ceea ce a condus la o redefinire a organului
adipos la om pe baza recunoaterii existenei simultane a dou esuturi componente
distincte morfologic i funcional (Zingaretti i colab., 2009).
1.2.1. Histologia depozitelor adipocitare multiloculare
BAT este constituit din aglomerri de adipocite care formeaz parenchimul
lobular i din fracia stromovascular, alctuind mpreun lobuli adipoi, bine
individualizai i circumscrii de esut conjunctiv.
n prezent este unanim acceptat c BAT este bine reprezentat la ft i la nou-
nscut, unde se gsete n mai multe locaii, formnd depozite n zona axilar,
cervical, periaortic i perirenal i sub forma unor depozite discrete n jurul vaselor
mari de snge (Enerback, 2010a).
1.2.1.1. Adipocitele multiloculare
Adipocitele multiloculare prezint form poliedric i diametrul cuprins ntre 20-
40m. Denumirea se datoreaz faptului c citoplasma conine mai multe picturi
lipidice de dimensiuni diferite, nconjurate fiecare de ctre o endomembran proprie.
Caracteristice pentru adipocitele multiloculare sunt numeroasele mitocondrii
rotunde, voluminoase, cu criste vizibile dispuse paralel, bogate n citocromi ce le
confer culoarea specific. Membrana intern a cristelor mitocondriale conine
termogenina/UCP1, care este considerat marker imunohistochimic pentru
adipocitele multiloculare (Cinti, 2005, Saely i colab., 2012).
1.2.2. Histologia depozitelor adipocitare uniloculare
Spre deosebire de depozitele BAT, WAT este mult mai bine reprezentat la
adult, fiind repartizat n depozite periferice sau subcutanate i depozite centrale sau
8

viscerale. Depozitele viscerale se gsesc n cavitile toracic i abdominal, fiind
coninute n special n zonele delimitate de membrane seroase. n structura oricrui
depozit, esutul adipos unilocular este alctuit din lobuli adipoi incomplet separai
prin septuri de esut conjunctiv bogat vascularizat i inervat (Cinti, 2002, Gesta i
colab., 2007).
1.2.2.1. Adipocitele uniloculare
Adipocitul unilocular prezint form sferic cnd se gsete izolat, iar n
structura lobulului forma devine poliedric sau ovalar prin compresiune reciproc.
Dimensiunea celulei poate varia ntre 80-120 m n funcie de starea de nutriie a
organismului i tipul de depozit (Ross i Pawlina, 2006).
1.3. Histofiziologia organului adipos
1.3.1.1. BAT- organ al termogenezei
Rolul BAT de a genera cldur este o descoperire relativ recent, acesta fiind
prima dat descris ca un organ termoreglator doar n urm cu aproximativ 50 de ani.
Termogeneza BAT se exercit n dou situaii fiziologice:
1. termogenez termoreglatoare - meninerea constant a temperaturii
organismului;
2. termogeneza metabolic sau termogeneza indus prin diet (diet-
induced thermogenesis) - meninerea balanei energetice a organismului (Cannon i
nedergaard, 2004).
1.3.1.2. WAT - organ de stocare a energiei
WAT are ca principal funcie nmagazinarea energiei necesare funcionrii
organismului n perioadele dintre aportul alimentar.
1.3.2. Plasticitatea organului adipos
Organul adipos i poate modifica compoziia celular, vascularizaia i inervaia
n funcie de necesitile metabolice ale organismului, fiind caracterizat printr-o
remarcabil plasticitate. Plasticitatea organului adipos se traduce n primul rnd prin
modificarea raportului numeric ntre cele dou tipuri de adipocite - uniloculare i
multiloculare care, conlucrnd, direcioneaz rezervele energetice ale organismului
spre termogenez sau spre alte procese metabolice. Capacitatea plastic a organului
adipos intervine n cadrul unor procese fiziologice - aclimatizarea organismului la
diferite temperaturi, perioade de restricie alimentar sau aport sczut de calorii,
sarcin/alptare, sau patologice - n obezitate (Cinti 2009).

Capitolul II
DEZVOLTAREA ESUTULUI ADIPOS
2.1. Etapele dezvoltrii esutului adipos (Billon i colab., 2007)
2.1.1. Etapa determinant - formarea precursorilor adipocitari din celule
stem mezenchimale.
2.1.1.1. Teorii privind originea adipoblastelor (Le Dourain i colab., 2004,
Atit i colab., 2006, Timmons i colab., 2007, Billon i Dani, 2012).
Diferenierea din celulele stem mezenchimale
Precursor comun al BAT i celulelor musculare
Precursor comun cu celulele endoteliale
Diferenierea din celula endotelial
Diferenierea din celulele fraciei stromovasculare
2.1.2. Etapa de difereniere terminal - diferenierea precursorilor n
adipocite mature, funcionale.
Etapa de expansiune clonal.
Etapa de difereniere final.
2.2.Factori de transcripie implicai n adipogenez (Farmer i colab., 2006,
Rosen i MacDougald, 2006).
9

Cascada transcripional implicat in adipogenez este guvernat de PPAR
(peroxisome proliferator activator receptor) i membrii familiei C/EBP.
PPAR, membru al superfamiliei de receptori nucleari, este considerat a fi
molecula cheie, fiind in acelai timp necesar i suficient pentru procesul de
adipogenez.
Mai muli membrii ai familiei C/EBP particip la procesul de adipogenez:
C/EBP, C/EBP, C/EBP, C/EBP i CHOP. C/EBP, alturi de PPAR, este un
factor transcripional cheie al adipogenezei, cei doi conlucrnd n stadiile finale ale
procesului.
PRDM16 este una dintre genele a crei expresie este puternic corelat cu
fenotipul brun, att in vitro ct i in vivo.
2.4. Adipogeneza uman
2.4.1. Adipogeneza fetal
Din puinele studii raportate n legtur cu adipogeneza uman (Poissonnet i
colab. 1983, 1984, 1988, Martin i colab., 1998, Hausman i colab., 2001, Gesta i
colab., 2007) apariia i evoluia esutului adipos la ft se poate sistematiza n 5 faze
morfogenetice identificate n ordine cronologic: esutul conjunctiv nedifereniat
(mezenchimal), condensarea mezenchimal i angiogeneza, apariia preadipocitelor,
lobuli adipoi primitivi, lobuli adipoi definitivi.
Mecanismele moleculare responsabile de diferenierea i evoluia adipogenezei
umane sunt departe ns de a fi elucidate, mai ales datorit imposibilitii de a
identifica i caracteriza precursorii adipocitari umani.
Preadipocitele att cele corespunztoare celulelor uniloculare ct i celor
multiloculare sunt dificil de identificat datorit imposibilitii diferenierii lor fa de
oricare alt celul de tip fibroblast like (Gesta i colab., 2007).

Capitolul III
ORGANUL ADIPOS LA ADULT I IMPLICAIILE SALE N PATOGENIA
INFLAMAIEI DIN OBEZITATE
3.1.esutul adipos multilocular la adult
3.1.1.Identificarea i localizarea BAT la adult
Depozitele brune scad imediat dup natere, fiind considerate n mod clasic
absente la adultul normal (Lean, 1989). Recent, prin tehnici moderne de imagistic
medical - PET-CT au pus n eviden cantiti importante de BAT activ metabolic la
adult (Van Marken Lichtenberg i colab., 2009, Cypess i colab., 2009, Virtanen i
colab., 2009). Distribuia BAT la omul adult, nu este identic cu cea cunoscut la
animalele de laborator: la om lipsete iBAT, i BAT axilar, n schimb depozitele din
regiunea cervical i supraclavicular sunt mult mai bine reprezentate. Exist i alte
depozite, localizate n regiunea paravertebral, de-a lungul coloanei vertebrale, n
regiunea mediastinal n special n zona periaortic, n jurul cordului cu precdere la
nivelul apexului, depozitul perirenal (Bar-Shalom i colab., 2004, Chiba i colab.,
2006, Nedergaard i colab., 2007, Enerback 2010a).
3.1.2. Implicaii terapeutice ale BAT n tratamentul non invaziv al obezitii.
BAT se poate constitui ntr-o posibil int terapeutic pentru controlul obezitii,
reprezentnd o alternativ a tratamentului chirurgical sau pentru dietele chinuitoare i
uneori inutile.
Activarea farmacologic a termogenezei
Sibutramina i efedrina sunt dou substane folosite i n prezent pe scar
larg, i al cror efect de scdere a greutii se datoreaz stimulrii centrale a BAT
via SNS. Efectele adverse sunt ns redutabile: aritmie cardiac, tahicardie,
hipertensiune (Enerback, 2010b, Betz i Enerback 2011).

10

Creterea volumului BAT
Unele molecule au fost utilizate cu succes la roztoare: FGF, BMP7, PRDM16
(Lidell i Enerback, 2010). Rmne nc de dovedit utilitatea acestor observaii
experimentale n tratamentul obezitii la om, dar ele ofer o nou perspectiv
cercetrii tiinifice cu aplicabilitate n practica medical.
3.2.esutul adipos unilocular la adult
3.2.1. Organul adipos-organ endocrin
Principalele adipokine ale secretomului adipocitar sunt prezentate n Tab.
3.1.(Trayhurn, 2005, Poulos i colab., 2010).
Tabel 3.1.
Adipokine cu funcie
hormonal
Citokine proinflamatorii Factori de cretere
Leptina
Adiponectin
Adipsin
Resistin
Renin
Angiotensinogen
Angiotensina I,
Angiotensina II
Omentina
Tumor Necrosis Factor-
Interleukine (IL-6, IL-8, IL-10, IL-
15)
Factorul inhibitor al migrrii
macrofagelor (MIF)
Factorul stimulator al coloniilor de
macrofagelor (M-CSF)
Activatorulul inhibitorul
plasminogenului (PAI-1)
Metalotioneina
Factorul de cretere
transformant (TGF-)
Factorul endotelial de
cretere
vascular(VEGF)
Factorul de cretere
fibroblastic-1 (FGF-1)
Factorul de cretere
insulin-like (IGF-1)

3.2.2. Adipogeneza la adult
Organul adipos este complet dezvoltat la vrsta pubertii, dezvoltarea sa fiind
susinut n primul rnd prin procesul de proliferare. S-a descris recent ns c,
indiferent de vrst sau de valoarea BMI, 10% din celulele adipoase sunt rennoite
anual, fapt ce demonstreaz existena unui proces dinamic de turnover al
adipocitelor la nivelul organului adipos al adultului (Spalding i colab.,2008).
esutul adipos este unicul esut al organismului ale crui dimensiuni pot suferi
modificri semnificative dup ce corpul a atins dimensiunile adulte; n obezitate
putnd s creasc pn la de patru ori, putnd atinge chiar i 60-70% din greutatea
corporal (Hausman i colab., 2001).
3.2.2.1. Hipertrofia i hiperplazia esutului adipos
Adipogeneza adultului implic att creterea n dimensiuni a celulelor -
hipertrofia determinat de intensificarea acumulrii triacilglicerolilor, ct i creterea
lor numeric hiperplazia.
Dei obezitatea se caracterizeaz iniial prin hipertrofie adipocitar, adipocitele
nu dispun de o capacitate nelimitat de expansiune, iar creterea numeric a
celulelor adipoase poate avea loc chiar i atunci cnd organismul a atins vrsta
adult. Diferitele depozite adipoase rspund n mod diferit la fenomenele de
hipertrofie i hiperplazie (Brook i colab., 1972, Bonnet, 1981).
3.2.2.2. Distribuia esutului adipos la adult - implicaiile n obezitate
Exist dou teorii importante cu privire la modul n care distribuia esutului
adipos poate influena apariia i ntreinerea sindromului metabolic:
(i) obezitatea central sau visceral conduce la o mobilizare accentuat a
acizilor grai n circulaia portal, datorit intensificrii procesului de lipoliz n
adipocitele viscerale ca urmare a expansiunii depozitelor adipoase din aceast
regiune (Frayn i colab., 1996)
(ii) sindromul metabolic i are originea la nivelul WAT visceral prin acumularea
de macrofage, care survine la rndul su consecutiv hipertrofierii adipocitare (Cinti i
colab., 2005b, Trayhurn i colab., 2008a).



11


CONTRIBUII PERSONALE
OBIECTIVELE I DESIGNUL STUDIULUI
Obiectivele generale
(i).Definirea etapelor histologice ale dezvoltrii organului adipos la ftul uman i
caracterizarea morfologic a adipogenezei fetale
(ii).Identificarea relaiei ntre heterogenitatea depozitelor adipocitare ale
adultului i sinteza unor citokine proinflamatorii precum i relaia dintre acestea i
imunitate, n raport cu statusul metabolic al indivizilor.
DESIGNUL STUDIULUI
esutul uman a fost recoltat n urma necropsiei de la fei cu diferite vrste de
dezvoltare intrauterin, care au fost ncadrai n patru grupe cronologice de studiu.
De la fiecare subiect au fost prelevate probe din determinate depozite
subcutanate i depozite viscerale.
Fragmentele de esut recoltat au fost fixate separat pentru studiul n tehnica
histologic uzual i tehnica de imunohistochimie, respectiv pentru studiul
electronomicroscopic.
Dup fixare i includere n parafin, fragmentele au fost secionate. Seciunile
au fost colorate hematoxilin-eozin i tricromic. Studiul histologic s-a fcut pentru
fiecare subiect pentru toate depozitele recoltate.
S-a urmrit descrierea histologic a fiecrui depozit adipocitar subcutanat
respectiv visceral pentru o anumit vrst fetal, precum i descrierea patternului de
evoluie al unui depozit cu o localizare determinat n evoluia maturizrii fetale. Pe
baza acestui studiu s-a fcut descrierea, n dinamica dezvoltrii fetale, a aspectului
structurii lobulilor adipocitari i a raportului ntre componentele celulare adipocitare i
ntre acestea i elementele fraciei stromovasculare.
Aceleai fragmente tisulare folosite n studiul histologic au fost folosite pentru
studiul imunohistochimic pentru UCP1 i CD31.
n raport cu rezultatele obinute i cu calitatea fixrii probelor biologice, dup
examinarea seciunilor histologice s-a completat studiul microscopic cu cel
ultrastructural al acelorai depozite.
Fragmentele de esut destinate studiului TEM au fost incluse n rin i iniial
au fost efectuate seciuni semifine care au fost colorate, examinate i au fost
efectuate fotografii digitale ale aspectelor semnificative. Coroborarea acestor tehnici
a permis stadializarea dezvoltrii unui depozit adipocitar i descrierea fenotipului
celular dintr-un anumit depozit ntr-un moment al diferenierii, recum i identificarea
zonelor de elecie pentru studiul ultrastructural.
n raport cu acestea s-a continuat studiul prin efectuarea seciunilor ultrafine.
Examinarea n microscopie electronic a completat studiul morfologic cu date
referitoare la originea precursorilor adipocitari, dar i cu date descriptive ale filiaiei
celulelor adipocitare n evoluia lor cronologic.
Rolul deinut de organul adipos n iniierea i ntreinerea reaciei inflamatorii n
cadrul sindromului metabolic al adultului a fost studiat n urma prelevrii
intraoperatorii a esutului adipos de la adult.
Au fost prelevate probe de esut conjunctiv (adipos) subcutanat periombilical i
central peritoneal. Subiecii au fost mprii n trei loturi de studiu n raport cu statusul
ponderal i metabolic: prezena sau absena obezitii izolate sau asociate cu
diabetul zaharat de tip 2.
Seciunile histologice au fost colorate n coloraii histologice uzuale pentru
evaluarea aspectului de ansamblu al depozitelor respective. Studiul a continuat prin
evaluarea imunohistochimic a exprimrii unor markeri proprii inflamaiei n cele dou
categorii de depozite adipocitare la loturile considerate.
12

Rezultatele obinute n urma reaciilor imunohistochimice au fost corelate pentru
fiecare molecul n parte, comparnd gradul de exprimare al unui anticorp n raport
cu al celorlali dar i n raport cu intensitatea infiltrrii macrofagice i a dezvoltrii
fibrozei. Toate rezultatele au fost discutate n raport cu informaiile obinute prin
studiul bibliografic efectuat.

Capitolul IV
MATERIAL I METODE
4.1. Studiul histogenezei adipocitare fetale
4.1.1. Materialul biologic studiat
n total au fost folosii n studiu un numr de 16 cazuri care au fost clasificate n
patru grupe de vrst:
Foarte precoce 10-12 sptmni 4 cazuri
Precoce 16-20 sptmni 4 cazuri
Intermediar 20-26 sptmni 5 cazuri
Tardiv 36-39 sptmni 3 cazuri
Pentru fiecare caz n parte au fost recoltate esuturi cu urmtoarele localizri:
a. subcutanate - periferice: cervical, axilar, interscapular, toracic anterior i
posterior, abdominal - anterior-periombilical i/sau lateral
b. viscerale - centrale: perioaortic / pericardic, intraabdominal - mezenteric i
omental, retroperitoneal perirenal.
4.1.2.Metodele utilizate
Metode histologice:
Fixare, includere n parafin, secionare
Colorare H-E
Colorare tricromic Masson
Metode imunohistochimice
Anticorpi primari folosii n prezentul studiu i tehnica imunohistochimic aplicat:
Anticorpii folosii n studiul imunohistochimic
Anticorp Diluie Productor/cod Metod
UCP1 1:700 Abcam ABC
CD31 1:40 Dako - clona JC70A M0823 EnVision
Tehnica de microscopie electronic de transmisie
Fixarea primar n soluie de 2% glutaraldehid plus 2% paraformaldehid n
tampon fosfat 0,1M, pH7,4, la 4
0
C. .
Splarea
Post-fixarea n amestec 1:1 tetraoxid de osmiu (OsO
4
) 2% n tampon fosfat, i
ferocianura de potasiu (K
4
[Fe(CN)
6
]x3H
2
O ) 2%, 60 min la 4
0
C .
Splarea
Deshidratare
Includerea n rin sintetic
Obinerea seciunilor semifine, colorare cu albastru de toluidin
Obinerea seciunilor ultrafine, contrastarea cu citrat de plumb.
4.2. Studiul implicrii esutului adipos n patogenia inflamaiei din
obezitate.
4.2.1. Materialul biologic studiat
Pacienii au fost distribuii n urmtoarele loturi :
Lotul I - control- pacieni normoponderali (7 cazuri) cu BMI 30.
Lotul II - pacieni obezi (10 cazuri) cu BMI > 30, cu obezitate abdominal
Lotul III - pacieni obezi i diabetici (7 cazuri), diagnosticai clinic cu diabet
zaharat tip 2.
4.2.2. Metodele utilizate
Metode histologice
13

Fixare, includere n parafin, secionare
Colorare H-E
Colorare tricromic Masson
Metode imunohistochimice folosind urmtorii anticorpi:
Anticorp Diluie
Productor
cod
Metod
CD68 1:200 Abcam - KP1ab955 ABC
TNF 1:100 Abcam - ab6671 ABC
TLR2 1:100 Abcam - ab24192 ABC
TLR 4 1:100 Abcam - ab13556 ABC
VEGF 1:50 Dako (VG1) - ab1316 LSAB
CD31 1:40 Dako - clona JC70A
cod M0823
EnVision
Evaluarea rezultatelor imunohistochimice
Fracia de celule pozitive pentru fiecare caz a fost calculat astfel:
(-) 5 celule pozitive
(+/-) ntre 5-10 celule pozitive
(+) ntre 10-50 celule pozitive
(++) > 50 celule pozitive.

Capitolul V
STUDIU HISTOLOGIC AL ADIPOGENEZEI FETALE
5.1.1. Grupul foarte precoce
n toate depozitele periferice esutul conjunctiv subcutanat s-a definit prin
prezena unui mezenchim cu celule nedifereniate, de dimensiuni medii, cu
citoplasm eozinofil.

Fig. 5.2. Subiect de 12 sptmni. esut mezenchimal cu localizare central
a. toracic periaortic H-E ob.x40; b. abdominal perirenal H-E ob.x20.

5.1.2. Grupul precoce - vrsta gestaional 16-20 sptmni
La ftul cu vrsta de 16 -17 sptmni, n localizarea subcutanat cervical
am remarcat coexistena lobulilor mezenchimali cu a celor intermediari.
Studiul ultrastructural al zonelor caracteristice surprinse pe seciunile semifine
din depozitul cervical profund a artat aspectele histologice ale diferenierii
adipocitare spre adipocitele brune, cu prezena celulelor precursoare n diferite stadii
de difereniere. Celulele cel mai puin difereniate apar n proximitatea sau chiar
alipite de membrana bazal a vaselor sanghine. Ele prezint caracteristici
ultrastructurale de blast, celul nedifereniat cu nucleu voluminos, rotund, nucleolat,
cu cromatina granular, citoplasm puin i raport nucleo-citoplasmatic n favoarea
nucleului.

14
















Fig.5.6. Subiect de 16-17 sptmni.
Aspect elecronomicroscopic al unor
preadipocite multiloculare pe cale de
difereniere la nivelul depozitului
cervical. PA-preadipocit, F-fibroblast,
CM-celul mezenchial, FC-fibre de
colagen


Fig.5.8. Aspect ultrastructural al unui
adipoblast pe cale de difereniere, situat
ntr-o cut a membranei bazale a unui vas
de snge.
n cadran detaliu adipoblast (AD)
V-vas sanghin, N-nucleu celul endotelial,
L-pictur lipidic n citoplasma unui
preadipocit M-mitocondrii tipice.
Fig.5.3. Subiect de 16-17 sptmni; aspecte diferite de evoluie ale lobulilor adipocitari la nivelul
depozitului cervical:
a. lobul intermediar n stadiu precoce cu foarte puine celule difereniate H-E ob.x20;
b. lobul intermediar de diferite dimensiuni coninnd mai multe celule difereniate H-E ob.x10;
c. lobul intermediar cu rare celule mezenchimale la periferie. H-E ob.x10;
d. detaliu, celule difereniate cu aspect multilocular i numeroase capilare ramificate H-E ob.x40.
Fig.5.4. Subiect de 16-17 sptmni . Aspecte ale compoziiei celulare a lobulilor intermediari la
nivelul depozitului cervical, seciuni semifine a. ob.x10; b. ob.x40; c. ob.x40; d. ob.x40.


15


Localizarea central. Pentru dezvoltarea adipocitar n ariile centrale-
viscerale, la fei cu vrsta cuprins ntre 16-18 sptmni au fost studiate depozite
mediastinale i perirenale. n ambele locaii aspectele evolutive au fost ntrziate
fa de cele subcutanate cervicale, dar i toracice, seciunile histologice artnd doar
prezena mezenchimului, esut conjunctiv lax, imatur, cu celule nedifereniate i
matrice extracelular bogat n substan fundamental.
Vrsta gestaional 18-20 sptmni.
Depozitele subcutanate cervicale.






Fig.5.15. Subiect de 18-20 sptmni, aspect ultrastructural, depozit cervical profund.
Celule adipocitare n diferite stadii de difereniere n vecintatea capilarelor.

n depozitele subcutanate dorsale studiul de TEM evideniaz marea varietate
de celule care formeaz n aceast etap de dezvoltare lobulul adipocitar, n
interiorul cruia se evideniaz adevrate insule vasculo-adipocitare care reprezint
nuclee de difereniere celular unilocular: adipoblaste i preadipocite, la care se
adug un numr important de macrofage i polimorfonucleare, dar i celule
conjunctive fixe, fibroblaste i celule mezenchimale nedifereniate (Fig.5.20.a.).
5.1.3. Grupul intermediar - vrsta gestaional 20-26 sptmni.
Vrsta gestaional 20-23 sptmni
n localizrile subcutanate cervicale i interscapulare la feii cu vrste de 20-22
sptmni am constatat o mare heterogenitate a dezvoltrii depozitelor adipocitare.
La vrsta de 23 sptmni am constatat depozite cervicale cu aspecte
histologice asemntoare celor descrise la 20-22 sptmni, majoritatea lobulilor
fiind ncadrai n categoria celor intermediari sau maturi cu celule difereniate mixte,
multiloculare i uniloculare (Fig.5.25).
Fig.5.14. Subiect cu vrsta gestaional de 20 sptmni, lobuli intermediari la nivel cervical,
seciuni semifine a. celule pauciloculare, multiloculare i cteva celule uniloculare ob.x20;
b. printre celulele adipocitare, celule mezenchimale, fibroblaste i macrofage;
la vrful sgeii, alipit capilarului o celul complet nedifereniat ob.x40.
16

Imaginile ultrastructurale surprinse n insulele de difereniere i proliferare din
interiorul acestor lobuli au demonstrat meninerea celulelor nedifereniate la nivelul
pereilor vaselor de snge, unele cu poziie endotelio-pericitic, cu un versant intern
delimitnd lumenul vasului iar cu cel extern proiectndu-se n matricea extracelular
(Fig.5.30.a.,b.,d.).

Fig.5.20. a. Imagine ultrastructural a unei insule de adipogenez unilocular la nivelul unui lobul
intermediar - depozit dorsal, ft de 20 sptmni: b. detaliu a. cadran gri; c. detaliu b. cadran gri;
d. detaliu a cadran rou, PA - preadipocite, M- mitocondrii , AD - adipoblaste, V-vas sanghin,
CM- celul mezenchimal, F-fibroblast, fC -fibre de colagen.


17


Fig.5.25. Subiect de 23 sptmni, caracterele histologice ale adipogenezei subcutanate
laterocervicale. a. tricromic ob.x4; b. H-E ob.x4; c. H-E ob.x10;
d. H-E ob.x40, e. H-E ob.x20, f. H-Ex40.
Unii precursori nedifereniai au fost surprini n diviziune (Fig.5.30.b.).
Adipoblatii au pstrat aceleai caracteristici cu cei descrii anterior, n timp ce
preadipocitele au prezentat caractere ultrastructurale de difereniere unilocular, cu
mitocondrii puine, situate la periferia citoplasmei, cu form ovalar-alungit i cu
criste puin vizibile, fr o anume orientare
18


Fig.5.30. Subiect de 23 de sptmni, depozit subcutanat toracic aspecte ultrastructurale: a., b.i d.
adipoblati n poziie endotelio-pericitic; c. adipoblast i pradipocit unilocular; e. detaliu chenar negru,
adipoblast n relaie cu peretele capilarului din care se desprinde; f. detaliu chenar albastru
mitocondrii caracteristice adipocitelor uniloculare.

Vrsta gestaional 24-26 sptmni
Localizarea visceral se remarc prin diferene majore fa de cazurile
precedente, adipocite n majoritate uniloculare putnd fi observate mai frecvent
grupate cte dou-trei i mai rar formnd lobuli compaci aa cum am prezentat
pentru depozitele subcutanate.
Depozitele cel mai bine reprezentate au fost cele perirenale (Fig.5.36.).
19



5.1.4. Grupul tardiv vrsta gestaional 36-40 sptmni
La aceast vrst am constatat i la nivel subcutanat abdominal separarea
prin benzi conjunctive coninnd numeroase capilare sanghine a celor dou zone de
lobuli superficiali i profunzi (Fig.5.38.). n interiorul acestor fascii conjunctive am
remarcat insule de adipocite n diferite stadii de difereniere ntre multiloculare i
uniloculare, acestea din urm aglomerndu-se chiar n foci intralobulari (Fig.5.38.b.).
Imaginile pentru localizrile viscerale ale subiectului de 39 sptmni au
artat dezvoltarea modest a lobulilor adipocitari n depozitul perirenal i puini lobuli
teriari n depozitul omental, alctuii exclusiv din celule uniloculare (Fig.5.43.a.,b).




Fig.5.34. Aspecte histologice ale
evoluiei adipogenezei n diferite
localizri viscerale la un ft de 23
sptmni:
a. mezenter H-E ob.x4
b. mezenter tricromic ob.x20
c. perirenal H-E ob.x4
d. perirenal H-E ob.x10
e. oment H-E ob.x4.

20

Fig.5.38.. Subiect de 36 sptmni a. aspect de ansamblu al depozitului subcutanat
abdominal, H-E ob.x4; b. detaliu al compoziiei unui lobul adipocitar profund H-E ob.x20.


Fig.5.43. Subiect de 39 de sptmni a. lobul matur cu celule mixte la nivelul depozitului
perirenal H-E ob.x20; b. oment, adipocite uniloculare, lobul teriar, seciune semifin, ob.x100.

5.2. Discuii
Dezvoltarea esutului adipos i corelarea funciilor sale n cadrul organului
adipos a devenit o prioritate n studiile actuale de histologie, biologie celular,
genetic i fiziologie, datorit amplorii epidemice pe care a luat-o n ultimul timp
obezitatea, urmat de consecinele sale dramatice asupra sntii individuale i
sociale.
Modul nostru de abordare a presupus un studiu amnunit i sistematic al
apariiei i evoluiei lobulilor adipocitari - lobulogeneza - la nivelul mai multor
depozite, localizate subcutanat i visceral precum i o evaluare a caracteristicilor
histologice a precursorilor adipocitari ncepnd cu originea lor din celulele
nedifereniate - adipogeneza.
n urma examinrii dinamice n evoluia vrstei gestaionale a acestor depozite
i a sistematizrii rezultatelor am putut s identificm etapele de difereniere a
lobulilor adipocitari:
I Etapa de esut mezenchimal indiferent, a caracterizat toate depozitele
considerate la lotul denumit foarte precoce, cuprinznd subieci cu vrsta
gestaional 10-12 sptmni.
II Etapa de lobulaie, individualizarea lobulilor adipoi ca insule definite de
esut conjunctiv. n funcie de gradul de ocupare cu celule adipocitare lobulii au fost
mprii n 3 categorii:
- Lobuli mezenchimali, lobuli primari sau lobuli nuzi - insule mezenchimale
vascularizate i inervate formate prin condensarea mezenchimului n jurul unor vase
a b
a
a
b
21

de snge, lipsite complet de celule aparinnd liniei adipocitare, n oricare dintre
stadiile de difereniere.
- Lobuli intermediari sau semiacoperii - apariia primelor celule din linia
adipocitar, gradul de ocupare putnd fi diferit, de la prezena a dou-trei celule
difereniate pn la cvasitotalitatea lobulului, dar nu n totalitate, rmnnd celule
mezenchimale. Aceast categorie de lobuli a fost cea mai heterogen din punct de
vedere structural i cea mai constant din punct de vedere al prezenei, fiind
observat de la vrsta gestaional de 16 -17 sptmni - grupul precoce pn la 36
sptmni - grupul tardiv. Celulele care intr n alctuirea acestor lobuli pot fi
elemente pe cale de difereniere fie spre adipocite multiloculare fie uniloculare, sau
celule mature, complet difereniate. n situaia n care am constatat existena celor
dou tipuri de celule - multi i uniloculare lobulul a fost definit ca mixt.
- Lobuli maturi - sau lobuli acoperii, se caracterizeaz prin dispariia
complet a celulelor mezenchimale, acestea fiind nlocuite de celule adipocitare cu
diferite grade de difereniere i de stroma conjunctivo-vascular. Aceti lobuli pot fi i
ei micti, formai att din celule multiloculare ct i din celule uniloculare cu diferite
grade de difereniere, incidena fiecrui tip de celule variind, dup cum am artat, n
raport cu vrsta subiectului i cu localizarea depozitului respectiv.
La feii foarte precoce 10-12 sptmni, am observat n toate locaiile studiate
esut mezenchimal indiferent, cu mici vase capilare.
Diferenierea adipocitar ncepe imediat dup sau chiar concomitent cu
proliferarea vascular, ceea ce susine ipoteza originii adipoblastelor din celulele
nedifereniate ale pereilor vasculari. Cum diferenierea adipocitar adipogeneza -
este un proces continuu pe toat perioada fetal studiat, am gsit n aceleai
depozite sau n depozite diferite la subieci de diferite vrste lobuli adipocitari primari
i intermediari. Apariia i dezvoltarea lobulilor nu este un proces format din etape -
segmente separate ci se desfoar n tafet.
Primii lobuli adipocitari apar la nivel cervical i aici celulele se i difereniaz
extrem de rapid n celule multiloculare. Unul dintre motivele care pot influena
aceast precocitate este cel legat de histofiziologia BAT, aceea de producere de
cldur, care astfel asigur temperatura necesar n jurul pachetului vasculonervos
al gtului, de unde sngele urc spre creier, acelai rol avndu-l i grsimea brun
perirenal pentru rinichi (Merklin, 1974). n aceste condiii este greu de explicat lipsa
BAT n depozitul omental sau n cel periepididimal la om. Aa dup cum reiese din
observaiile noastre, esutul adipos omental se difereniaz trziu n lobulogeneza
fetal, dup 26 de sptmni gestaionale, vrst pn la care nu au fost
consemnate modificri histologice proprii diferenierii. Abia n grupul tardiv, la
subiectul de 36 sptmni am putut nota apariia lobulilor adipocitari formai din
celule uniloculare.
Acceptarea definiiilor pe care le-am propus - lobulogenez i adipogenez - ar
putea armoniza rezultatele cercetrilor i oferi o baz de pornire pentru cuantificarea
dezvoltrii esutului adipos. Un argument puternic n favoarea modului continuu de
difereniere pe care l propunem este faptul c la vrsta gestaional de 23 de
sptmni, n depozitele toracice, am descris lobuli care n coloraiile uzuale preau
complet difereniai, n timp ce imaginile de detaliu pe seciuni semifine sau n
microscopie electronic au demonstrat c se menin celule complet nedifereniate n
vecintatea vaselor sanghine. Tot la aceast vrst am surprins celule cu aspect de
blast (adipoblaste) aflate n diviziune, ceea ce ar putea semnifica c nu toi
precursorii adipocitari (preadipocitele) provin din diferenierea celulelor nedifereniate
perivasculare/pericitice ci c o parte iau natere n urma multiplicrii unor elemente
intrate deja n difereniere.
22

Grupul intermediar a fost cel mai heterogen din punct de vedere al aspectului
lobulilor adipoi dar i al patternului celular din structura acestora, semnificaia fiind
legat de dinamica susinut a lobulogenezei i adipogenezei n acest interval de
vrst. O caracteristic a fost cea a dispunerii depozitelor subcutanate pe dou
planuri, separate ntre ele prin esut conjunctiv sau, dup caz, prin fibre musculare
striate. Rezultatele noastre arat c aceste planuri prezint o desincronizare n
diferenierea lobulilor, stratul profund fiind mai puin dezvoltat dect cel superficial,
descris n jurul complexului pilo-sebaceu. Nu doar c lobulii profunzi sunt mai mici, ci
ei conin i mai multe celule multiloculare i pauciloculare imature fa de cei
superficiali.
O categorie de celule care apar la sfritul perioadei de gestaie este cea
reprezentat de celule uniloculare de dimensiuni mici, cu citoplasm groas, posibil
celule pauciloculare mai difereniate. Imaginile de detaliu au artat c inelul periferic
de citoplasm conine discrete vacuole lipidice nefuzionate. Interesant este faptul c
aceste celule fost mai frecvent ntlnite n depozitele viscerale, unde se pare c
celulele uniloculare prezint i dimensiuni mai modeste.
Studiul nostru microscopic a continuat, aa dup cum am prezentat n
subcapitolul de rezultate cu studiul ultrastructural, ceea ce ne-a permis obinerea
unor rezultate interesante n ceea ce privete adipogeneza fetal.
Studiul nostru ultrastructural vine n continuarea rezultatelor discutate, pe care
le completeaz cu noi observaii. Observaiile noastre se refer la aspecte
ultrastructurale ale originii adipocitelor din depozitele multiloculare dar i din cele
uniloculare la ftul uman, fiind efectuate n acele depozite (cervical, respectiv dorsal
de la diferite vrste, gestaionale: cervical 20 i 23 sptmni i dorsal 20 sptmni,
unde seciunile semifine au demonstrat prezena insulelor de vasculo-adipogenez la
nivelul lobulilor intermediari i prezena unor celule adipocitare n diferite etape de
difereniere. n toate depozitele studiate, la toate vrstele, au coexistat adipocite n
diferite stadii de difereniere, permindu-ne descrierea morfologic secvenial a
liniei adipocitare, n relaie direct cu peretele vaselor de snge.
5.3. Concluzii
1. Diferenierea depozitelor adipocitare cuprinde lobulogeneza - formarea
lobulilor adipoi - i adipogeneza - diferenierea propriu-zis a celulelor mature din
precursori.
2. Lobulogeneza nu debuteaz concomitent n toate depozitele adipocitare i se
ntinde pe toat perioada de dezvoltare fetal a trimestrelor 2 i 3 de via
intrauterin.
3. Diferenierea lobulilor avanseaz dinspre suprafaa spre interiorul corpului iar
la nivel subcutanat dinspre extremitatea cefalic spre trunchi.
4. Ftul la termen prezint depozite mature multiloculare sau mixte n toate
zonele unde la adult PET-CT a pus n eviden BAT: cervical profund, interscapular,
pericardic.
5. Adipogeneza n depozitele BAT sau WAT se desfoar similar, pornind de
la precursori nedifereniai, situai n poziie pericitic fa de endoteliul vascular, care
trec prin etapa de preadipocit i apoi adipocit matur multilocular sau unilocular.
6. Adipoblastele sunt identice din punct de vedere microscopic dar
preadipocitele multiloculare i cele uniloculare prezint caracteristici morfologice
distincte.
7. Diferenierea preadipocitelor multiloculare i a celor uniloculare dintr-un
precursor comun endotelial reprezint un argument n favoarea fenomenului de
transdifereniere adipocitar, cu profunde semnificaii n tratamentul neinvaziv al
obezitii.

23

Capitolul VI
STUDIU IMUNOHISTOCHIMIC AL ADIPOGENEZEI FETALE
6.1.Rezultate
6.1.1. Studiul imunohistochimic al UCP1
6.1.1.1. Grupul precoce - vrsta gestaional 16-20 sptmni
UCP1 s-a exprimat imunohistochimic cel mai precoce la un subiect cu vrsta
gestaional de 18-19 sptmni la nivelul depozitelor cervicale, interscapulare i
dorsale.
Pozitivitatea a fost extrem de discret i inconstant, prezent la cteva celule
multiloculare din lobulii intermediari care abia au iniiat sinteza proteinei (Fig.6.1.a.),

Fig.6.1. Subiect cu vrsta gestaional de 18 sptmni. Reacie imunohistochimic pentru UCP1: a.
lobul adipocitar din regiunea cervical, ob.x10;b. preadipocite pozitive din zona toracic dorsal
ob.x100.
6.1.1.2. Grupul intermediar vrsta gestaional 20-26 sptmni
La subiecii cu vrste gestaionale cuprinse ntre 20-24 sptmni au fost
testate pentru prezena UCP1 cu precdere depozitele cervical, interscapular i
toracic posterior, aceleai care au fost analizate i la grupul precoce.
Am remarcat o mare variabilitate a reaciei imunohistochimice. Pe imaginile de
ansamblu ce au surprins lobuli intermediari din depozitul cervical aparinnd unui
ft cu vrsta gestaional de 20 sptmni celularitatea a fost mixt, i dei
majoritatea celulelor sunt multiloculare, pozitivitatea este slab i inconstant
(Fig.6.2.).

Fig.6.2. Subiect cu vrsta gestaional de 20 sptmni, reacie imunohistichimic pentru UCP1 n
lobulii adipocitari cervicali ; a. lobul intermediar cu numeroase celule multiloculare ob.x10.b. imagine
de detaliu, se remarc pozitivitate extrem de discret la nivelul unor celule multiloculare, situate mai
ales la periferia lobulului; celulele uniloculare vecine sunt negative, ob.x40.

Pentru vrsta de 24 sptmni, reacia imunohistochimic pentru UCP1 la
nivel cervical a fost complet diferit fa de cea de la 20 sptmni, cu pozitivitate
extrem de accentuat la nivelul tuturor lobulilor. Imaginile de detaliu arat i de
aceast dat c populaia adipocitar pozitiv pentru UCP1 din lobulii n majoritate
difereniai cu populaie celular mixt, este format din celule multiloculare (Fig.6.4
a., b.).

24


Fig.6.4. Subiect de 24 sptmni, reacie imunohistochimic pentru UCP-1, depozit
laterocervical. a. doi lobuli adipocitari complet difereniai ob.x4; b. pozitivitate inconstant, n mozaic
a celulelor adipocitare ob.x20; c. ob.x100; d. celulele multiloculare pot prezenta sau nu pozitivitate,
ob.x100.
6.1.1.3.Grupul tardiv - vrsta gestaional 36-40 sptmni
Pentru ftul de 36 sptmni depozitul interscapular, format din lobuli
adipocitari teriari, confluai, a demonstrat pozitivitate neomogen pentru UCP1,
asemntor cazurilor precedente, celulele multiloculare i cele pauciloculare
prezentnd pozitivitate inconstant, iar cele uniloculare fiind negative (Fig.6.8.).

Fig.6.8. Subiect de 36 sptmni, depozit interscapular. Reacie pozitiv pentru UCP1
n celulele multiloculare i negativ n celelalte elemente celulare. a. ob.x4; b. ob.x40.

n grupa de vrst 38-40 sptmni au fost studiate depozite subcutanate
laterocervical, interscapular i dorsotoracic i viscerale perirenal i omental.
Imaginile de ansamblu arat c pozitivitatea este prezent n cteva celule
multiloculare restante, dar i n celule uniloculare cu citoplasm groas care se
gsesc din abunden n aceti lobuli (Fig.6.10.c. i d.).
25


Fig. 6.10. Subiect de 38 sptmni, imunoreacie pentru UCP1. a. depozit cervical ob.x40; b.
depozit interscapular ob.x20; c. depozit interscapular ob.x40; d. depozit omental ob.x20.

6.1.2.Studiul imunohistochimic al CD31
6.1.2.1.Grupul precoce - vrsta gestaional 16-20 sptmni
La nivelul depozitelor cervicale CD31 a prezentat o reacie foarte bine
conturat n endoteliul vaselor de snge de toate categoriile aflate n afara lobulilor
adipocitari, n mezenchimul viitorului depozit adipocitar. n interiorul lobulilor reacia a
fost uneori absent

Fig.6.11. Subiect de 20 de sptmni Aspecte ale imunocolorrii pentru CD31 la nivelul
depozitelor adipocitare cervicale,. a. ob.x 20; b. ob.x100; c. ob.x100; d. limfonodul ob.x100.

6.1.2.3.Grupul tardiv - vrsta gestaional 36-40 sptmni
n acest interval de vrst, la nivel subcutanat intralobular am remarcat c
discontinuitile n reaciile imunohistochimice de marcare a CD31 au aprut cu
precdere n lobulii intermediari puin acoperii, i anume n ariile unde predomin
celule mezenchimale sau cele nedifereniate. Reeaua de capilare este bine
structurat, cu perete continuu, bine evideniat prin imunoreacia cu CD31, indiferent
de structura celular dominant - multilocular sau paucilocular aa cum am
semnalat n locaia subcutanat, sau unilocular, cum a fost cazul celei peritoneale
(Fig.6.16.).
26


Fig.6.16. Subiect la termen. Imunoreacie pentru CD31. a. depozit interscapular ob.x40;
b. depozit peritoneal ob.x40

6.2. Discuii
esutul adipos multilocular - BAT - reprezint componenta termogenic a
organului adipos, dezvoltat mai bine la ft i nou nscut i absent la adult n
condiii fiziologice, aa cum considera histologia clasic. Studiile din ultimele dou
decade au artat ns c BAT este implicat metabolic nu doar n termogenez ci i n
meninerea greutii corporale avnd rol n prevenirea obezitii (Lowell i
Spiegelmann, 2000, Lowell i Beckman, 2003). Studiile pentru detectarea UCP1 n
perioada fetal la om sunt absente din literatura de specialitate pe care am studiat-o,
rezultatele noastre fiind originale. Din rezultatele noastre reiese c exist un decalaj
de aproximativ 14 zile gestaionale ntre apariia esutului adipos multilocular i
pozitivarea reaciei pentru UCP1: primii lobuli coninnd celule multiloculare
difereniate au fost remarcai la grupul precoce la 16-17 sptmni gestaionale iar
primele reacii UCP1 pozitive la ftul de 18-19 sptmni la nivelul depozitelor
cervicale, interscapulare i dorsale. nc de la debutul pozitivrii reaciei pentru
UCP1, meninndu-se pe toat perioada adipogenezei fetale studiate, am constat
prezena inconstant a reaciei pozitive, indiferent de tipul de lobul, de apartenena
acestuia la un anumit depozit sau de vrsta fetal. Am denumit acest fenomen de
pozitivitate n mozaic. Aa dup cum am artat, nu toate adipocitele miultiloculare
dintr-un depozit au fost pozitive la UCP1 (efectul mozaic). n acelai timp pozitivitatea
a fost prezent nu doar n celulele multiloculare ci i n unele adipocite uniloculare
tinere - pauciloculare sau celule cu citoplasma groas. UCP1 a fost ns constant
absent n celulele unilocularele mature, de dimensiuni mari, prezente n depozitele la
termen. Interesant este faptul c UCP1 a fost prezent i n depozitul viscerale
perirenal - ceea ce este n acord cu localizarea BAT la nou-nscut dar, surprinztor i
n depozitul omental, care este considerat prin excelen un depozit unilocular. Aa
dup cum am artat acest depozit este ultimul care se edific n lobulogenez i noi
nu am surprins dect aspectul su unilocular, dar nu poate fi exclus o scurt
perioad de multilocularitate n cursul n adipogenezei acestui depozit, care s
explice meninerea la ftul la termen a pozitivitii pentru UCP1. Aceste rezultate ne
permit s concluzionm c UCP1 este marker pentru unele adipocite multiloculare,
probabil pentru cele active termogenetic i c toate adipocitele uniloculare din toate
depozitele studiate de noi au originea n adipocitele multiloculare, din moment ce
pozitivitatea UCP1 se menine n aceleai depozite de-a lungul maturrii fetale.
Exist dou mari curente de opinie n ceea ce privete originea i rolul metabolic la
adult al esutului adipos convertibil: (i) aceste celule brune din depozitele albe, wBAT
(white in brown) sunt genetic diferite de iBAT i au drept unic funcie
fiziologic/termogenic reglarea adipozitii corporale n raport cu alimentaia n timp
ce iBAT ndeplinete funcia de homeostazie termic (Kozak i colab., 2010) (ii)
transdiferenierea esutului adipos din organul adipos (Cinti, 2009, Betz i Enerback,
2011). Am remarcat celule pozitive pentru UCP1 n lobulii intermediari din depozitele
a b
27

pe cale de difereniere. Este posibil ca aceste celule, pe care le-am considerat
adipocite uniloculare incomplet difereniate s reprezinte celule intermediare sau
dormante ale depozitului WAT.
n completarea studiului nostru ne-am propus evidenierea modului n care
evolueaz vascularizaia lobulilor adipocitari pe parcursul adipogenezei, scop n care
am folosit marcarea imunohistochimic a celulelor endoteliale cu anticorpul anti
CD31 - rotein transmembranar cu rol n adeziunea celulelor endoteliale adiacente.
CD31 este exprimat n celulele endoteliale ale tuturor vaselor de snge cu perete
continuu, indiferent de calibru, inclusiv n artere, arteriole, venule i vene dar lipsete
n capilarele sinusoide cu perete discontinuu. Rezultatele obinute n urma marcrii
cu CD31 au artat c celulele endoteliale sunt diferit marcate n timpul adipogenezei
fetale n raport cu etapele de difereniere ale celulelor liniei adipocitare.
6.3. Concluzii
1. Prezena UCP1 a fost studiat pentru prima oar la ftul uman, iar rezultatele
prezentate indic o pozitivare a reaciei imunohistochimice la vrsta de 19-20
sptmni gestaionale i creterea progresiv a incidenei celulelor UCP1 pozitive
pn n momentul naterii.
2. UCP1 este intens pozitiv la ft n unele depozite BAT n care PET-CT arat
prezena BAT funcional la adult - cervical, interscapular i perirenal, dar slab pozitiv
n depozitele pericardic i periaortic, indicnd faptul c nu toate depozitele brune ale
ftului conin celule multiloculare active metabolic.
3. Pozitivitatea pentru UCP1 este prezent nu doar n celule multiloculare ci i
n celule uniloculare imature din depozitele WAT, care ar putea reprezenta esutul
adipos convertibil din depozitele uniloculare ale adultului.
4. Pozitivitatea pentru UCP1 la nivelul unor celule uniloculare poate semnifica
fie originea comun a celulelor multiloculare i uniloculare, fie posibilitatea ca celulele
uniloculare s provin prin diferenierea celor multiloculare.
5. Marcarea imunohistochimic cu CD31 a jonciunilor aderente dintre celulele
endoteliale a indicat discontinuiti n peretele capilarelor din ariile de profiferare
vasculo-adipocitar, semnificnd desprinderea unor celule endoteliale i reaezarea
lor n poziie pericitic.
6. Aceste rezultate au fost remarcate i n depozitele multiloculare i n
depozitele uniloculare, deci se poate concluziona prezena unui precursor comun
endotelial pentru cele dou fenotipuri ale celulelor adipocitare.

Capitolul VII
STUDIU IMUNOHISTOCHIMIC AL IMPLICRII ESUTULUI ADIPOS
N PATOGENIA INFLAMAIEI DIN OBEZITATE
Coloraiile histologice au artat c n ambele localizri - periferic i central,
peritoneal, depozitele adipocitare cu organizare lobular. Lobulii sunt formai la
rndul lor din adipocite i din componenta stromovascular, mai bine reprezentat la
nivel visceral, unde i dimensiunea lobulilor a fost mai modest. La subiecii
normoponderali aspectul lobular a fost mult mai discret n localizarea central, unde
au fost remarcate mai ales celule adipoase izolate, rareori grupate. Coloraia
tricromic a indicat acumulare de colagen nu numai intralobular sub forma de septuri
conjunctive ci i perivascular, ultimul aspect fiind evident n localizarea peritoneal.
Aspectul fibrotic a fost n general mai evident la pacienii obezi n comparaie cu cei
normoponderali.
7.1.1. Studiul imunohistochimic al CD68
n cazul pacienilor normoponderali, numr extrem de redus de celule
proinflamatorii CD68 pozitive. CD68 a prezentat un aspect sensibil asemntor n
esutul adipos subcutanat abdominal provenit de la pacienii obezi cu cel descris la
28

pacienii normoponderali. n localizarea visceral la pacienii obezi - numeroase
vase de calibru mic i mediu dilatate, att n interstiiul dintre adipocite, ct i n
esutul conjunctiv nconjurtor, n al cror lumen numeroase celule au fost marcate
cu CD68.
7.1.2.Studiul imunohistochimic al TNF
Toi pacienii normoponderali au prezentat reacie negativ pentru TNF att
n cazul depozitelor adipoase periferice - subcutanate, ct i n cele centrale.
n cazul pacienilor obezi, n locaia subcutanat reacia a fost pozitiv, att n
celulele proinflamatorii, ct i n cteva celule endoteliale (Fig.7.5.a.) ns negativ n
adipocite.






7.1.3. Studiul imunohistochimic al TLR
La pacienii normoponderali, att n localizarea subcutanat ct i n cea
visceral, cele dou categorii de receptori TLR2 i TLR4 au fost inconstant prezeni
n celulele imunocompetente din fracia stromovascular, dar abseni n celelalte
celule: celule endoteliale sau adipocite (Fig.7.6 a,b.). La pacienii obezi i la cei
obezi i diabetici, TLR2 a prezentat distribuie sensibil asemntoare n depozitele
centrale, n sensul prezenei sale n celulele imunocompetente i inconstant n
celulele endoteliale, dar i n membrana unor adipocite (Fig.7.6.d.).
Rezultatele reaciilor imunohistochimice pentru, TNF, TLR2 i TLR4 sunt
sintetizate n tabelul urmtor:

7.1.4. Studiul imunohistochimic al CD31 i al VEGF
Anticorp Celul NORMOPONDERAL OBEZ OBEZ DIABETIC
sc per sc per sc per

TNF-
icc - - + + + ++
ves - - + ++ + +
adc - - - +/- +/- +

TLR2
icc +/- +/- +/- + +/- +
ves - - +/- +/- +/- +/-
adc - - +/- +/- +/- +/-

TLR4
icc +/- +/- +/- ++ +/- ++
ves +/- - +/- ++ +/- ++
adc - - - ++ +/- ++
Fig.7.5. Imunoexpresia TNF a. depozit subcutanat, pacient obez, ob.x40;
b.depozit peritoneal, pacient obez, ob.x20; c. depozit peritoneal, pacient obez,
ob.x40; d.depozit peritoneal, pacient obez diabetic, ob.x40.
29

Pacienii obezi nu au prezentat diferene fa de cei normoponderali n ceea
ce privete incidena capilarelor la nivelul depozitelor subcutanate, n schimb n
localizarea visceral vasele de snge au fost mai puine n interstiiul dintre celulele
adipocitare dar mai voluminoase i mai dilatate n stroma vascular i n benzile
fibrotice dintre lobulii adipocitari. La pacienii obezi VEGF a prezentat reacie pozitiv
att la nivel subcutanat ct i n depozitele viscerale, la acest nivel prezena
factorului de cretere fiind observat nu doar n peretele vasului ci i n citoplasma
adipocitelor.
Discuii
Organul adipos al adultului este repartizat n dou mari depozite:
subcutanat/periferic i visceral/central. Recent, att TLR2 ct i TLR4 au fost
incriminai n ateroscleroz i n rezistena la insulin (Tsukumo i colab., 2007,
Erridge, 2009) aici fiind de asemenea raportat cretera expresiei i activitii TLR2
i TLR4 n monocitele circulante (Jialal i colab., 2012). Activarea TLR determin
inducerea rapid a cascadei proinflamatorii intracelulare i creterea exprimrii
citokinelor, chemokinelor i moleculelor de adeziune (Tsukomo i colab., 2007,
Erridge, 2009). Rezultatele noastre indic faptul c aceleai elemente celulare
pozitive pentru TNF sunt pozitive i pentru TLR4, dar acestea sunt reprezentate n
primul rnd de macrofage sau de celulele endoteliale. Reacia imunohistochimic s-a
pozitivat la nivelul adipocitelor doar la obezi i diabeticii obezi n depozitele
peritoneale. Pozitivitatea pentru TLR2 i TLR4 nu s-a corelat dect nesemnificativ la
nivel subcutanat, TLR2 fiind prezent inconstant n depozitele subcutanate la toate
loturile de pacieni. Numrul relativ sczut de cazuri studiate i existena unei
patologii abdominale nu exclude posibilitatea ca aceast pozitivitate s fie indus de
activarea TLR de ctre liganzii lor specifici. Pozitivarea reaciei pentru TLR4 la obezi
i la diabetici a fost constatat ns nu doar la nivelul celulelor imunocompetente ci i
la nivelul celulelor pereilor vasculari i al adipocitelor viscerale. Excluznd activarea
similar celei propuse pentru TLR2, presupunem c TLR4 pot fi activai prin
eliberarea acizilor grai liberi din adipocitele necrozate. Activarea TLR2 i TLR4 de
ctre acizii grai saturai este ns un mecanism parial acceptat. Aa dup cum am
artat n studiul nostru imunohistochimic pozitivitatea pentru VEGF este mai
accentuat n depozitele adipocitare ale pacienilor obezi i ale celor obezi diabetici,
mai ales n localizrile viscerale.
7.3. Concluzii
1. n raport cu statusul metabolic individual exist diferene semnificative ntre
modul de exprimare al unor citokine proinflamatorii ntre depozitele subcutanate i
cele centrale.
2. Obezitatea central a adultului se nsoete de creterea numrului de
celule proinflamatorii la nivelul depozitelor adipocitare. La persoanele obeze i la
diabeticii obezi sinteza de TNF este prezent nu doar n celulele CD68 pozitive ci i
la nivelul adipocitelor.
3. n obezitatea central din diabetul de tip 2 exist o corelaie direct ntre
numrul de celule imune CD68 pozitive, sinteza de TNF i cea de TLR4, ceea ce
implic mecanismele imunitii nnscute n inducerea i meninerea inflamaiei din
sindromul metabolic.
4. Adipocitele nchid un cerc vicios n inflamaia din obezitate, ele reprezentnd
n acelai timp att sursa de citokine proinflamatori ct i efectorul activitii biologice
induse de acestea.
5. Sinteza de VEGF la nivelul esutului adipos visceral este crescut n
obezitate ca urmare a instalrii hipoxiei, dar este ineficient, nefiind urmat de o
angiogenez compensatorie, ci VEGF amplific doar reacia inflamatorie prin
vasodilataie i creterea afluxului de celule proinflamatorii.
30

6. Exist o relaie patogenic direct ntre gradul de fibroz intralobular din
depozitele adipocitare i exprimarea VEGF de ctre celulele adipoase ale depozitelor
centrale.
7.Creterea sintezei citokinelor proinflamatorii n obezitate reprezint consecina
intricrii activitii tuturor elementelor constitutive ale lobulilor adipoi, n evaluarea
efectului proinflamator fiind necesar studiul implicrii depozitului adipos n totalitate -
celule adipocitare i celulele fraciei stromovasculare.

CONCLUZII GENERALE
1. Histogeneza esutului adipos cuprinde formarea lobulilor adipoi -
lobulogeneza i diferenierea celulelor adipocitare propriu-zise - adipogeneza.
Lobulogeneza este un fenomen secvenial, dar continuu, care se desoar n
timestrul II i III de via intrauterin, pn n momentul naterii. Diferenierea
lobulilor adipoi prezint decalaje cronologice n raport cu topografia depozitului
considerat: mai nti apar lobulii subcutanai cervicali la 16 sptmni i ultimii apar
cei viscerali omentali, la 22-24 sptmni.
Diferenierea lobulilor adipoi avanseaz dinspre suprafaa spre interiorul
corpului.
Cu excepia depozitului omental, care este alctuit nc de la debut din celule
uniloculare, toate celelalte depozite subcutanate i viscerale prezint iniial aspect
multilocular sau mixt, coninnd celule multiloculare n diferite etape de evoluie.
La natere ftul prezint celule multiloculare sau mixte n toate depozitele
adipocitare n care la adult investigaia PET-CT a pus n eviden BAT funcional:
cervical profund, interscapular i pericardic.
2. Adipogeneza se desfoar similar n depozitele BAT i WAT, pornind de la
precursori nedifereniai - adipoblaste - identici din punct de vedere morfologic, situai
n poziie endotelio-pericitic fa de lumenul vascular, care trec prin etapa de
preadipocit i apoi adipocit matur multilocular sau unilocular.
3. Exprimarea UCP1, studiat pentru prima oar la ftul uman, arat o
pozitivare a reaciei imunohistochimice la vrsta de 19-20 sptmni gestaionale la
nivelul depozitelor cervicale, care sunt i primele care de formeaz, i creterea
progresiv incidenei elementelor celulare pozitive pn n momentul naterii.
UCP1 este intens pozitiv la ft n ariile n care PET-CT arat prezena BAT la
adult, ceea ce semnific existena unui BAT funcional.
Pozitivitatea pentru UCP1 este prezent i n celule uniloculare imature din
depozite WAT, semnificnd fie originea comun a celor dou fenotipuri adipocitare,
fie originea celulelor uniloculare din cele multiloculare. Celulele uniloculare imature
ale ftului, pozitive pentru UCP1, ar putea reprezenta esutul adipos convertibil din
depozitele uniloculare ale adultului.
4. Coroborarea studiului morfologic cu cel imunohistochimic argumenteaz
ipoteza c, cel puin o fracie a celulelor uniloculare se difereniaz trecnd prin etapa
de multilocularitate.
5. esutul adipos al adultului prezint diferene semnificative ntre depozitele
subcutanate i cele viscerale n modul de exprimare al unor molecule implicate n
meninerea statusului inflamator din obezitate.
n obezitatea nsoit de diabet de tip 2 exist o corelaie direct ntre incidena
celulelor stromovasculare proinflamatorii i adipocitele pozitive pentru TNF i TLR4,
implicnd factorii ce in de genetica imunitii nnscute n cile patogenice ale
sindromului metabolic.
Sinteza crescut de VEGF la nivelul esutului adipos visceral este una
ineficient, nefiind urmat de o angiogenez care s contrabalanseze hipoxia
tisular, dar amplificnd prin vasodilataie reacia inflamatorie.
31

n obezitatea adultului adipocitele sunt situate la intersecia cilor patogenice ce
ntrein reacia inflamatorie, ele reprezentnd n acelai timp sursa i efectorul
sintezei de factori proinflamatori.
6. Originea embrionar comun a celor dou fenotipuri celulare sau/i
diferenierea WAT din BAT se constituie ntr-un argument n favoarea existenei
fenomenului de transdifereniere adipocitar n organul adipos al adultului.
Consecinele clinice sunt importante, implicnd tratamente inovative ale obezitii,
prin utilizarea unor substane care s stimuleze conversia adipocitelor uniloculare n
fenotipul multilocular metabolic activ.

BIBLIOGRAFIE SELECTIV

1. Atit R, Sgaier SK, Mohamed OA, Taketo MM, Dufort D, Joyner AL, Niswander L, Conlon RA,
(2006). -Catenin activation is necessary and sufficient to specify the dorsal dermal fate in the mouse.
Dev. Biol. 296:164-176.
2. Bar-Shalom R, Gaitini D, Keidar Z, Israel O, (2004). Non-malignant FDG uptake in
infradiaphragmatic adipose tissue: a new site of physiological tracer biodistribution characterized by
PET/CT. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 31:1105-1113.
3. Betz MJ, Enerbck S, (2011). Therapeutic prospects of metabolically active brown adipose
tissue in humans. Front Endocrinol (Lausanne). 2:86.
4. Billon N, Dani C, (2012). Developmental Origins of the Adipocyte Lineage: New Insights from
Genetic and Genomics Studies. Stem Cell Rev. 8(1):55-66.
5. Bonnet FP, (1981). Fat cell size and number in obese children. pp.133-154. Adipose tissue in
childhood. Ed Bonnet F. P. (CRC, Boca Raton, FL).
6. Brook CG, Lloyd JK, Wolf OH, (1972). Relation between age of onset of obesity and size and
number of adipose cells. Br Med J. 1;2(5804):25-27.
7. Cannon B, Nedergaard J, (2004). Brown adipose tissue: fuction and physiological
significance. Physiol Rev. 84:277-359.
8. Cinti S, (1999).The Adipose Organ. Ed. Kurtis. Milano.
9. Cinti S, (2001a). The adipose organ: endocrine aspects and insights from transgenic models.
Eat Weight Disord. 6:4-8.
10. Cinti S, (2002). Adipocyte differentiation and transdifferentiation: Plasticity of the adipose
organ. J Endocrinol Invest. 25:823-835.
11. Cinti S, (2005) The adipose organ. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids.
73:9-15;
12. Cinti S, (2009). Transdifferentiation properties of adipocytes in the adipose organ. Am J
Physiol Endocrinol Metab. 297:E977-E986.
13. Cypess AM, Lehman S, Williams G, Tal I, Rodman D, Goldfine AB, Kuo FC, Palmer EL,
Tseng YH, Doria A, Kolodny GM, Kahn CR, (2009). Identification and importance of brown adipose
tissue in adult humans. N Engl J Med. 360:1509-1517.
14. Enerbck S, (2010a). Human Brown Adipose Tissue. Cell Metab. 11:248-215.
15. Enerbck S, (2010b). Brown adipose tissue in humans. Int J Obes. 34:Suppl1:S43-S46.
16. Erridge CJ, (2009).The roles of Toll-like receptors in atherosclerosis. Innate Immun. 1(4):340-
9.
17. Gesta S, Tseng YH, Kahn CR, (2007). Development Origin of Fat: Tracking Obesity to Its
Source. Cell. 131(2):242-56.
18. Hauner H, (2005). Secretory factors from human adipose tissue and their functional role.
Proc.Nutr.Soc., Symposium on Biology of obesity. 64:163-169.
19. Hausman DB, DiGirolamo M, Bartness TJ, Hausman GJ, Martin RJ, (2001). The biology of
white adipocyte proliferation. Obes Rev. 2:239-254.
20. Jialal I, Huet BA, Kaur H, Chien A, Devaraj S, (2012). Increased toll-like receptor activity in
patients with metabolic syndrome. Diabetes Care. 35(4):900-4.
21. Kozak LP, Koza RA, Anunciado-Koza R, (2010). Brown fat thermogenesis and body weight
regulation in mice: relevance to humans. Int J Obes (Lond). Suppl1:S23-7.
22. Le Douarin NM, Creuzet S, Couly G, Dupin E, (2004). Neural crest cell plasticity and its limits.
Development. 131(19):4637-50.
23. Lean MEJ, (1989). Brown adipose tissue in humans. Proc Nutr Soc. 48(2):243-257.
24. Lidell ME, Enerbck S, (2010). Brown adipose tissue - a new role in humans?. Nat Rev
Endocrinol. 6(6):319-325.
32

25. Lowell BB, Bachman ES, (2003). Beta-Adrenergic receptors, diet-induced thermogenesis, and
obesity. J Biol Chem. 278(32):29385-8.
26. Lowell BB, Spiegelman BM, (2000). Towards a molecular understanding of adaptive
thermogenesis. Nature. 404(6778):652-60.
27. Martin RJ, Hausman GJ, Hausman DB, (1998). Regulation of Adipose Cell Development In
Utero. Proc Soc Exp Biol Med. 219(3):200-210.
28. Merklin RJ, (1974). Growth and Distribution of Human Fetal Brown Fat. Anat Rec. 178: 637-
646.
29. Nedergaard J, Bengtsson T, Cannon B, (2007). Unexpected evidence for active brown
adipose tissue in adult humans. Am J Physiol Endocrinol Metab. 293:444-452.
30. Poissonet CM, Burdi AR, Garn SM, (1984). The chronology of adipose tissue appearance and
distribution in the human fetus. Early Human Development (Elsevier). 10:1-11.
31. Poissonnet CM, Burdi AR, Bookstein FL, (1983). Growth and development of adipose tissue
during early destation. Early Hum Dev. 8:1-11.
32. Poissonnet CM, LaVelle M, Burdi AR, (1988). Growth and development of adipose tissue. The
Journal of Pediatrics. 113:1-9.
33. Poulos SP, Hausman DB, Hausman GJ, (2010). The development and endocrine functions of
adipose tissue. Molecular and Cellular Endocrinology. 323:20-34.
34. Rosen ED, MacDougald OA, (2006). Adipocyte differentiation from the inside out. Nature
reviews. 7:885-896. .
35. Ross MH, Pawlina W, (2006). Histology-A Text and Atlas, 5
th
edition. pp238-247. Lippincott
Williams & Wilkins, Philadelphia.
36. Saely CH, Geiger K, Drexel H, (2012). Brown versus white adipose tissue: a mini-review.
Gerontology. 58(1):15-23.
37. Spalding K, Arner E, Westermark PO, Bernars S, Buchholz BA, Bergmann O, Blomqvist L,
Hoffstedt J, Naslund E, Britton T, Concha H, Hassan M, Ryden M, Frisen J, Arner P, (2008). Dynamics
of fat cell turnover in humans. Nature. 453:783-787.
38. Trayhurn P, (2005). Endocrine and signaling role of adipose tissue: new perspectives on fat.
Acta Physiol Scand. 184:285-293.
39. Trayhurn P, Wang B, Wood IS, (2008a). Hypoxia and the endocrine and signalling role of
white adipose tissue. Arch Physiol Biochem. 114(4):267-76.
40. Tsukumo DM, Carvalho-Filho MA, Carvalheira JB, Prada PO, Hirabara SM, Schenka AA,
Arajo EP, Vassallo J, Curi R, Velloso LA, Saad MJ, (2007). Loss-of-function mutation in Toll-like
receptor 4 prevents diet-induced obesity and insulin resistance. Diabetes. 56(8):1986-98.
41. Van Marken Lichtenbelt WD, Vanhommering JW, Smulders NM, Drossaerts JM, Kemerink GJ,
Bouvy ND, Schrauwen P, Teule GJ, (2009). Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. N
Engl J Med. 360:1500-1508;
42. Virtanen KA, Lidell ME, Orava J, Heglind M, Westergren R, Niemi T, Taittonen M, Laine J,
Savisto N-J, Enerback S, Nuutila P, (2009). Functional brown adipose tissue in healthy adults. N Engl
J Med. 360:1518-1525.
43. Zingaretti MC, Crosta F, Vitali A, Guerrieri M, Frontini A, Cannon B, Nedergaard J, Cinti S,
(2009). The presence of UCP1 demonstrates that metabolically active adipose tissue in the neck of
adult humans truly represents brown adipose tissue. FASEB J. 23:3113-3120.