Rezumat D.gheorghes

Universitatea de Medicin i Farmacie Gr. T.
Popa Iai
Facultatea de Farmacie

TEZ DE DOCTORAT

CERCETAREA ANALITIC A UNOR
TUBERCULOSTATICE MAJORE
(Izoniazida, Rifampicina i Etambutolul)

Coordonator tiinific,
PROF. DR. VASILE DORNEANU

Doctorand,
DANIELA GHEORGHE (cstorit GRBULE)

Iai
2010
1

Prin decizia Rectorului Universitii de Medicin i Farmacie
Gr.T.Popa Iai nr. 2134 / 09.02.2010 a fost numit urmtoarea
comisie de doctorat alctuit din:

Prof.univ.dr. Monica Hncianu Preedinte
Decanul Facultii de Farmacie
UMF Gr.T.Popa Iai

Prof.univ.dr. Vasile Dorneanu Conductor tiinific
UMF Gr.T.Popa Iai

Prof.univ.dr. Marius Boji Membru
UMF Iuliu Haieganu Cluj Napoca

Prof.univ.dr. Ioan Srghie Membru
Facultatea de Chimie Industrial
Universitatea Tehnic Gh. Asachi Iai

Prof.univ.dr. Elena Butnaru Membru
UMF Gr.T.Popa Iai

edina public de susinere a tezei de doctorat cu tema
Cercetarea analitic a unor tuberculostatice majore
(Izoniazida, Rifampicina i Etambutolul), va avea loc la data
de 19 martie 2010, ora 11
00
, Sala Societii de Medici i
Naturaliti Iai Iai.

2
Cuprins

INTRODUCERE ........................................................................ 3

PARTEA GENERAL............................................................... 4
Capitolul 1. Caracterizarea general a antibioticelor .................. 4
Capitolul 2. Caracterizarea tuberculostaticelor majore
(Izoniazid, rifampicin, etambutol) ....................................... 4
Capitolul 3. Date privind metodologia de lucru .......................... 5

PARTEA EXPERIMENTAL................................................... 6
(CONTRIBUII PERSONALE) ................................................ 6
Capitolul 4. Separarea si determinarea cantitativ a
rifampicinei prin cromatografie de lichide de nalt
performan.Validarea metodelor HPLC. Determinarea
urmelor de rifampicin din tampoanele de curare. ............... 6
Capitolul 5. Determinarea isoniazidei si rifampicinei prin
HPLC. Validarea metodei ..................................................... 11
Capitolul 6. Determinarea izoniazidei si etambutolului prin
HPLC.Validarea metodei ...................................................... 16
Capitolul 7. Elaborarea unei metode de determinare a
izoniazidei, etambutolului i rifampicinei din amestec
prin HPLC. ............................................................................ 22
Capitolul 8. Aplicaiile metodelor HPLC pe forme
farmaceutice i diferite medii biologice ................................ 31
Capitolul 9. Aplicarea metodei de dozare a izoniazidei,
etambutolului i rifampicinei n testele de stabilitate ale
comprimatelor i capsulelor .................................................. 39
Capitolul 10. Metode enzimatice de determinare a
adenozin-dezaminazei (ADA) ............................................... 44
CONCLUZII GENERALE ....................................................... 48

PERSPECTIVE DE CERCETARE .......................................... 52
BIBLIOGRAFIE SELECTIV ................................................ 53
LISTA LUCRRILOR PUBLICATE DIN TEZA DE
DOCTORAT ............................................................................. 60
CURRICULUM VITAE ........................................................... 62
3

INTRODUCERE

Descoperirea antibioticelor a nsemnat un pas important
n domeniul chimioterapiei, care a condus la modificri profunde
ale vechilor concepii terapeutice. Utilizate, frecvent n
tratamentul tuberculozei,chimioterapicele au contribuit la o
scdere considerabil a mortalitii.
Industria farmaceutic este una dintre cele mai strict
reglementate ramuri industriale, reglementrile referindu-se i la
activitatea laboratoarelor analitice de dezvoltare i control.
Astfel, se acord o atenie deosebit optimizrii i utilizrii
metodelor de analiz i control a materiilor prime, a produilor
intermediari i produselor finite. Chimioterapicele din grupa
tuberculostaticelor sunt reprezentate prin patru substane active
n arsenalul terapeutic uman din Romnia.
Scopul acestei lucrri este de a realiza o serie de metode
cromatografice pentru separarea si determinarea cantitativ a
tuberculostaticelor luate in studiu (izoniazida, rifampicina si
etambutolul) cu aplicatii att pe produse farmaceutice ct i din
medii biologice.
Obiectivele lucrrii sunt:
-prezentarea tuturor datelor privind unele chimioterapice
majore (izoniazida, etambutolul i rifampicina), sinteza,
proprietile fizico-chimice i farmacologice, metodele utilizate
n analiza i controlul chimioterapicelor antituberculoase
studiate;
-instituirea de noi metode de separare i determinare
cantitativ prin cromatografie de lichide de nalt performan
att pentru fiecare substan separat ct i din amestecul acestora;
-validarea acestor metode n conformitate cu prevederile
ghidurilor internaionale n cazul produselor cu coninut n
izoniazid, etambutol i rifampicin, n ncercarea de a face un
pas nainte n cercetarea i optimizarea activitii de control a
calitii, n cazul acestui grup important de medicamente;
4
-folosirea acestror metode pentru separarea i
determinarea cantitativ a izoniazidei, rifampicinei i
etambutolului din produse farmaceutice i din medii biologice.

PARTEA GENERAL

Stadiul actual al cunoaterii este structurat n
urmtoarele capitole:

Capitolul 1. Caracterizarea general a antibioticelor

n acest capitol sunt prezentate cele mai importatante date
privind tuberculoza: istoric, evoluia cercetrilor n domeniu,
tipuri de tuberculoz (primar, reactiv, pulmonar i
extrapulmonar), chimioterapia activ n tuberculoz: (a)
chimioterapice antituberculoase majore, de prim alegere:
izoniazida, rifampicina, etambutolul, pirazinamida,
streptomicina;i b) chimioterapice antituberculoase minore, de a
doua alegere (de rezerv): protionamida, acid aminosalicilic,
cicloserina, capreomicina, kanamicina, ansamicina, ofloxacina,
ciprofloxacina. De asemenea sunt prezentate schemele de
tratament antituberculos.

Capitolul 2. Caracterizarea tuberculostaticelor majore
(Izoniazid, rifampicin, etambutol)

Capitolul 2 prezint caracterizarea tuberculostaticelor
majore (izoniazida, rifampicina, etambutolul)
Izoniazida sau hidrazida acidului izonicotinic se gsete
sub diferite nume generice cum ar fi: Tubazin, Azuren, Cotizon,
HIN [28] Denumire tiinific: Piridin 4 carboxilhidrazida
[19].
Rifampicina este cunoscut sub diverse denumiri:
Rifampin, Rifampicin, Rifadine, Eremfat, Tubocin, Sinerdol,
RPM [19].
Rifampin este denumit dup regulile IUPAC astfel: 2,7
(Epoxipentadeca [1, 11, 13] trienimino) nafto [2, 1 - b] furan 1,
5
11 [2H] dioxo, 5, 6, 9, 17, 19, 21 hexahidroxi -23- metoxi
2, 4, 12, 16, 18, 20, 22 heptametil 8 [N (4 metil 1
piperozil) formidol] 21 acetat [27].
Etambutolul Denumire tiinific: D-2,2-(etilendiamino)-
1-butanol [19, 29]. Etambutolul se gsete sub diferite denumiri:
Dexambutol, Myambutol, Sural, Syntomen [7, 11].
Pentru cele trei substane medicamentoase luate in studiu
se prezint proprietile fizico-chimice i farmacologice.

Capitolul 3. Date privind metodologia de lucru

In ceea ce priveste bazele teoretice ale separrii prin
cromatografie de lichide, se prezinta informatii asupra:
selectivitatii coloanei; factorului de capacitate si a celui de
simetrie; performanei coloanei sau eficacitatea aparent;
rezoluiei; raportul pic vale si raportul semnal-zgomot (S/N).
De asemenea sunt prezentate studii de dizolvare in vitro.
Acest capitol mai cuprinde i: metode de analiz
prevzute de Farmacopeea European n controlul calitii
izoniazidei, etambutolului si rifampicinei.
De asemenea, se prezinta metoda de determinare a
urmelor de rifampicin cu validarea igienizrii utilajelor din
industria farmaceutica; validarea metodelor analitice cu
descrierea parametrilor de validare (Acurateea - exactitatea,
fiabilitatea, randamentul; precizia - repetabilitatea,
reproductibilitate; specificitatea selectivitatea; limita de
detecie si cea de cuantificare; liniaritatea; domeniul; rigiditatea;
robusteea) [19, 66-71, 73, 74] precum si unele reglementri
privind studiile de stabilitate.
6

PARTEA EXPERIMENTAL
(CONTRIBUII PERSONALE)

Capitolul 4. Separarea si determinarea cantitativ a
rifampicinei prin cromatografie de lichide de nalt
performan.Validarea metodelor HPLC.
Determinarea urmelor de rifampicin din
tampoanele de curare.

Scop: realizarea i validarea unei metode HPLC pentru
separarea i determinarea rifampicinei din urme n instalaiile
industriale.
Principiul metodei
Separarea si determinarea cantitativ a rifampicinei s-a
realizat cromatografie de lichide de nalt performan, n
condiii isocratice cu detectie n ultraviolet, la 230 nm [119].
Condiii cromatografice: coloana Nucleosil C18 (10m,
250 x 4,6 mm); debit: 1,5 mL/min; temperatura coloanei la 25C;
volum de injectare de 10 L; faza mobil formnata din soluie
acid oxalic 0,01M / acetonitril (20/80, v/v) si detectie la 230 nm.
Parametrii de validare urmariti sunt: selectivitatea
metodei, precizia sistemului cromatografic, testul de regsire a
metodei analitice; testul de regsire a prelevrii probei mpreun
cu cea a metodei analitice (test total de regsire); liniaritatea
metodei si limitele de detecie (LCD) respectiv de cuantificare
(LOQ).

Rezultate
Domeniul: metoda a fost validat n domeniul 0,04
g/mL (LOD) - 100 g/mL.
Liniaritatea s-a determinat pe domeniul de lucru (17
concentratii diferite). S-a reprezentat grafic aria picului
corespunztor rifampicinei n funcie de concentraie. Dreapta de
regresie s-a calculat prin metoda celor mai mici ptrate,vezi
graficul obinut n figura 17. Ecuaia dreptei de calibrare pentru
rifampicin este: Arie pic = 14479,52 x concentraia 729,83;
7
coeficientul de corelaie r = 0,9999, eroare standard a dreptei de
regresie (SE) = 810,28

Figura nr. 17. Liniaritatea metodei de determinare prin HPLC a
rifampicinei

Selectivitatea metodei a fost determinat prin injectarea
unor soluii martor (prelucrat n mod identic ca i soluiile
prob, dar nu conine substana de analizat) (Figura nr. 19) si a
unei soluii de referin (20 g rifampicin/mL faz mobil)
(Figura nr. 20).
Cromatogramele solventului i a soluiei-martor nu
prezint rspunsuri care ar putea interfera cu determinarea
rifampicinei n soluia de referin, prin urmare metoda este
selectiv.

Figura nr. 19. Cromatograma soluiei-martor

8

Figura nr. 20. Cromatograma soluiei standard
Precizia sistemului a fost demonstrat prin injectarea de
ase ori a soluiei de referin i determinarea ariilor rifampicinei,
n cazul picului corespunztor rifampicinei, cnd s-au obinut
valori ale ariei foarte apropiate . RSD (%) = 0,96%.
Pentru a determina procentul de regsire n cazul metodei
analitice, s-au aplicat la ase tampoane de control cte 100 L
soluie de rifampicin cu concentraie de 1 mg/mL (corespunde
la 100 g/tampon), iar tampoanele s-au prelucrat n mod identic
cu probele, soluia obinut fiind filtrat i injectat. Din aria
picului corespunztor rifampicinei s-a calculat procentul de
regsire a metodei analitice, iar rezultatele obinute prezint
valoarea RSD = 0,74%.
Pentru deteminarea procentului total de regsire, s-au
aplicat pe 3 suprafee de oel inoxidabil (simularea suprafeei
echipamentului de producie) de 25 cm cte 100 L soluie de
rifampicin cu concentraie de 0,2 mg/mL (corespunde la 20 g
/tampon), 0,5 mg/mL (50 g /tampon) i 1 mg/mL (100
g/tampon). Dup evaporarea solventului fiecare plac s-a ters
cu un tampon imbibat cu apa distilat. Tampoanele s-au prelucrat
n mod identic cu probele. Regsirea (procentul de regsire):
medie =89,85%, RSD = 4,08%.
Limita de detecie (LOD) s-a determinat pe baza
raportului semnal/zgomot 3. Raportul semnal-zgomot (S/Z)
influeneaz precizia cuantificrii i este calculat cu formula:
S/Z = H/h; unde H reprezint nlimea picului corespunztor
componentului de interes. Pentru confirmarea limitei de detecie
s-au luat n lucru trei soluii de rifampicin, preparate n paralel
9
cu o concentraie de 0,04 g rifampicin/mL. Fiecare soluie s-a
injectat de trei ori. Raportul semnal/zgomot obinut este 4,72.
Limita de detecie este 0,04 g/mL; concentraie echivalent cu
0,204 g rifampicin/tampon sau 0,0088 g/cm
2
. Cantitatea de
rifampicin maxim admisibil este de 4 g / cm
2
(100 g
/tampon), ceea ce corespunde la o concentraie de 19,6 g
rifampicin/mL.
Limita de cuantificare (LOQ) s-a determinat pe baza
raportului semnal/zgomot 10, lund n lucru trei soluii,
preparate n paralel i avnd concentraia de 0,15 g
rifampicin/mL. Fiecare soluie s-a injectat de trei ori. Raportul
semnal/zgomot obinut este 14,03. Limita de cuantificare este
0,15 g/mL. Aceast concentraie este echivalent cu 0,7503 g
rifampicin/tampon sau 0,0302 g rifampicin/cm
2
. Cantitatea de
rifampicin maxim admisibil este 4 g/cm
2
(100 g/tampon),
ceea ce corespunde la o concentraie de 19,6 g rifampicin/mL.
Concluzii
Toate criteriile de admisibilitate fixate pentru validarea
metodei analitice de determinare a urmelor de rifampicin din
tampoane au fost ndeplinite; prin urmare, validarea se consider
corespunztoare, iar metoda de testare adecvat pentru scopul
propus, adic pentru determinarea concentraiilor sczute de
rifampicin n cadrul validrii proceselor de igienizare n
industria farmaceutic, pentru detectarea urmelor de substan
activ care pot rmne pe suprafeele utilajelor de producie.
Metoda este:
rapid, timpul de retenie a rifampicinei este
aproximativ 4,8 minute;
cu o limit de detecie i de cuantificare mult sub limita
de admisibilitate a urmelor ce pot rmne pe suprafee;
prelucrarea probelor este simpl i rapid, nu necesit
procedee i aparatur complexe, doar o simpl ultrasonare;
factorul de regsire este foarte apropiat de 1 (1,11),
adic metoda asigur o bun regsire a urmelor de substan
activ existente pe suprafeele de lucru.

10
Aplicaii ale metodei HPLC de determinare a urmelor de
rifampicin dup efectuarea igienizrii sticlriei

n laboratoarele destinate analizelor fizico-chimice din
industria farmaceutic, un rol important este atribuit validrii
igienizrii sticlriei. Din acest motiv, periodic, pe baza unui
program bine stabilit, se efectueaz analize a cror rezultate s
confere sigurana utilizrii unei sticlrii care s corespund din
punct de vedere fizico-chimic, adic s nu prezinte urme de
substane. S-au folosit substane de referin, reactivi, aparatur
i condiii cromatografice ca la metoda descris mai sus.

Figura nr. 22. Cromatograma soluiei standard de concentraie 20
g rifampicin/ mL

S-a determinat procentul de regsire (100,82%);
RSD=0,33%.
Pentru prelucrarea probelor se prepar 6 soluii, n
acelai mod n care se prepar soluiile standard (20 g/ mL). Se
golete coninutul baloanelor cotate utilizate la prepararea celor 6
probe; se spal cu ap purificat i detergent Neodiser FA (10%),
produs comercializat de firma Nitech; se cltesc foarte bine
baloanele cotate cu ap purificat; se adaug faz mobil pn la
semn; se ultrasoneaz 15 minute; soluiile astfel obinute se
filtreaz prin membrane filtrante de nylon 0,45 m i se
injecteaz. Dup injectarea soluiilor standard, n cromatograma
obinut dup injectarea soluiei prob, nu a fost identificat
11
niciun pic la 4,27 minute, timp de retenie la care elueaz picul
de rifampicin din soluia standard.

Concluzii
Metoda HPLC utilizat pentru determinarea urmelor de
rifampicin, prin evaluarea igienizrii sticlriei, este facil i
simplu de aplicat; nu necesit aparatur complicat; timpul de
cromatografiere este redus, ceea ce permite efectuarea unui
numr mare de analize ntr-un timp relativ scurt; procedeul de
igienizare este valid; n soluiile prob nu s-au detectat urme ale
compusului analizat (urme de rifampicin).

Capitolul 5. Determinarea isoniazidei si rifampicinei prin
HPLC. Validarea metodei

Scop: avnd n vedere importana izoniazidei i a
rifampicinei n terapeutic ne-am propus elaborarea i validarea
unei metode de determinare cantitativ a acestora prin
cromatografie de lichide de nalt performan (HPLC).
Validarea metodei a fost efectuat n conformitate cu literatura
de specialitate [118].

Material si metod
Materiale: substane de referin: Rifampicin i
Isoniazid, conform Farmacopeei Europene; acetonitril de
puritate HPLC (Merck); acid oxalic anhidru (Merck); ap MilliQ
(rezistivitate 18,2 M/cm).
Aparatur: HPLC Waters e 2695 prevzut cu detector UV
- Waters 2489; balan analitic Mettler Toledo.
Condiii cromatografice:
- coloan cromatografic Nucleosil 100-10 C18 (250 x 4,6
mm);
- faza mobil: acetonitril / acid oxalic 10
-2
M n raport de 80 /
20, debit 1,5 mL/min;
- volum injectat: 10 L;
- detecie n UV la lungimea de und de 230 nm;

12

Soluii standard:
- se prepar soluii standard (1 mg/mL) din fiecare
component, solvent (ap /acetonitril 20 / 80, v/v);
- un volum de 5 mL se dilueaz la 25 mL cu solvent; se
obine un amestec cu o concentraie de 0,2 mg/mL pentru fiecare
component n parte.
Rezultate: s-a injectat o soluie standard de lucru (10 L)
utiliznd mai multe faze mobile, cu detecia la lungimea de und
de 230 nm. n final s-a ales amestecul acetonitril / acid oxalic n
raport volumic de 80 / 20, obinndu-se picuri simetrice.
Compoziia fazei mobile a fost stabilit i n funcie de rezoluie,
astfel c la amestecul ales, s-a obinut o rezoluie de 8,64 (Figura
nr. 27).

Figura nr. 27. Cromatograma standard a soluiei coninnd
izoniazid (0,2 mg/mL);
Rt = 2,31 0,03 min i rifampicin (0,2 mg/mL); Rt = 5,33
0,04 min, detecie la 230 nm; faz mobil: amestec acetonitril /
acid oxalic 0,01 M (80 / 20, v/v), debit 1,5 mL/min
Determinarea liniaritii: au fost preparate din soluia
standard de lucru o serie de 5 soluii coninnd isoniazid i
rifampicin n domeniul de concentraie 5 250 g/mL. Fiecare
din aceste soluii au fost analizate de cte 6 ori msurndu-se aria
picurilor corespunztoare. Valorile medii obinute au fost folosite
pentru trasarea dreptelor de calibrare. Prelucrarea datelor prin
13
regresie matematic conduce la obinerea dreptelor de calibrare,
prezentate n figurile nr. 25 i 26.
Avnd n vedere faptul c lum n considerare
posibilitatea aplicrii metodei la determinarea cantitativ a
isoniazidei i rifampicinei nu numai din materii prime sau
diverse preparate farmacetutice ci i din medii biologice, unde
concentraia acestora este mult redus, am studiat mai ales
intervalul 5 100 g/mL. Pe acest interval, datele obinute au
fost evaluate statistic.

Figura nr. 25 Dreapta de calibrare pentru izoniazid
(n amestec cu rifampicina)

Figura nr. 26. Dreapta de calibrare pentru rifampicin
(n amestec cu izoniazida)

Din datele statistice obinute se observ c pe domeniul
de concentraie studiat liniaritatea este foarte bun, valorile
14
coeficienilor de corelaie fiind mai mari de 0,999, dar i faptul
c interceptul cu ordonata prezint o valoare mai mic de 2%.
Limita de detecie i limita de cuantificare: au fost
calculate utiliznd valoarea erorii standard (SE) i a pantei
dreptei de regresie conform formulelor (1) i (2):
Panta
SE
LD

=
3 , 3
(1);
Panta
SE
LC

=
10
(2)
Valorile calculate ale celor dou limite sunt:
Isoniazid LOD = 0,6 g/mL, LOQ = 1,9 g/mL.
Rifampicin LOD = 2,2 g/mL, LOQ = 6,7 g/mL.
Determinarea preciziei (gradul de performan al
operaiilor, instrumentelor i a metodelor utilizate pentru a obine
un rezultat): au fost determinate precizia sistemului, precizia
metodei de analiz i precizia intermediar.
Metoda a fost aplicat pentru determinarea cantitativ a
izoniazidei din forme farmaceutice orale folosind metoda HPLC

Dozarea izoniazidei din comprimate de 100 mg i 300 mg

S-a folosit metoda de mai sus pentru izoniazid si rifampicina
(cap.5).
Pentru prepararea probei se determin masa medie a
unui numr de 20 comprimate, apoi 10 dintre acestea se
mojareaz. Din pulberea de comprimate se cntrete o cantitate
echivalent la 50 mg izoniazid, se aduce cantitativ n balon cotat
de 50 mL cu 30 mL solvent (ap / metanol, 80 / 20, v/v), apoi se
ultrasoneaz 15 minute, soluia se rcete la temperatura camerei
i se aduce aduce la semn cu sovent. In continuare, un volum de
5 mL din soluia astfel obinut se dilueaz la 25 mL cu solvent.
Au fost preparate un numr de 6 astfel de soluii,
rezultatele experimentale obinute sunt calculate conform
formulei:
/
10
P st st
st P
A m C M
mg tablet
A m

=

,
15
unde: A
P
= aria picului probei, m
st
= masa standardului, A
st =
aria
picului de standard, C
st
= concentraia standardului, M = masa
medie a comprimatelor de izoniazid m
P
= masa probei.
Rezultate i discuii
Pentru cele 6 soluii preparate, rezultatele experimentale
obinute confirm faptul c regsirea este conform normelor n
ambele cazuri (folosind standarde preparate n aceeai zi i
standarde meninute 24 de ore la o temperatur de 4
o
C).
Concluzii
- Rezultatele experimentale obinute, au confirmat faptul
c regsirea este conform normelor n ambele cazuri (folosind
standarde preparate n aceeai zi i standarde pstrate timp de 24
de ore la o temperatur de 4
o
C).
- Variaia ntre rezultatele obinute n prima, respectiv a
doua zi este mai mic de 2,0%. Considerm astfel c soluiile
prob i standard sunt stabile la 4C, timp de 24 ore.
- Metoda este valid i poate fi folosit n controlul
calitii i evaluarea produsului izoniazid comprimate 100 i
300 mg.

Dozarea rifampicinei din capsule de 150 mg i 300 mg

S-a folosit metoda de mai sus pentru izoniazid si
rifampicina (cap.5).
Pentru prepararea probei se determin masa medie pe
pulberea coninut de 20 capsule rifampicin; se cntrete o
cantitate de pulbere echivalent cu 50 mg rifampicin, se aduce
cantitativ la balon cotat de 50 mL cu 30 mL solvent (ap /
acetonitril, 80/20, v/v) apoi se ultrasoneaz timp de 15 minute;
soluia se rcete la temperatura camerei i se aduce aduce la
semn cu solvent iar un volum de 5 mL din soluia astfel obinut
se dilueaz la 25 mL cu solvent.
formulei:
/
100
P st st
st P
A m C M
mg tablet
A m

=

,
16
unde A
P
= aria picului probei; m
st
= masa standardului; A
st =
aria
picului de standard; C
st
= concentraia standardului; M = masa
medie a pulberii rezultat din 20 capsule rifampicin; m
P
= masa
probei.
De asemenea, s-a studiat i stabilitatea probelor pstrate
la 4
C, timp de 24 ore injectnd standarde preparate n aceeai zi

i inute la 4
C, timp de 24 ore.
Concluzii
-Pentru cele 6 soluii preparate, rezultatele experimentale
obinute confirm faptul c regsirea este conform normelor n
ambele cazuri (folosind standarde preparate n aceeai zi i
standarde meninute 24 de ore la o temperatur de 4
o
C).
doua zi este mai mic de 2,0%. Considerm astfel c soluiile
prob i standard sunt stabile la 4C, timp de 24 ore.
calitii i evaluarea produsului rifampicin capsule 150 i 300
mg.

Capitolul 6. Determinarea izoniazidei si etambutolului prin
HPLC.Validarea metodei

Scopul acestui studiu a fost elaborarea i validarea unei
metode de determinare prin HPLC a unui amestec de isoniazid
(I) i etambutol (II), folosind un cromatograf de lichide de nalt
performan.
Material si metod
Materiale: substane de referin: etambutol i izoniazid,
conform Farmacopeei Europene [5]; metanol de puritate HPLC
(Merck); acetat de amoniu, acetat de cupru (Merck); ap MilliQ
(rezistivitate 18,2 M/cm
2
).
Aparatur: HPLC Waters e 2695 prevzut cu detector UV
- Waters 2489 cu temperatura compartimentului de termostatare
a probelor 4C; Waters 2487 Dual Wavelength, detector UV-Vis
(cu dou lungimi de und); programul de achiziie i prelucrare a
datelor Empower 2002; balan analitic Mettler Toledo.

17
Condiii cromatografice
- coloan cromatografic Luna 100-5 C18, 250 x 4,6 mm,
lot:5291-77 (Phenomenex);
- faza mobil -metanol / tampon acetat pH = 5,0 n raport
de 20 /80;
- solvent = apa Milli Q;
- debit faza mobil = 1 mL/min;
- volumul de soluie injectat 20 L;
- temperatura coloanei = 25C;
- temperatur probe = 4C ;
- detecie n UV la lungimea de und de 270 nm.
Rezultate i discuii
Orice ncercare de a separa cei doi compui din amestec,
izoniazida, respectiv etambutolul, folosind diverse faze mobile, a
condus la rezultate nesatisfctoare, n ceea ce privete
etambutolul, pentru care n cromatogram nu apare picul
corespunztor.
Etambutolul este o diamin, care deine patru puncte de
coordinare, formnd compleci stabili cu ionii metalici bivaleni
ca: Cu
+
, Ni
+
, Co
+
, i Zn
+
. S-a optat pentru ionul de Cu
+
,
deoarece acesta formeaz cu etambutolul un complex mult mai
stabil dect ceilali cationi metalici.
Am folosit complexul etambutol Cu
2+
i izoniazida n
soluie tampon acetat (acetat de amoniu 50 g/L, acetat de cupru
0,2 g/L, pH = 5,0) prezint maxime de absorbie la 270 nm.
n aceste condiii, se obine o bun separare a celor doi
compui (izoniazid i etambutol), cu rezultate foarte bune n
ceea ce privete parametrii de performan ai sistemului
(rezoluie, factor de simetrie).
Soluii standard
- se prepar dou soluii standard n solvent= ap /
metanol, 20 / 80 (v/v) coninnd fiecare o cantitate de 1 mg/mL
din fiecare component. Un volum de 5 mL din soluia astfel
obinut se dilueaz la 25 mL cu solvent. Se obine un amestec
cu o concentraie de 0,2 mg/mL pentru fiecare component n
parte.

18
Modul de lucru
S-a ales amestecul metanol / tampon acetat pH = 5,0 n
raport volumetric de 20/80, obinndu-se picuri simetrice (factor
de simetrie = 1,07 pentru izoniazid, respectiv 1,11 pentru
etambutol), conform figurii nr. 33.

Figura nr. 33. Cromatograma standard a soluiei continnd
izoniazid (HIN) 0,2 mg/mL;
Rt =4,08 0,03 min. etambutol (EMB) 0,2 mg/mL; Rt = 8,36
0,04 min, detecie la 270 nm; faz mobil: amestec metanol /
tampon acetat pH=5,0 (20 / 80, v/v), debit 1 mL/min.

Determinarea liniaritii: au fost preparate din soluia
standard de lucru o serie de 9 soluii coninnd isoniazid i
etambutol n domeniul de concentraie 5 - 300 g/mL. Fiecare
din aceste soluii au fost analizate de cte 3 ori, msurndu-se
aria picurilor corespunztoare. Valorile medii obinute prelucrate
prin regresie matematic conduce la obinerea dreptelor de
calibrare prezentate n figurile nr. 34 i 35 [96].

Figura nr. 34. Dreapta de calibrare pentru izoniazid.

19

Figura nr. 35. Dreapta de calibrare pentru etambutol.

Ecuaia dreptei ce calibrare pentru izoniazid este :Arie
pic = 19907,276 x concentraia 37562,94; coeficientul de
corelaie r = 0,9999,
Ecuaia dreptei ce calibrare pentru etambutol este :Arie
pic = 12213,79 x concentraia 28221,50; coeficientul de
corelaie r = 0,9982,
Avnd n vedere posibilitatea aplicrii metodei la
determinarea cantitativ a izoniazidei i a etambutolului i n
medii biologice, unde se afl n concentraii mici, am studiat mai
ales intervalul 5 - 100 g/mL.
Din datele statistice obinute se observ c pe domeniul
de concentraie studiat liniaritatea este foarte bun, valorile
coeficienilor de corelaie fiind mai mari de 0,9950.
calculate utiliznd rapotul semnal/zgomot de 3/1 pentru LOD i
10/1 pentru LOQ. Valorile calculate ale celor dou limite sunt:
lzoniazid -LOD = 0,05 g/mL, LOQ = 0,2 g/mL
Etambutol - LOD = 0,1 g/mL, LOQ = 0,5 g/mL.
Determinarea preciziei: s-au determinat precizia
sistemului, precizia metodei de analiz i precizia intermediar.
Pentru determinarea preciziei sistemului a fost analizat
de 6 ori o prob coninnd izoniazid, respectiv etambutol n
concentraie de 200 g/mL. Valorile experimentale obinute att
pentru izoniazid ct i pentru etambutol (RSD este 0,2%),
conduc la concluzia c sistemul de lucru este precis.
Pentru determinarea preciziei metodei au fost analizate
probe ntr-un domeniu de concentraie de 40% fa de
concentraia de interes ce are valoarea de 50 g/mL. Pentru
20
fiecare valoare a concentraiei au fost efectuate un numr de trei
determinri. Din valorile experimentale ale ariilor picurilor s-a
calculat concentraia probei utiliznd ecuaia dreptei de regresie.
Pentru precizia metodei, RSD = 0,61% iar pentru precizia
intermediar, RSD = 0,59% n cazul izoniazidei i RSD 0,55%
respectiv 1,08% pentru etambutol.
Acurateea (se refer la calitatea unui rezultat i este
distinctiv de precizie, care se refer la calitatea unei operaii
prin care se obine acel rezultat): au fost analizate probe ntr-un
domeniu de concentraie de 40% fa de concentraia de
interes. Pentru fiecare valoare a concentraiei au fost efectuate un
numr de trei determinri. Din valorile experimentale se
calculeaz concentraia probei utiliznd ecuaia dreptei de
regresie. Exactitatea metodei se exprim prin procentul de
regsire a cantitii de substan luat n studiu care are valoarea
medie 101,36% pentru izoniazid, respectiv 101,16% pentru
etambutol, domeniul de concentraii 20 - 80 g/mL.
n concluzie, metoda de analiz propus este liniar,
precis i exact, cu un mod simplu de lucru i rapid, putnd fi
aplicat la determinarea isoniazidei i etambutolului din diverse
tipuri de probe.
Metoda a fost aplicat la dozarea etambutolului din
comprimate de 250, respectiv 400 mg
Pentru prepararea probelor se determin masa medie
pentru un numr de 20 comprimate, dup care se mojareaz 10
comprimate. Se cntarete o cantitate de pulbere echivalent cu
50 mg etambutol n balon cotat de 50 mL i se adaug 30 mL
solvent (ap / metanol, 80 / 20, v/v). Se ultrasoneaz 15 minute,
se rcete soluia la temperatura camerei i apoi se aduce aduce
la semn cu solvent. Un volum de 5 mL din soluia astfel obinut
se aduce la 25 mL cu solvent. S-au preparat 6 astfel de soluii,
rezultatele calculate conform formulei:
/
100
APp mst Cst M
mg tablet
APst mp

=

unde: A
Pp
st
= masa standardului, AP
st =
aria picului de standard, Cst = concentraia standardului, M =
masa medie a comprimatelor de etambutol,m
p
= masa probei.
21
De asemenea, s-a studiat i stabilitatea probelor pstrate
la 4C, timp de 24 ore injectnd standarde preparate n aceeai zi
i inute la la 4C, timp de 24 ore.
Concluzii
- S-au preparat 6 astfel de soluii iar rezultatele au
confirmat faptul c regsirea este conform normelor n ambele
cazuri (folosind standarde preparate n aceeai zi i standarde
inute 24 de ore la 4
o
C).
doua zi este mai mic dect 2,0%. Considerm c soluiile prob
i standard sunt stabile la 4C, timp de 24 ore.
calitii i evaluarea produsului-etambutol comprimate coninnd
250, respectiv 400 mg.

Dozarea izoniazidei din comprimate de 100 mg i 300 mg

Se prepar dou soluii, standard 1 i standard 2, coninnd
fiecare cte 0,2 mg/mL izoniazid n solvent (ap / metanol, 80 / 20,
v/v).
Soluia standard 1 s-a injectat de 6 ori, iar soluia
standard 2 s-a injectat de trei ori. Se determin procentul de
regsire, conform formulei:
1 2
2 1
100
Std mst
PR
Std mst

unde: Std
1
Aria medie a picului de izoniazid rezultat din cele
6 injectri de soluiei standard 1; Std
2
Aria medie a picului de
izoniazid rezultat din cele 3 injectri de soluiei standard 2;
mst
1
masa standard 1; mst
2
masa standard 2.
Procentul de regsire pentru soluiile standard = 98,64%;
RSD (n=6) = 0,6%
Pentru prepararea probei se determin masa medie a
unui numr de 20 comprimate: din pulberea de comprimate se
cntrete o cantitate echivalent la 50 mg izoniazid, se aduce
cantitativ n balon cotat de 50 mL cu 30 mL solvent (ap /
metanol, 80 / 20, v/v); Dup ultrasonare timp de 15 minute
soluia se rcete la temperatura camerei i se aduce aduce la
22
semn cu sovent; un volum de 5 mL din soluia astfel obinut se
dilueaz la 25 mL cu solvent;
formulei:
/
10
P st st
st P
A m C M
mg tablet
A m

=

,
unde: A
P
st
= masa standardului, A
st =
aria
picului de standard,C
st
= concentraia standardului, M = masa
medie a comprimatelor de izoniazid, m
P
= masa probei.
Rezultate i discuii
Pentru cele 6 soluii preparate, rezultatele experimentale
obinute faptul c regsirea este conform normelor.
Concluzii
S-au preparat 6 astfel de soluii iar rezultatele prezentate
au confirmat faptul c regsirea este conform normelor n ambele
cazuri.
Metoda este valid i poate fi folosit n controlul calitii
i evaluarea produsului- izoniazid comprimate 100 i 300 mg.

Capitolul 7. Elaborarea unei metode de determinare a
izoniazidei, etambutolului i rifampicinei din amestec
prin HPLC.

Scop: avnd n vedere c exist forme farmaceutice
combinate ale celor trei chimioterapice majore, (utilizate cu
precdere n tipul II de tratament mpotriva tuberculozei), care
fac obiectul acestui studiu, ne-am propus elaborarea si validarea
unei metode simple i rapide HPLC care s poat fi aplicat att
pentru identificarea ct i determinarea cantitativ a lor din forme
farmaceutice, dar i din diverse medii biologice, n conformitate
cu ghidul ICH. [130].
Material si metod
Materiale: substane de referin: izoniazid, etambutol i
rifampicin conform Farmacopeei Europene [19], metanol de
puritate HPLC (Merck), acetat de amoniu, acetat de cupru
23
(Merck); acetonitril de puritate HPLC (Merck); acid oxalic
anhidru (Merck); ap MilliQ (rezistivitate 18,2 M/cm); acid
acetic glacial (Merck).
Soluii stoc standard coninnd isoniazid, etambutol,
respectiv rifampicin de concentraie 1 mg / mL n solvent.
Aparatur: HPLC Waters 2695 prevzut cu detector UV -
Waters 2489 cu temperatura compartimentului de termostatare a
probelor fixata la 4C; program de achiziie i prelucrare a
datelor Empower 2002 si balan analitic Mettler Toledo.
Condiii cromatografice:
- coloan cromatografic Luna 100-5 C18, 250 x 4,6 mm,
lot:5291-77 (Phenomenex);
- detecie n UV la lungimea de und de 270 nm pentru
izoniazid i etambutol i 320 nm pentru rifampicin. Softul
folosit pentru dezvoltarea acestei metode ne pemite schimbarea
lungimii de und n timpul analizei, ceea ce confer o procesare a
datelor mult mai facil.
- faza mobil A: metanol / tampon acetat pH=5,0 n
raport de 20 /80.
- faza mobil B - acetonitril / acid oxalic 0,01M 70/30;
- solvent = ap Milli Q/ MeOH = 80/20;
- debit 1 mL/min;
- volumul de soluie injectat 20 L;
- temperatura coloanei = 25C;
- temperatur probe = 4C;
Gradientul de concentraie:
Iniial, faza mobil A, a avut n compoziie metanol /
tampon acetat pH=5,0 n raport 30/70 (v/v) iar faza mobil B
acetonitril / acid oxalic 0,01M n raport de 80/20. Gradientul de
concentraie al fazei mobile este prezentat n tabelul nr. 57.
Tabelul nr. 57. Gradientul de concentraie al fazei mobile
Timpul
Debit
ml/min
% A % B
0 1,0 100 0
6,8 1,0 100 0
8,2 1,0 0 100
18 1,0 0 100
24
n aceste condiii, parametrii de performan ai
sistemului, pentru cei trei compui (izoniazid, etambutol i
rifampicin) sunt: factor de simetrie pentru izoniazid = 1,5;
pentru etambutol = 1,8; respectiv pentru rifampicin = 1,7;
rezoluia ntre picul izoniazidei i cel de etambutol = 8,3;
respectiv 15,7 ntre picul etambutolului i rifampicinei).

Figura nr. 41. Cromatograma solventului (metanol/ap, 20/80,
v/v)

Figura nr. 42. Cromatograma soluiei standard, coninnd
200g/mL din fiecare component (izoniazid, etambutol
respectiv rifampicin)

Avnd n vedere alura cromatogramei obinut prin
analizarea solventului (figura nr. 41), precum i a soluiei
standard (figura nr. 42), am continuat studiul acestei metode,
modificnd compoziia celor dou faze mobile, precum i
gradientul de concentraie.
S-au operat urmtoarele modificri:
25
- faza mobil A - metanol / tampon acetat pH = 5,0 n
raport de 20 /80.
- faza mobil B - acetonitril / acid oxalic 0,01M 70/30;
Faza mobil a avut urmtorul gradient de concentraie
(tabelul nr. 58).

Tabelul nr. 58. Gradientul de concentraie al fazei mobile
Timpul
Debit
mL/min
% A % B
0 1,0 100 0
6,5 1,0 100 0
15 1,0 50 50
22 1,0 0 100
Schimbarea lungimii de und de la 270 nm la 320 nm se
realizeaz n intervalul 9-9,1 min. n aceste condiii
cromatografice timpul de retenie al izoniazidei ~ 3,7 minute,
etambutolului ~ 8,1 minute i rifampicinei ~ 25,3 minute.

Figura nr. 43. Cromatograma soluiei standard, coninnd 200 g/mL
din fiecare component (izoniazid, etambutol respectiv rifampicin)

Dei timpul de retenie al rifampicinei s-a modificat (de la
15 minute la 25 minute), factorul de simetrie pentru cei trei
compui s-a modificat semnificativ, n special pentru etambutol,
de la 2,4 la 1,10. De asemenea, alura cromatogramei nu mai
prezint o modificare brusc a liniei de baz odat cu schimbarea
gradientului de concentraie i a lungimii de und.
Dup ce timpul de cromatografiere s-a scurs (30 min.),
sistemul necesit o echilibrare de 8 minute, pentru a se ajunge la
compoziia iniial a gradientul fazei mobile.
26
Se prepar dou soluii standard (standard 1 i standard
2), coninnd fiecare, o cantitate de 1 mg/mL din fiecare
component. Un volum de 5 mL din soluia astfel obinut se
dilueaz la 25 mL cu solvent. Se obine un amestec cu o
concentraie de 0,2 mg/mL pentru fiecare component n parte.
Se prepar 6 soluii prob, continnd fiecare soluie test
50 mg din fiecare component (izoniazid, etambutol si
rifampicin). Substanele se aduc n balon cotat de 50 mL, se
adaug 10 mL metanol i se ultrasoneaz 10 minute. Dup ce
soluiile s-au rcit la temperatura camerei, se aduc la semn cu ap
purificat. Din soluiile test-stoc se prepar soluii de
concentraie 0,2 mg/mL (5 mL soluie stoc se dilueaz la 25 mL
cu ap).
Rezultate
Liniaritatea metodei: s-au preparat o serie de soluii prin
diluii successive din soluiile standard stoc i s-au construit
curbele de calibrare pentru cele trei substane. S-au preparat 7
astfel de soluii de diferite concentratii din soluia standard de
lucru, fiecare injectandu-se de trei ori. In figura nr.44 sunt
prezentate croamtogramele amestecului pentru diferite
concentraii.

Figura nr. 44. Cromatogramele amestecului de izoniazid, etambutol i
rifampicin n cadrul studiului liniaritii.
27

Figura nr. 45. Curba de calibrare pentru studiul liniaritii izoniazidei,
date statistice prelucrate cu JMP 8.0.1 design experimental.

Figura nr. 37. Curba de calibrare pentru studiul liniaritii
etambutolului, date statistice prelucrate cu JMP 8.0.1 design
experimental

Figura nr. 46. Curba de calibrare pentru studiul liniaritii
rifampicinei, date statistice prelucrate cu JMP 8.0.1 design
experimental.

28
Ecuaia dreptei ce calibrare pentru izoniazid este:
Arie pic =19382,16 x concentraia -1817,19;coeficientul de
corelaie r = 0,9999, eroare standard a dreptei de regresie (SE)
= 2952,15;
Ecuaia dreptei de calibrare pentru rifampicin este :
Arie pic =11447,40 x concentraia2756,40; coeficientul de
corelaie r = 0,9999, eroare standard a dreptei de regresie (SE)
= 1982;
Ecuaia dreptei ce calibrare pentru etambutol este:
Arie pic =17753,70 x concentraia 250,09; coeficientul
de corelaie r > 0,9999, eroare standard a dreptei de regresie
(SE) = 293,60.
Precizia sistemului: pentru determinarea preciziei
sistemului a fost analizat de 6 ori o prob coninnd isoniazid,
etambutol i respectiv rifampicin n concentraie de 100
g/mL.Valorile experimentale obinute pentru cele trei
componente conduc la valori ale RSD ce atest o metod foarte
bun. Pentru izoniazid, RSD = 0,32%, pentru rifampicin, RSD
= 0,38% i pentru etambutol, RSD = 0,40%. n figurile nr. 47 i
48 sunt prezentate cromatogramele obinute dup injectarea
solventului, respectiv a soluiei standard, coninnd 200 g/mL
din fiecare component (izoniazida, etambutol respectiv
rifampicina).

Figura nr. 47. Cromatograma
obinut prin injectarea
solventului
Figura nr. 48. Cromatograma
soluiei standard, coninnd 200
g/mL din fiecare component
(izoniazid, etambutol respectiv
rifampicin)

Precizia metodei: au fost analizate probe ntr-un domeniu
de concentraie de 40% fa de concentraia de interes (50
29
g/mL). Pentru fiecare valoare a concentraiei au fost efectuate
un numr de trei determinri. Din valorile experimentale ale ariei
picurilor s-a calculat concentraia probei utiliznd ecuaia dreptei
de regresie. Precizia se exprim prin deviaia standard relativ
(RSD) a valorilor obinute. Au fost efectuate dou seturi de
determinri, n zile diferite, pentru a evalua i precizia
intermediar.
Conform datelor obinute, se observ c precizia metodei
este foarte bun (RSD% = 0,61 pentru isoniazid, RSD = 0,550
pentru etambutol i RSD% = 1,27 pentru rifamicin) ca i
precizia intermediar (RSD% = 0,5971 pentru isoniazid, RSD%
= 1,085 pentru etambutol i RSD% = 1,13 pentru rifamicin).
Acurateea: au fost analizate probe ntr-un domeniu de
concentraie de 40% fa de concentraia de interes. Pentru
fiecare valoare a concentraiei au fost efectuate un numr de trei
determinri. Din valorile experimentale ale absorbanei msurate
se calculeaz concentraia probei utiliznd ecuaia dreptei de
regresie. Exactitatea metodei se exprim prin procentul de
regsire a cantitii de substan luat n studiu. Regsirea medie
pentru izoniazid 101,1%, pentru rifampicin 100,75%, iar
pentru etambutol 101,3%.
calculate utiliznd raportul S/Z.
Valorile calculate ale celor dou limite sunt:
Isoniazid LOD = 0,03 g/mL, LOQ = 0,06 g/mL.
Rifampicin LOD = 0,04 g/mL, LOQ = 0,08 g/mL.
Etambutol LOD = 0,03 g/mL, LOQ = 0,08 g/mL
30

Figura nr. 49. Cromatograma soluiei de determinare a limitei de
cuantificare
Robusteea metodei: debitul poate fi variat ntre 0,85
1,13, iar pH-ul fazei mobile poate fi variat ntre 4,91 5,08,
astfel nct factorul de simetrie (pentru fiecare din cei trei
compui analizai) s se ncadreze n intervalul 0,9 2,5; deci,
metoda este robust la variaii mici a celor doi parametri (debit,
pH).
Concluzii
Tabelul nr. 71 Concluziile validrii metodei de testare
Parametru
Criteriu de
admisibilitate
Rezultate
pentru
izoniazid
Rezultate
pentru
etambutol
Rezultate
pentru
rifampicin
Domeniul -
De la
5.00
g/mL la
200
g/mL
De la
5.00
g/mL la
200
g/mL
De la 5.00
g/mL la
200 g/mL
Selectivitate
Cromatogramele
solventului i a
soluiei martor nu
prezint rspunsuri
care ar putea
interfera cu
determinarea
rifampicinei n
soluia de referin
conform conform conform
Precizia
sistemului
RSD (n = 6) 2,0%
RSD
(n = 6) =
0,32%
RSD
(n = 6)
= 0,38%
RSD
(n = 6)
= 0,40%
31
Precizia
metodei
Precizia
intermediar
RSD (n = 6) 2,0%

RSD (n = 6) 2,0%
0,17%

0,59%
0,55%

1,08%
1,27%

1,15%
Liniaritate R 0,995
R >
0,9999
R >
0,9999
R >0,9999
Limita de
detecie
Raportul semnal /
zgomot 3:1
RSD (n=9) 10%
0,03
g/mL
0,04
g/mL
0,03
g/mL
Limita de
cuantificare
Raportul semnal /
zgomot 10:1
RSD (n=9) 10%
0,06
g/mL
0,08
g/mL
0,08
g/mL

Capitolul 8. Aplicaiile metodelor HPLC pe forme
farmaceutice i diferite medii biologice

Aplicarea metodei de dozare a izoniazidei, etambutolului i
rifampicinei eliberate n testele de dizolvare ale comprimatelor
sau capsulelor

Monografia general pentru comprimate, precum i
monografiile specifice, prevd determinarea cantitativ a
substanei active eliberate dup dizolvarea comprimatelor.
Aplicarea metodei HPLC pentru determinarea procentului de
substan activ (eliberat dup dizolvarea comprimatelor)
prezint interes, deoarece la controlul produsului finit sau
intermediar, precum i n cadrul studiilor de stabilitate n general,
se verific mai muli parametri n acelai timp folosind aceeai
metod pentru determinarea cantitativ a substanei active i
testul de dizolvare a capsulelor, eficiena laboratorului poate fi
crescut.
Condiiile de lucru pentru efectuarea testului de dizolvare
n cazul comprimatelor cu izoniazid de 100 si 300 mg: mediul
de dizolvare HCl 0,1 M; volumul mediului de dizolvare de 1000
mL; temperatura mediului de dizolvare fixata la 37C 0,5C.
Aparat: USP nr. 2, palete cu viteza de rotatie a paletelor: 75 rpm
si cu timpul de dizolvare de 30 minute.
32
Pentru efectuarea testelor de dizolvare, n cazul
comprimatelor de 100 mg, respectiv 300 mg izoniazid, s-au
utilizat produse medicamentoase ale companiei Antibiotice S.A.
Limite de admisibilitate (USP 28): cel puin 80%
izoniazid dizolvat n 30 minute.
Modul de lucru: testul de dizolvare a fost efectuat att
pentru comprimate de 100 mg, precum i pentru comprimate de
300 mg, conform planului de testare USP [21]. Dup expirarea
celor 30 minute, din fiecare vas de dizolvare se preleveaz cte
10,0 mL soluie i se filtreaz prin membrane filtrante de
celuloz 0,45 m. n cazul comprimatelor de 100 mg soluia se
injecteaz nediluat (concentraia soluiei obinute 0,1 mg
izoniazid/mL). n cazul comprimatelor de 300 mg, 3 mL soluie
se dilueaz la 10,0 mL, n balon cotat, cu mediu de dizolvare,
cnd se obin soluii cu o concentraie de aproximativ 0,09 mg
izoniazid/mL, ceea ce corespunde concentraiei soluiei
standard.
Folosind metoda HPLC prezentat la capitolul 7, se obin
cromatogramele probelor din care se determin cantitatea de
izoniazid. n figura nr. 53 este prezentat cromatograma soluiei
continnd 0,1 mg izoniazid/mL n HCl 0,1M.

Figura nr. 53. Cromatograma soluiei 0,1 mg izoniazid/mL
n HCl 0,1M
Concluzii
izoniazid dizolvat n 30 minute, sunt indeplinite.
33
n cazul comprimatelor cu etambutol de 250 si 400 mg au fost
aceleai, ca i n cazul izoniazidei.
Modul de lucru: dup expirarea celor 30 minute, din
fiecare vas de dizolvare se preleveaz cte 10,0 mL soluie i se
filtreaz prin membrane filtrante de celuloz 0,45 m. n cazul
comprimatelor de 250 soluia se injecteaz nediluat
(concentraia soluiei obinute-0,25mg etambutol/mL). n cazul
comprimatelor de 400 mg, 5 mL soluie se dilueaz la 10,0 mL,
n balon cotat, cu mediu de dizolvare, cnd se obin soluii cu o
concentraie de aproximativ 0,2 mg etambutol /mL, ceea ce
corespunde concentraiei soluiei standard.
Folosind metoda HPLC prezentat la capitolul 7, se obin
cromatogramele probelor din care se determin cantitatea de
etambutol. n figura nr. 54 este prezentat cromatograma soluiei
coninnd 0,25 mg etambutol/mL n HCl 0,1M.

Figura nr. 54.Cromatograma soluiei 0,25 mg etambutol/mL n HCl
0,1M

Concluzii
Se constat c limita de admisibilitate (USP 28): cel puin
80% substan activ etambutol dizolvat n 30 minute, este
ndeplinit.
n cazul capsulelor cu rifampicina de 150 si 300 mg: mediul de
dizolvare HCl 0,1M; volumul mediului de dizolvare de 1000 mL
si cu temperatura mediului de dizolvare de 37C 0,5C. Aparat:
USP nr. 1, coulee cu viteza de rotaie a paletelor de 100 rpm.
Timpul de dizolvare este de 45 minute.
34
rifampicin n 45 minute.
Testul de dizolvare a fost efectuat att pentru capsule de
rifampicin de 150 mg, precum i pentru capsule de 300 mg,
conform planului de testare USP 28 [21]:
Pentru efectuarea testelor de dizolvare, n cazul
capsulelor de 150 mg, respectiv 300 mg rifampicin, s-au utilizat
produse medicamentoase ale companiei Antibiotice S.A.
capsulelor de 150 soluia se injecteaz nediluat (concentraia
soluiei obinute-0,15 mg rifampicin/mL). n cazul capsulelor de
300 mg, 5 mL soluie se dilueaz la 10,0 mL, n balon cotat, cu
mediu de dizolvare, cnd se obin soluii cu o concentraie de
aproximativ 0,15 mg rifampicin /mL, ceea ce corespunde
concentraiei soluiei standard. Se inregistreaz cromatogramele
probelor din care se determin cantitatea de rifampicin. n figura
nr. 55 este prezentat cromatograma soluiei continnd 0,15mg
rifampicina/mL n HCl 0,1M.

Figura nr. 55. Cromatograma soluiei 0,15 mg rifampicin/mL n HCl
0,1M

Concluzii
Se constat c limita de admisibilitate (USP 28) - cel
puin 75% rifampicin n 45 minute este ndeplinit.
35
Aplicarea metodei de dozare a izoniazidei, etambutolului i
rifampicinei din lichide biologice: Determinarea izoniazidei din
plasm de cobai

Studiul a fost realizat pe 10 subieci, cu greutate ntre 196
si 220 g.
Pentru c doza de izoniazid administrat oral este de 5
mg/kg, la un animal cu o greutate medie de 200 g s-a administrat
1 mg/animal.
Procedeul de lucru: dup administrare, nainte de
prelevarea probelor de snge, animalul a fost anesteziat cu eter
etilic. Dup prelevare, probele de snge (aproximativ 1,0 mL) au
fost centrifugate n tuburi de centrifug la 3000 rotaii/minut timp
de 10 minute. Din plasma rezultat se msoar 0,5 mL, se
trateaz cu 0,5 mL alcool izoamilic n scopul precipitrii
proteinelor plasmatice, apoi se centrifugheaz la 4000 rotaii/
minut timp de 10 minute i din supernatant se injecteaz volumul
prevzut de metod.
Soluia standard: S-au preparat dou soluii standard stoc
coninnd 1000 g izoniazid/mL n solvent (ap/metanol, 80/20
(v/v)).
S-au realizat soluiile standard 1 i soluia standard 2
(ambele 1,6 g/mL izoniazid).
Mod de lucru: inainte de efectuarea injectrilor, sistemul
a fost echilibrat 30 minute apoi s-a injectat soluia standard 1 (de
concentraie 1,6 g izoniazid/ mL) de 6 ori si soluia standard 2
o singur dat; s-a stabilit c sistemul este stabil iar parametrii
SST sunt ndeplinii (RSD pe 6 injectri = 1,6%) .
De asemenea, a fost evaluat regsirea standardelor dup
formula de mai jos (101,3%), care trebuie s se ncadreze n
intervalul 98-102%.
Rezultate: Prelevarea probelor de snge a fost realizat la
3 ore dup administrarea substanei de interes, iar la trei ore dup
administrare, s-au nregistrat concentraii ale izoniazidei n
plasma de cobai situate n intervalul 0,127 g/ mL 1, 074 g/
mL, cu o medie de 0,695 g/mL.

36
Determinarea cantitativ a celor trei tuberculostatice din lichid
pleural (LP)

S-au luat in studiu un numr de 19 pacieni, la care s-a
determinat Adenozin dezaminaza - ADA pleural - (s-au gsit
valori > 50 UI), pe baza creia s-a nceput tratametul
tuberculostatic. (Determinarea ADA-pleural, vezi cap.10).
Prelevrile de lichid pleural, ulterioare nceperii
chimioterapiei antituberculoase, au fost fcute n scop de
diagnostic i terapeutic, nu n scop tiinific.
Modul de lucru: probele de lichid pleural au fost
centrifugate n tuburi de centrifug la 3000 rotaii/minut timp de
10 minute, apoi 1,0 mL lichid pleural a fost tratat cu 1,0 mL
alcool izoamilic n scopul precipitrii proteinelor plasmatice iar
dupa centrifugare la 4000 rotaii/ minut timp de 10 minute se
injecteaz 10 L din supernatant.
S-au preparat dou soluii standard stoc coninnd 1000
g izoniazid/mL, 1000 g etambutol/mL, respectiv 1000 g
rifampicin/mL, din care, prin diluii succesive n solvent
(amestec ap / metanol = 80 / 20, v/v) se obin soluii standard de
concentraie 1,6 g/mL pentru fiecare component.
Mod de lucru: Inainte de efectuarea injectrilor (conform
metodei), sistemul a fost echilibrat 30 minute apoi s-a injectat
soluia standard 1 (de concentraie coninnd 1,6 g / mL din
fiecare component) de 6 ori si soluia standard 2 o singur dat.
Parametrii SST au fost ndeplinii, RSD (n = 6) = 1,9%,
Regsirea standardelor = 98,64%.
Rezultate: n tabelul nr. 80 sunt prezentate concentraiile
celor trei substane determinate din lichidul pleural.

Tabelul nr. 80. Concentraia n izoniazid, etambutol i rifampicin
(g/mL) din lichidul pleural
Nr.
Arie pic
HIN
g/ml
HIN
Arie pic
EMB
g/ml
EMB
Arie pic
RMP
g/ml
RMP
1 1230 0,181 2312 0,190 3568 1,293
2 2540 0,374 1564 0,128 2568 0,931
3 562 0,082 864 0,071 1684 0,610
37
4 1503 0,221 3561 0,293 4510 1,635
5 784 0,115 129 0,010 1023 0,370
6 864 0,012 532 0,043 864 0,313
7 1229 0,181 844 0,069 3684 1,335
8 2004 0,295 1642 0,135 4511 1,635
9 356 0,052 556 0,045 995 0,360
10 - - 443 0,036 563 0,204
11 1568 0,230 1242 0,102 4410 1,598
12 563 0,082 - - 564 0,204
13 1451 0,213 - - 333 0,120
14 325 0,047 899 0,074 4511 1,635
15 155 0,022 1056 0,087 1209 0,056
16 2645 0,389 1653 0,1361 - -
17 452 0,066 422 0,034 596 0,216
18 653 0,096 - - - -
19 2525 0,371 864 0,071 3331 1,207
M=0,159 M= 0,080 M=0,722

Concluzii: cele trei tuberculostatice strbat bariera
pleural, atingnd concentraii mai mici dect cele plasmatice.
Din figura nr. 56, se poate observa c rifampicina atinge
concentraii mult mai mari n lichidul pleural, n comparaie cu
celelalte produse medicamentoase. Metoda utilizat pentru
efectuarea acestor determinri se dovedete a fi facil i simpl.

Determinarea izoniazidei, etambutolului i a rifampicinei din ser
uman
Pentru acest studiu s-au prelevat probe de snge de la 6
pacieni diagnosticai cu tuberculoz. Dup diagnosticare s-a
instituit tratament tuberculostatic (izoniazid, rifampicin,
etambutol i pirazinamid, n regim 7/7) n urmtoarele doze:
300 mg izoniazid, 600 mg rifampicin i 1200 mg etambutol, la
aceeai or.
Modul de lucru: probele de snge au fost prelevate la 1h,
2h i 3h apoi au fost centrifugate la 3000 rotaii/minut timp de 10
minute. Un volum de 1,0 ml ser a fost tratat cu 1,0 mL alcool
izoamilic n scopul precipitrii proteinelor serice. Dupa
centrifugare la 4000 rotaii/ minut timp de 10 minute, din
supernatant s-au injectat 20 L.
Rezultate: n tabelul nr. 81 sunt consemnate
concentraiile celor trei substane determinate din serul uman.
38

Tabelul nr. 81. Concentraia n izoniazid, etambutol i rifampicin
(g/mL) n probele recoltate n timp de 1 la 3 ore
Nr.
crt.
Concentraia izoniazidei
(g / mL)
Concentraia
etambutolului
(g / mL)
Concentraia rifampicinei
(g / mL)
1 h 2h 3h 1 h 2h 3h 1 h 2h 3h
1 0,124 0,564 0,845 0,068 2,096 6,453 0,127 4,203 12,633
2 0,103 0,439 0,925 0,046 1,077 7,342 0,055 4,522 9,341
3 0,095 0,602 1,226 0,027 1,255 5,520 0,088 7,235 14,723
4 0,085 0,438 1,336 0,063 2,973 6,455 0,045 6,253 7,235
5 0,113 0,498 0,877 0,033 2,035 9,365 0,119 9,330 14,344
6 0,127 0,553 0,910 0,065 3,681 7,113 0,092 4,622 5,993

n concluzie, n cazul celor trei tuberculostatice, n toate
cele 6 probe analizate, se poate observa un trend ascendent al
concentraiilor celor trei substane active n timp.

Determinarea izoniazidei, etambutolului i a rifampicinei din
lapte matern

Studiul a fost efectuat pe probe de lapte matern prelevat
de la o persoan diagnosticat cu tuberculoz, la dou luni dup
ce a nscut.
Modul de lucru: probele de lapte au fost prelevate la 0h,
1h, 2h, 3h i 6h dup administrarea tratamentului antituberculos
(izoniazid, etambutol i rifampicin).
Prepararea soluiilor standard: din soluia stoc standard s-
a preparat soluia standard de lucru prin diluare. Se prepar dou
astfel de soluii. S-a injectat soluia standard 1 (coninnd 1,6
g/mL din fiecare component) de 6 ori si soluia standard 2
(coninnd 1,6 g/mL din fiecare component) o singur dat.
Prepararea probei: 4 mL lapte matern au fost mixai cu 1
mL acid tricloracetic 10%; se las n repaus 20 minute; se
centrifugheaz la 5500 rotaii/minut, timp de 15 minute. O prob
de 600 L supernatant se amestec cu 100 L soluie metanolic
1% de cianaldehid i se las n repaus 5 minute. n figura nr. 60
este redat cromatograma efectuat din laptele matern prelevat
dup 3 ore de la administarea medicaiei.
39

Figura nr. 60. Cromatograma soluiei prob (lapte matern) la 3h
dup administrarea tratamentului antituberculos.

Rezultate i discuii: concentraia n izoniazid i
rifampicin n laptele matern crete cu timpul scurs de la
administrare; etambutolul nu a fost identificat n probele de lapte
matern, acest lucru fiind prevzut i n literatura de specialitate
[6, 7].

Capitolul 9. Aplicarea metodei de dozare a izoniazidei,
etambutolului i rifampicinei n testele de stabilitate
ale comprimatelor i capsulelor

Metode de testare: Se testeaz acele caracteristici ale
produselor medicamentoase care se presupune c se pot modifica
n timpul depozitrii i care pot influena calitatea i sigurana
acestora. Procedeele de testare analitic trebuie s fie complet
validate, iar determinrile trebuie s ofere indicaii privind
stabilitatea [83,85,88].
Metodele de testare utilizate n studiul de stabilitate ale
capsulelor de rifampicin, comprimatelor de izoniazid i
comprimatelor de etambutol sunt prezentate n cele ce urmeaz:

Dizolvarea rifampicinei din capsule

S-a efectuat n conformitate cu procedura general de
efectuare a studiilor de dizolvare in vitro n urmtoarele condiii
de lucru: mediul de dizolvare HCl 0,1M; volumul mediului de
40
dizolvare de 1000 ml si temperatura de 37C 0,5C. Aparat:
USP nr. 1, coulee, cu viteza de rotaie a paletelor de 100 rpm
timp de 45 minute.
rifampicin n 45 minute.
capsulelor de 150 soluia soluia prob se injecteaz nediluat
(concentraia soluiei obinute - 0,15 mg rifampicin/mL). n
cazul capsulelor de 300 mg, 5 mL soluie se dilueaz la 10,0 mL,
concentraie de aproximativ 0,15 mg rifampicin/mL, ceea ce

Determinarea cantitativ a rifampicinei din capsule

S-a realizat prin metoda HPLC, prezentat n capitolul 7.
Dizolvarea izoniazidei din comprimatede 100 mg, respectiv 300
mg
Studiile de dizolvare in vitro ale comprimatelor de
izoniazid de 100 mg, respectiv 300 mg s-au efectuat n
condiiile de lucru de mai sus.
izoniazid dizolvat n 30 minute.
Testul de dizolvare a fost efectuat, n aceleai condiii,
att pentru comprimate de 100 mg, precum i pentru comprimate
de 300 mg.
Mod de lucru: dup expirarea celor 30 minute, din fiecare
vas de dizolvare se preleveaz cte 10,0 mL solutie i se filtreaz
prin membrane filtrante de celuloz 0,45 m. n cazul
comprimatelor de 100 mg soluia se injecteaz nediluat
(concentraia soluiei obinute 0,1 mg izoniazid/mL). n cazul
comprimatelor de 300 mg, 3 mL soluie se dilueaz la 10,0 mL,
concentraie de aproximativ 0,09 mg izoniazid/mL, ceea ce
41
Se obin cromatogramele probelor din care se determin
cantitatea de izoniazid.

Determinarea cantitativ a izoniazidei din comprimate de 100
mg, respectiv 300 mg

S-a realizat prin metoda HPLC, n aceleai condiii
cromatografice care au fost prezentate in cazul etambutolului.

Dizolvarea etambutolului din comprimate de 250 mg respectiv 400
mg

Mediul de dizolvare HCl 0,1M; volumul mediului de
dizolvare: 1000 mL la temperatura de 37C 0,5C. Aparat:
USP nr. 2, palete cu viteza de rotaie a paletelor de 75 rpm timp
de 30 minute.
etambutol dizolvat n 30 minute.
Dup expirarea celor 30 minute, din fiecare vas de
dizolvare se preleveaz cte 10,0 mL soluie i se filtreaz prin
membrane filtrante de celuloz 0,45 m. n cazul comprimatelor
de 250 soluia se injecteaz nediluat (concentraia soluiei
obinute - 0,25mg etambutol/mL). n cazul comprimatelor de 400
mg, 5 mL soluie se dilueaz la 10,0 mL, n balon cotat, cu mediu
de dizolvare, cnd se obin soluii cu o concentraie de
aproximativ 0,2 mg etambutol /mL, ceea ce corespunde
concentraiei soluiei standard.
Rezultate:
Studiile de stabilitate pentru produsele rifampicin 150
mg capsule, respectiv rifampicin 300 mg capsule, izoniazid
100 mg, respectiv 300 mg i etambutol 250 mg, respectiv 400
mg, s-au efectuat pn la termenul de 6 luni, n trei condiii de
pstrare prevzute de ghidurile ICH [83-88].
Rezultatele obinute sunt cuprinse n tabele.
Cromatogramele obinute n cazul celor trei condiii de pstrare,
pentru cele trei substane, sunt prezentate n figurile: 62 73.
42

Figura nr. 62. Cromatogramele de
dozare, izoniazid comprimate 100 mg
3 luni
6 luni
3 luni
6 luni
dozare, etambutol comprimate 250
mg 3 luni
mg 6 luni
43
mg 3 luni
mg 6 luni

dozare, rifampicin capsule 150 mg
3 luni
dozare, rifampicin capsule 150
mg 6 luni
dozare, rifampicin capsule 300 mg
3 luni
dozare, rifampicin capsule 300
mg 6 luni
Legend: --- 40C/75%UR ; --- 30C/65%UR ; --- 25C/60%UR

44
Concluzii
Studiile de stabilitate pentru cele tuberculostatice au fost
efectuate pe cte un lot din: (rifampicin capsule de 150 mg,
respectiv 300 mg, izoniazid comprimate de 100 mg respectiv
300 mg i etambutol comprimate 250 mg respectiv 400 mg);
S-au efectuat pn la termenul de ase luni, n trei condiii
de pstrare prevzute de ghidurile ICH, testate n condiii
accelerate (40C/ 70%UR), intermediare (30C/65%UR), i
testare pe termen lung (25C/60%UR).
Interpretarea rezultatelor obinute pentru rifampicin
- procentul de rifampicin dizolvat din forma
farmaceutic se ncadreaz n limitele prevzute de specificaia
de calitate (cel puin 75% rifampicin dizolvat n 45 minute),
dizolvarea s-a meninut practic constant de-a lungul celor ase
luni de studiu n cazul probelor pstrate la 30C/65%UR i
25C/60%UR, dar a sczut n condiii accelerate 40C/70%UR.
Aceast scdere este corelat cu scderea coninutului de
substan activ a capsulelor de rifampicin.
- n urma determinrii cantitative, substana activ din
capsule de rifampicin s-a meninut constant n interval de 6
luni n cazul probelor pstrate la 30C/65%UR i 25C/60%UR,
dar a sczut n condiii accelerate 40C/70%UR. Scderea
substanei active la probele pstrate n condiii accelerate se
datoreaz descompunerii rifampicinei la efectul temperaturii i
umiditii ridicate.

Capitolul 10. Metode enzimatice de determinare a
adenozin-dezaminazei (ADA)

Adenozin-dezaminaza (ADA) este o enzim care
catalizeaz transformarea adenozinei n inozin.
Pentru evaluarea intensitii activitii ADA n ser, lichid
pleural, lichid de ascit sau lichid pericardic, a fost pus la punct
o metod simpl i rapid, spectrofotometric, permind
evaluarea activitii ADA prin determinarea cantitii de amoniac
eliberat prin dezaminarea adenozinei.
45
Determinarea cantitativ a acestei enzime permite un
diagnostic rapid i diferenial al revrsatelor pleurale. Avnd n
vedere c efectuarea punciei pleurale i prelevarea de lichid
pleural s-a facut numai n scop diagnostic i terapeutic, dozarea
ADA a permis o transabilitate mult mai facil de urmrit i de
identificat probele de lichid pleural de la pacienii care au primit
tratament tuberculostatic n urma efecturii testul ADA, a crui
principiu i mod de lucru sunt descrise n cele ce urmeaz.
Principiul metodei: Adenozina n prezena adenozin-
dezaminazei (ADA) i a apei, trece n inozin i amoniac.
Amoniacul rezultat n cantitate echivalent cu ADA se determin
spectrofotometric n urma reaciei cu fenolul si hipocloritul de
sodiu n mediu alcalin, catalizator fiind nitroprusiatul de sodiu,
cnd rezult indofenol ce prezint absorbie maxim la 628 nm.
Ecuaiile reaciilor chimice care au loc sunt urmtoarele:
( 1 ) ADENOZIN + H
2
O ----ADA----> INOZIN + NH
3

( 2 ) NH
3
+ OCl
-
+ 2 C
6
H
5
-OH ----HO
-
----> INDOFENOL
Reacia catalizat de ADA este oprit la sfritul
perioadei de incubare prin adiia de fenol-nitroprusiat.
n scopul de a diferenia revrsatele pleurale serocitrine
am efectuat un studiu pe un lot de 86 de pacieni cu diagnosticul
de revrsat pleural.
Dintre cei 86 de pacieni, 71 au fost brbai i 15 femei
(deci raportul ntre sexe a fost de aproximativ 4B/1F), cu vrste
cuprinse ntre 13-72 ani.
Condiii optime de msurare
adenozin 20 mM;
tampon fosfat, pH = 6,2 - 6,8;
spectrofotometru UV-VIS Spekord;
baie de ap la 37
0
C.
Reactivi necesari
-Fosfat diacid de sodiu (NaH
2
PO
4
H
2
O);
-Fosfat monoacid de sodiu (Na
2
HPO
4
12H
2
O);
-Adenozin;
-Fenol;
-Nitroprusiat de sodiu (Na
2
[FeNO(CN)
5
] H
2
O);
-Hipoclorit de sodiu (NaClO soluie);
46
-Hidroxid de sodiu (NaOH soluie 1N);
-Sulfat de amoniu ((NH
4
)
2
SO
4
);

Soluii
-Ap distilat far amoniu;
-Soluia I: Tampon fosfat 50 mM, pH = 6,5:
-Soluia II: Soluie de adenozin n tampon fosfat 50mM ( >
1mM adenozin, 50 mM fosfat, pH = 6,5:
-Soluia III: Soluie stoc de sulfat de amoniu 15 mM:
-Solutia IV: soluie standard de sulfat de amoniu 75 mM:
-Solutia V: Soluie fenol/nitroprusiat (106 mM fenol; 0,17 mM
nitroprusiat de sodiu):
-Soluia VI: soluie alcalin de hipoclorit de sodiu (11mM
NaClO; 125 mM NaOH):
Toate soluiile se pastreaz la temperatura de 4
0
C;
soluiile I, III, IV si V se pastreaz n sticle de culoare brun;
soluiile I, III, IV, V si VI sunt stabile cel puin 2 luni; soluia de
adenozin trebuie proaspt preparat;
Procedeu de lucru: Absorbana se masoar la lungimea de
und 628 nm, n cuv de 1cm. Volum de incubare 1,05 mL.
Temperatura 37
0
C. Volum final 7,05 mL. Absorbana se masoar
fa de ap. De asemenea, se prepar un blank pentru reactivi.
Ordinea adugrii reactivilor este prezentat n tabelul nr. 105.

Tabelul nr. 105. Ordinea adaugrii reactivilor
Nr Se pipeteaz succesiv
Martor
(mL)
Standard
(mL)
Proba
blank
(mL)
Proba
(mL)
1. Tampon fosfat (soluia I) 1 - - -
2.
Adenozin n soluie tampon
(soluia II)
- - 1 1
3.
Soluie sulfat de amoniu
standard
(soluia IV)
- 1 - -
4. LP - - - 0,05
5. Ap distilat 0,05 0,05 - -

Se amestec i se acoper tuburile cu parafilm. Se
incubeaz 60 de minute la temperatura 37
0
C, n baie de ap.

47
Nr Se pipeteaz succesiv
Martor
(mL)
Standard
(mL)
Proba
blank
(mL)
Proba
(mL)
6.
Fenol/nitroprusiat
(soluie V)
3 3 3 3
7. LP - - 0,05 -
8.
Soluie alcalin de hipoclorit
(soluie VI)
3 3 3 3

Se adaug soluiile V i VI n ordinea dat i se amestec
coninutul tubului nainte de a pipeta tubul urmtor.
Se incubeaz pentru 30 de minute, la 37
0
C n baie de ap;
se masoar extincia fa de ap distilat, n cuv de 1 cm, la
lungimea de und de 628 nm.
Valoarea activitii ADA se calculeaz dup formula:
(Ep Ep blank / E standard E martor) x 50;
unde: E
P
= extincie prob,E
P blank
= extincie prob blank; E
standard

= extincie standard; E
M reactivi
= extincie martor-reactiv.
Valorile normale:17,05 3,75 UI/L ser la 37C.
Rezultate: Diagnosticul de revrsat pleural a fost pus pe
baza urmtoarelor criterii:
- manifestari clinice (durere pleuretic, dispnee, tuse)
-examen radiologic (evideniaz lichidul prezent n cavitatea
pleural).
Pentru diagnosticul etiologic al acestor revrsate pleurale
au fost necesare investigaii de laborator suplimentare ca [101,
108, 115]:
-puncia lichidului pleural urmat de examenul
macroscopic i microscopic al lichidului;
- cultura lichidului pleural; cultura sputei; biopsie
pleural toracoscopie.
Acestea au condus la urmtoarele rezultate: pleureziile
tuberculoase: 33 cazuri; peurezii neoplazice: 29 cazuri;
mezoteliom pleural malign: 4 cazuri; pleurezii parapneumonice:
7 cazuri; empieme: 5 cazuri; transudate: 6 cazuri; pleurezii de
etiologie divers 2 cazuri.
Discuii: dac lum n considerare o valoare a ADA
pleurale mai mare de 50 UI/L, sensibilitatea, specificitatea,
predicia pozitiv, predicia negativ i eficiena acestui test n
48
diagnosticul tuberculozei sunt de: 92%, 98%,97%, 94% i
respectiv 95%.
Valorile obinute n acest studiu sunt asemntoare celor
citate n literatur.
Folosirea acestui test nu trebuie s exclud ns utilizarea
celorlalte teste uzuale folosite n diagnosticul etiologic al
revrsatelor pleurale. Testul de determinare a
adenozindezaminazei ar trebui folosit nu ca o alternativ pentru
culturi si biopsii, ci ca un test ajuttor care s permit punerea
unui diagnostic de certitudine, rapid i hotrrea unui tratament
precoce.
Testul de determinare al ADA pleurale este util n
diagnosticul diferenial al revrsatelor pleurale, i mai ales al
pleureziilor TB de cele neoplazice. Este important, de asemenea,
pentru identificarea pleureziilor tuberculoase.

CONCLUZII GENERALE

Lucrarea de doctorat intitulat Cercetarea analitic a
unor tuberculostatice majoreeste structurat n dou pri:
- Partea teoretic a lucrrii cuprinde dou capitole, n
capitolul 1 fiind prezentate o serie de aspecte generale asupra
chimioterapicelor antituberculoase cum ar fi: clasificarea
acestora, date referitoare la aciunea farmacologic a
tuberculostaticelor majore, eficacitatea i indicaii.
- n capitolul 2 al prii teoretice, am trecut n revist o
serie de proprieti fizico-chimice i farmacologice ale
chimioterapicelor antituberculoase: izoniazida, etambutolul i
rifampicina.
- n capitolul 3 se prezint date teoretice privind
metodologia de lucru: tehnici de analiz, noiuni de validare i
reglementri privind studiile de stabilitate.
Partea personal a lucrrii este structurat, la rndul su,
n apte capitole.
Se prezint elaborarea i validarea metodei analitice de
determinare prin HPLC a urmelor de rifampicin, aplicabil n
procesul de validare a igienizrii, verificnd parametrii:
49
selectivitate, precizie, liniaritate i domeniu, limita de detecie,
limita de cuantificare i testul de regsire. n urma efecturii
analizelor i a evalurii rezultatelor, putem declara c toate
criteriile de admisibilitate urmrite au fost ndeplinite, validarea
se consider corespunztoare, iar metoda de testare adecvat
pentru scopul propus. Metoda analitic este destul de rapid, are
limita de detecie i de cuantificare mic, mult sub limita de
admisibilitate stabilit pentru reziduurile de rifampicin care pot
rmne pe suprafeele de lucru.
Parametrii obinui n urma validrii sunt: domeniul de liniaritate
0,04 100 g/mL; coeficientul de corelaie r = 0,9999; limita de
detecie 0,04 g/mL; limita de cuantificare 0,15g/mL; precizia
sistemului: RSD = 0,96%; exactitatea metodei: regsire medie =
89,85%;
Prelucrarea probelor este simpl, nu necesit aparatur
sau tehnici de lucru complicate. Prin urmare metoda se preteaz
pentru detectarea i cuantificarea urmelor de rifampicin rmase
pe suprafeele utilajelor de producie dup igienizare, i prelevate
de pe aceste suprafee cu ajutorul tampoanelor. Astfel, metoda
analitic validat a fost folosit n procesul de validare a
igienizrii n industria farmaceutic i sticlrie de laborator.
Am elaborat i validat o metod HPLC de dozare a
izoniazidei i rifampicinei din materie prim, obinnd
urmtoarele rezultate: pentru izoniazid: liniaritatea pe domeniul
5 100 g/mL;
coeficientul de corelaie r = 0,9999; limita de detecie 0,6
g/mL; limita de cuantificare 1,9 g/mL; precizia sistemului:
RSD = 1,1259%; precizia metodei: RSD = 1,18%; precizia
intermediar: RSD = 1,80%; exactitatea metodei: regsire medie
= 102,66%; pentru rifampicin: coeficientul de corelaie r =
0,9998; limita de detecie 2,2 g/mL; limita de cuantificare 6,7
g/mL; precizia sistemului: RSD = 0,16%; precizia metodei RSD
= 1,01%; precizia intermediar RSD = 1,07%; exactitatea
metodei: regsire medie = 100,51%.
Considerm c validarea este corespunztoare, astfel:
conformitatea sistemului cromatografic este corespunztoare
pentru metoda aleas, precizia metodei este corespunztoare,
50
cromatogramele fazei mobile, ale solventului i ale soluiei
placebo nu prezint rspunsuri care ar putea interfera cu
determinarea izoniazidei i rifampicinei din soluia standard, deci
metoda se poate considera selectiv, soluiile prob i standard
sunt stabile la 4C, timp de 24 ore, un timp suficient pentru
automatizarea metodei n cazul n care se lucreaz cu un numr
foarte mare de probe.
Metoda a fost aplicat pentru determinarea cantitativ a
izoniazidei din comprimate i a rifampicinei din capsule.
Am dezvoltat i validat o metod HPLC de
determinare a izonizidei i etambutolului din materie prim.
Pentru separarea i determinarea cantitativ a
etambutolului cu detecie n UV, s-a complexat etambutolul cu
ionii de Cu
2+
adugai n faza mobil (sub form de acetat de
cupru), complex stabil cu absoarana maxim la 270 nm.
Cromatograma realizat pentru cei doi compui prezint picuri
simetrice cu o rezoluie foarte bun, timp de cromatografiere
relativ scurt.
Parametrii de validare sunt: pentru izoniazid: liniaritatea
metodei pe domeniul 5 - 300 g/mL; coeficientul de corelaie r >
0,995; limita de detecie 0,05 g/mL; limita de cuantificare 0,2
g/mL; precizia sistemului: RSD = 0,24%; precizia metodei:
RSD = 0,61%; precizia intermediar: RSD = 0,59%; exactitatea
metodei: regsire medie = 101,36%; pentru etambutol:
coeficientul de corelaie r > 0,995; limita de detecie 0,1 g/mL;
limita de cuantificare 0,5 g/mL; precizia sistemului: RSD =
0,22%; precizia metodei RSD = 0,55%; precizia intermediar
RSD = 1,08%; exactitatea metodei: regsire medie = 101,16%.
Studiul parametrilor de validare a dus la concluzia c
metoda este corespunztoare, i a fost aplicat la determinarea
celor doi compui din forme farmaceutice orale, izoniazid i
etambutol comprimate.
Am elaborat i validat o metod HPLC, de determinare
din amestec a izoniazidei, etambutolului i rifampicinei, utiliznd
eluia fazei mobile n gradient, i complexarea etambutolului cu
ionii cuprici.
51
S-au obinut picuri simetrice n cazul celor trei substane
(izoniazid, etambutol respectiv rifampicin) iar pentru rezoluia
dintre picul de izoniazid i etambutol, precum i rezoluia dintre
etambutol i rifampicin s-au obinut valori foarte bune.
n urma efecturii analizelor i validrii metodei am
obinut urmtoarele rezultate: pentru izoniazid: liniaritatea pe
domeniul 5 - 200 g/mL; coeficientul de corelaie r > 0,999;
limita de detecie 0,03 g/mL; limita de cuantificare 0,06 g/mL;
precizia sistemului: RSD = 0,17%; precizia metodei: RSD =
0,58%; precizia intermediar: RSD = 1,08%; exactitatea metodei:
regsire medie = 100,10%; pentru etambutol: liniaritatea pe
domeniul 5 - 200 g/mL; coeficientul de corelaie r > 0,999;
limita de detecie 0,04 g/mL; limita de cuantificare 0,08g/mL;
precizia sistemului: RSD = 0,38%;
precizia metodei: RSD = 0,55%; precizia intermediar: RSD =
1,08%; exactitatea metodei: regsire medie = 100,75%; pentru
rifampicin: liniaritatea pe domeniul 5 - 200 g/mL;
coeficientul de corelaie r > 0,999; limita de detecie 0,03 g/mL;
limita de cuantificare 0,08 g/mL; precizia sistemului: RSD =
0,40%; precizia metodei: RSD = 1,27%; precizia intermediar:
RSD = 1,15%; exactitatea metodei: regsire medie = 100,66%.
Metoda a fost utilizat pentru determinarea izoniazidei,
etambutolului i rifampicinei din forme farmaceutice, lichide
biologice (plam cobai, lichid pleural, ser uman, lapte matern).
Metoda a fost aplicat n testele de stabilitate pentru
comprimatele de izoniazid (100 mg i 300 mg), etambutol (250
mg i 400 mg) i pentru capsulele de rifampicin (150 mg i 300
mg).
Studiile de stabilitate efectuate pe o perioad de ase
luni, n trei condiii climatice diferite, conform ghidurilor ICH,
au demonstrat sensibilitatea substanei active la efectul
temperaturii i umiditii ridicate (40C / 75% U.R.) i
stabilitatea probelor n condiii de pstrare normale (25C / 60%
U.R.) i intermediare (30C / 65% U.R.), astfel se preconizeaz
c pentru depozitarea produsului, condiiile normale vor fi
corespunztoare.
52
Studiul de stabilitate dovedete faptul c metoda analitic
aleas este adecvat pentru scopul propus.
Metoda a fost, de asemenea, aplicat n teste de
dizolvare ale comprimatelor de izoniazid (100 mg i 300 mg),
etambutol (250 mg i 400 mg) i ale capsulelor de rifampicin
(150 mg i 300 mg).
Studiul dovedete faptul c metoda analitic aleas este
adecvat pentru scopul propus.
Rezultatele obinute, vin s confirme faptul c
metodele elaborate sunt exacte, precise, ndeplinind toate rigorile
procesului de validare analitic.
Am pus la punct o metod de determinare a ADA, o
enzim ce prezint valori semnificativ crescute n procesele
tuberculoase, indiferent de localizare. Dozarea acestei enzime din
lichid pleural permite un diagnostic diferenial rapid al
revrsatelor pleurale. Posibilitatea efecturii acestui test
biochimic, conduce la instituirea tratamentului tuberculostatic
imediat dup efectuarea testului, ceea ce a fost de mare ajutor n
selectarea probelor de lichid pleural.
Testul de determinare al ADA pleurale este util n
diagnosticul diferenial al revrsatelor pleurale, i mai ales al
pleureziilor TB de cele neoplazice. Este important, de asemenea,
pentru identificarea pleureziilor tuberculoase.
n elaborarea prezentei lucrri, am utilizat o bibliografie
divers, selectnd din multitudinea datelor din literatura de
specialitate un numr redus de referine (n numr de 137), i
anume doar pe cele considerate semnificative scopului propus n
prezenta lucrare i anume elaboarea, validarea i aplicarea n
practica analitic a unor metode de determinare cantitativ pentru
unele medicamente tuberculostatice majore.

PERSPECTIVE DE CERCETARE

folosirea metodelor HPLC instituite i validate pentru:
- determinarea tuberculostaticelor luate n studiu att din
produse farmaceutice ct mai ales
53
- din lichide biologice ( snge, ser, plasma, lichide pleurale
etc);
aplicarea metodei HPLC pentru rifampicin n detecia
urmelor de rifampicin n procesul de igienizare a utilajelor din
industria farmaceutic;
folosirea metodei HPLC pentru separarea i
determinarea cantitativ a rifampicinei, izoniazidei i
etambutolului n testele de stabilitate a comprimatelor i
capsulelor;
aplicarea metodei spectrofotometrice pentru dozarea
adenozin dezaminazei (ADA) n laboratoarele de biochimie.

BIBLIOGRAFIE SELECTIV
(se pstreaz numerotarea din tez)

5. Liteanu C., Gocan S.,Cromatografia de lichide cu gradieni,
Ed.Tehnic Buc.1976, 62-115;
6. Crofton J. Horne N., Miller F. Tuberculoza, Tehnopres S.A. Iai
1992, 3-45;
12. Green J.M. A practical guide to analytical method validation. Anal.
Chem. News & Features, 305A/309A, 1996;
14. Dobrescu D.: Farmacoterapie practic, Ed. Medical, Bucureti;
1989, vol. I: 11-55;
15. Stroescu V.: Bazele farmacologice ale practicii medicale, ed. a
VII-a, Ed. Medical, Bucureti; 2001, 1194-1239;
17. Smith R.V. Stewart J. T., Textbook of Biopharmacetical Analysis,
A Description of Methos for the Determination of Drugs in
Biological Fluids, Philadelphia 1981, 186;
18. Topliss J.G. et al.: Natural and synthetic substances related to
human health (IUPAC Technical Report), IUPAC; 2002,
74(10): 1957-1959;
20.
*

*

*
- Farmacopea Romn, ed. a X-a, Ed. Medical, Bucureti
1993;
21.
*

*

*
- United States Pharmacopoeia 28 ed., Maryland 2005;
22.
*

*

*
- The Pharmaceutical Codex: Principles and Practice of
Pharmaceutics, 12th Ed., The Pharmaceutical Press, London,
1994: 729-731; 733-739;
54
24.
*

*

*
- European Pharmacopoeia 5 ed., 4. Supplement, Strassbourg;
2005;
25. Boji M., Roman L., Sndulescu R., Oprean R.: Analiza i
controlul medicamentelor, Ed. lntelcredo, Deva; 2003;
27.
*

*

*
- Analytical Profiles of Drug Substances, Ed. Academic
Press, 1977, vol.5, 467 514;
28.
*

*

*
Press, 1977, vol.6, 183 258;
29.
*

*

*
Press, 1977, vol.7, 231 251;
30.
*

*

*
- FDA/CBER: Guideline for determination of residual
moisture in dried biological products, January 1990;
38. Horvth Cs., High performance liquid chromatography, advances
and perspectives, Academic Pres, New York, 1980;
40. Storey D.E.: The Role of dissolution testing in the design of
immediate release dosage forms. Drug Informational Journal,
Vol. 30: 1039-1 044, 1996;
43. Lukas G.: Critical manufacturing parameters influencing
dissolution. Drug Informational Journal, 1996, 30,1091-1104;
44.
*

*

*
- FDA-CDER: Dissolution testing of immediate release solid
oral dosage forms, August 1997;
45.
*

*

*
- FDA-CDER SUPAC-IR: Immediate-release solid oral
dosage forms. Scale-up and post-approval changes: chemistry,
manufacturing and controls, in vitro dissolution testing, and in
vivo bioequivalence documentation, November 1995;
46.
*

*

*
- CPMP: Note for guidance on the investigation of
bloavailability and bioequivalence.
CPMP/EWP/QWP/1401/98, London 2001;
47. FIP/AAPS Guidelines to Dissolution/in Vitro Release Testing of
Novel/Special Dosage Forms. AAPS Pharm Sci Tech 2003, 4
(1) Article 7;
48. Klein S.: Dissolution testing in the 21 th century 2. Calibration of
dissolution equipment and troubleshooting, Farmacia, 2006, 54
(2), 3-12;
51. LeBlanc D.A.: Establishing scientifically justified acceptance
criteria for cleaning validation of finished drug products,
Pharmaceutical Tehnology, 1998; 22 (10): 136-148;
55
52. LeBlanc D.A., Dispelling cleaning validation myths: Part I,
Pharmaceutical Tehnology Europe, 2005; 17 (11) 30-34;
53. LeBlanc D.A., Dispelling cleaning validation myths: Part II,
Pharmaceutical Technology Europe, 2005; 17 (12), 45-47;
54.
*

*

*
- FDA: Guide to inspection of Validation of Cleaning
Process, Rockville, USA, Office of Regulatory Affairs, 1993;
56.
*

*

*
- FDA, Inspection guide: Cleaning Validation, Rockville,
USA, Mid- Atlantic Region, 1993;
57. Smith J., Selecting analytical methods to detect residues of
cleaning agents in validated process systems, Pharmaceutical
Tehnology, 1993, 17 (6), 88-98;
58. Kirsch RB.,Validation of analytical methods used in
pharmaceutical cleaning assesment and validation, Analytical
Validation in the Pharmaceutical Industry, 1998, 40-46;
59. Chudzik G.M., General guide to recovery studies using swab
sampling methods for cleaning validation, Journal of
Validation Tehnology, 1998, 5 (1), 77-81;
60. Cooper D.W., Using swabs for cleaning validation, Institute for
Validation Technology, Royal Palm Beach, 1997, 74-89;
61. Yang P., Burson K. et al.: Swab sampling for cleaning validation,
Pharmaceutical Technology, January 2005; 86-94;
62.
*

*

*
- ICH Guideline, Validation of Analytical Procedures:
Methodology, Recommended for Adoption of Step 4 of the
ICH Process on 6 November 1996 by the ICH Steering
Committee;
63.
*

*

*
- Text on Validation of Analytical Procedures Recommended
for Adoption of Step 4 of the ICH Process on 27 October 1994
by the ICH Steering Committee;
64.
*

*

*
- ICH Harmonized Tripartite Guideline, Validation of
Analytical Procedures, Text and Methodology, Q2(R1),
November 2005;
65.
*

*

*
- Analytical Procedures and Methods Validation, Fed.Reg. 65
(169), 52,776-52,777, 30 August 2000;
66. Roman L., Boji M., Sndulescu R., Validarea metodelor de
analiz i control. Bazele teoretice i practice, Ed. Medical,
Bucureti; 1998;
56
67. Shabir G.A., HPLC method development and validation for
pharmaceutical analysis, Pharmaceutical Technology Europe,
2004, 16, 37-49;
70. Boudreau S.P. et al., Method Validation by Phase of Development,
Pharmaceutical Technology, November 2004, 54-66;
71. Brown R. et al., Analytical procedures and method validation:
Highlights of the FDAs draft guidance, LCGC, 2001, 19, 74-
79;
73. Swartz M.E., Krull I., Analytical Method Validation, Accuracy in
Quantitation, LCGC North America, January 2005; 23(1), 46-
52;
74. Thompson M. et al., Harmonized Guidelines for Single Laboratory
Validation of Methods of Analysis, IUPAC Pure Appl. Chem.,
2002, 74(5), 835- 855;
76. Swartz E.M., Kwh I., Method Validation and Robustness, LCGC
North America, May 2006, 24(5), 480-490;
77. Raghunandan Yendapally and Richard E. Lee, Design, synthesis,
and evaluation of novel ethambutol analogues, Bioorganic &
Medicinal Chemistry Letters 18 (2008), 1607-1611;
78. Faugeroux V., Gnjsson Y, SalmaY,Baltasa P. M., Synthesis and
biological evaluation of conformationally constrained
analogues of the antitubercular agent ethambutol, Bioorganic
& Medicinal Chemistry 2007, 15, 5866-5876;
80. Hemant Bhutani, Saranj it Singh, * K. C. Jindal Asit K.
Chakraborti C, Mechanistic explanation to the catalysis by
pyrazinamide and ethambutol of reaction between rifampicin
and isoniazid in anti-TB FDCs, J. Pharm. Biomed. Anal.,
2005, 39, 892-899;
81. Calleri E, Furlanetto S., Validation of RP-LC method for the
simultaneous determination of isoniazid, pyrazinamide and
rifampicin in a pharmacetical formulation, J. Pharm. Biomed
Anal., 2002, 29, 1089-1096;
83.
*

*

*
- ICH Q1A (R2) sau preluat CPMP/ICH/2736/99, Stability
Testing of New Drug Substances and Products;
84.
*

*

*
- ICH Q1B sau CPMP/ICH/279/95, Photostability Testing;
85.
*

*

*
- ICH Q1 C sau CPMP/ICH/280/95, Stability Testing for New
Dosage Forms;
57
86.
*

*

*
- ICH Q1 D sau CPMP/ICH/41 04/00, Bracketing and
Matrixing Designs for Stability testing of Drug Substances and
Drug Products;
87.
*

*

*
- ICH QI E sau CPMP/ICH/420/02, Evaluation of Stability
Data;
88.
*

*

*
- ICH QI F sau CPMP/ICH/421/02, Stability data Package for
Registration in Climatic Zones III and IV;
90.
*

*

*
- ICH Q6A sau CPMP/ICH/367/96: Specifications -
Chemical Substances with its Decision Tree;
91. Swartz M., Krull I., Setting Specifications, LCGC North America,
June 2004, 22(6), 536-542;
94. Pyzdek T., The six sigma handbook, revised and expanded, Mc
Graw Hill, USA, 2006, 492-533;
96.
*

*

*
- JMP Design of experiments, Release 6.0.1, 2005, SAS
Institute Inc., Cary, NC, USA;
98. Yuwono M., Indryanto G., Validation of Chromatographic method
of analysis. In: Harry G. Brittain, Profiles of Drug Substances,
Excipients, and Related Methodology, Academic Press,
Elsevier, 2005, vol. 32, 143-149;
100. Chenevier P., Massias L, Gueylard D.,Farmotti R., Determination
of ethambutol in plasma by high-performance liquid
chromatography after pre-column derivatization Journal of
Chromatography B, 1998, 708, 310-315;
102. Gupta V. K., Prasad R., Kumar A., Preparation of ethambutol-
copper(II) complex and fabrication of PVC based membrane
potentiometric, Talanta 2003, 60 , 149-160;
106. Piaras M.A., Sakis. C., Brudoni M., Adenosine deaminase activity
in pleural effusions. An aid to differential diagnosis, Br. Med.
J., 1978, 2, 1751;
108. Riantawan M.D., Chaowalit P., Diagnosis Value of Pleural Fluid
Adenosine Deaminase in Tuberculous Pleuritis with Reference
to HIV Coinfection and a Bayesian Analysis, Chest,1999, 116,
97-103;
109. Salazar L.M.A., Cuadra, C.J., Quiroz, R.H. et al., Adenosine
deaminase / lymphocyte correlation in pleural liquid of
tuberculosis, Revista Institutului Naional de Boli Respiratorii,
1997, 10 ( 3 ), 160-163;
58
111. Seibert, A.F., Haznes J., Middleton, R., Tuberculous pleural
effusion.Twenty years experience, Chest, 1995, 99, 883;
113. Ungerer J.P., Oosthuizen H.M., Bissbort, S.H. et al., Serum
adenosine deaminase: isoenzymes and diagnostic application,
Clinical Chemistry, 1992, 38, 1322-1326;
114. Ungerer J.P., Oosthuizen H.M., Retief J.H., Significance of
adenosine deaminase activity and its isoenzymes in
tuberculous effusions, Chest, 1994, 106, 33-37;
117. Villegas M.V., Labrada LA., Saravia N.G., Evaluation of
Adenosine Deaminase and Interferon in Pleural Fluid for
the Differential Diagnosis of Pleural Tuberculosis, Chest,
2000, 118, 1355-1364;
118. Grbule D., pac A. F., Dorneanu V., Determinarea izoniazidei
i rifampicinei prin HPLC. Validarea metodei, Clujul Medical,
2009, 82 (3), 429-432;
119. Grbule D., Validation of analytical method used for detection
of rifampicin traces, Revista de Medicin i Farmacie, Tg.
Mure, 2009, 55, 350-353;
120. Grbule D., Dorneanu V., Development of a HPLC method for
the determination of isoniazide in rat plasma, Buletin of
University of Agricultural sciences and veterinary medicine
Cluj-Napoca, 2009, 66 (1), 373-377;
123. Gray V.A.: Challenges to the dissolution test including equipment
calibration. Pharmaceutical Technology, February 2006;
http://www.pharmtech.com/pharmtech/article/articleDetail
.jsp?id=309313;
127. Krause S.0.: Tools for Ensuring a Validation Continuum,
BioPharm International, October 2005,
http://www.biopharminternational
.com/biopharm/article/articleDetail .jsp?id=187658;
128 Lukulay P.: Automation of the Chromatographic Analytical
Method Validation Process, LCGC North America, February
2006, http://www.lcgcmag.com/lcgc/article/articleDetall
.jsp?id=302244;
129. Grbule D, Dorneanu V. Determination of the isoniazid and
ethambutol by HPLC. Validation of method , Revista de
Medicin i Farmacie, Tg. Mure, n curs de publicare;
131. Grbule D, Tomooiu A., Determination of T (half-lives)
plasmatic of HIN, a possible distinction method of the patients
that present secondary effects at the therapy with
59
tuberculostatics, European Respiratoty Journal, 2005, Vol. 26.
Supplement 49, Abstract no: [2722] Session Info: Poster
Session: Clinical, diagnostic and therapeutic situations in
adulthood and childhood in TB;
135. Grondahl T., Langmoen I.: Epileptogenic effect of antibiotic
drugs, J. Neurosurg. 1993; 78: 938-943;
136. Daniela Grbule, A.F.Spac, V.Dorneanu Date comparative
privind dou metode de determinare prin HPLC a izoniazidei-
Rev.Med.Chir.Soc.Med.Nat. Iai, 2009, vol.113, nr.4, 1285-
1288.

60
LISTA LUCRRILOR PUBLICATE DIN TEZA DE
DOCTORAT

1. Daniela Grbule - Validation of analytical method used for
detection of rifampicin traces, Revista de Medicin i
Farmacie, Tg. Mure, vol 55, pag. 350-353, 2009
2. Daniela Grbule, Adrian pac, Vasile Dorneanu -
Determinarea izoniazidei i rifampicinei prin HPLC.
Validarea metodei, Clujul Medical, Vol 82/Nr.3/2009, Pag
429-432
3. Daniela Grbule, Vasile Dorneanu - Development of a
HPLC method for the determination of isoniazide in rat
plasma, Buletin of University of Agricultural sciences and
veterinary medicine Cluj-Napoca, Vol. 66(1), Pag. 373-377,
2009
4. Daniela Grbule, Vasile Dorneanu - Determination of the
isoniazid and ethambutol by HPLC. Analytical performance
of the method, Revista de Medicin i Farmacie, Tg. Mure,
Vol. 55, pag. 350-353, 2009
5. Grbule D, pac A, Dorneanu V. - Date comparative privind
dou metode de determinare prin HPLC a izoniazidei, Rev.
Med. Chir. Soc. Med. Nat., Iai, Vol. 113, nr. 4, pag. 1285-
1288, 2010;
6. Daniela Grbule, A. Tomooiu - Determination of T (half-
lives) plasmatic of HIN, a possible distinction method of the
patients that present secondary effects at the therapy with
tuberculostatics, European Respiratoty Journal, Vol. 26.
Supplement 49 Abstract no: [2722] Date: September 19,
2005, Session Info: Poster Session: Clinical, diagnostic and
therapeutic situations in adulthood and childhood in TB
7. Gheorghe D, Iacobovici A., Tomooiu A. - The diagnosis
value of the ADA isoenzymes activity in tuberculosis,
European Respiratory Journal; European Respiratoty Journal,
Vol. 22. Supplement 45 Abstract no: [1009] Date: Monday,
September 28, 2003; Session Info: Poster Session: Clinic
feature in tuberculosis diagnostic and therapeutic situations in
adulthood and childhood in TB
61
8. Gheorghe D, Cernat R. - Increased specificity for diagnosis
of tuberculosis pleuritis through combined ADA with
lymphocyte/ neutrophil ratio, European Respiratory Journal;
Vol. 18. Supplement 49 Abstract no: [3590] Date:
September 17, 2005
Session Info: Poster Discussion and oral presentation:
Diagnostic methods in tuberculosis, 2002;
62
CURRICULUM VITAE

Nume i prenume: GRBULE DANIELA

DATE PERSONALE
Data i locul naterii: IAI, 15.03.1971
Domiciliul: Trgu Mure, Judeul Mure, strada Banat nr. 12/14
E-mail: dgheorghes@yahoo.com
Naionalitatea: romn
Limbi strine cunoscute: englez

STUDII / PREGTIRE PROFESIONAL
Preuniversitare
- absolvent a Liceului Mihai Eminescu, Iai, promoia 1989
- absolvent a colii postliceale sanitare Iai, promoia 1994
Universitare
- absolvent a Facultii de Chimie, Universitatea Al. I. Cuza,
Iai iulie 1998; Lucrarea de licen: Fore intra i extra
moleculare;
Postuniversitare
- Studii de masterat Studiul i controlul medicamentului,
Universitatea de Medicin i Farmacie Iuliu Haiganu Cluj-
Napoca, promoia 2008;
- 2001-2009, doctorand Facultatea de Farmacie, catedra de
chimie analitic, Universitatea de Medicin i Farmacie Gr. T.
Popa, Iai;

EVOLUIA PROFESIONAL
1995 - 1998, asistent medical Clinica de pneumologie Iai;
1998 - 2000, asistent medical Centrul de diagnostic,Clinica de
pneumologie Iai;
2000 - 2006, chimist, laboratorul de biochimie Clinica de
pneumologie Iai;
2006 noiembrie 2009, chimist analist, departamentul controlul
calitii, Sandoz SRL, Trgu Mure;
Noiembrie 2009 i n prezent, ef laborator fizico - chimic,
Sandoz SRL, Trgu Mure;
63

SPECIALIZRI I CALIFICRI

- Stagiu de pregtire n departamentul de pneumologie Clinica
Middelheim, Anwerpen - Belgia 1999;
- Curs de cromatografie de lichide de nalt performan,
Bucureti 2006;
- Curs de Gaz Cromatografie, Trgu Mure 2009;
- Curs de management i eficien n laborator, Barcelona 2009;
- Curs de leadership Tirgu Mures 2009;

ACTIVITATEA TIINIFIC

Principalele direcii ale activitii tiinifice i de cercetare au
fost:
- Rolul ADA n diagnosticul diferenial al revrsatelor pleurale;
-Elaborarea i dezvoltarea unor metode HPLC de determinare
cantitativ a izoniazidei, etambutolului i rifampicinei din forme
farmaceutice orale i medii biologice;

Activitatea tiinific este concretizat n:

Prezentri orale:
1. Rolul ADA n diagnosticul diferenial al revrsatelor
pulmonare, Conferia Inspiriai, Iai 2000;
2. Increased specificity for diagnosis of tuberculosis pleuritis
through combined ADA with lymphocyte/ neutrophil ratio ,
prezentare oral, 12
th
Congress European Respiratory Society
Stockolm 2002;
3. Dozarea izoniazidei din forme farmaceutice orale prin HPLC.
Validarea metodei, A 2-a Conferina a doctoranzilor Trgu
Mure, 2009;
4. Determinarea urmelor de rifampicin din tampoane. Validarea
igienizrii A 2-a Conferina a doctoranzilor Trgu Mure, 2009;
5. Development of a HPLC method for the determination of
isoniazide in rat plasma; 8
th
Prospects for the 3
RD
Millenium
Agriculture, octombrie 2009;
64

Participri la manifestari stiinifice naionale i
internaionale:
- Congresul de biologie molecular, Iai 2000;
- Sesiunea de comunicari stiintifice, Valoarea indicanului urinar
in afectiuni pulmonare, Facultatea de chimie, Iasi 2001;
- 12
th
Congress European Respiratory Society, Increased
specificity for diagnosis of tuberculosis pleuritis through
combined ADA with lymphocyte/ neutrophil ratio, Stockolm
2002;
- edina USSM Roman, ADA, Considerii generale, februarie
2002;
- Sedina USSM Iasi, Aportul ADA in diagnosticul pleureziilor,
martie 2003;
- 13
th
Congress European Respiratory Society, The diagnosis
value of the ADA isoenzymes activity in tuberculosis, Viena
2003;
- 14
th
Congress European Respiratory Society, Glasgow 2004;
- 15
th
Congress European Respiratory Society, Determination of
T (half-lives) plasmatic of HIN, a possible distinction method
of the patients that present secondary effects at the therapy with
tuberculostatics, Copenhaga 2005;
- Al- XIII- Congres de Farmacie Cluj-Napoca septembrie 2006;
Conferina doctoranzilor, Tg Mure, 2009;

Articole publicate n rezumat:
1. Determination of T (half-lives) plasmatic of HIN, a possible
distinction method of the patients that present secondary effects
at the therapy with tuberculostatics European Respiratory
Journal;
2. Increased specificity for diagnosis of tuberculosis pleuritis
through combined ADA with lymphocyte/ neutrophil ratio,
European Respiratory Journal;
3. The diagnosis value of the ADA isoenzymes activity in
tuberculosis, European Respiratory Journal;

65
Articole publicate integral ca prim autor:
1. Validation of analytical method used for detection of
rifampicin traces, Revista de Medicin i Farmacie, Tg. Mure
2. Determinarea izoniazidei i rifampicinei prin HPLC. Validarea
metodei, Clujul Medical ;
3. Development of a HPLC method for the determination of
isoniazide in rat plasma; Buletin of University of Agricultural
sciences and veterinary medicine Cluj-Napoca;
4. Determination of the isoniazid and ethambutol by HPLC.
Analytical performance of the method; Revista de Medicin i
Farmacie, Tg. Mure;
5. Date comparative privind dou metode de determinare prin
HPLC a izoniazidei, Revista Medico-Chirurgical Iai, 2010;

Rezumat D.gheorghes

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Rezumat D.gheorghes

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Universitatea de Medicin i Farmacie Gr. T.

C, timp de 24 ore injectnd standarde preparate n aceeai zi

S-ar putea să vă placă și