Metode cromatografice - privire de ansamblu

Analiza chimic cromatografic este un domeniu mai recent al analizei

instrumentale care include mai multe metode de separare i totodat de analiz a
componenilor amestecului din prob. n toate variantele, separarea precede
analiza i se realizeaz prin repetarea, de un numr mare de ori, a echilibrului de
distribuie ntre dou faze. Una dintre faze este imobil i poart denumirea de
faz staionar (aflat de regul ntr-un tub numit coloan) iar cealalt - faza
mobil - aflat n micare, se deplaseaz prin golurile primei faze. Separarea se
petrece n coloana cromatografic, piesa cheie a ntregii metode. Faza mobil,
denumit i eluent - scurgndu-se continuu (deci cu vitez constant) prin
interstiiile fazei staionare, adeseori poroase, poate provoca migrarea, cu viteze
diferite, a celor n componeni ai amestecului de separat de-a lungul coloanei.
Amestecul supus separrii se introduce sub form de soluie la nceputul
coloanei, folosindu-se un dispozitiv de introducere a probei (de exemplu o
microsering), i se afl iniial fixat ntr-o zon ngust de la nceputul coloanei.
Splai de eluent, o parte din componenii probei migreaz apoi prin coloan cu
viteze diferite. Acest lucru se datoreaz interaciunilor fizice specifice, dintre
moleculele probei i faza staionar (desigur, nu orice molecul poate migra pe
orice faz staionar). Efectul, este numit retenie i aceasta provoac o aa-
numit migrare difereniat. Adic moleculele migreaz n grupuri, n fiecare
grup existnd doar molecule de acelai fel. Aceasta face posibil sesizarea
componenilor, pe rnd, la prsirea coloanei, de ctre un instrument, n
grupurile respective - denumite uneori zone. Instrumentul amintit este un
analizor fizico-chimic, sensibil la mai muli (n mod ideal la oricare) dintre
componeni ce ies din coloan i care este plasat n eluent, imediat dup ieirea
din coloan. Acest analizor, denumit detector este capabil s dea un semnal
proporional cu masa sau cu concentraia soluiei de component n faza mobil.
n consecin, dispozitivul, "marcheaz" trecerea fiecreia din substanele ce
formeaz iniial proba, similar cu o fotocelul care nregistreaz trecerea
concurenilor la sosire n atletism. Reprezentarea grafic a semnalului
detectorului n funcie de timp poart numele de cromatogram.


Clasificarea tehnicilor cromatografice

S-au imaginat i realizat numeroase variante ale metodei cromatografice,
diferind unele de altele n primul rnd prin natura fazei mobile, dar i a celei
staionare. Astfel se distinge cromatografia de lichide (LC) cnd faza mobil
este un lichid, cromatografia de gaze (GC) cnd aceasta este un gaz sau
cromatografia cu fluide supracritice la care faza mobil este un lichid aflat
peste temperatura critic. n cadrul cromatografiei de lichide se mai face
distincie ntre cromatografia pe coloan deschis i cea pe coloan nchis Pe
de alt parte, n cadrul fiecreia dintre acestea, distingem mai multe variante.
n cadrul LC se disting, n funcie de mecanismele de separare:
Cromatografia de adsorbie, una dintre primele tehnici utilizate, veche de mai
bine un secol (vet, 1903), utilizat pentru separarea substanelor organice cu
molecule de dimensiuni mici i medii pe adsorbeni, ca silicagel i alumin,
folosindu-se, ca faze mobile, diferite amestecuri de solveni organici.
Cromatografia ionic (de schimb ionic), care se petrece pe o faz staionar
solid, poroas, format din materiale specifice - schimbtorii de ioni -
substane cu o reea solid afnat, de natur organic sau anorganic, pe care se
gsesc grefate, prin procesul de obinere, nite centre de schimb ionic. Cele mai
rspndite sunt rinile schimbtoare de ioni - organice - la care scheletul-
suport este unul organic - un polimer poros. Pe aceste centre are loc o reacie
ionic sau o interaciune ntre substana din soluie (electrolit sau neelectrolit) i
funciunea legat chimic de suportul solid, numit reacie de schimb ionic.
Cromatografia de excluziune steric se desfoar pe faze staionare poroase
dar cu porozitatea selecionat astfel nct s corespund dimensiunilor
moleculelor supuse separrii. O parte dintre molecule intr prin pori, reuind s
interacioneze cu suportul solid, prin fore de adsorbie foarte slabe, iar altele
sunt excluse deplasndu-se practic nereinute odat cu faza mobil. Se obine
astfel un soi de sit la scar molecular separarea moleculelor fcndu-se n
funcie de dimensiune. Tehnica se mai ntlnete i sub denumirea de filtrare
prin geluri sau permeaie prin geluri n funcie de natura apoas sau organic a
fazei mobile.
Cromatografia lichid-lichid (LLC), n care faza staionar este o faz lichid,
nemiscibil cu cea mobil i imobilizat pe un suport solid, ntr-o coloan. Aici
suportul solid este, cel puin principial, inert fa de componentele din prob.
ntruct simpla impregnare a unui suport poros cu un lichid permitea splarea
acestuia n timp, s-a recurs la legarea pe cale chimic a acestora de suport,
obinndu-se nite faze cu totul specifice - faze staionare legate chimic.
Molecule organice de dimensiuni mici sunt, prin sintez, legate de suportul
poros, fenomenul de pierdere prin splare de ctre faza mobil, fiind practic
anulat. Acest tehnic este cea mai rspndit devenind aproape sinonim cu
cromatografia de lichide.
Cromatografia pe coloan deschis sau cromatografia planar (PC), se
refer la un grup de tehnici nrudite cu cele din LC, care au toate n comun
faptul c faza mobil circul printr-un material poros dispus ntr-un plan i
formnd un strat relativ subire, dar de compoziie asemntoare cu cele
menionate la cromatografia pe coloan. Se disting: Cromatogafia pe hrtie,
tehnic n care faza staionar este o hrtie poroas din celuloz (iniial o hrtie
de filtru) care este irigat de solvent prin fore capilare - o tehnic, azi, de
importn istoric.
Cromatografia pe strat subire (TLC), n care faza staionar pulverulent este
fixat de suportul plan (sticl, aluminiu, material plastic) cu un liant, formnd
un strat subire (0.1- 0.5mm) de asemenea irigat prin capilaritate.
Cromatografia pe strat subire de nalt performan (HPTLC), n care faza
staionar are granulaie extrem de fin ridicndu-se astfel eficiena separrilor
dar i viteza acestora.
Toate acestea se caracterizeaz prin simplitate, accesibilitate i pre de
cost cobort, dar totodat prin performane ceva mai slabe dect cromatografia
de lichide pe coloan sub presiune ridicat (HPLC) varianta modern a LC.
n mod analog, n cazul cromatografiei de gaze (sau mai pretenios
cromatografiei n faz gazoas), denumit prescurtat GC se disting urmtoarele
tehnici:
Cromatografia gaz-lichid n care faza staionar este un lichid nevolatil
imobilizat pe un suport solid. Aici suportul poate fi unul granular, poros, situat
ntr-o coloan n aa-numita cromatografie de gaze convenional sau chiar pe
pereii coloanei, confecionat de dimensiuni capilare, n cromatografia pe
coloan capilar.
Cromatografia gaz-solid este analog cu cele discutate la cromatografia de
adsorbie i la cea de excluziune steric cu deosebirea c schimbarea gazului nu
modific selectivitatea. Faza staionar o constituie tot silicagelul sau alumina,
respectiv sitele moleculare (nite silicai naturali sau sintetici) respectiv
granulele de carbon poros. Metoda este extrem de important pentru separarea
gazelor permanente (CO, CO2, O2, N2, gaze nobile etc.). Din punct de vedere
istoric, evoluia cromatografiei a cunoscut o suit de progrese, care au adus-o
din situaia iniial de metod de separare i purificare de laborator la o tehnic
de separare i analiz chimic cu o arie de aplicare aproape universal. Iniial
rusul vet, a introdus n 1903 cromatografia de lichide pe coloan (LC).
Aceast metod a fost uitat mult vreme i abia dup 1930, anul descoperirii
cromatografiei n strat subire pe alumin, s-a perfecionat metoda utiliznd
coloana, o dat cu nevoile de separare i purificare a compuilor organici
naturali sau sintetici implicai n biochimie. n 1941 enlezii Martin i Synge
descoper cromatografia de repartiie pe hrtie, reuind s separe cu ajutorul
unui amestec de solveni care irig o band de hrtie de filtru (coninnd o
pictur de prob) aproape toi aminoacizii, descoperire extrem de important
pentru dezvoltarea ulterior a biochimiei. Doar n 1952 aceiai A. J. P. Martin
and R. L. M. Synge [102] au nlocuit faza mobil lichid cu un gaz, realiznd
pentru prima oar cromatografia de repartiie gaz-lichid. n aceast variant,
detecia a fost realizat fizico-chimic, n efluentul gazos, dup ieirea din
coloan, reuind astfel s mbunteasc marcant separrile. Din acest moment
asistm la demarajul extraordinar al acestor tehnici, devenite azi cteva din
principalele mijloace de analiz n chimia organic i biochimie, dar i n
criminalistic, igien, controlul alimentelor, industria metalurgic etc. Din 1968
Halazs, (profesor la Franckfurt/Main), a pus la punct LC folosind un solvent sub
presiune n calitate de faz mobil i detecie fizico-chimic n efluentul lichid,
acesta fiind nceputul dezvoltrii cromatografiei de lichide sub presiune nalt
(200 atm). Din 1980 s-a reuit i obinerea unor separri analitice performante
bazate pe schimb ionic prin introducerea eluenilor diluai i a supresorului
ionic - datorate americanilor Hamisch i Schmall, tehnic care de atunci a primit
denumirea de cromatografie ionic (IC). Azi se lucreaz nu numai cu
cromatografe de laborator, analitice, ci i cromatografe de proces, dedicate
analizelor automate ale proceselor industriale sau cromatografe preparative,
destinate obinerii de substane pure n industria farmaceutic sau n
biotehnologii.