Analiza proceselor de fermentatie

Procesul de cretere a microorganismelor pe medii de cultur, cu scopul de a biosintetiza

diveri produi, poarta denumirea de fermentaie.
Procesul de cretere a microorganismelor reprezint rezultatul interaciunii dintre celula
individual i mediul de cultur. Aplicarea legilor termodinamicii, cineticii i ale transferului de
masa, impuls i energie demonstreaz c mediul de cultur, prin compoziie, temperatura,
presiune i concentraii de substrat limitativ, afecteaz direct creterea microorganismelor i
performana elaborrii produselor utile.
Microorganismele sunt nzestrate genetic cu un mecanism care regleaz producerea
metaboliilor, la un nivel care s le satisfac propriile necesiti. Evident, dorina specialitilor este
s obin, prin modificri genetice, o tulpin care s produc n exces un anumit compus necesar
omului, compus care s poat fi separat, purificat i comercializat.
Procesul de baza din tehnologiile de biosinteza este un proces biologic (de fermentaie),
transpus la scara industriala, ceea ce a fcut ca el sa aparin unui nou domeniu, cel al ingineriei
biochimice, domeniu care studiaz procesele de fermentaie aerobe i anaerobe i elaboreaz
tehnologiile pentru obinerea antibioticelor, vitaminelor, hormonilor, alcoolilor, proteinelor, a
produselor destinate agriculturii, culturilor de celule, fabricarea brnzeturilor prin fermentaia laptelui,
fabricarea berii i a vinului.
Pentru fermentaia alcoolic se utilizeaz diferite specii de drojdii specifice substratului
folosit. Astfel, pentru fermentaia hexozelor se utilizeaz Saccharomyces cerevisiae, iar pentru
pentoze sau lactoz Kluyveromyces fragilis i Candida sp. n condiii optime, dup aproximativ
120 de ore s-a obinut o concentraie a alcoolului etilic n mediu de 11,5 %. Cu tulpini selecionate
de drojdie, dup luni de fermentaie pot fi atinse concentraii duble.
Agenii tipici ai fermentaiei alcoolice sunt drojdiile genului Saccharomyces care pot sa
produc prin fermentarea glucidelor mai mult de 8 alcool etilic.
Drojdiile sunt microorganisme eucariote unicelulare saprofite sau parazite, din clasa
ascomicetelor, utilizate n industria fermentativ, n industria de biosintez, n scopul obinerii
proteinelor furajere. Cele mai multe specii sunt folosite pentru obinerea alcoolului etilic, berii,
vinului, pinii, enzimelor i a numeroaselor altor preparate alimentare.
Fermentaia alcoolic este un proces ntlnit la numeroase microorganisme, dar care
produc prin fermentare cantiti mai reduse de alcool etilic comparativ cu drojdiile. Astfel mai pot
produce alcool etilic bacteriile: Bacillus macerans, CI. acetonaetilicus, Zymomonas dar ele nu
sunt considerate ageni tipici .
Pentru a putea fi folosite n practica drojdiile genului Saccharomyces sunt studiate si
selecionate n funcie de unele proprieti care le recomand pentru utilizarea industrial, cum
ar fi: puterea alcooligen; alcoolorezistena; capacitatea de floculare i pulverulenta;
osmotoleranta; frigofilia; caracterul killer.
Fermentaia alcoolic n condiii industriale folosete substraturi naturale bogate n zahar
fermentescibil, iar viteza de fermentare i transformare a glucidelor n produi primari i
secundari este dependent de numeroi factori care pot fi mprii n dou mari categorii:
factori biologici, dependeni de microagenii fermentrii, i factori fizico-chimici, dependeni
de compoziia mediului supus fermentrii i condiiile mediului ambiant.
1. Selecia i caracterizarea tulpinilor de microorganisme utilizate n fermentaia
alcoolic
1.1. Caracterizarea drojdiilor din genul Saccharomyces
n vederea utilizrii n practic a drojdiilor genului Saccharomyces acestea au fost
caracterizate i selecionate n funcie de unele proprieti care le recomand utilizrii lor pe scar
industrial.
Puterea alcooligen. Aceast proprietate se refer la concentraia mare de alcool care se
poate acumula cnd n mediu exist un exces de zahr. Drojdiile sunt sensibile la creterea
concentraiei n alcool. Spre deosebire de drojdiile cu putere alcooligen slab din genul Kloeckera,
Torulopsis, care sunt inhibate la o concentraie alcoolic de 4-6
o
, drojdiile din genul Saccharomyces
(Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus, Saccharomyces cerevisiae - cerevisiae) au o putere
alcooligen mare i continu fermentaia pn se acumuleaz 16-18
o
alcool.
Alcoolorezistena. Reprezint capacitatea drojdiei de a continua fermentaia la o cretere a
concentraiei de alcool i de a porni fermentaia n prezena a 8% alcool.
Sulfitorezistena. Este definit ca fiind capacitatea drojdiilor de vin, respectiv a drojdiilor din
genul Saccharomyces, de a produce fermentaia alcoolic o proprietate important a acestora care n
prezena unor concentraii de 200-5000 mg SO
2
dm
-3
pot influena negativ activitatea altor drojdii
din must neadaptate (peliculare sau oxidative) ca urmare a scderii potenialului de oxidoreducere.
Putem presupune c rezistena la SO
2
se datoreaz i capacitii drojdiilor din genul
Saccharomyces de aexcreta aldehid acetic ce poate lega SO
2
care astfel i poate reduce efectul
levuristatic.
Capacitatea de floculare i pulverulena. Aceste proprieti se datoreaz structurii
peretelui celular i a modificrii de pH i rH din timpul fermentaiei. Drojdiile floculante
formeaz asociaii ce se depun mai uor, n timp ce drojdiile pulverulente se menin mai mult
timp n suspensie i produc o fermentaie mai avansat. Astfel, pentru drojdiile de ampanie s-
a urmrit ca acestea s se depun uor n gtul sticlei, iar prin operaia de degorjare s se
separeu sedimentul, obinndu-se o ampanie limpede.
Osmotolerana. Aceast proprietate se refer la capacitatea drojdiile de a produce
fermentaia n mediu cu o concentraie crescut de zahr. Este recomandat drojdiilor utilizate
la obinerea spirtului de melas cu un randament superior n alcool etilic.
Frigofilia. Reprezint adaptarea drojdiilor de a produce fermentaia la temperaturi mai
sczute de 10-15
o
C. n acest fel sunt evitate fermentaiile secundare, iar n vin sunt acumulate
mai multe substane de arom.
Caracterul killer. Acesta este ntlnit la unele drojdii capabile de a sintetiza
intracelular o toxin cu efect inhibitor asupra altor drojdii sensibile. De exemplu, n
selecionarea drojdiilor de vin, culturile care au caracter k dau randamente superioare
deoarece n cursul fermentaiei are loc o autoselecie natural.


1.2. Caracterizarea produilor principali i secundari obinui n fermentaia alcoolic
Fermentatia alcoolica este un proces anaerob prin care glucidele fermentescibile sunt
metabolizate prin reacii de oxido-reducere sub aciunea echipamentului enzimatic al drojdiei in
produii principali (alcool etilic si CO
2
) iar ca produi secundari: alcooli superiori, acizi, aldehide
s.a
Alcoolul etilic este un metabolit primar care poate fi obinut prin fermentaia zahrului
sau a unor polizaharide care sunt transformate enzimatic la zahr.
Conversia prin fermentare n mediu acid a glucidelor, catalizat de enzime le din
drojdii se desfoar n cinci etape principale:
1. Transformarea diferitelor tipuri de glucide n esteri ai glucozei i formarea
esterului fructo-furanozo-1,6-difosfat. Este etapa n care se consum energie
prin reacia de transformare a ATP-ului n ADP.
2. Formarea triozelor aldehid fosfogliceric i fosfodioxiaceton.
3. Transformarea triozelor pn la formarea de acid piruvic. Energia eliberat
prin procesul de oxido-reducere este nmagazinat prin fosforilare de
substrat.
4. Decarboxilarea acidului piruvic i formarea de aldehid acetic.
5. Aldehida acetic se reduce devenind acceptor de hidrogen i se formeaz
alcoolul etilic.

Reacia global a fermentaiei alcoolice n mediu acid este:

ATP CO OH H C P ADP O H C 2 2 2 2 2
2 5 2 6 12 6


n fermentaia alcoolic rezult o diversitate de produi secundari. De exemplu, n
vinuri au fost identificate prin cromatografie 300-500 de substane diferite. Majoritatea lor
rezult prin procesul de fermentaie, iar celelalte sunt dependente de compoziia mediului.
n urma analizei culturii de Saccharomyces cerevisiae Hansen au fost identificai prin
cromatografie o serie de produi secundari. Dintre acetia pot fi enumerai urmtorii:
- glicerol: 3g/100g glucoz fermentat;
- aldehida acetic: 2,2 mgdm
-3
;
- acid acetic: 86mgdm
-3
;

Dinamica multiplicrii
procesul multiplicrii populaiei cuprinde mai multe faze
faza de laten (lag)
ntre momentul introducerii germenului n mediul de cultur (inoculare) si
momentul n care celulele acestuia ncep s se multiplice
nr. bacteriilor din inocul rmn neschimbate
scad temporar
cultura nu este vizibil la microscop
bacteriile acumuleaz n celul
metabolii eseniali
sisteme enzimatice necesare creterii
perioad de adaptare la noile condiii de cultivare (de via)
mediu nutritiv
temperatur
pH
aeraie
timp
cteva ore
mai scurt cu ct noul mediu este mai apropiat de cel vechi
transvazarea inoculului
prima situaie
inoculul provine dintr-o cultur aflat n curs de multiplicare
mediu nutritiv cu aceeai compoziie
i pstreaz ritmul rapid de dezvoltare
cazul
transvazrii inoculului n intermediar
pentru obinerea unor cantiti mai mari de inocul
a doua situaie
inoculul provine dintr-o cultur aflat n curs de multiplicare
mediu nutritiv cu alt compoziie
perioad de adaptare
cretere neevident de la nceput
faza de multiplicare exponenial (cretere logaritmic)
precedat de o perioad scurt (cca. 2h)
accelerare a ritmului de cretere
multiplicarea se produce cu o vitez progresiv mrit
diviziunile sunt sincronizate
nr. celulelor
se dubleaz brusc
la intervale de timp regulate
progresie geometric
cretere exponenial
scurt timp 2-3 ore
tendina de multiplicare rapid scade progresiv
epuizarea substanelor nutritive
acumularea de produse de catabolism cu efect inhibitor
celulele de tip embrionar
dimensiuni mai mari
citoplasma
mai omogen
nu conine materiale de rezerv
afinitate pentru coloranii bazici
coninut ridicat de ARN
cele mai potrivite pentru lucrri de genetic

perioada de post-lag
spre sfritul fazei de multiplicare logaritmic
ncetinirea
desincronizarea creterii populaiei
acum sunt amorsate biosintezele n culturi continui
faza staionar maxim
numrul celulelor viabile
maxim
rmne constant
ore cteva zile
nsoit de
epuizarea substanelor nutritive
acumularea unor produi toxici
celulele nu se mai multiplic
faza de declin
scderea progresiv a numrului celulelor viabile
celule
btrne
cu fenomene de involuie
n unele cazuri fenomene de autoliz
metode de apreciere a creterii unui microorganism
determinarea substanelor uscate a masei celulare
determinarea concentraiei sursei de carbon din mediu
determinarea nr. total de celule, cu ajutorul celulelor de numrat
determinarea gradului de turbiditate a suspensiei bacteriene n funcie de timp
Dinamica procesului de cretere la fungi
cresc sub form de colonii
miceliu 10-15 m
se poate pleca de la
inocul de spori
fragment micelian
mai multe faze
faza iniial de lag
cteva ore
germinarea sporilor (inoculare cu suspensie de spori)
regenerarea hifelor rupte i lezate (inocul vegetativ)
faza de cretere liniar
pe suprafaa mediului apare o colonie
circular
crete liniar cu timpul
forma unei reele fine de hife

faza de nvechire
ncetinirea vitezei de cretere
efectul duntor al produilor de metabolism
mai repede n cazul mediilor mai bogate n substane nutritive

Metabolismul microbian
- totalitatea reaciilor biologice implicate n activitatea biologic prin intermediul
crora energia, elementele de mediu nutritiv sunt utilizate pentru biosinteze, cretere i
alte activiti celulare;
- ci metabolice
- catabolism
- reacii exergonice (elibereaz energie)
- furnizeaz energie - ATP
- anabolism
- reacii endergonice (consum de energie)
- sintez de noi constitueni prin folosirea energiei stocate din primul
proces
- bioelemente
- majore
- concentraii mari
- 10
4
M
- C, O, H, N, S, P, K, Mg, Ca
- Minore
- Cantiti foarte mici
- Zn, Mn, Mo, Co, Cu, W
- Tipuri de metabolism dup natura sursei de energie
- Microorganisme fototrofe energia radiant
- Microorganisme chimiotrofe energia din reacii chimice oxidative la
ntuneric
- Capacitatea de a biosintetiza metabolii eseniali
- Autotrofe
- Au capacitatea de a sintetiza toi constituenii celulari
- pornind de la surse anorganice simple
- de C CO
2
,
- de azot - NH
3

- Heterotrofe
- incapabile de a sintetiza metaboliii eseniali
- necesar adugarea lor n mediu ca
- substane organice
- anorganice
- necesar
- o surs de C
- hidrai de C
- acizi organici
- o surs de N
- aminoacizi
- proteine
- sruri anorganice de amoniu
- biotehnologie heterotrofe
- factori de cretere
- Andr Lwoff
- Substane necesare pentru dezvoltarea microorganismelor
- substane pe care un organism este incapabil s le sintetizeze
- n absena crora multiplicarea este imposibil
- aminoacizi naturali care intr n compoziia proteinelor
- bazele purinice
- bazele pirimidinice
- vitaminele hidrosolubile B


METABOLISMUL ENERGETIC LA MICROORGANISME
- Energia obinut din reaciile metabolismului energetic este necesar activitii biologice
- Transport prin membrane
- Respiraie
- Biosintez
- Energia microorganismelor heterotrofe provine din degradarea unor substane
organice adugate n mediul de cultur ca surs de carbon
- 3 faze de eliberare a energiei n procesul de catabolism
- macromoleculele organice sunt descompuse la unitile lor cu eliberarea a 1%
din energia nglobat
- proteinele aminoacizi
- grsimile glicerol i ac. grai
- glucidele monozaharide
- moleculele rezultate din prima faz sunt degradate pn la produi mai mici +
CO
2
+ H
2
O cu eliberarea a 1/3 din energia lor total
- intermediari ai cilor metabolice
- a 3-a faz este diferit pentru diferitele tipuri de microorganisme
- microorganisme care pot descompune integral substanele nutritive
pn la CO
2
i H
2
O pe calea acizilor tricarboxilici
- microorganisme care realizeaz numai o descompunere parial a
substratului nutritiv cu formare de produi intermediari servind ca
acceptori, donori de electroni
- se obin astfel diveri produi (fermentaie)
- compuii glucidici reprezint sursa cea mai cunoscut de energie
- degradare pe calea Ebden-Meyerhof-Parnas cu
- formarea a 2 molecule de ac. piruvic
- eliberarea a 2 molecule de ATP
- ac. piruvic
- transformat n acetil-coenzim care intr n ciclul lui Krebs
- se elibereaz 4 perechi de electroni care pot intra n lanul respirator
Bacterii lanul respirator este asociat cu
membrana plasmatic
mezozomi
eucariote sediul respiraiei n mitocondrii
energia
nmagazinat n ATP
folosit la nevoie

n funcie de acceptorul final de electroni
oxigenul respiraia aerob (oxibiotic)
un compus organic respiraia anaerob (anoxibiotic)
fermentaia compuii organici funcioneaz ca donor i acceptor e

n funcie de comportarea fa de Oxigenul molecular
microorganisme strict (obligatoriu) aerobe
oxigenul este acceptor final de H
au nevoie permanent de oxigenul atmosferic
dispun de citocromi
enzime
peroxidaze
catalaz
superoxid dismuataza
microorganisme strict (obligatoriu) anaerobe
nu se pot dezvolta n prezena oxigenului molecular
nu au echipamentul enzimatic al celor aerobe
microorganisme aerobe facultativ anaerobe
cele mai numeroase
i orienteaz metabolismul spre respiraie (fermentaie) n funcie de
prezena (absena) Oxigenului
microorganisme microaerofile
au nevoie de o cantitate de Oxigen mai mic dect din aerul atmosferic
metaboliii formai produii obinui prin biosintez
metabolii primari
formai n faza de cretere exponenial
rezultat al metabolismului oxidativ (fermentativ)
alcooli primari (simpli)
acizi
aldehide
CO
2

H
CH
4

Metabolii secundari
Substane chimice complexe
La nceputul fazei staionare de cretere
Uneori produse n cantiti foarte mari
Nu au funcie metabolic evident
Antibiotice
Enzime
Vitamine
Sintetizai
pe seama constituenilor cu mas molecular mic
pentru a ndeprta din mediu compuii mici care le-ar periclita viaa
Datorai
existenei unor inductori
epuizrii unor represori

Medii de cultur
Suporturi nutritive sterilizate
Permit dezvoltarea unui microorganism n afara niei sale ecologice naturale
Importante pentru
Reproductibilitate
Eficien

Criterii de clasificare
Consistena
Lichide
Solide
Semisolide
Compoziie
Naturale
Elemente nutritive
Vegetale
Animale
Pot conine
Subproduse agroalimentare
- rot de floarea soarelui
- Fin de porumb
- Tre de gru
- Extract de porumb
Completate cu mici cantiti de sruri minerale
Avantaje
Mai ieftine
Dezavantaje
Nu permite
Standardizarea
Reproducerea procesului cu un randament constant
Sintetice
Reproductibile la scar industrial
Numai compui
cu structur chimic cunoscut
care pot fi dozai
Tipul de respiraie al microorganismelor
aerobe
anaerobe
Scopul i frecvena
de uz curent
medii speciale pentru studiile de izolare la nivel de laborator
elective
selective
de mbogire
de conservare
de identificare
Faza de biosintez la care este folosit
laborator
pilot
industrial
Destinaia final
pentru cultura inocul
cultura de regim (medii de fermentaie, de biosintez)
trebuie s conin
surs de carbon - carbohidrai
sursa principal de energie
regleaz necesarul de O i H
glucoz
amidon
fructoz
zaharoz
surs de azot
organic
aminoacizi
proteine
uree
anorganic
amoniac
sulfat de amoniu
surs de fosfor
acid fosforic
fosfat de amoniu
fosfat acid de potasiu
oligoelemente
potasiu
clorur de potasiu
fosfat acid de potasiu
magneziu
sulfat de magneziu
fier
clorur feric
factori de cretere
aminoacizi
proteine
vitamine
coenzime
precursori
poriuni structurale ale moleculei produsului biosintetizat
sursa de carbon
exist o valoare a concentraiei elementelor necesare dezvoltrii nerestrictive
definit de Peppler, Harrison, 1970

ETAPELE ELABORRII TEHNOLOGIILOR DE BIOSINTEZ
- cuprinde mai multe faze
- Laborator
- Micropilot
- Staii pilot
- Producie industrial
- Faza de laborator cuprinde 2 etape
- Etapa I
- Izolarea, selectarea i testarea microorganismului productor
- Tehnici specifice pentru fiecare microorganism
- Metode folosite pentru izolarea i testarea microorganismului
- Tehnica diluiilor
- Microorganismele
- preluate din diferite habitate
- cultivate pe medii
- solide
- lichide
- iniial se urmrete realizarea unei culturi pure
- tehnici microbiologice specifice
- epuizarea ansei
- diluii succesive
- apoi se stabilete o metod de triere (screening)
- microorganismul cultivat pe plci Petri pe medii de agar-agar
- se fac teste de identificare
- calitative
- cantitative
- De ex. - Enzime
- includerea substratului specific pentru enzima dorit
- amidon/amilaze
- cazein/proteaze
- celuloz/celulaze
- enzimele difuzeaz n gelul de agar-agar
- dac nu se poate aplica un test calitativ
- coloniile izolate se cultiv pe medii specifice
- extractul (lichidul) de biosintez
- prelevat
- prelucrat
- dozarea compusului
- spectrofotometric
- fluorimetric
- tritrimetric
- polarimetric
- se rein numai cteva tulpini care au dat cele mai bune rezultate
- ntreinerea culturilor productoare
- lucrri de caracterizare a microorganismului dup criterii
- morfologice
- biochimice
- fiziologice
- imunologice
- toxicologice
- nregistrarea tulpinii
- ntr-o colecie de microorganisme
- sub un numr de identificare
- Selecia unui mutant nalt productor
- Lucrri de selecie
- Natural
- Artificial (mutagenez)
- Conservarea
- Tulpini parentale
- Tulpini mutante
- Prin
- metode speciale
- la temperaturi sczute
- Liofilizarea
- Conservarea n azot lichid
- Cultura stoc
- Cultura de la care se pornete procesul de biosintez
- Tulpinile din colecie utilizate n lucrrile de biosintez
- Metodele de ntreinere a culturilor sunt specifice fiecrui
microorganism
- Condiii de pstrare
- La frigider
- Pe geloz nutritiv
- n tub nclinat
- punctul de plecare pentru prepararea unei culturi inocul de
laborator
- Cultura inocul
- constituie
- cultur microbian n curs de multiplicare
- materialul de nsmnare a mediului de biosintez n etapa
urmtoare
- condiii de dezvoltare
- format pe un substrat nutritiv corespunztor
- pH
- Temperatur
- Agitare
- Aerare
- Transvazarea inoculului
- n mediul de biosintez
- Condiii aseptice
- Dup o perioad de dezvoltare bine stabilit i definit prin
- Vrst
- Cantitate
- Aspect microscopic
- Aparatur
- Plci Petri
- Tuburi test
- Flacoane Ehrlenmeyer

- Faza de laborator
- Etapa a II-a
- Stabilirea parametrilor optimi de cultivare
- Mediul de cultur
- pH
- Temperatur
- Agitare
- Aerare
- Aparatur
- Flacoane Ehrlenmeyer
- Agitatoare rotative
- Faza de micropilot
- stabilirea condiiilor de cultivare
- pH
- temperatur
- consum de O dizolvat
- turaie
- debit de aer
- aparatur
- bioreactor de laborator - 10 L
- Faza de staie pilot
- A - stabilirea parametrilor
- de cultur
- biosintez
- aparatur
- instalaii de capacitate medie
- bioreactoare 100 1000 L
- B - stabilirea condiiilor de lucru la nivel semiindustrial
- aparatur
- bioreactoare 5000 10.000 L
- sterilizarea
- precede operaiile de nsmnare vitamina C
- aparaturii
- mediului
- mediul de cultur
- sterilizat
- rcit la temperatura optim de cultivare
- cultur intermediar
- treapt intermediar de cultivare
- apare atunci cnd raportul de inoculare
- cantitatea de inocul/cantitatea de mediu de fermentaie
- nu permite pregtirea culturii inocul n laborator
- moduri de cultivare
- A - culturi de suprafa
- B - submers
- mediu lichid
- agitat
- aerat
- adoptat
- n funcie de fiziologia productorului
- rentabilitate
- Producia industrial
- iniial - faz experimental industrial
- apoi obinerea industrial a bioproduselor
- bioreactoare 10.000 100.000 L

Cultivarea microorganismelor n instalaii industriale specializate,
performante determin
Asigurarea de condiii optime de:
Cretere
Dezvoltare
Biosintez a metaboliilor dorii
Acumularea preferenial a unui anumit metabolit necesit
Creterea i dezvoltarea microorganismelor
Condus
Reglat

PROCEDEE DE BIOSINTEZ
- condiiile proceselor de biosintez pot fi
- oxibiotice (aerobe)
- anoxibiotice (anaerobe) fermentative
- termenul de fermentaie s-a extins i la procesele oxibiotice
- procesele de biosintez bioproces
- criterii de clasificare a bioproceselor
- felul culturii
- de suprafa
- submers
- tipul de operare
- omogen/ heterogen
- discontinuu/continuu
- modul de transformare al componentelor nutritive ale mediului
- simple
- simultane
- consecutive

Bioprocese n culturi de suprafa
- suport
- solid
- semisolid
- culturi solide
- microorganismele se dezvolt
- pe suprafaa
- n interiorul mediului
- culturi semisolide
- microorganismele se dezvolt n toat masa mediului

Bioprocese n culturi submerse
- instalaii pentru asigurarea
- amestecrii perfecte a componentelor mediului de biosintez
- solide
- lichide
- gazoase
- alimentarea adecvat cu aer
- aparatur de msur i control
- utilaje speciale bioreactoare
- avantaje
- se preteaz la automatizri
- economie de spaiu
- o bun amestecare i aerare a mediului
- condiii optime pentru microorganisme
- randamente ridicate
- cel mai utilizat pentru
- aminoacizi
- proteine
- enzime
- sisteme industriale
- discontinui (arje)
- continui
- productivitate mare
- aparte de capaciti mici pstreaz mai bine parametrii optimi

tipul de operare
- sistemele omogene
- compoziia mediului este uniform pe tot parcursul bioprocesului
- sistem este monofazic
- microorganismele sistemului au aceeai stare fiziologic (stadiu de
dezvoltare)
- sistemele heterogene
- compoziia mediului de fermentaie are gradiente de celule sau de substrat
- sisteme
- monofazice
- multifazice
- lichid/lichid
- lichid/gaz
- microorganismele
- expuse la diferite condiii de mediu
- diferite stri fiziologice (diferite stadii de dezvoltare)

tipul de operare
- bioprocese nchise
- celulele microbiene meninute n totalitate n sistem
- nu pot atinge o stare staionar
- bioprocese deschise
- celulele trec continuu n efluent
- celulele prsesc sistemul n rata n care se formeaz
- rezult c se gsesc n stare staionar

tipul de operare
- sistem continuu de operare
- deschis
- omogen
- cu un stadiu
- cu mai multe stadii
- heterogen
- cu un stadiu
- cu mai multe stadii
- mixt
- nchis
- omogen
- heterogen
- mixt

modul de transformare al componentelor nutritive ale mediului
- procese simple
- componentele nutritive se transform stoechiometric n produse de reacie
- fr acumulare de intermediari n mediu
- procese simultane
- componentele nutritive se transform n diferite proporii stoechiometrice
- fr acumulare de intermediari n mediu
- procese consecutive
- componentele nutritive se transform cu acumulare de intermediari
- procese desfurate n etape
- componentele nutritive se transform n intermediari i apoi n produi de
reacie

VARIAIA CONCENTRAIEI COMPONENTELOR MEDIULUI DE BIOSINTEZ
au fost elaborate modele matematice n scopul reprezentrii ct mai apropiate de
realitate a cineticii de desfurare a unui proces de biosintez
Mono, Komo, Verhoft
Descriu ecuaia variaiei n timp a concentraiei de celule n mediul de biosintez
Variaia vitezei specifice de dezvoltare respect n acest caz cinetica Michaelis-
Menten
Viteza specific de dezvoltare depinde de concentraia unui component din mediul de
cultur cu rol limitativ
Elementul limitativ
Sursa de carbon (glucoza)
Sursa de azot (aminoacidul esenial)
Pe baza ecuaiei variaia vitezei specifice de dezvoltare se poate calcula timpul necesar
dublrii concentraiei de celule microbiene
Viteza specific de dezvoltare calculat este mai mare dect cea real
Variaia n timp a concentraiei de microorganisme este supus efectelor
inhibitorii
ale substratului
ale produsului finit
efecte exercitate de mai multe substane
de inducie
de represie
modelarea proceselor metabolice
urmrete obinerea de
biomas celular
metabolii

prin
viteza de dezvoltare a microorganismelor
concentraia de microorganisme
stadiul culturii de microorganisme
folosirea particularitilor proprii ale culturii

INFLUENA FACTORILOR DE MEDIU ASUPRA CRETERII
MICROORGANISMELOR
factori de mediu
conc. substratului
calitatea i cantitatea inoculului
temperatura
pH-ul mediului de biosintez
agitarea
concentraia oxigenului dizolvat
INFLUENA CONCENTRAIEI SUBSTRATULUI ASUPRA CINETICII
DEZVOLTRII MICROBIENE
Mrirea conc. de substrat din mediu determin creterea nr. celule microbiene pn la
o limit
Fenomen subordonat aciunii inhibitorilor
Inhibitorii acioneaz prin
Modificarea potenialului chimic al
Substratului
Intermediarilor metabolici
Produsului finit
Modificarea permeabilitii peretelui celular cu reducerea transportului
substanelor nutritive
Modificarea activitii enzimelor metabolice
Disocierea agregatelor metabolice
Modificarea parametrilor funcionali
Capacitatea de reproducere
Mobilitatea
Biosinteza unor metabolii
Mecanismele inhibiiei
Reacie chimic cu una sau mai multe componente celulare
Adsorbia (complexarea) de enzime (coenzime)
Intervenia n secvene ale reaciilor biochimice
Intervenia n disocierea complexelor enzimatice
Modificarea parametrilor fizico-chimici ai mediului de biosintez
pH
trie ionic
constanta dielectric
capacitatea de solvatare
intervenia n funciile celulare de control
concentraia optim de substrat n momentul iniial i pe parcurs
concentraia inhibitoare a glucozei 10-15%, dulcea, siropuri
INFLUENA DIMENSIUNILOR INOCULULUI ASUPRA PROCESELOR
BIOTEHNOLOGICE
calitatea i cantitatea inoculului
cantitate mare
declanarea unei rapide dezvoltri
reducerea riscului de contaminare
3-10% din volumul total al culturii
raport optim de inoculare
definirea strii fiziologice
vrst
aspect microscopic
efectele mrimii i vrstei inoculului
bacterii
Mrimea inocului influeneaz stadiile ulterioare ale culturii
inocul mare se micoreaz faza de lag
datorit formrii i acumulrii unor metabolii intermediari eseniali -
difuzeaz rapid
cantitate prea mare
autoinhibiie
datorat sensibilitii celulelor bacteriene fa de unii produi
metabolici intermediari
cantitate prea mic
faza de lag poate fi prelungit la infinit
dezvoltare anormal a microorganismului
iniierea dezvoltrii unui inocul
concentraie critic de metale grele
Bacillus subtilis Mn
levuri
mrimea inocului influeneaz faza de lag i stadiile ulterioare ale culturii
fungii
necesar standardizarea inoculului vegetativ pentru acest grup de microorganisme
inocul sub form de suspensie de spori ritm rapid de dezvoltare
autoinhibiie (autostimulare) a germinrii sporilor substane produse n
timpul germinrii
fazele ulterioare
cantitatea inoculului influeneaz
miceliul
mrime
form
randamentul n metabolii
raportul de inoculare judicios
dezvoltarea masei miceliene
consum mare de carbohidrai
cultur ineficient
EFECTELE TEMPERATURII ASUPRA CRETERII MICROORGANISMELOR
diferena ntre temperatura mediului nconjurtor i din interiorul celulei nul
variaiile temperaturii
randamentul de transformare a substratului
cerinele nutritive
compoziia biomasei
viteza de cretere microbian
domeniul de temperatur n care ating viteza maxim de cretere
criofile (10C)
mezofile
microorganisme industriale
25 30C
termofile
mecanismul de aciune afecteaz
procesele metabolice
compoziia biomasei n
proteine
lipide
ARN

EFECTELE PH-ULUI ASUPRA CRETERII MICROORGANISMELOR
Cteva direcii de influenare
Domeniul optim de pH
Drojdii 4-5 ---- 2; 8.
Valori mici ale pH (3-4) risc sczut de contaminare
Efectul pH asupra randamentului de conversie a substratului
Domeniu foarte strict de pH
Ac. Citric
1,7-2
< ------ ac. citric
> ------ ac. oxalic, gluconic
deviaii ale pH de la valoarea optim
efecte nedorite
datorate
consumarea unui nutrient
producerea unui acid de ctre microorganism
corectarea abaterii
adugarea unor substane chimice
pH sub cel optim
NaOH
KOH
Amoniac gazos
Amoniac soluie
Ioni de Na, K
pH peste cel optim
HCl
Ac. sulfuric
Ac. azotic
ion Clorur
sruri greu solubile
corecia poate determina coroziune
pH-ul determin efecte de disociere a acizilor i bazelor
acioneaz la nivelul suprafeelor celulei
modific proprietile
de aderare la diverse materiale
de floculare

CONCENTRAIA DE OXIGEN DIZOLVAT
culturile aerobe
oxigenul necesar
oarecare exces
transferul de oxigen din faza gazoas n faza lichid are loc cu viteze mari
n biosinteza n laborator (baloane agitate) aeraia depinde de
viteza de rotaie (translaie) a agitatorului
mrimea baloanelor
volumul de mediu de cultur din balon
creterea turbulenei prin icane
eficiena aerrii concentraia de oxigen dizolvat determinat prin
metode sulfit
msurarea vitezei maxime de transfer a oxigenului din aer n
mediu
metoda polarografic
determinarea concentraiei oxigenului dizolvat n mediu
utilizarea electrodului cu membran
msurarea oxigenului dizolvat
determinarea raiei consumului de oxigen
folosirea analizorului paramagnetice de oxigen
analizeaz i compar compoziia aerului
ce iese din bioreactor
ce intr n bioreactor
conducerea unui proces
cunoaterea
modului de variaie n timp a necesarului de oxigen
rata consumului de oxigen
sporete rapid la o valoare maxim din primele stadii
este momentul atingerii concentraiilor ridicate
de celule
apoi scade
necesarul de oxigen mediul de biosintez utilizat
Penicillium oxigen dublu glucoz (zaharoz simplu)
Factori care influeneaz transferul de oxigen
Agenii tensioactivi micoreaz coeficientul de transfer
Concentraia de microorganisme
concentraii mari vscozitatea crete eficiena sistemului de
aerare scade
Sistemul de agitare agitare eficient dispersie bun a bulelor
Echipament de aerare conducte perforate bioreactoare de volum mare
Suprapresiunea favorizeaz mrirea conc. de oxigen 0,5 1 atm.
Micoreaz riscul de infecie

PRELUCRAREA MEDIILOR DE BIOSINTEZ
Prelucrarea primar
Filtrarea
Centrifugarea
Decantarea
Concentrarea fazei lichide
Dezagregarea celulelor
Extracia
Uscarea
Atomizarea
Precipitarea
cu solveni organici
cu sruri anorganice
ultrafiltrare pentru
purificri
concentrri
echipamente complexe i specifice
dificulti ale separrii produselor din lichid
produse termolabile
dificulti eliminate prin cunoaterea proprietilor fizico-chimice ale
produselor
solubilitatea n
ap (soluii diluate de sruri)
solveni polari (metanol, etanol, aceton)
solveni slab polari (cloroform, hidrocarburi)
stabilitatea n soluie n funcie de efectul
pH
temperatur
soluii tampon
solvenilor organici
stabilitatea n stare solid n funcie de temperatur i efectul umiditii
proprieti fizice
gradul de dializ
adsorbia pe substane solide
migrarea n cmp electric
sedimentarea n ultracentrifuge
proprieti chimice
stabilitatea fa de enzime
stabilitatea la aciunea unor ageni chimici
metode de separare din biomas
extracia cu solveni organici
separarea pe schimbtori de ioni
cromatografie
adsorbie
operaiile cele mai utilizate n biotehnologia medicamentelor
filtrarea
concentrarea
dezagregarea celular
atomizarea

Filtrarea mediilor de biosintez
probleme datorate
compoziia chimic a mediului
materialul biologic
adjuvani de filtrare
formeaz paturi microscopice cu micorarea dimensiunilor porilor
mresc vitezei de filtrare
reduc consumul de materiale
mai multe scheme
aplicarea pe materialul filtrant (pnz, hrtie) a unui strat subire de
material adjuvant
amestecarea adjuvantului cu suspensia de filtrat
raclarea permanent a stratului adjuvant cu ajutorul unor cuite pentru
meninerea stratului la o valoare constant (cazul filtrelor rotative)
se folosete foarte mult filtrarea sterilizant
prefiltrare grosier
apoi filtrarea sterilizant
filtre din
acetat de celuloz
azbest
polimeri sintetici
Dezagregarea celulelor de microorganisme
necesar pentru cazul n care substanele biologicactive sunt intracelulare
diverse procedee
fizice mecanice
mori coloidale
mori vibratoare
agent de rcire pentru meninerea sistemului la o anumit temperatur
fizice nemecanice
ngheare lent
oc osmotic
vibraii ultrasonice 20.000 Hz
chimice
pentru distrugerea componentelor lipoproteice din membrane se folosesc
detergeni cationici
detergeni aminici
solveni organici
preparate enzimatice
E. coli bacteriofagi
esut muscular enzime proteolitice
Drojdia de bere autoliz la 30C, 2-3 zile
Concentrarea mediilor de biosintez
Se are n vedere termolabilitatea produselor
Evaporarea n vacuum la temperaturi sczute (25-50C) liofilizare
Procedee de concentrare atermic
Ultrafiltrarea
Separarea pe baza diferenei de volum molecular cu ajutorul unei
membrane
Avantaje
Concentrarea la temperaturi sczute
Micoreaz
fenomenele de autodigerare
pierderile n activitate prin denaturare termic
nu necesit modificri de faz (evaporri, condensri)
nu utilizeaz substane chimice
purific soluiile biologice prin ndeprtarea unor componente
cu volum molecular inferior
Osmoza invers
Atomizarea
Uscarea prin atomizare
Util pentru materialele care n faza iniial sunt lichide
Soluii
Suspensii
Paste subiri
Se realizeaz o cea de lichid din particule de 2 200 m
Uscare rapid nct materialul nu se nclzete
Se obine o pulbere nu este necesar mrunirea

ntr-o prim concluzie biotehnologiile farmaceutice industriale sunt alese i optimizate n
funcie de aceti doi mari factori, raportai la criteriul economic (preul de cost):
medii
solide
lichide
culturi
de suprafa
submerse
procesele biotehnologice industriale
determin o dezvoltare
abundent
egal
agitare mecanic
aerare corespunztoare