PROCESE DE STERILIZARE IN BIOTEHNOLOGIE

CURS 2

2. PROCESE DE STERILIZARE N BIOTEHNOLOGIE

Procesele de cretere a biomasei microbiene impun, n marea
lor majoritate, absena total a sporilor de microorganisme strine,
provenite din ap, aer sau materii prime, care s-ar putea dezvolta n
faza de fermentaie, infectnd cultura unic a microorganismului util.
Aceast cerin tehnologic se poate realiza prin sterilizare i, mai
rar, prin pasteurizare.
Sterilizarea este, prin urmare, procesul prin care are loc
distrugerea sau ndeprtarea microorganismelor patogene sau
apatogene (att a formelor vegetative, ct i a sporilor) din
substane, preparate, spaii nchise, obiecte etc. Pasteurizarea
reprezint operaia care const n distrugerea microorganismelor,
inclusiv a bacteriilor, prin nclziri repetate sub 100OC.
n industria de biosintez, unde se obin culturi microbiene
pure, precum i n industria farmaceutic i cea alimentar, procesul
de sterilizare este de nenlocuit i poate fi realizat, de obicei, prin:
a) metode termice:
- sterilizare cu aer cald la 140 - 200C;
- sterilizare cu vapori de ap sub presiune la 120 - 140C;
- sterilizare prin nclziri repetate la 70 - 100C.
b) metode fizice:
- filtrare prin umpluturi fibroase;
- filtrare prin materiale poroase;
- filtrare prin membrane;
- utilizarea radiaiilor UV, IR, raze X, , etc.
c) metode chimice:
- utilizarea agenilor chimici: oxid de etilen, formaldehid,
fenol, azotiperit, ozon etc.
d) metode de preparare pe cale aseptic.
Sterilizarea termic uscat include i sterilizarea prin flambare,
folosit n faza de nsmnare a inoculului i a prelevrii probelor.
Acest gen de sterilizare const n trecerea probelor sau a obiectelor
prin flacr, timp de cteva secunde.
n general, metoda de sterilizare se alege n funcie de
proprietile fizico-chimice ale materialelor supuse sterilizrii, astfel
nct s se evite modificrile calitative ale acestora.
ntre nclzirea uscat i nclzirea umed, n procesul de
sterilizare prin metoda termic, exist o deosebire important, ultima
avnd o eficien sporit. Fenomenul se explic prin aciunea

13

PROCESE DE STERILIZARE IN BIOTEHNOLOGIE

CURS 2

hidratant, coagulant i hidrolizant a apei i a aburului asupra

proteinei microbiene. Comparnd performanele sterilizrii prin
nclzire uscat i umed (tabelul 2.1.), se constat c sterilizarea
cu aer cald necesit temperaturi i durate mult mai mari.
Din aceste motive, n tehnic se prefer sterilizarea umed,
care poate fi urmrit n funcie de punctul termic mortal i timpul
termic mortal. Punctul termic mortal este definit prin valoarea
temperaturii la care sunt omorte toate celulele unei anumite specii,
n timp de 10 minute. Timpul termic mortal reprezint acea valoare a
timpului de expunere la o anumit temperatur necesar distrugerii
tuturor celulelor sporulate.
Tabel 2.1. Parametrii sterilizrii prin nclzire uscat (cu aer cald) i
umed (cu abur sau ap fierbinte)
Denumire
microorganism
Salmonella typhi
Mycobacterium
tuberculosis
Staphylococcus
pyogenes

nclzire uscat
Temperatura,
Timp
C
100
30 min

nclzire umed
Temperatura,
Timp
C
65
20 s

100

45 min

65

10 s

120

30 min

65

60 s

Spori fungici

120

90 min

80

Spori de Bacillus
anthracis

170

10 min

100

Spori nativi din sol

180

30 min

120

30
min
10
min
30
min

Dup cum se observ din tabelul 2.2, pentru sporii unor

anumite microorganisme, timpul termic mortal scade semnificativ
odat cu creterea temperaturii, ceea ce conduce la concluzia c
trebuie ales regimul de sterilizare rapid la temperaturi mai ridicate. n
acest mod, se asigur un grad sporit de siguran n sterilizare i o
conservare mai bun a calitilor nutritive ale mediului de cultur.

14

PROCESE DE STERILIZARE IN BIOTEHNOLOGIE

CURS 2

Tabelul 2.2. Timpul termic mortal pentru sporii unor microorganisme

n sterilizarea termic umed
Spori

80
74 - 75 h

Temperatura, C
100
110
120
175 min 37 min 7,5 - 8 min

Bacillus subtilis
Bacillus
10 - 10,5 h 40 - 45min
fusiformis
Bacillus
7,5 - 8 h
10 min
mycoides
Bacillus
16 - 17 h 15 - 16 min
megaterium
Bacillus
20 h
cylindricus
Clostridium
5,5 h
32 min
botulinum
Clostridium
10 h
90 min
sporogenes

4 min
15 min

n concluzie, studiul bazelor termodinamice ale sterilizrii

termice reprezint singurul criteriu concret n alegerea condiiilor de
realizare a acestui proces.
Sterilizarea prin filtrare pe materiale poroase se utilizeaz
frecvent n cazul preparatelor termolabile. Procedeul este preferat i
atunci cnd preul prea mare al energiei i cheltuielile pentru
aparatur exclud ndeprtarea microorganismelor prin metoda
termic. n procesul de sterilizare prin filtrare se folosesc filtre
poroase Jena G5, filtre de azbest-celuloz (denumite filtre Seitz sau
Filtrasic), filtre cu membran, filtre de profunzime i filtre absolute.
Sterilizarea cu ajutorul radiaiilor, dei prezint unele
neajunsuri, este aplicat din ce n ce mai mult n industrie, att
pentru sterilizarea produselor, ct i a aerului din boxele sterile.
n afara filtrrii, pentru sterilizarea unor produse sau materii
prime termolabile, se poate utiliza procedeul sterilizrii la rece cu
etilenoxid, formaldehid, fenol, amestec aer-formaldehid etc.
Pentru substane mai puin termolabile se recomand combinarea
sterilizrii termice cu cea chimic (sunt utilizate astfel de procedee

15

PROCESE DE STERILIZARE IN BIOTEHNOLOGIE

CURS 2

combinate, care folosesc acidul 5-nitrofenil-acrilic, formaldehida, apa

oxigenat).
Prepararea produselor pe cale aseptic se utilizeaz atunci
cnd nu este posibil sterilizarea lor prin procedeele prezentate
anterior. Tehnologia preparrii aseptice se realizeaz n boxe sterile,
aerul din acestea fiind sterilizat prin filtrare, iradiere sau cu ageni
chimici. n ultima perioad a fost extins la scara industrial
sterilizarea aerului din boxe prin curgere pelicular, controlul
sterilitii aerului fcndu-se cu ajutorul filtrelor cu membran.
Pentru industria de biosintez, procesele de sterilizare a
mediului de cultur, a aerului tehnologic, a sistemelor de
transvazare i a instalaiilor care deservesc tehnologia respectiv
constituie probleme determinante n obinerea unor culturi pure de
microorganisme, respectiv n atingerea unor performane
tehnologice sporite, redate prin intermediul randamentului n produs
util.
2.1. Sterilizarea mediilor de cultur
Dei teoretic sterilizarea mediilor de cultur se poate realiza
prin metode mecanice (filtrare, centrifugare, flotaie), termice, cu
ageni chimici bactericizi, cu radiaii X, , , radiaii UV, aplicaii
practice au gsit numai procedeele termice de sterilizare. Aceste
procedee se caracterizeaz prin simplitate, uurin n exploatarea
utilajelor de sterilizare i sigurana n realizarea gradului de
sterilizare dorit. Sterilizarea termic prezint, ns, i o serie de
inconveniente, generate, n special, de reaciile secundare de
degradare care au loc n timpul procesului de sterilizare:
- denaturarea proteinelor i inactivarea lor;
- denaturarea vitaminelor i a unor factori de cretere;
- supranclziri care iniiaz reacii de oxidare a fenolilor i a
acidului ascorbic, de polimerizare a aldehidelor nesaturate, de
caramelizare a hidrailor de carbon i brunificare a mediului.
De asemenea, n timpul sterilizrii termice, se produc reacii
de condensare a gruprilor aldehidice, din zaharuri reductoare, cu
gruprile aminice libere, din aminoacizi sau proteine, cu formare de
produi asemntori bazelor Schiff (reacia Maillard), produi toxici
pentru majoritatea microorganismelor. Pentru a fi evitat apariia
acestor compui, este recomandat sterilizarea separat a hidrailor
de carbon i a compuilor cu azot. Aceast recomandare devine

16

PROCESE DE STERILIZARE IN BIOTEHNOLOGIE

CURS 2

obligatorie n cazul n care se lucreaz cu medii de cultur

concentrate, la care apar diferene semnificative ntre energiile de
activare ale reaciilor de degradare (80 - 100 kJ/mol) i cele de
distrucie termic a sporilor microbieni (400 - 420 kJ/mol).
Multe din neajunsurile sterilizrii cu abur sunt diminuate prin
alegerea judicioas a tehnologiei de realizare a acestui proces, care
rmne, practic, cel mai sigur.
Din punct de vedere cinetic, procesul de distrucie termic a
microorganismelor poate fi descris prin diverse ecuaii, n funcie de
rata de distrucie termic, care poate fi logaritmic sau
nelogaritmic.
Distrucia termic logaritmic a microorganismelor este
descris matematic de ecuaia:

dN
kN
d

(2.1)

n care: N - numrul de microorganisme viabile/ml mediu;

k - constanta vitezei de distrucie termic, min -1;
- timpul de sterilizare, min.
Prin integrarea ecuaiei (2.1), n condiiile iniiale: = 0 i N =
No
(No
reprezint
contaminarea
iniial,
numr
de
microorganisme/ml mediu), se obine:
N N o e k sau

N
2,303
lg o
k
N

(2.2)

Aceast ecuaie permite determinarea duratei procesului de

sterilizare, pentru orice valoare a gradului de sterilizare. Raportul
2,303/k reprezint timpul necesar reducerii numrului de
microorganisme cu a zecea parte i poart denumirea de reducere
decimal, notat cu D.
Din reprezentarea grafic a acestei ecuaii pentru sterilizarea
sporilor de Escherichia coli i Bacillus stearothermophilus (figurile
2.1. i 2.2.) se constat c pentru acelai grad de sterilizare, timpul
de expunere variaz semnificativ la diferene reduse de
temperatur.

17

PROCESE DE STERILIZARE IN BIOTEHNOLOGIE

CURS 2

Figura 2.1. Distrucia termic a sporilor de E. Coli

Figura 2.2. Distrucia termic a sporilor de B. stearothermophilus

De asemenea viteza specific de distrucie termic a
microorganismelor, k, este funcie numai de temperatur i poate fi
determinat cu ajutorul urmtoarelor ecuaii:
Ea

- ecuaia Arrhenius: k k o e RT
- ecuaia Eyring:

(2.3)
H *

k
k B T e RT e
h

S *
R

(2.4)

sau n funcie de coeficientul termic al reaciei, Q10:

1
10
k
t Q10 1

(2.5)

Datele publicate de Aiba privind valorile vitezei specifice de

distrucie termic, k, a reducerii decimale, D, i a energiei de
activare, Ea, prezentate n tabelul 2.3, evideniaz faptul c sporii
necesit condiii mai severe pentru sterilizare, comparativ cu
celulele vegetative.

18

PROCESE DE STERILIZARE IN BIOTEHNOLOGIE

CURS 2

Tabel 2.3. Valorile vitezei specifice de distrucie termic k, a

reducerii decimale, D, i a energiei de activare E a
K la 121C,
D la 121C,
Ea,
Microorganism
-1
-1
min
min
kJ/mol
Bacillus subtilis
2,6 - 3,8
0,6 - 0,9
317,68
Bacillus
2,9
0,8
283,0
stearothermophilus
Clostridium
1,8
1,3
342,76
sporogenes
Prokop i Humphrey au dezvoltat un model cinetic
nelogaritmic pentru sterilizarea unor medii, model care se bazeaz
pe desfurarea procesului n 2 secvene, conform schemei:

NR

kR

NS

kS

ND

Acest model este caracteristic comportrii sporilor de Bacillus

stearothermophilus, fenomen redat n figura 2.3. i descris de
ecuaiile:
dN R
k R N R
d

(2.6)

dN S
kR N R kS N S
d

(2.7)

unde:
NR, NS, ND - concentraia sporilor rezisteni, sensibili,
respectiv distrui, nr. microorganisme/ml;
kR, kS - vitezele specifice de distrucie termic, min-1.

19

PROCESE DE STERILIZARE IN BIOTEHNOLOGIE

CURS 2

Figura 2.3. Distrucia sporilor de B. Stearothermophilus la

diferite temperaturi
Energia de activare pentru distrugerea sporilor are valori
cuprinse ntre 200 i 400 kJ/mol, iar pentru enzime i vitamine ntre
10 i 110 kJ/mol.
Soluia ecuaiilor anterioare este:
kR
N

No kR kS

k
e k S S e k R
kR

(2.8)

n care: No i N reprezint contaminarea iniial i final.

Procesul de sterilizare a mediului de cultur poate fi realizat
prin procedee discontinue (pentru cantiti mici de mediu, de obicei
pentru inoculator i, mai rar, pentru fermentatorul intermediar) i
continue (pentru cantiti mari de mediu), utilizndu-se ca agent de
nclzire abur saturat sau energia electric.
2.1.1. Sterilizarea discontinu a mediilor de cultur
Analiza performanelor procesului de sterilizare discontinu a
mediilor de cultur se bazeaz pe cinetica distruciei sporilor
bacterieni cu cea mai mare termostabilitate, precum i pe relaia
timp - temperatur prezentat anterior. Sterilizarea efectiv se
produce n perioada de nclzire, meninere i rcire a mediului, iar
efectul total al sterilizrii este rezultatul cumulat al efectelor obinute
n fiecare din aceste etape.

20

PROCESE DE STERILIZARE IN BIOTEHNOLOGIE

CURS 2

Ecuaia vitezei de distrucie termic a microorganismelor

n sterilizarea discontinu se obine prin combinarea ecuaiilor (2.1)
i (2.3):
E

a
dN
k N k o e RT N
d

(2.9)

a
No
k o e RT d
N
0
E

ln

(2.10)

n acord cu Deindoerfer, raportul ln(No/N) se noteaz cu i

reprezint criteriul de proiectare a procesului de sterilizare
discontinu:

ko e

Ea
RT

(2.11)

Acest criteriu adimensional descrie eficacitatea procesului de

sterilizare i permite determinarea timpului optim de sterilizare n
funcie de sursa de nclzire folosit. Timpul total de sterilizare este
egal cu suma timpilor de nclzire, meninere, rcire. Prin urmare,
unele microorganisme (Escherichia coli, Aerobacter aerogenes) vor
fi distruse n faza de nclzire, altele (Bacillus stearothermophilus) n
faza de meninere, iar un numr redus n perioada de rcire.
n aceste condiii, ecuaiile (2.10.) i (2.11.) pot fi scrise n
forma:
ln

respectiv:

No
N
N
N
ln o ln 1 ln 2
N
N1
N2
N

total incalzire mentinere racire

(2.12)

(2.13)

n care: N1 - nivelul de contaminare la sfritul fazei de nclzire;

N2 - nivelul de contaminare la sfritul fazei de meninere;
N3 - nivelul de contaminare remanent (dup faza de rcire).
1

incalzire k o e

Ea
RT

(2.14)

mentinere k o e
1

21

Ea
RT

(2.15)

PROCESE DE STERILIZARE IN BIOTEHNOLOGIE

CURS 2
3

racire k o e

Ea
RT

(2.16)

Rezolvarea acestor ecuaii se poate face prin utilizarea

relaiilor timp-temperatur stabilite de Deindoerfer i Humphrey
pentru diferite sisteme de nclzire, relaii prezentate n tabelul 2.4.
Tabelul 2.4. Relaii timp-temperatur n sterilizarea discontinu
Mod de
nclzire
nclzire cu
abur viu
nclzire cu
abur n
manta
nclzire
electric
Rcire prin
manta

Relaia timp-temperatur

T To 1
1

T Ta 1 e

Constante

H D
M C pm To

D
M

(2.17.)

(2.18.)

T To 1

(2.19.)

T Te 1 e

(2.20.)

K S
M C pm

Ta To
Ta

q
M C pm To

K S
W C pa
W C pa

1 e
M C pm

To Te

Te

Mrimile din tabelul 2.4 au urmtoarele semnificaii:

T - temperatura de sterilizare, K
To - temperatura iniial a mediului, K
Ta - temperatura agentului de nclzire, K
Te - temperatura agentului de rcire, K
D - debitul aburului, kg/s
H - entalpia aburului, kJ/kg
M - cantitatea de mediu supus sterilizrii, kg
Cpm - cldura specific a mediului, kJ/kgK
Cpa - cldura specific a agentului de rcire, kJ/kgK
K - coeficient global de transfer de cldur, W/m2K
S - suprafaa de transfer de cldur, m 2
W - debit de agent de rcire, kg/s
q - flux termic, kJ/s

22

PROCESE DE STERILIZARE IN BIOTEHNOLOGIE

CURS 2

- timp, s.
Durata fiecrei etape din proces se poate determina cu
uurin prin alegerea modului de nclzire a mediului supus
sterilizrii. De exemplu, pentru cazul sterilizrii cu abur viu, durata
fazei de nclzire se calculeaz cu ajutorul expresiei (2.17):
incalzire

T To
To T To

(2.21)

iar faza de rcire din relaia (2.20.):

racire

T Te

ln
ln
Te

(2.22)

Apoi cunoscndu-se contaminarea iniial, No, i cea final,

N, se calculeaz contaminarea la sfritul perioadei de nclzire:

ln N 1 ln N o k o

incalzire

E
1
exp a

RTo
1

(2.23)

i la sfritul perioadei de meninere, care corespunde nceputului

etapei de rcire:
ln N 2 ln N k o

racire

E
1
exp a

RTe 1 e
mentinere

(2.24)

n continuare, se calculeaz durata fazei de meninere, pe

baza valorilor contaminrilor N1 i N2 determinate anterior:

mentinere
E
N1
1
ln
k o exp a

N2
RT
incalzire
1

(2.25)

Cu datele obinute se traseaz diagrama timp-temperatur

pentru procesele de sterilizare discontinue (figura 2.4).

23

PROCESE DE STERILIZARE IN BIOTEHNOLOGIE

CURS 2

Pentru unele cazuri concrete, aportul perioadelor de nclzire

i rcire la distrugerea microorganismelor din mediul de cultur
poate atinge 65%.

Figura 2.4. Diagrama timp-temperatur pentru sterilizarea

discontinu
ti - temperatura iniial
tf - temperatura final
ts - temperatura de sterilizare
n prezent, pentru proiectarea procesului de sterilizare a
mediilor de cultur i a instalaiilor n care se realizeaz procesul
biotehnologic, se recomand utilizarea caracteristicilor sporilor de
Bacillus stearothermophilus sua 1518, pentru care:
k o 10 36, 2 s 1 si E a 282,9 kJ / mol

Cu ajutorul acestor date i n ipoteza c nclzirea i rcirea

mediului supus sterilizrii se realizeaz cu o vitez de 1 grad/min,
Richards rezolv ecuaiile (2.12) - (2.25), rezultatele obinute fiind
prezentate n tabelul 2.5.
Tabelul 2.5. Valorile vitezei specifice de distrucie termic i ale
criteriului de sterilizare pentru sporii de B. stearothermophilus sua
1518 funcie de temperatur
Temperatura,
o
C
100
101
102

k,min1

total

0,019
0,025
0,032

0,044
0,073

Temperatura,
C
122
123
124

24

k,min-1

total

3,160
3,925
4,881

15,825
19,000
24,165

PROCESE DE STERILIZARE IN BIOTEHNOLOGIE

CURS 2

103
104
105
106
107
108
109
110
111
112
113
114
115
116
117
118
119
120
121

0,040 0,116
0,051 0,168
0,065 0,237
0,082 0,319
0,105 0,412
0,133 0,551
0,165 0,726
0,212 0,930
0,267 1,192
0,336 1,536
0,423 1,948
0,531 2,460
0,666 3,150
0,835 3,983
1,035 5,083
1,302 6,265
1,607 7,975
2,030 10,050
2,530 12,585

125
126
127
128
129
130
131
132
133
134
135
136
137
138
139
140
141
142

6,056
7,502
9,293
11,350
14,200
17,524
18,600
20,060
23,400
29,500
37,200
46,800
59,000
74,200
93,500
104,800
118,000
148,000

30,535
38,130
47,530
58,880
73,080
90,580
98, 980
117,580
130,980
160,480
197,680
2440480
298,480
377,680
471,180
575,980
693,980
841,990

Dac viteza de nclzire sau rcire peste 100 oC se abate de la

valoarea indicat, 1 grad/min, atunci criteriul sterilizrii, n faza de
nclzire i de rcire, se calculeaz cu expresiile:
incalzire T

incalzire
t S 100

racire T

racire
t S 100

(2.26)

n care: tS- temperatura de sterilizare, oC;

nclzire, rcire - durata de nclzire de la 100 oC la ts, respectiv de
rcire de la ts la 100oC;
T - valoarea tabelar a criteriului sterilizri determinat n
condiiile unei nclziri cu o vitez de 1 grad/min.
n faza de meninere, temperatura de sterilizare fiind
constant, criteriul sterilizrii se determin cu ecuaia:
mentinere k mentinere

(2.27)

Valorile vitezei specifice de distrucie termic a

microorganismelor, k, sunt date n tabelul 2.5. Astfel, se poate

25

PROCESE DE STERILIZARE IN BIOTEHNOLOGIE

CURS 2

calcula valoarea criteriului total de proiectare a sterilizrii cu ajutorul

ecuaiei (2.13).
Pentru caracterizarea cantitativ a procesului de sterilizare n
faza de meninere i pentru determinarea limitelor inferioare care
asigur sigurana n sterilizare, literatura propune utilizarea
indicelui de eficacitate aseptic, Sas, i a valorii obligatoriu
necesare pentru criteriul sterilizrii, n . ntre cele dou mrimi
exist dependena redat de expresia:
n ln

No
S as

(2.28)

Pentru concretizarea celor prezentate, se va exemplifica

calculul de proiectare pentru situaia n care se sterilizeaz
discontinuu 3,5 m3 de mediu de cultur prin nclzire de la 100C la
135C, n timp de 30 minute, meninere la 135 oC timp de 25 minute
i rcire pn la 100C n 40 minute. Indicele de eficacitate aseptic,
identic cu contaminarea final admis, N, este S as = 0,001, iar
contaminarea iniial este de 106 microorganisme/ml mediu.
Iniial, se calculeaz criteriul total al sterilizrii. Pentru aceasta,
din tabelul 2.5, se ia valoarea criteriului sterilizrii la 135C:
T 197,68 , iar cu relaia (2.26) se calculeaz valoarea criteriului
sterilizrii pentru perioada de nclzire:
incalzire T

incalzire
30
197,7
169,5
t S 100
135 100

Din acelai tabel, valoarea vitezei specifice de distrucie a

microorganismelor la 135oC este k = 37,2 min-1, iar cu relaia (2.27)
se determin criteriul sterilizrii pentru etapa de meninere:
mentinere k mentinere 37,2 25 930

n mod analog, se calculeaz criteriul sterilizrii n faza de

rcire, cu expresia (2.26):
racire T

racire
40
197,7
225,9
t S 100
135 100

Valoarea total a criteriului sterilizrii, calculat cu relaia

(2.13), este:
T 1325,4 .

26

PROCESE DE STERILIZARE IN BIOTEHNOLOGIE

CURS 2

Criteriul sterilizrii absolut necesar pentru acest caz se

calculeaz cu ecuaia (2.28):
n ln

N o 10 6 V
10 6 10 6 3,5
ln
35,79
N
10 3

Aceast valoare nu include o serie de factori, printre care:

aglomerarea celulelor, aciunea agenilor activi de suprafa,
prezena unor spori singulari cu rezisten termic sporit, fapt care
a impus ca, n situaia n care se obine din calculele de proiectare
n mic, s se admit n practic valoarea n = 800.
Cu valoarea adoptat pentru n se recalculeaz timpul de
meninere:
mentinere n incalzire racire 800 16,5 25,9 404,6

iar meninere calculat cu relaia (2.27), devine:

mentinere

mentinere
404,6

10,8
k
37,2

minute

Pentra a evita supranclzirile i degradarea componentelor

mediului de cultur, se recomand conducerea sterilizrii cu
calculatorul de proces, chiar dac aceasta conduce la creterea
investiiei.
Aparatura utilizat pentru sterilizarea discontinu este, de
obicei, chiar fermentatorul n care urmeaz a fi realizat procesul de
cretere a biomasei microbiene.
2.1.2. Sterilizarea continu a mediilor de cultur
Sterilizarea continu a mediilor de cultur se aplic atunci
cnd debitele de mediu sunt ridicate i ofer o serie de avantaje,
comparativ cu sterilizarea discontinu, cum ar fi:
conservarea mai bun a proprietilor nutritive;
control superior al calitii procesului;
aparatur cu gabarit redus;
reducerea duratei ciclului de sterilizare;
productivitate i eficien sporit;
control automat;
realizarea de randamente superioare n faza de fermentaie.
Cea mai dificil problem n proiectarea sterilizatoarelor
continue o constituie stabilirea timpului de staionare a mediului n
zona de meninere. Fiind un lichid real, viteza medie de curgere a

27

PROCESE DE STERILIZARE IN BIOTEHNOLOGIE

CURS 2

mediului de cultur este funcie de distribuia radial a vitezelor n

seciunea sterilizatorului, distribuie reprezentat n figura 2.5.
Pentru curgerea tip piston, timpul mediu de staionare n zona
de meninere este egal cu timpul de meninere, respectiv cu timpul
de expunere a mediului la nclzire. Dei ar fi ideal s existe
curgerea tip piston, n practic, ns, curgerea mediilor este
turbulent i, ca urmare, timpul de staionare n zona de sterilizare
difer de la centru la peretele aparatului, fiind necesar stabilirea
unei valori medii.

Figura 2.5. Profilul vitezelor de curgere ale mediului de cultur

Parametrul care caracterizeaz cel mai exact gradul de
amestecare, respectiv dispersia, n curgerea turbulent a mediilor
de cultur prin sterilizatoarele continue este criteriul de dispersie al
sterilizatorului, D/v L (D - coeficient de dispersie, v - viteza medie
de curgere, L - lungime caracteristic). Acest criteriu reprezint
inversul criteriului Pclet = vL/D, notat P, pentru transferul de
mas axial i are valori cuprinse ntre 0, pentru curgerea tip piston,
i infinit, pentru curgerea cu amestecare perfect.
Dup cum au demonstrat Levenspiel i Van der Laan, ntre
aceste valori extreme, criteriul de dispersie al sterilizatorului este
descris de o familie de curbe care caracterizeaz curgerea n zona
de sterilizare (figura 2.6). Aceste curbe teoretice redau distribuia
timpilor de staionare i au drept parametrii mrimea dispersiei.

28

PROCESE DE STERILIZARE IN BIOTEHNOLOGIE

CURS 2

Figura 2.6. Efectul diferitelor moduri de curgere n sterilizarea

continu a mediilor de cultur
Cu ajutorul acestor curbe, s-a stabilit dependena dintre natura
curgerii n sterilizarea continu, caracterizat prin criteriul P, i
procentul de degradare a mediului, ca rezultat al supranclzirilor.
Corelrile dintre valorile numerice ale curbei concentraie - timp din
zona de meninere (denumit curba I) i timpul redus (definit prin
raportul dintre timpul de staionare i timpul mediu de staionare ),
redate n figura 2.6, demonstreaz c odat cu creterea gradului
de dispersie crete procentul de mediu degradat.
Din informaiile prezentate, se constat c este necesar ca
proiectarea i realizarea sterilizatoarelor s fie astfel efectuate nct
s permit o apropiere ct mai mare de curgerea tip piston.
Pentru a se analiza modul n care criteriul dispersiei
influeneaz procesul de distrucie termic a microorganismelor, n
regim staionar, se combin ecuaia bilanului de materiale din
procesul de sterilizare cu ecuaia cinetic care descrie acest proces.
n acest sens, se consider un element de volum din sterilizatorul
tubular cu lungimea L i seciunea S, prin care circul mediul de
cultur cu viteza medie v constant i n care dispersia axial este
caracterizat prin coeficientul de dispersie D (figura 2.7).

29

PROCESE DE STERILIZARE IN BIOTEHNOLOGIE

CURS 2

Figura 2.7. Variabilele zonei de sterilizare

Pentru acest element de volum, bilanul de materiale este
descris de relaia urmtoare (2.29):
N int are v S N iesire v S flux

dN
DS

dl

int are

dN

DS

dl

ie ;ire

dispersie axiala

dN
S l 0
d

Prin rearanjarea termenilor se obine:

dN
v S N iesire N int are D S

dl

dN

dl

iesire

dN
S l 0

d
int are

(2.30)

Pentru -(dN/d) = kN (ecuaia (2.1)) i mprind ecuaia (2.30)

la S l rezult:

N iesire N int rare

D
l

dN

dl

dN

dl
l

iesire

int rare

(2.31)

kN 0

iar prin trecere la limit ( l 0):

D

d 2N
dN
v
kN 0
2
dl
dl

(2.32)

Ecuaia (2.32) reprezint expresia general a bilanului de

materiale la distrucia termic a microorganismelor prin reacie i
dispersie. Pentru rezolvarea ei se trece la o form adimensional,
prin introducerea urmtoarelor variabile:
N

N
No

vL
D

l
L

Nr

kL
v

Prin utilizarea acestor variabile, ecuaia (2.32) devine:

30

PROCESE DE STERILIZARE IN BIOTEHNOLOGIE

CURS 2

d2N
dN
P
P N r N 0
2
dz
dz

(2.33)

Rezolvarea ecuaiei (2.33) se face pentru urmtoarele condiii

de limit:

dN
P 1 N 0
dz
dN
0
dz

z 0+
z1

(2.34)

soluia ecuaiei (2.33) n condiiile de limit descrise de ecuaia

(2.34) fiind:
N

N z 1
N0

l L

1 vL
4 a exp

2 D

1 a 2 exp a v L 1 a 2 exp a v L
2 D
2 D

(2.35) n

care:
a 1 4 k

D
vL

Expresia (2.35) reprezint ecuaia de proiectare a

sterilizatoarelor continue i permite determinarea timpului de
staionare a mediului n zona de meninere, n funcie de criteriul de
dispersie (determinat din figura 2.6), pentru un anumit nivel al
contaminrii remanente. Pentru cazul n care curgerea se apropie
de curgerea tip piston (P ), soluia ecuaiei (2.33) devine:
N

No

lL

kL
exp

(2.36)

Prin reprezentarea ecuaiei (2.35) n coordonatele N/N o i Nr

se obine o familie de drepte, al cror parametru independent este
criteriul P, i care ilustreaz efectul diferitelor tipuri de curgere
asupra gradului de sterilizare, n procesul de sterilizare continu, la
diferite valori ale distruciei termice, redat prin raportul kL/v (figura
2.8).
Datele furnizate de aceast diagram permit att proiectarea
eficient a sterilizatoarelor, ct i stabilirea timpului de staionare a

31

PROCESE DE STERILIZARE IN BIOTEHNOLOGIE

CURS 2

mediului n zona de meninere, pentru un grad de sterilizare impus,

ntr-o instalaie existent. n primul caz, instalaia trebuie s
satisfac performanele tehnologice impuse, iar n al doilea caz,
performanele instalaiei de sterilizare limiteaz performanele
tehnologiei.
Pentru proiectarea unei noi instalaii continue de sterilizare a
mediului de cultur, se cunoate, de obicei, debitul de mediu i
durata sterilizrii (determinat n condiii economice), se impune
gradul de sterilizare i se determin lungimea zonei de meninere,
timpul de meninere i temperatura la care se desfoar procesul
de sterilizare.

Figura 2.8. Efectul tipurilor de curgere asupra gradului de

sterilizare
n acest scop, se admite viteza de curgere a mediului prin
sterilizator i se calculeaz diametrul zonei de meninere (din
ecuaia debitului) i criteriul Reynolds, Re. Cu valoarea Re calculat
se determin, din figura 2.9, valoarea dispersiei axiale D/vd (d diametrul zonei de sterilizare).
Apoi, din figura 2.6, se alege o valoare a criteriului P astfel
nct degradarea mediului s fie minim. Folosind dispersia axial
determinat anterior, se calculeaz lungimea zonei de meninere cu
relaia:

32

PROCESE DE STERILIZARE IN BIOTEHNOLOGIE

CURS 2

vL vd L

D
D d

(2.37)

n continure, cu ajutorul diagramei 2.8, n funcie de criteriul P

ales i de raportul N/N o impus, se determin mrimea Nr = kL/v,
respectiv valoarea vitezei specifice de distrucie termic k. Cu
aceast valoare, se poate calcula temperatura de sterilizare,
folosindu-se fie relaia (2.3), fie diagrama din figura 2.10, care este
corelaia dintre viteza specific de sterilizare i temperatura la care
se realizeaz procesul.

Figura 2.9. Variaia dispersiei axiale cu criteriul Re

Timpul mediu de staionare n zona de meninere a instalaiei
de sterilizare se determin n funcie de viteza de curgere a mediului
i lungimea zonei de meninere, folosindu-se dependena: = L/v.
Dac se dorete stabilirea timpului de staionare a mediului
supus sterilizrii ntr-o instalaie existent, se calculeaz viteza de
curgere i criteriul Re, iar din diagrama 2.9 se obine valoarea
raportului D/vd (criteriul dispersiei axiale). Cu aceast valoare se
calculeaz criteriul P, conform relaiei (2.37), iar din figura 2.8 se
determin, n funcie de criteriul P calculat i N/N o impus, raportul
kL/v i, apoi, valoarea vitezei specifice de sterilizare, k.
Din diagrama 2.10 se obine temperatura de sterilizare, iar din
relaia % - L/v timpul de meninere n zona de sterilizare.

33

PROCESE DE STERILIZARE IN BIOTEHNOLOGIE

CURS 2

Figura 2.10. Variaia vitezei specifice de distrucie termic a

microorganismelor cu temperatura de sterilizare
Trebuie menionat faptul c, n ambele cazuri prezentate,
raportul dintre cantitatea de mediu supus sterilizrii i cantitatea de
abur direct utilizat pentru nclzire fiind de aproximativ 10, influena
aburului condensat asupra criteriului Re este neglijabil, astfel nct
toate consideraiile anterioare constituie criteri de proiectare i
conducere a instalaiilor de sterilizare.
2.1.2.1. Instalaii pentru sterilizarea continu a mediilor de
cultur
Pentru sterilizarea continu a mediilor de cultur la nivel
industrial se folosesc instalaii care funcioneaz la temperaturi de
120 - 125C, precum i instalaii care lucreaz la 135 - 140C.
Instalaia de sterilizare continu la 120 125oC, prezentat
n figura 2.11, este alctuit din coloan de sterilizare (1), menintor
(2) i rcitor (3). Coloana de sterilizare este conceput din dou evi
concentrice, prin eava interioar fiind introdus aburul, mediul de
cultur circulnd prin spaiul dintre cele dou evi. nclzirea
mediului se face prin barbotarea aburului de 5 ata prin intermediul
fantelor practicate pe eava interioar, acesta fiind dirijat tangenial
i uniform cu ajutorul unui nec montat pe exteriorul evii. Mediul
staioneaz n coloan 4 - 6 secunde, dup care ptrunde n
menintor, unde rmne 15-20 minute pentru perfectarea
procesului de sterilizare. n final, mediul este rcit, ntr-un
schimbtor de cldur tip eav n eav, la 35 - 40C, temperatur
cu care este introdus n fermentator.

34

PROCESE DE STERILIZARE IN BIOTEHNOLOGIE

CURS 2

Figura 2.11. Instalaie continu de sterilizare la 120 - 125C

Din diagrama timp - temperatur, prezentat n figura 2.12, se
observ c, n aceast instalaie, contribuia fazei de nclzire i
rcire la performana procesului de sterilizare este de 5 - 6%, astfel
nct se poate considera c sterilizarea se realizeaz aproape n
totalitate n faza de meninere.

Figura 2.12. Diagrama timp - temperatur pentru sterilizarea

continu la l00 -125C
n procesul de sterilizare continu la 135 140oC, realizat
industrial fie n instalaii cu injecie de abur, fie n schimbtoare de
cldur cu plci, timpul de expunere este foarte scurt, rcirea
mediului trebuind realizat n cteva secunde. Din aceste motive,
problemele tehnice care apar sunt legate, aproape exclusiv, de
posibilitile de realizare a rcirii.
n instalaia de sterilizare prin injecie (figura 2.13), aburul
este injectat prin ventilul (1), astfel nct temperatura mediului urc
instantaneu la 140 - 142C.

35

PROCESE DE STERILIZARE IN BIOTEHNOLOGIE

CURS 2

Temperatura se menine 2-3 minute n serpentina de

meninere (2), dup care rcirea se face prin trecerea prin valva de
expansiune (3) n vasul de destindere (4). Prin expansiune i
destindere la vid, temperatura scade brusc. n acelai timp, ns, se
pierde i o cantitate de ap prin evaporare, fenomen de care se ine
seama la prepararea mediilor de cultur. Apa evaporat genereaz
pierderi de energie termic, fapt care constituie punctul slab al
instalaiei.

Figura 2.13. Instalaie de sterilizare a mediului de cultur la 140C

prin injecie de abur
n instalaia de sterilizare prin schimbtoare de cldur cu
plci, curgerea lichidului fiind pelicular, schimbul termic este
intensificat i n consecin, nclzirea la 140C se face n 15-20
secunde, iar dup etapa de meninere, rcirea se produce n 20 - 30
secunde, n recuperatorul de cldur (2) i rcitorul (1) (figura 2.14).

36

PROCESE DE STERILIZARE IN BIOTEHNOLOGIE

CURS 2

Figura 2.14. Instalaie de sterilizare la 140C prin schimbtoare de

cldur cu plci
1 - rcitor, 2 - prenclzitor, 3 - sterilizator, 4 - serpentin de
meninere
Din diagramele timp - temperatur, redate n figurile 2.15. a. i
b., se constat c, n aceste instalaii, contribuia fazei de nclzire i
rcire, la ciclul de sterilizare, nu depete 1 - 2%. Din acest motiv,
consideraiile teoretice prezentate anterior, referitoare la curgerea
mediilor de cultur prin zona de meninere, sunt valabile i pentru
aceste instalaii.

Figura 2.15. Diagrama timp - temperatur la sterilizarea prin injecie

de abur (a.) i n schimbtoare de cldur cu plci (b.)
n ultimul timp, au fost concepute noi instalaii de sterilizare a
mediului de cultur la temperatura de 140 - 142C, care conin
combinaii ale elementelor ce compun instalaiile de sterilizare prin
injecie sau n schimbtoare de cldur cu plci. n instalaia
prezentat n figura 2.16, nclzirea se face n recuperatorul de
cldur (3) i prin injecie de abur n (1), iar etapa de meninere se
realizeaz n serpentinele de meninere (2).

37

PROCESE DE STERILIZARE IN BIOTEHNOLOGIE

CURS 2

Figura 2.16. Sterilizarea mediului de cultur n instalaii cu

schimbtoare de cldur peliculare i injecie de abur
Rcirea se produce n schimbtoare de cldur cu plci i
decurge n dou etape: - rcirea preliminar n recuperatorul (3) cu
mediul supus sterilizrii;
- rcirea n rcitorul (4).
Instalaia din figura 2.17 funcioneaz pe principiul nclzirii
combinate a mediului de cultur:
- prin injecie de abur n (1) pn la temperatura de 70 - 85C;
- n recuperatorul (2) pn la temperatura de 100 - 105C;
- n schimbtorul de cldur cu plci (3) pn la 135 - 140C.
Dup meninere n serpentina de meninere (4), rcirea
mediului sterilizat se realizeaz n dou etape, folosindu-se
schimbtoarele de cldur cu plci (2) i (5).

Figura 2.17. Sterilizarea mediului de cultur n instalaii prin injecie

de abur schimbtoare de cldur cu plci

38

PROCESE DE STERILIZARE IN BIOTEHNOLOGIE

CURS 2

Aceste tipuri de instalaii valorific superior energia termic

rezidual i asigur o sterilizare avansat, concomitent cu
conservarea mai bun a calitatilor nutritive ale mediului de cultur.
2.2. Sterilizarea aparaturii de biosintez
Dintre toate posibilitile de sterilizare a aparaturii de
fermentaie (nclzire cu abur direct, nclzire prin manta sau/i
serpentine interioare, nclzire cu aer cald), cel mai eficient
procedeu, dup cum se constat i din figura 2.18, este sterilizarea
cu abur saturat introdus direct n aparat.

Figura 2.18. Durata proceselor de nclzire i rcire n sterilizarea

instalaiilor de fermentaie
a - nclzire cu abur n manta i serpentine, b - nclzire cu abur
direct,
c - rcire prin manta i serpentine;
1 - fermentator de 200 l, 2 600 l, 3 - 2 m 3, 4 - 20 m3

39

PROCESE DE STERILIZARE IN BIOTEHNOLOGIE

CURS 2

Utilizarea aburului direct asigur o nclzire mult mai rapid,

comparativ cu varianta de nclzire prin mantaua i serpentinele
fermentatorului, permind astfel, reducerea timpului total de
sterilizare cu cel puin o or.
Eficacitatea
procesului
global
de
inactivare
a
microorganismelor din bioreactor depinde, n mare msur, de
modul de aciune al aburului asupra prilor componente ale
aparaturii utilizate n fermentaie, inclusiv asupra armturilor. Se
cunoate faptul c cel mai dificil se sterilizeaz tuurile prin care se
introduc n bioreactor mediile de cultur, aerul, antispumanii,
precum i tuurile pentru elementele de msur, control i reglare a
parametrilor procesului de biosintez.
n funcie de utilitatea tehnologic, staturile cu care sunt
prevzute bioreactoarele pot fi clasificate n dou categorii:
- tuuri pentru utiliti tehnologice;
- tuuri de rezerv i de introducere a materialului de nsmnare.
tuurile pentru utiliti tehnologice se termin cu un ventil care
separ zona interioar steril de restul conexiunilor. Pentru
sterilizarea acestora, alimentarea cu abur se face fie direct, prin
ventil, fie prin conducta de legtur, situaie n care sunt necesare
dou ventile. n cazul tuurilor blindate, unde gsete o cantitate
nsemnat de aer, sterilizarea este mult mai dificil. La sterilizarea
acestor tuuri trebuie s se in cont c raportul dintre cantitatea de
aer la suprafaa flanei de blindaj i cantitatea de aer la intrare n
tu se gsete ntr-o dependen exponenial fa de coeficientul
de difuzie, cldura latent de condensare a aburului i dimensiunile
tuului. Analiza detaliat a acestor dependene demonstreaz c
temperatura n tu este cu att mai mic, cu ct este mai mare
cantitatea de aer (nu se admite o temperatur inferioar valorii de
120 - 121C), tuurile cu diametru mai mare sterilizndu-se mult
mai uor.
2.3. Sisteme de inoculare i transvazare steril
Conservarea proprietilor aseptice ale culturilor monocelulare
unice impun luarea unor msuri severe att n etapa de inoculare,
ct i n faza de transvazare dintr-un bioreactor n altul mai mare,
pentru desvrirea creterii biomasei microbiene. Pentru
nsmnarea aseptic a sporilor (materialul de inoculare) au fost
dezvoltate dou tehnici:

40

PROCESE DE STERILIZARE IN BIOTEHNOLOGIE

CURS 2

- nsmnarea sub protecia unei flcri;

- nsmnarea cu ajutorul unei instalaii conceput pentru acest
scop.
n primul caz, flacra trebuie s asigure sterilizarea zonei
capacului n care se gsete gura de nsmnare, iar n timpul
introducerii suspensiei de spori flacra trebuie s asigure
securitatea mpotriva unei eventuale infestri.
Mai uoar i mai sigur este nsmnarea aseptic sub
presiune de aer steril (figura 2.19). Recipientul cu inocul se
conecteaz la sistemul de conducte n punctele A i B, sterilizate n
prealabil. Dup conectare, se resterilizeaz traseele prin
deschiderea ventilelor E, F, G i slbirea legturilor din punctele A i
B, se trece abur de 125 - 130C, timp de 20 - 25 minute, dup care
se strng etan conexiunile A i B i se nchid ventilele E, F, G. n
continuare, se deschide ventilul D, pentru accesul aerului steril
comprimat, iar, dup rcire, se deschid ventilele H, I i C, pentru
trecerea sporilor n fermentator. La sfritul operaiei, se nchid
ventilele C i D i canelele A i B, demontndu-se recipientul n care
a fost suspensia de spori.

Figura 2.19. Transferul aseptic al suspensiei de spori

Pentru transvazarea biomasei microbiene dintr-un bioreactor
n altul, se poate folosi fie un racord flexibil i o pomp peristaltic,
fie transvazarea cu aer steril sub presiune, cu ajutorul unui sistem
similar celui descris anterior (figura 2.20).

41

PROCESE DE STERILIZARE IN BIOTEHNOLOGIE

CURS 2

Figura 2.20. Transferul aseptic al biomasei

Sterilizarea legturilor dintre bioreactoare se realizeaz cu
abur de 5 ata, timp de 20 - 25 minute, prin deschiderea ventilelor
A,B, D, E, H, I i a celor de acces a aburului. Condensul se
colecteaz n nchiderile hidraulice (oale de condens), iar, dup
sterilizare, se nchid ventilele G, H, I, J i se deschid ventilele C i F
pentru transvazare. n scopul prevenirii unei posibile infestri,
este recomandat ca circuitul principal (A - B) s fie prevzut cu
conduct nsoitoare prin care s circule abur n timpul transvazrii.
2.4. Sterilizarea aerului
Procesele industriale de fermentaie sunt, aproape n totalitate,
procese aerobe i, n marea lor majoritate, aseptice. Necesarul orar
de aer steril variaz ntre 60 i 120 m 3 aer/m3 mediu de cultur. n
sterilizarea acestor debite mari de aer apar dificulti generate, pe
de o parte, de varietatea microorganismelor prezente (virui,
bacterii, spori bacterieni, fungi), iar pe de alt parte, de rezistena lor
la temperaturi uscate.
Studiind procesul de sterilizare a aerului, Aiba a determinat
speciile reprezentative de bacterii i spori care trebuie ndeprtate n
mod obligatoriu, pentru a fi asigurate condiiile unei fermentaii
aseptice (tabelul 2.6).
Tabelul 2.6. Speciile reprezentative de bacterii i spori bacterieni din
aer

42

PROCESE DE STERILIZARE IN BIOTEHNOLOGIE

CURS 2

Specia bacterian
Bacterii:
Aerobacter aerogenes
Bacillus cereus
Bacillus licheniformis
Bacillus megaterium
Bacillus subtilis
Bacillus mycoides
Micrococcus aureus
Proteus vulgaris
Spori bacterieni:
Bacillus megaterium
Bacillus mycoides
Bacillus subtilis

Dimensiunile caracteristice
Lungime,
Lime,

1,0 - 2,5
8,1 - 25,8
1,8 - 3,3
2,0 - 10,0
1,6 - 4,8
1,6 - 13,6
0,5 - 1,0
1,0 - 3,0

1,0 - 1,5
1,3 - 2,0
0,5 - 0,7
0,9 - 2,1
0,5 - 1,1
0,6 - 1,6
0,5 - 1,0
0,5 - 1,0

0,9 - 1,7
0,8 - 1,8
0,9 - 1,8

0,6 - 1,2
0,8 - 1,2
0,5 - 1,0

Cu toate c sterilizarea aerului se poate realiza att prin

procedee termice, ct i prin filtrare, metoda cea mai utilizat n
industrie este filtrarea. Pentru sterilizare prin filtrare se pot folosi
urmtoarele materiale filtrante:
- fibre de sticl cu diametru cuprins ntre 5 i 18 ;
- nitrat de celuloz, pentru filtrul cu membran;
- teflon cu o mare rezisten termic (pn la 300C) i caracter
hidrofob, utilizat sub form de folii de teflon sau n amestec cu
polietilen;
poliamid (nylon), caracterizat prin rezisten termic,
hidrofobicitate, elasticitate i durabilitate.
Pentru sterilizarea aerului prin filtrare, n principiu, exist trei
tipuri de filtre cu aplicabilitate practic. Primul tip, filtrul cu fibre de
sticl, prezentat n figura 2.21, este alctuit dintr-un strat de
material filtrant fixat ntre dou site, susinute de dou plci perforate
(diametrul perforaiilor este de 0,7 - 0,8 cm). Filtrul este prevzut cu
manta de nclzire, care permite uscarea materialului filtrant
sterilizat cu abur direct. Acest tip de filtru, indicat pentru industria de
biosintez, ofer posibilitatea sterilizrii unor debite ridicate de aer,
realizarea unui grad avansat de purificare i durat ndelungat de
funcionare.
Dezavantajele filtrului cu fibre sunt: operaii complicate la
schimbarea fibrelor de sticl (durata 2,5 - 3 ore), manipularea

43

PROCESE DE STERILIZARE IN BIOTEHNOLOGIE

CURS 2

neplcut a fibrelor de sticl i anularea efectului de sterilizare dup

umezirea materialului filtrant fibros.

Figura 2.21. Filtru cu fibre de sticl pentru terilizarea aerului

1 - plac perforat, 2 - plas de srm, 3 - garnitur de cauciuc, 4 material filtrant, 5 - ram
Din a doua categorie fac parte aa-numitele fibre disc cu
membran (filtre absolute, filtre milipori), redate schematic n figura
2.22. Acest tip de filtru este indicat att pentru sterilizarea aerului,
ct i pentru sterilizarea lichidelor. Membranele folosite sunt
membrane microporoase cu dimensiuni ale porilor 0,2 . Sterilizarea
filtrului se face cu abur direct introdus pe direcia fluxului de aer.
Dac membrana filtrului este format dintr-un material hidrofob,
umiditatea aerului nu deranjeaz procesul de filtrare, respectiv de
sterilizare, ceea ce permite utilizarea lor i ca filtre de ieire.

Figura 2.22. Filtru disc cu membrane

1 - sit-suport, 2 - membran, 3 - carcas

44

PROCESE DE STERILIZARE IN BIOTEHNOLOGIE

CURS 2

Dezavantajele acestor filtre constau n productivitatea redus,

datorit suprafeei mici de filtrare, i durat relativ scurt de via a
membranei.
A treia categorie de filtre include filtrele-lumnare (figura
2.23).
Carcasa filtrelor poate s includ unul sau mai multe elemente
de filtrare (filtre-lumnare). Filtrarea se realizeaz fie printr-o
membran, fie prin trei straturi de fibre nfurate n jurul unei evi
poroase. Avantajele acestor filtre sunt reprezentate de suprafaa
ridicat de filtrare, posibilitatea sterilizrii unor debite mari de aer
ntr-un timp scurt, durat lung de funcionare, ntreinere simpl i
schimbare rapid a elementelor de filtrare (10 -12 minute).

Figura 2.23. Filtru lumnare pentru sterilizarea aerului

1 carcas; 2 membran; 3 ventil aerisire; 4 garnituri de
etanare
Sterilizarea acestor filtre se face cu abur direct, iar condensul
este ndeprtat prin suflare cu aer steril. Experiena practic a
confirmat durata mare de funcionare a filtrelor-lumnare, care pot
suferi 200 de sterilizri termice n timp de 3,5 - 4 ani.
Schema de principiu a liniei de purificare i sterilizare a aerului
prin filtrare pe material fibros este redat n figura 2.24. Conform
acestei scheme, aerul, separat de impuriti n filtrul (1), trece prin
compresorul (2), unde este comprimat adiabatic la 3 - 3,5 at,
temperatura crescnd la 150 - 160C. Dup rcire n (3), aerul este
introdus n separatoral de picturi (4), filtrul principal cu material
fibros (5) (prima treapt de sterilizare), filtrul individual cu material

45

PROCESE DE STERILIZARE IN BIOTEHNOLOGIE

CURS 2

fibros (a doua treapt de sterilizare), dup care ptrunde n

fermentator.

Figura 2.24. Schema de purificare i sterilizare a aerului

Sterilizarea pe material fibros poate fi descris printr-un model
de curgere prin ocolire (figura 2.25), fenomen care impune absena
total a umiditii din filtru (prezena umiditii transform curgerea
prin ocolire n curgere prin alunecare, anulnd total proprietile
filtrante).
Din aceste motive, rcirea aerului n rcitorul (3) se face pn
la apariia condensului, iar, dup separarea lui, aerul saturat se
prenclzete cu aer fierbinte pn cnd temperatura de ieire din
filtrul individual (6) depete cu cel puin 12C temperatura
punctului de rou. Stabilirea parametrilor de funcionare ai instalaiei
de sterilizare se face numai n funcie de parametrii termodinamici ai
aerului.

Figura 2.25. Modelul curgerii perpendiculare a aerului pe fibr

Reinerea microorganismelor pe fibrele de sticl, n procesul
de filtrare a aerului, se realizeaz ca efect al combinrii urmtoarelor
fenomene: impact inerial, intercepie, difuzie i atracie
electrostatic. Analiza cantitativ a procesului de reinere a

46

PROCESE DE STERILIZARE IN BIOTEHNOLOGIE

CURS 2

particulelor din aer pe filtre de fibr de sticl a evideniat c

eficacitatea filtrrii depinde de caracteristicile materialului fibros i de
parametrii operaiei de filtrare.
Considerndu-se c influena atraciei electrostatice este
foarte redus, eficacitatea reinerii microorganismelor pe o fibr
individual, , poate fi calculat cu relaia urmtoare:
i int d
(2.38)
n care: i - randamentul reinerii prin impact inerial;
int - randamentul reinerii prin intercepie;
d - randamentul reinerii prin difuzie.
Pentru cazul fibrei individuale cu seciune sferic, aranjat
perpendicular pe direcia de curgere a aerului, astfel nct particulele
microbiene care lovesc fibra sunt reinute pe aceasta, randamentul
separrii prin impact inerial se determin cu expresia urmtoare:
i

b
df

(2.39)

unde b reprezint limea zonei de impact a fluxului de aer, iar df

diametrul fibrei (figura 2.25). Trebuie menionat faptul c reinerea
microorganismelor prin impact inerial se anuleaz dac viteza
aerului este mai mic dect viteza critic, eficiena total de
colectare reducndu-se. Viteza critic este dependent de diametrul
particulei i de diametrul fibrei, conform ecuaiei:
v c 1,125

df

cp dp

(2.40)

n care: c - factor de corecie Cunninghan, determinat cu ecuaii

empirice;
dP - diametrul particulei;
p - densitatea particulei;
- vscozitatea aerului.
Efectul diametrelor d, i dP asupra vitezei critice este redat
grafic n figura 2.26.

47

PROCESE DE STERILIZARE IN BIOTEHNOLOGIE

CURS 2

Figura 2.26. Efectul diametrului fibrei i a diametrului particulelor

asupra vitezei critice de curgere a aerului prin filtrul cu fibre
Pentru determinarea randamentului de separare prin
intercepie, a fost propus urmtoarea relaie, cu condiia ca distana
dintre fibrele colectoare s fie mai mic de dp/2:
int

unde:

1
1

2 1 R ln 1 R 1 R
2 2 ln Re
1 R

(2.41)

R - parametrul interceptrii (R = dp/df);

Re - criteriul Reynolds (Re = df v a / )
v - viteza medie a aerului
a - densitatea aerului.
Eficiena separrii prin difuzie se calculeaz cu expresia:

2 xo
2 xo
1
d
2 1
ln 1

2 2 ln Re
d
df
f

1
1 2 xo

2
d
f

1 xo
df

n care:

xo
2 2 ln Re D B
1
1,12

df
2
vdf

1
3

(2.42)

DB

c kB T
3 d p

xo - grosimea filmului de aer n jurul fibrei;

DB - coeficientul de difuzie al microorganismului;
kB - constanta Boltzman;
T - temperatura, K.
Pentru determinarea acelorai mrimi au fost propuse i
ecuaii criteriale, n care reinerea este rezultatul numai a proceselor
de difuzie i interceptare:

48

PROCESE DE STERILIZARE IN BIOTEHNOLOGIE

CURS 2

d Sc

2
3

Re

11
18

int R 2 Re 6 (2.43)

Consideraiile anterioare sunt valabile pentru o fibr

individual izolat. n realitate, numrul de particule reinute pe fibra
individual din stratul filtrant este mult mai mare, datorit influenei
pozitive a fibrelor vecine. Aceast cretere depinde de fracia de
volum a fibrelor n stratul filtrant, , i de criteriul Re. Relaia dintre
randamentul separrii pe fibra individual din stratul filtrant, , i
fibra izolat, , este de forma:
1 k
(2.44)
sau
1 4,5
pentru 0< <0,l i Re = 0,2 (k fiind o
constant).
Pentru caracterizarea global a performanei reinerii
microorganismelor prin intercepie i difuzie, factori determinani n
proces, se definete randamentul de reinere t, cu ajutorul relaiei:
t

unde:

Nr
No

(2.45)

Nr - numrul de microorganisme reinute pe filtru;

No - numrul iniial de microorganisme.
Corelaia dintre i t este descris de expresia:

d f 1
4 H

ln

d f 1
No
1

ln
No Nr
4 H
1 t

(2.46)

Ecuaia (2.46) poate fi utilizat pentru determinarea nlimii H

a stratului filtrant folosit la sterilizarea aerului.
Plecnd de la premisa c dac o particul atinge o fibr este
reinut de aceasta i c exist o concentraie uniform a
particulelor n orice orificiu al filtrului, astfel nct fiecare strat reduce
numrul de microorganisme n aceeai proporie, Stanberg a propus
pentru stabilirea nlimii stratului filtrant urmtoarea ecuaie:
dN
K N
dH

(2.47)

N fiind concentraia particulelor din stratul filtrant, iar K o constant.

Prin integrare, se obine:

49

PROCESE DE STERILIZARE IN BIOTEHNOLOGIE

CURS 2
N
e K H
No

respectiv

ln

N
K H
No

(2.48)

unde:
No - concentraia particulelor din aer la intrarea n filtru;
N - concentraia particulelor din aer la ieirea din filtru.
Expresia (2.48) sub form logaritmic este cunoscut sub
denumirea de relaia logaritmic a penetraiei. n acest context,
eficacitatea filtrului, E, definit ca raportul dintre numrul de particule
reinute i numrul iniial de particule din aerul supus sterilizrii, va
fi:
E

No N
N
1
1 e K H
No
No

(2.49)

aceast relaie putnd fi util n calculul nlimii stratului filtrant.

Relaia logaritmic a penetraiei a fost folosit de Humphrey i
Gaden n proiectarea sterilizatoarelor, care au utilizat conceptul X 90.
Acesta indic faptul c stratul filtrant reine 90% din numrul total de
microorganisme intrate n filtru. Astfel, cu ajutorul ecuaiei (2.48), se
obine:
ln

1
K X 90
10

sau

2,303 lg

X 90

2,303
K

1
K X 90
10

(2.50)

de unde rezult:
(2.51)

Relaia (2.48) sugereaz faptul c dependena grafic a

ln(No/N) funcie de H reprezint o dreapt a crei pant este K.
Valoarea constantei K este influenat sensibil de natura materialului
filtrant i de viteza liniar a aerului la trecerea prin filtru. De
asemenea, dup cum se constat din tabelul 2.7, mrimea
parametrul X90, depinde de aceeai factori.
Tabel 2.7. Valorile parametrului X90 n funcie de viteza aerului
pentru diferite materiale filtrante
Material
filtrant

Diametru,

Microorganisme

50

v,
cm/s

X90

PROCESE DE STERILIZARE IN BIOTEHNOLOGIE

CURS 2

16

Spori de Bacillus
subtilis

18,5

Seratia murcescens

8,5

Escherichia coli
(Fagi tip 129)

Fibre de sticl

Fibre de sticl
Norite
(15-30 mesh)
Crbune activ
(4-8 mesh)

Spori de Bacillus
cereus
Spori de Bacillus
cereus

3
15
30
150
300
3,9
78
3
15
30
150
300
1,4
6,4
18
28,5

4,0
9,0
11,5
1,5
0,4
3,1
3,0
0,4
0,6
0,7
0,8
0,9
1,7
1,5
1,7
8,7

Din reprezentarea grafic a dependenei mrimilor K i X 90 de

viteza liniar a aerului, v, din figura 2.27, se constat existena a
dou domenii de variaie a lui K: iniial, creterea valorii lui K odat
cu creterea vitezei liniare a aerului, urmat de reducerea valorii
acestui parametru.

Figura 2.27. Influena vitezei liniare de curgere a aerului

asupra performanelor procesului de sterilizare
Pentru primul domeniu de variaie, evoluia parametrului K
este rezultatul creterii importanei reinerii microorganismelor
datorit impactului. ns, odat cu creterea vitezei de curgere a
aerului i depirea unui anumit nivel, apare fenomenul de vibraie a

51

PROCESE DE STERILIZARE IN BIOTEHNOLOGIE

CURS 2

fibrelor (scuturare) i de generare a canalelor prefereniale de

curgere, ceea ce determin antrenarea microorganismelor reinute
pe fibr. Din studiile experimentale prezentate n literatura de
specialitate, s-a constatat c viteza liniar optim a aerului este de
0,15 - 0,30 m/s, iar pentru o vitez de 0,15 m/s constanta K are
valoarea 1,535 cm-1.
n scopul dimensionrii filtrului prin metoda penetraiei, se
utilizeaz gradul de ncrcare microbian iniial a aerului i limita
inferioar de ncrcare microbian admis la intrarea n fermentator
i se aplic relaia logaritmic a penetraiei. Astfel, dac procesul de
fermentaie se realizeaz ntr-un fermentator de 30 m 3, timp de 100
ore, cu un consum de aer de 15 m 3/min, iar aerul conine 250
microorganisme/m3, contaminarea total va fi:
N o 15 60 100 250 2,25 10 7

microorganisme.

Deoarece aerul care este barbotat n fermentator nu trebuie s

aib o contaminare mai mare de 10-3 microorganisme, relaia
logaritmic a penetraiei va deveni:
ln

10 3
K H
2,25 10 7

ln 4,44 10 11 1,535 H

sau

obinndu-se:
H = 15,52 cm (nlimea sau grosimea stratului
filtrant).
Prin urmare, filtrul utilizat pentru sterilizarea aerului are un
strat de fibre de sticl gros de 16 cm, pentru o vitez a aerului de
0,15 m/s, creia i corespunde K = 1,535 cm -1. Din ecuaia debitului
se calculeaz, apoi, diametrul filtrului:
D2
15
v
0,25 D
4
60

1
1,46 m
0,15

Eficacitatea filtrului proiectat este dependent, n foarte mare

msur, de viteza liniar a aerului. Dac viteza aerului scade de la
0,15 m/s la 0,03 m/s, atunci K va avea valoarea 0,2 cm-1, iar
numrul de microorganisme N existente n fluxul de aer la intrarea n
fermentator va fi N = 33,80, respectiv, n fermentator, ntr-un minut,
ptrund 33,8 microorganisme. Pentru asigurarea contaminrii

52

PROCESE DE STERILIZARE IN BIOTEHNOLOGIE

CURS 2

admise (10-3 microorganisme), este necesar un strat filtrant de 67,60

cm.
Exemplul prezentat evideniaz hazardul care poate interveni
n proiectarea filtrului i n precizia sterilizrii, fapt ce impune
meninerea strict a vitezei aerului i montarea a nc unui filtru.
Prezena unui al doilea filtru asigur nivelul de sterilizare dorit, dar
mrete consumul de energie i abur.
n plus, dificultile acestui procedeu de sterilizare a aerului
constau i n necesitatea meninerii fibrelor de sticl, care sunt
hidrofile, n afara oricror urme de umiditate. Pentru stabilirea
corect a parametrilor de funcionare a instalaiei de sterilizare a
aerului prin filtrare, trebuie s se in seama i de caracteristicile
termodinamice ale aerului. Sub acest aspect, este necesar s se
determine corect condiiile climaterice iniiale (presiunea, umiditatea
relativ, temperatura medie), n funcie de acestea stabilindu-se
regimul de exploatare al instalaiilor de sterilizare a aerului.
Pentru a nu favoriza ptrunderea umiditii n filtrul principal i
individual, aerul comprimat se rcete sub valoarea temperaturii
punctului de rou, se ndeprteaz umiditatea separat i se
nclzete, cu aer fierbinte, pentru depirea temperaturii critice.
Acest procedeu este utilizat n perioada n care aerul are
temperatur i umiditate relativ mare. Dac aerul are un coninut
redus n umiditate, rcirea se face pn la o temperatur superioar
punctului de rou. n ambele situaii, temperatura aerului la ieirea
din filtrul individual trebuie s fie superioar valorii temperaturii
critice, n acest mod, asigurndu-se funcionarea normal a filtrelor.
n industria de biosintez, presiunea aerului la ieirea din
compresor este de 1,5 2,5 at, iar dup filtrul individual de 1 2 at.
Scderea presiunii aerului conduce la reducerea punctului de rou,
valoarea acestui parametru stabilindu-se n funcie de presiune i
umiditate. Astfel, pentru aerul cu umiditatea d g/kg aer uscat i
presiunea P, presiunea parial a vaporilor de ap, p, va fi:
p

P 622

1
d

(2.52)

n funcie de aceasta determinndu-se, din tabele, temperatura

punctului de rou.
Valoarea obinut se compar cu temperatura aerului dup
filtrul individual.
Parametrii principali ai procesului de sterilizare a aerului sunt:

53

PROCESE DE STERILIZARE IN BIOTEHNOLOGIE

CURS 2

temperatura punctului de rou a aerului comprimat;

temperatura aerului dup filtrul individual;
temperatura aerului dup destinderea adiabatic la ieirea din
barbotor.
Stabilirea regimului optim de exploatare a instalaiilor de
sterilizare a aerului se face cu ajutorul diagramelor care redau
dependena dintre coninutul de umiditate i temperatura punctului
de rou (figura 2.28), precum i dependena dintre temperatura
aerului dup scderea presiunii i temperatura iniial (figura 2.29).
De exemplu, pentru aerul cu presiunea de 2,5 ata i un
coninut de umiditate de 20 g/kg aer uscat, temperatura punctului de
rou, conform diagramei 2.28, este de 47,5C.

Figura 2.28. Dependena dintre temperatura punctului de rou i

coninutul de umiditate al aerului n funcie de presiune
n situaia n care aerul a fost rcit pn la 75C, iar cderea
de presiune este de 0,35 ata, temperatura dup filtrul individual,
determinat cu ajutorul diagramei 2.29, pentru P 2/P1 = (2,5-0,35)/2,5
= 0,86 este de 60oC. Valoarea obinut depete cu 12,5oC
temperatura punctului de rou, fiind, astfel asigurat buna
funcionare a filtrelor de aer.
Aerul cu temperatura de 60C este barbotat n lichidul de
fermentaie, la ieirea din barbotor, temperatura sa reducndu-se
datorit destinderii adiabatice. Reducerea temperaturii nu trebuie s
afecteze desfurarea n condiii optime a procesului de biosintez,
valoarea acesteia determinndu-se n funcie de presiunea aerului
dup filtrul individual i presiunea din fermentator. Dac presiunea
din fermentator este de l,28 ata, atunci temperatura aerului la ieirea

54

PROCESE DE STERILIZARE IN BIOTEHNOLOGIE

CURS 2

din barbotor se stabilete din diagrama 2.29 pentru raportul P 3/P2 =

1,28/2,14 = 0,6 i va fi 15C, valoare care nu perturb procesul de
fermentaie (temperatura procesului este cuprins, n general, ntre
24 i 30C).

Figura 2.29. Dependena dintre temperatura aerului comprimat

dup scderea presiunii i temperatura iniial
Datorit dificultilor care apar n procesul de filtrare a aerului
n filtre cu fibre, au fost studiate i alte posibiliti de sterilizare,
dintre acestea impunndu-se sterilizarea prin membrane hidrofobe,
cu pori de 0,2 - 0,45 , adecvate pentru ndeprtarea bacteriilor.
Aceste membrane au condus la crearea filtrelor de excluziune, de
dimensiuni variabile, n funcie de debitele de fluide supuse
sterilizrii (aer sau lichide).
Studiind comparativ sterilizarea aerului prin membrane i prin
filtrare pe fibre de sticl, Scragg a evideniat avantajele
membranelor hidrofobe, recomandnd utilizarea acestora n
construcia filtrelor de aer (tabel 2.8).
Tabelul 2.8. Performanele sterilizrii aerului prin filtrare pe fibre de
sticl i pe membrane
Caracteristicile filtrrii
Reinerea absolut a contaminanilor
Capacitatea de ndeprtare a impuritilor
Eficacitatea reinerii particulelor mici
Eficacitatea reinerii depinde de viteza de

55

Strat de
fibre de
sticl
Nu
nalt
nalt
Da

Membrane de
0,2 - 0,45
Da
Sczut
nalt
Nu

PROCESE DE STERILIZARE IN BIOTEHNOLOGIE

CURS 2

curgere i presiune
Posibiliti de strpungere (trecere prin
filtru)

Da

Nu

Utilizarea filtrelor cu membrane nregistreaz costuri mai mari,

ceea ce poate limita, n anumite situaii, extinderea n aplicarea
practic.

56