Disciplina Biologie celular i molecular-lucrri practice- BCM-3

Microscopia electronic
Microscopul electronic reprezint un instrument de vizualizare direct a ultrastructurilor
celulare, cu o putere de rezoluie mult mai mare dect a microscopului fotonic. Microscopul
electronic functioneaza la fel ca si un microscop optic, diferenta fiind ca in loc de fotoni se folosesc
electroni ca sa iluminam proba de investigat, iar in loc de lentile de sticla se folosesc lentile
electromagnetice si/sau electrostatice.
Microscopul electronic este constituit dintr-o sursa de lumina (tun de electroni) care ilumineaza
proba, iar apoi "lumina" transmisa prin proba este proiectata cu ajutorul unui sistem optic pe un ecran
fluorescent sau pe o camera CCD.

Descriere mod de organizare i funcionare

Microscopul electronic se bazeaz pe proprietatea electronilor de a fi deviai de un cmp
elecrostatic sau electromagnetic. Dac se plaseaz un filament (catodul) ntr-un tub cu vid,
dup care filamentul se nclzete, el emite electroni ce pot fi accelerai, prin intermediul unei
diferene de potenial.
Fluxul de electroni astfel realizat are proprieti similare luminii, prezint caracteristici
corpusculare i vibratorii, ns lungimea de und este mult mai mic n comparaie cu lumina
alb. Acest flux trece printr-o bobin electromagnetic (cu rol asemntor unui condensator)
prin care electronii se concentreaz n direcia obiectivului.
Lungimea de und a unui flux de electroni este n funcie de tensiunea de accelerare la
care acetia sunt supui i se poate calcula dup formula lui Broglie:
= h/mv
= lungimea de und
h = constanta lui Plank
v = viteza electronului
m= masa electronului
Instrumentul mai prezint o bobin electromagnetic cu funcii similare lentilei
obiectivului prin care se obine o imagine mrit a obiectului, iar una care funcioneaz ca i
ocular sau lentil de proiecie. Aceasta permite o mrire suplimentar a imaginii.
Limitele de rezoluie calculate pentru microscopul electronic sunt cuprinse ntre 3-5. n
cercetarea biologic aceast limit de rezoluie este de 10. Un microscop electronic ce prezint
o mrire iniial a obiectului de 100x, poate mri imaginea de 200x, cu ajutorul bobinei
proiectoare, ceea ce echivaleaz cu o mrire total de 20.000x. Instrumentele perfecionate pot
realiza mriri suplimentare de 160.000, iar imaginea poate fi fotografiat la 1.000.000x mrire i
chiar 80 milioane x.

Cel mai performant microscop din lume, este la acest moment instalat la Berkeley Lab si are o
rezolutie de 0.5 . Diametrul unui atom este intre 1 si 5. Microscopul de la McMaster este aproape
identic (diferentele sunt minore) cu cel de la Berkeley si are specificatiile de rezolutie, mai bune de 1
Angstrom, dar in practica s-a putut obtine o rezolutie de 0.65 in TEM si 0.79 in STEM. Microscopul
1

Disciplina Biologie celular i molecular-lucrri practice- BCM-3

are doua corectoare de aberatie de sfericitatete, unul pentru partea de iluminare (de formare a
fasciculului) si un corector pentru partea de imagine. In afara de cele doua corectoare, are un
monochromator pentru fascicolul de electroni, un spectrometru de electroni de inalta rezolutie, detector
de raze X (EDX) si citeva camere CCD. Microscopul de Universitatea McMaster Hamilton, Ontario,
Canada este cel mai performant microscop instalat intr-o universitate. Cel mai puternic microscop din
lume (Titan), nu studiaz scara nano (adic grupri de civa atomi), ci scara nano-nano, adic a mia
parte din un proton.
Microscopul are doua corectoare de aberatie de sfericitatete, unul pentru partea de iluminare (de
formare a fasciculului) si un corector pentru partea de imagine. In afara de cele doua corectoare, are un
monocromator pentru fascicolul de electroni, un spectrometru de electroni de inalta rezolutie, detector de
raze X (EDX) si citeva camere CCD.

.
Formarea imaginii
n microscopia fotonic formarea imaginii este dat de devierea razelor de lumin de ctre
preparatul biologic, cu densiti diferite. n cazul preparatelor colorate, colorantul fixat pe
diferite structuri absoarbe o parte din radiaiile luminoase, iar imaginea este rezultatul radiaiilor
reziduale ce dau culoarea complementar.
n microscopia electronic, formarea imaginii este rezultatul dispersiei electronilor,
determinat de mai multe motive. Cauza principal a dispersiei electronilor este dat de
grosimea i densitatea molecular a obiectului biologic i n special de numrul atomic i natura
atomilor ce intr n constituia sa. Cu ct este mai mare numrul atomic, cu att este mai mare
dispersia.
Majoritatea atomilor care intr n constituia materiei vii au numr atomic sczut i din
acest motiv este nevoie s se fixeze atomi grei pe structurile biologice pentru a putea fi
vizualizate.
De asemenea, imaginea depinde i de grosimea seciunii. Daca seciunile sunt prea subiri
apare o deviere mic, iar imaginea este lipsit de contrast, dac grosimea este prea mare
imaginea devine neclar.
Avantaje i dezavantaje
Microscopul electronic este un instrument ideal pentru studiul structurilor submicroscopice
celulare, al unor constituieni chimici celulari sau macromolecule purificate. Se poate urmri
structura n relief a moleculelor din structurile biologice, deosebit de folositoare pentru a lmuri
aranjamentele moleculare ale membranelor plasmatice i citoplasmatice.
Deoarece fluxul de electroni nu are o mare putere de penetraie, pentru observarea la
microscopul electronic a structurilor celulare este necesar utilizarea unor preparate biologice
foarte fine. Dac grosimea materialului biologic depeste 5000 (0,5 microni), opacitatea este
total. Obiectul de studiu trebuie pus pe o gril metalic fin.
Microscopul electronic, prin utilizarea vidului n interiorul lor, nu permite studierea direct
a celulelor vii. Limitarea este datorat i faptului c preparatele biologice trebuiesc fixate,
deshidratate i colorate, procedee ce produc o serie de alterri ale structurilor celulare.
De asemenea, bombardamentul cu electroni induce alterri de ordin structural sau chimic
care n unele cazuri poate duce la calcinarea preparatului.
Confectionarea preparatelor biologice
2

Disciplina Biologie celular i molecular-lucrri practice- BCM-3

Pentru analiza preparatelor biologice se folosesc mai multe tehnici:

1- studiul pe sectiuni ultrafine
1. prelevarea materialului
2. fixarea materialului
Tipul de fixator, procedeul de fixare i durata depind de materialul
biologic si de scopul urmrit
3. deshidratarea
eliminarea apei din tesuturile fixate pe cale chimic sau fizic
(acetona, al. Etilic, propilenoxidul sunt agenti de deshidratare)
4. includerea in rezine sintetice
Cele mai uzitate sunt rsinile poliesterice (vestopal) i cele
epoxidice (epon 812, epon 562) i medii de includere hidrofile
(durcopanul)
Includerea se face in capsule de gelatin sau polietilen (se tin la
termostat la 600C 24-48 h pentru polimerizarea materialului de
includere
5. sectionarea la ultratom permite realizarea de sectiuni foarte fine
invizibile ochiului liber.
6. etalarea pe grila a sectiunilor
Sunt folosite suporturi confectionate pe cale electrolitic din
cupru, nichel, otel inox, argint, aur, platin, molibden
7. colorarea i contrastarea sectiunilor
Se folosesc acetat de uranil i citrat de plumb (Sol Reynolds)
8. observarea
9. fotografiere i obtinerea imaginilor pozitive.
2- studii prin coloraie negativa a preparatelor depuse de gril (organite celulare,
virusuri, etc.)
preparatul biologic este introdus intr-o soluie care conine un pigment ntunecat,
pigmentul nu interacioneaz cu preparatul. Prin aceast tehnic se pot studia
structurile tridimensionale ale biomoleculelor, virusurilor, organitelor celulare
purificate.
3- Metalizarea este o metoda de mrire a contrastului . Metoda const n evaporarea
unui metal sub vid (aur, platin) si depunerea pulberii atomice sub un anumit unghi
pe preparatul biologic.
Aplicaii
1. Stabilirea legaturilor genetice dintre organisme
2. Biosinteza de proteine si structurile implicate n acest proces
3. Structura si configuratia macromoleculelor proteice
4. Configuratia moleculara a acizilor nucleici si stabilirea greutatii lor moleculare
5. Procese de filtrare prin membrane
6. Transportul ionic in celule
7. Localizarea reactiilor imunologice si a activitatilor enzimatice
3

Disciplina Biologie celular i molecular-lucrri practice- BCM-3

8. Structura suprafetelor tesuturilor, celulelor, biomoleculelor

9. Alctuirea molecular a virusurilor si mecanismele infectiei virale
10. Procese de transcriptie si translatie in codul genetic
11. Ultrastructura diferitelor tipuri de celule si a componentelor acestora n stare
normal i patologic.

3
4

Fig 1 Schema realizrii imaginii n microscopia electronic

n biologia celular i molecular se folosesc mai multe tipuri de microscoape:
1- Microscopul electronic de transmisie (TEM) uziteaz fascicul de electroni cu de
ordinul . Preparatele microscopice trebuie sa aib o grosime de 300-350.
Componente
Tubul
sau
microscopului

Rol i mod de funcionare

coloana In acesta se creaz vidul, fluxul de electroni este produs de
un filament nclzit (catod) i dirijai de un disc metalic
(anod) ctre axul optic al coloanei microscopului. ntre
catod i anod exist o accelerare a electronilor.
Lentile condensator -1
De tip electromagnetic
4

Disciplina Biologie celular i molecular-lucrri practice- BCM-3

Camera preparatului- 2
Sistemul de formare a
imaginii - 3
Camera de observare -4
Camera fotografic

Prezint posibilitatea de miscare orizontal i vertical

3 lentile electromagnetice (obiectiv, intermediar, proiector)
Prezint un ecran fluorescent, lup binocular
Prezint plci fotografice sau film de dimensiuni variabile.

Ca i variate imbuntite sunt : microscopul electronic cu voltaj nalt (HYEM) are o tensiune
de accelerare foarte mare 1-4,5 milioane voli datorit creia puterea de penetrare a electronilor
prin preparat este mult mai crescut ceea ce permite examinarea unor preparate biologice groase
de mai muli micron.
M.E. analitic de transmisie (TEAM) este format dintr-un microscop electronic de transmisie
de nalt rezoluie la care se ataeaz un microanalizor de raze X care msoar lungimile de und
ale radiaiilor X emise de preparat sub aciunea bombardamentului de electroni.
Acest tip de microscop permite determinarea compoziiei chimice elementare a unor
volume extreme de mici de materie. n biologie celular este folosit n studiul suprafeelor
celulare (microvili, cili, flageli) fenomene de suprafa ale diviziunii celulare, segmentare i
formarea blastului.
Microscopie electronica de baleiaj (SEM)
Ofer posibilitatea examinrii suprafeelor unor preparate cu diametrul de 2-4 cm i 1 cm
nlime, furnizeaz imagini tridimensionale ale suprafetelor i nu pot furniza date de morfostructura. Are un principiu de funcionare asemntor unui sistem TV n circuit nchis.
Alctuire:
-

Coloana microscopului unde se realizeaz bombardarea preparatului cu faciculul primar

de electroni, preparatul produce electroni secundari care sunt captai de un detector.
Curentul astfel format este antrenat si amplificat ntr-un tub catodic unde se formeaz
imaginea. Tensiunea de accelerare a electronilor este de 1000-60.000V.
Sistemul de vid (2 pompe)
Sistemul de operare i afisaj