NOTE DE CURS

AN UNIVERSITAR 2012-2013
BIOLOGIE MOLECULAR anul II

Specializarea Biochimie

Titular curs Prof. Dr. Marieta Costache

LP Asist. Dr. Andreea Toana

Bucuresti aprilie 2013

STRUCTURA NOTE DE CURS

STRUCTUR ACIZI NUCLEICI RAPEL

I.
II.
III.
IV.
V.

NOTE DE CURS BM1 - STRUCTURA MOLECULAR A

CROMOZOMILOR I GENELOR
NOTE DE CURS BM2 - ORGANIZAREA MOLECULAR,
EXPRESIA I REGLAREA GENELOR EUCARIOTE
NOTE DE CURS BM3 - REGLAREA INIIERII
TRANSCRIPIEI
NOTE DE CURS BM4 - PROCESAREA ARN,
TRANSPORT
NUCLEAR
I
CONTROL
POSTTRANSCRIPIONAL
NOTE DE CURS BM5 - TRADUCEREA

NOTE DE CURS BM1 - STRUCTURA MOLECULAR A

CROMOZOMILOR I GENELOR

SLIDE 2. Reprezentare clasic a unei celule procariote
Figura: Reprezentare clasic a unei celule procariote (dup Campbell, et al.,
Biology, 2002).
Unul dintre criteriile care stau la baza clasificrii organismelor este absena sau
prezena nucleului individualizat. Celulele procariote lipsite de un veritabil nucleu,
includ eubacteriile i archeobacteriile. De cealalt parte se afl celulele eucariote care
posed o membran nuclear care separ cromozomii de restul celulei. Cromozomul
unic al celulelor procariote este format dintr-o molecul de ADN dublu catenar
circular care conine cteva milioane de perechi de baze. n general, genoamele
eucariotelor au o mrime i o complexitate variabil i conin mai muli cromozomi.
Att celulele procariote ct i cele eucariote posed mecanisme, pe de o parte
comune i pe de alt parte distincte, pentru reglarea expresiei genelor i a fluxului de
informaie de la ADN la proteine. Transcripia ADN realizat de ARN polimeraze
constituie prima etap, comun la toate organismele. La celulele procariote, ribozomii
se fixeaz pe molecula de ARNm, n curs de sintez, i realizeaz traducerea imediat
a informaiei n proteine, n citoplasm. Din contr, la eucariote membrana celular
separ locul n care se realizeaz transcripia de cel n care are loc traducerea.
Transcriptul primar, ARNm imatur, conine o succesiune de secvene netraduse,
numite introni, care vor fi eliminate prin procedeul de scindare a intronilor i sudare a
exonilor (splicing), n procesul de maturare a ARNm. n urma acestei etape,
localizat n nucleu, ARNm trece n citoplasm unde este tradus. Maturarea ARNm
prin splicing confer celulei eucariote posibilitatea diversificrii informaiei prin
combinarea alternativ a exonilor, o alt etap foarte important n dezvoltarea
organismelor.
Bacteriile, organismele procariote cele mai simple ntlnite n toate mediile
naturale, prezint caracteristici comune. Adesea, un perete celular, format din
peptidoglicani, nconjoar membrana plasmatic i confer celulei o form rigid. De
asemenea, este prezent o membran extern care posed un numr de flageli i pili
variabil. Bacteriile au un compartiment citoplasmatic unic care conine un nucleoid
format dintr-o molecul simpl circular de ADN, ARN i proteine. Pe lng ADN
prezent n nucleoid, citoplasma majoritii bacteriilor conine mici molecule circulare
de ADN, numite plasmide. Cel mai adesea acestea confer celulei rezisten la
antibiotice i la alte toxine. n condiii favorabile, bacteriile se multiplic rapid prin
diviziune. Capacitatea lor de adaptare la condiiile de mediu i de diviziune rapid fac
ca aceste celule s constituie suporturi excelente pentru numeroase analize biochimice
i de biologie molecular, in vitro.
Dei cea mai mare parte a genoamelor procariote sunt mai mici de 5 Mpb
lungime, exist i cteva mai mari. n prezentarea tradiional, genomul tipic
procariotelor conine o singur molecul circular de ADN, localizat la nivelul
nucleoidului.
Aceast abordare este adevrat pentru E. coli i pentru multe alte bacterii
foarte studiate, dar specificm c evoluia cunoaterii, n sfera genomului
procariotelor, pune n discuie anumite concepte dezvoltate n era pre-genomic a
microbiologiei. Aceste aspecte se refer att la structura fizic a genomului
procariotelor ct i la organizarea genetic.

SLIDE 3. Punctul de vedere tradiional asupra cromozomului bacterian

Tabel Mrimea i complexitatea genomului la cteva virusuri i celule

Asemeni eucariotelor, genomul procariotelor trebuie s se ncadreze ntr-un
spaiu foarte restrns. Cromozomul circular de la E. coli are o circumferin de 1,6
mm n timp ce dimensiunile celulei sunt de 1,0 x 2,0 m. Structurarea necesar este
realizat, ca i la eucariote, cu ajutorul proteinelor de legare la ADN (DNA binding
proteins) care compacteaz genomul ntr-o form organizat. Structura obinut nu
prezint similitudini substaniale cu cromozomul de la eucariote cu toate c din punct
de vedere didactic este folosit exprimarea de cromozom bacterian.
Majoritatea cunotinelor pe care le avem despre organizarea ADN n nucleoid
sunt rezultatul studiilor pe E. coli. Genomul circular al E. coli este suprarsucit.
Suprarsucirile apar cnd ture suplimentare sunt introduse sau ndeprtate din
structura dublei elice (suprarsucire pozitiv/negativ). Suprarsucirea este
modalitatea ideal de mpachetare a unei molecule ntr-un spaiu redus. Primele
dovezi c suprarsucirile sunt implicate n mpachetarea genomului circular de la E.
coli au fost obinute n 1970 n urma examinrii unor nucleoizi izolai, fiind
confirmate definitiv ca o trstur a celulelor vii n 1981. Se consider c, la E. coli
supra-rsucirile sunt generate i controlate de dou enzime, ADN giraza i ADN
topoizomeraza I.
Cea mai plauzibil explicaie privind compactarea nucleoidului este aceea c
ADN este ataat la proteine care restrng capacitatea de relaxare, astfel nct rotaia la
nivelul unui situs de scindare are ca rezultat pierderea unei suprarsuciri dintr-un mic
segment al moleculei. Modelul curent propune ataarea ADN de la E. coli pe structura
unei proteine miez de la care radiaz 40-50 bucle n interiorul celulei. Fiecare bucl
radiaz n interiorul celulei i conine aproximativ 100 kpb de ADN suprarsucit.

SLIDE 4. Compactarea cromozomului la E. coli

Figura Model pentru structura nucleoidului de E. coli
Componentele proteice ale nucleoidului includ ADN giraza i ADN
topoizomeraza I, cele dou enzime care sunt principale responsabile pentru
meninerea strii de suprarsucire, ca i un set de aproximativ patru proteine
considerate a avea un rol mai specific n mpachetarea ADN bacterian. Cea mai
abundent protein este HU, care este foarte diferit structural de histonele eucariote
dar acioneaz similar, formnd un tetramer n jurul cruia se nfoar aproximativ
60 pb. n celula de E. coli sunt prezente aproximativ 60 000 copii ale HU care acoper
aproximativ 1/50 din molecula de ADN, dar nu se cunoate dac tetramerii sunt
distribuii de-a lungul ADN sau sunt poziionai numai n regiunea central a
nucleoidului.
Discuii pe tema structurii nucleoidului procariot
n ultimii 10 ani a devenit foarte clar c anatomia genomului procariot
dezvoltat pe baza studiilor pe E. coli este foarte simplist. Dei marea majoritate a
genoamelor bacteriene sau a cromozomilor de la archeobacterii sunt circulari, a fost
descoperit un numr mare de forme lineare. Prima a fost descris pentru Borrelia
burgdorferi, n 1989 de ctre Ferdows i Barbour, urmtorii ani fiind realizate
descoperiri similare pentru genul Streptomyces i alte bacterii.
Un alt aspect l reprezint prezena plasmidelor care reprezint mici molecule
de ADN, adesea dar nu ntotdeauna circulare, care coexist cu cromozomul principal

n celula bacterian. Anumite tipuri de plasmide sunt capabile de integrare n genomul

principal, n timp ce altele pot avea o existen independent. Plasmidele conin gene
care, de obicei, nu se gsesc pe cromozomul principal, dar care sunt, n multe cazuri,
neeseniale pentru bacterie, deoarece codific pentru fenotipuri cum sunt rezistena la
antibiotice fr de care bacteriile pot tri n condiii de mediu normale. Multe
plasmide sunt capabile de transfer de la o celul la alta, i aceleai plasmide sunt
adesea regsite n bacterii care aparin la diferite specii. Trsturile diferite ale
plasmidelor sugereaz c ele reprezint entiti independente care, n majoritatea
cazurilor, nu sunt incluse n definiia genomului bacterian.
Pentru o bacterie de tipul E. coli, care are un cromozom de 4,6 Mpb i care
poate conine variate combinaii de plasmide, nici una mai mare de cteva kilobaze,
toate dispensabile, putem defini cromozomul principal ca genom. n cazul altor
procariote lucrurile nu stau la fel de simplu. De exemplu, cromozomul linear al
Borrellia burgdoferi care are 910 kpb i conine 853 gene, este nsoit de cel puin 17
plasmide circulare i lineare care mpreun contribuie cu alte 533 kpb i cu cel puin
430 gene. Dei, majoritatea acestor gene sunt orfane (fr funcie identificat), au
fost identificate i structuri indispensabile cum sunt genele pentru proteinele
membranare i biosinteza purinelor. Se consider c mcar unele din cele 17 plasmide
de la Borrelia sunt componente eseniale ale genomului. Astfel, este admis
posibilitatea ca anumite procariote s posede genoame constituite din mai multe
componente care includ un numr separat de molecule ADN. Aceast situaie este
mult mai apropiat de ceea care exist la eucariote dect la procariotele tipice. De
fapt, interpretarea informaiilor privind genomul de la Borrelia este nc
controversat, i complicat datorit existenei unei bacterii nrudite, Treponema
pallidum, al crei genom este format dintr-o singur molecul de ADN de 1138 kpb
care conine 1041 gene, este lipsit de orice omologie cu genele prezente n plasmidele
de la Borrelia.
Tabel Trsturile ctorva plasmide tipice
Tip de plasmid
Funciile genelor

Rezisten
Fertilitate
Uciga (killer)
Degradativ
Virulen

Exemple

Rezisten antibiotice
Rbk la E. coli i alte bacterii
Conjugare i transfer ADN F de la E. coli
ntre bacterii
Sinteza de toxine care ucid Col de la E. coli; produce colicin
alte bacterii
Enzime pentru metabolismul
TOL pentru Pseudomonas putida;
moleculelor neobinuite
metabolism toluen
Patogenitate
Ti
de
la
Agrobacterium
tumefaciens; capacitatea de a
determina formarea galelor la
dicotiledonate

O alt complicaie privind structura fizic a genoamelor procariote este legat

de diferenele dintre sistemele de mpachetare pentru moleculele de ADN de la
bacterii i archeobacterii. Una dintre motivaiile pentru care archeobacteriile sunt
privite ca un grup distinct de organisme, diferite de bacterii, este faptul c acestea nu
posed proteine de compactare de tipul HU, dar posed proteine mult mai
asemntoare cu histonele. Cu toate c, informaiile despre nucleoidul de la
archeobacterii sunt destul de incomplete, se presupune c proteinele asemntoare
histonelor au un rol important n mpachetare.
Cunoatem deja c genomul bacterian are o structur genetic compact cu
foarte puin spaiu ntre gene. Aceast organizare este foarte bine demonstrat i tipic

la genomul de la E. coli. La acest organism ADN care nu codific pentru diferite gene
reprezint numai 11% din total i este distribuit pe toat lungimea sub forma unor
segmente mici. O serie de teorii susin c organizarea compact este benefic pentru
replicarea rapid a genomului cu toate c ipotezele nu pot fi susinute de dovezi
experimentale.

SLIDE 5. Coninutul minim de gene i identitatea genelor specifice

Tabel. Catalog comparativ de gene pentru E. coli, H. influentze, M. genitalium

Cu toate c numrul de genoame procariote secvenializate integral crete
continuu, nu este nc posibil realizarea unui catalog complet cu coninutul genelor
fiecrei specii, din simplul motiv c funciile anumitor gene rmn necunoscute. De
exemplu, genomul de la E. coli conine 4 288 gene care codific pentru proteine dar
peste 1 500 din acestea sunt orfane. Chiar dac informaia este adesea incomplet,
este interesant s examinm rolul genelor ale cror funcii sunt cunoscute, i s
apreciem numrul diferit al genelor implicate n diferite activiti biochimice la o
bacterie de tipul E. coli.
Cataloagele de gene sunt mult mai interesante cnd comparaiile se realizeaz
ntre diferite specii. De exemplu, la E. coli 243 de gene sunt implicate n
metabolismul energetic, la Haemophylus influenzae numai 112 i la Mycoplasma
genitalium numai 31. Aceste comparaii pot duce la speculaii privind numrul minim
de gene necesar pentru supravieuirea unei celule. Majoritatea demersurilor realizate
n acest sens au demarat cu studiul celor mai mici genoame, cel al Mycoplasma
genitalium i cel a Mycoplasma pneumoniae, care conin numai 470 i respectiv 679
gene. Consideraii teoretice au dus la sugestia c 256 gene reprezint minimul
necesar, dar experimentele de inducere de mutaii sugereaz c pentru Mycoplasma
sunt necesare minim 300. Studii similare interesante au fost realizate pentru genele
specifice care determin distincia dintre o specie i alta. Din cele 470 gene ale
genomului de la M. genitalium, 350 sunt prezente i la bacterii mai ndeprtate
evolutiv, cum este Bacillus subtilis. Aceasta sugereaz c trsturile biochimice i
structurale care disting Mycoplasma de Bacillus sunt codificate n aproximativ cele
120 gene care sunt unice la fiecare tip. Din nefericire, astfel de comparaii privind
genele particulare nu dau rspunsuri cheie privind caracteristicile care
individualizeaz fiecare tip de microorganism.

SLIDE 6. Operonii sunt caracteristici ale genoamelor procariote

Figura. Diferite tipuri de operoni: a) operonul lactoz de la E. coli; b) operonul triptofan
de la E. coli; c) operonul mixt de la Aquifex aeolicus

Cea de a doua caracteristic a genomului de la procariote, ilustrat la E. coli, este

prezena operonilor. Operonii reprezint un grup de gene localizate una lng cealalt.
Toate genele din structura unui operon sunt exprimate ca o singur unitate. Acest tip
de aranjament este comun genoamelor procariote i poate fi ilustrat la E. coli cu
operonul lactozei care a fost descoperit n 1961 de ctre Jacob i Monod. Acesta
conine trei gene implicate n transformarea dizaharidului lactoz n unitile sale
componente (glucoz i galactoz). Genele operonului lactoz sunt implicate n
utilizarea lactozei ca surs de energie de ctre E. coli. Deoarece, lactoza nu este o
component comun a mediul nconjurtor pentru E. coli, majoritatea timpului
operonul nu este exprimat i enzimele pentru utilizarea lactozei nu sunt sintetizate de
bacterie. Cnd lactoza devine disponibil se realizeaz activarea operonului i cele
trei gene sunt exprimate mpreun. Operonul lactoz reprezint un exemplu clasic de
reglare a expresiei genelor la bacterii (Figura a).
6

La E. coli i la Bacillus subtilis exist aproximativ 600 operoni. n majoritatea

cazurilor, genele unui operon sunt corelate funcional i codific pentru un set de
proteine implicate ntr-o anumit cale metabolic, cum ar fi utilizarea unui glucid ca
surs de energie sau sinteza unui aminoacid (operon triptofan, Figura b). La alte
bacterii sau archeobacterii exist posibilitatea ca operonii s conin gene implicate n
diferite ci metabolice. Este cazul unuia dintre operonii de la Aquiflex aeolicus care
conine ase gene linkate care codific pentru: i) dou proteine implicate n
recombinare; ii) o enzim folosit n sinteza proteic; iii) o protein necesar pentru
mobilitate; iv) o enzim utilizat n sinteza nucleotidic; v) o enzim pentru sinteza
lipidic (Figura c). n concluzie, teoria c expresia unui operon conduce la sinteza
coordonat a mai multor enzime necesare pentru o singur cale metabolic nu este
valabil pentru toate speciile.

SLIDE 7. Structura materialului genetic la eucariote

Nucleul celulei eucariote
Figura . Nucleul celular i caracteristicile sale (dup Campbell, et al., Biology, 2002).

Structura materialului genetic la eucariote

n ciuda diferenelor evidente de form i de funcie, diferitele tipuri celulare care
compun un organism multicelular, fie c este vorba de o ciuperc sau de un mamifer,
conin un lot complet de gene. Vzut din exterior o celul din constituia unui cartilaj
i un neuron nu se aseamn deloc. Cu toate acestea cele dou tipuri celulare conin
acelai complement de gene.
Informaia genetic, prezent ntr-o celul eucariot specializat, se poate
compara cu o carte care conine toate informaiile necesare construciei unei cldiri cu
utiliti multiple. n cursul realizrii construciei, sunt probabil necesare toate
planurile dar numai o mic parte a informaiei va trebui consultat n timpul activitii
de construcie a unui etaj sau a unei singure camere. Aceast abordare este adevrat
i pentru un ovul fecundat, care conine ansamblul instruciunilor genetice, i care este
fidel replicat i informaia distribuit tuturor celulelor organismului n dezvoltare. n
consecin, celulele poart mult mai mult informaie genetic dect pot utiliza
vreodat. Acestea posed mecanisme care le permit s exprime informaia genetic, n
mod selectiv, urmnd numai instruciunile care privesc numai o singur celul ntr-un
moment particular al existenei acesteia. n acest subcapitol, o s analizm
modalitile care le permit celulelor eucariote s structureze totalitatea materialului
genetic pe care l conin, n condiiile controlului coordonat al expresiei genelor
menite s asigure numai sinteza anumitor proteine. Mai nti vom descrie structura i
proprietile nucleului celulei eucariote, care conine majoritatea informaiei genetice
i mecanismele de reglare a acesteia.
Nucleul celulei eucariote
n ciuda importanei sale pentru stocarea i utilizarea informaiei genetice,
nucleul celulei eucariote posed o morfologie destul de comun. Coninutul nuclear
reprezint o mas vscoas amorf de materie, nchis ntr-un nveli nuclear
complex. n nucleul unei celule tipice, n interfaz, se evideniaz: i) cromozomii,
prezeni sub forma unor fibre nucleoproteice foarte alungite, cromatina; ii) matricea
nuclear care este format dintr-o reea fibrilar care conine proteine; iii) unul sau
mai muli nucleoli, structuri amorfe, opace la microscopie electronic care sunt sediul
sintezei ARN ribozomal i al asamblrii ribozomilor; iv) nucleoplasma, substan
lichid care conine toate componentele i elementele nucleului eucariot. n figura
sunt ilustrate schematic diferitele elemente ale nucleului eucariot.
nveliul nuclear
7

n opoziie cu termenul de membran nuclear, nveliul nuclear desemneaz

structura complex care se afl la frontiera dintre nucleul i citoplasma unei celule
eucariote. ntr-o celul, separarea materialului genetic i a citoplasmei care l
nconjoar este poate caracteristica cea mai important care distinge eucariotele de
procariote. Apariia nveliului nuclear este cu siguran un punct de reper n evoluia
biologic. nveliul nuclear const n mai multe elemente distincte. Continuitatea
nveliului care delimiteaz nucleul este asigurat de dou membrane concentrice
separate de un spaiu intermembranar de 10 la 50 nm. Cele dou membrane sunt
fuzionate din loc n loc i formeaz pori circulari care sunt compui dintr-un ansamblu
complex de proteine. Densitatea porilor nucleari variaz de la aproximativ 2 la 4 pe
m2 n nveliul nuclear al eritrocitelor de pasre, relativ inactiv din punct de vedere
metabolic, la mai mult de 60 m2 n cel al ovocitelor care se pregtesc s rspund
nevoilor viitoare ale dezvoltrii embrionare.
O celul de mamifere, de mrime medie, posed aproximativ 3 000 de pori
nucleari. Membrana extern este n general presrat cu ribozomi i adesea n
continuitate cu membrana reticulului endoplasmatic.
Suprafaa intern a nveliului nuclear este bordat de o plas fibrilar dens,
numit lamina nuclear. n anumite celule, cum este ovocitul de amfibian, aceast
lamin formeaz un strat continuu, n timp ce n altele pare mult mai fragmentat.
Considerm c lamina nuclear reprezint un suport structural pentru nveliul nuclear
i servete la fixarea fibrelor de cromatin la periferia nucleului.
Fibrilele laminei nucleare au un diametru de aproximativ 10 nm i sunt
compuse din polipeptide numite lamine, care aparin aceleiai superfamilii de
polipeptide care compun filamentele intermediare ale citoscheletului. Ca i pentru
componentele intermediare ale citoplasmei, integritatea laminei nucleare este
controlat de ctre procesul de fosforilare/defosforilare. Dezasamblarea laminei
nucleare, nainte de mitoz, este indus de ctre fosforilarea laminelor de ctre o
kinaz specific.

SLIDE 8 -15. Ciclul Celular

- principalele stadii ale fazei M ntr-o celul animal
Ciclul celular normal i mecanisme de control
Ciclul celular
Ciclul celular reprezint totalitatea modificrilor i transformrilor suferite de
celul n timpul procesului de replicare i difereniere.
ntr-o populaie de celule ce se divid, replicarea i diviziunea unei celule n
dou celule fiice identice cuprinde 2 faze funcionale i 2 faze preparatorii.
Fazele funcionale sunt reprezentate de :
copierea precis a ADN: faza S (de replicare a ADN);
segregarea sau mprirea setului de cromosomi ntre cele dou celule fiice:
faza M (mitoza).
Celula se pregatete biologic pentru faza S ntr-o faz preparatorie, numit G1
i pentru mitoz ntr-o faz mult mai puin neleas, G2.
Celulele ce nu se mai divid pot fi permanent scoase din ciclul celular prin
difereniere terminal, sau pot fi oprite ntr-o stare intermediar, G0, (celular resting).
Evenimentele ce presupun desfurarea unui ciclu celular intervin ntr-un mod
organizat, astfel ncat anumite evenimente se termin nainte ca altele s nceap.
Aceast ordine a evenimentelor este controlat de o serie de mecanisme de control
intracelulare incomplet elucidate i este influenat de factori extracelulari: factori de

cretere, mitogeni i antimitogeni, inductori de difereniere, contact celul-celul sau

factori de ancorare, nutrieni, etc.
Fig. 1. Fazele ciclului celular
Notatii:
Go=faza de repaus
G1=faza de presintez ADN
G2=faza de postsintez ADN
S =faza de replicare a ADN
M=faza de mitoz
Controlul ciclului celular
Factorii ce influeneaz ciclul celular sunt:
Factori extracelulari:
-factori de cretere;
-factori mitogeni;
-factori antimitogeni;
-inductori ai diferenierii celulare;
Factori intracelulari:
-cicline;
-cdk - kinaze ciclin dependente;
-proteine codate de gene supresoare ale tumorii:-p53, Rb-1;
-PCNA - proliferating cell nuclear antigen;
-gena myc.
Abilitatea celulei de a produce o copie exact a ei nsi, prin diviziune, este o
component esenial a vieii celulare. Acest proces trebuie realizat cu mare fidelitate,
astfel nct organismele s fie capabile s se nmuleasc. Mecanismul molecular de
control al ciclului celular utilizat de celul are un nivel nalt de organizare i este
relativ bine conservat n cursul evoluiei speciilor.
Ne aflm de-abia la nceputul revelrii mecanismului implicat n acest proces
complicat, n care sunt implicate numeroase semnale intra- i extracelulare. Dei n
timpul procesului evoluiei i al diferenierii celulare pot interveni anumite schimbri
subtile, genetice sau epigenetice, n orice faz a ciclului celular, aceste schimbri
trebuie s se produc ntr-un mod controlat, pentru a preveni urmri dezastruoase.
Lipsa fidelitii n procesul de reproducere a celulelor creaz o situaie de
instabilitate genetic care pare a fi un factor contributiv semnificativ n dezvoltarea
celulelor maligne n organismele eucariote avansate.
Deci nu este surprinztor c boala canceroas este caracterizat printr-o
reglare anormal a creterii i a reproducerii celulare. Pentru a ntelege cum debuteaz
cancerul i pentru a dezvolta strategii optime pentru a elimina celulele canceroase,
trebuie s fie identificate diferenele, chiar la nivel molecular, ntre celula normal i
celula canceroas.
Fenomenul cheie al tranziiei de la o etap la alta a ciclului celular este
reprezentat de aciunea enzimatic a unei anumite kinaze ciclin-dependente. Forma
activ a acestor enzime se realizeaz prin formarea unui complex cu o anumit
protein specific unui anumit stadiu al ciclului celular. Aceste proteine se numesc
cicline.

Tabel - Kinazele ciclin dependente (cdk), ciclinele i substraturile kinazelor din

diverse faze ale ciclului celular

FAZA

KINAZA CICLIN-
DEPENDENT

CICLINA

SUBSTRATUL
KINAZELOR

G1

cdk2

Ciclina D

G1/S

cdk2

Ciclina E

cdk2

Ciclina A

G2/M

cdk2

Ciclina B/A

Rb-1

Rb-1

?

?

Dat fiind c progresia celulei n ciclul celular este condiionat de activitatea

cdk, controlul activitii acestor enzime i a complexelor pe care acestea le formeaz
cu ciclinele, constituie un mecanism esenial de reglare a ciclului celular. Acest tip de
control acioneaz la mai multe niveluri:
1. Sinteza ciclinelor
Condiionarea sintezei unui anumit tip de ciclin se face n funcie de etapa
ciclului celular. Din punct de vedere cantitativ, sinteza de cicline depinde de:
- amploarea semnalelor extracelulare ce favorizeaz proliferarea (hormoni, factori de
crestere);
- intensitatea degradrii proteolitice a ciclinelor.
Complexul cdk-ciclin activat fosforileaz substraturile necesare tranziiei
celulei la urmatoarea faz a ciclului.
Controlul ciclului celular prin kinaze ciclin-dependente.
2. Blocarea activitii enzimatice a cdk se realizeaz prin fosforilarea cdk sau prin
legarea lor de inhibitori ai kinazelor ciclin-dependente (CKI), proces ce mpiedic
formarea complexului activ cu ciclinele.
Tabel- Complexele cdk-ciclin i inhibitorii acestora n funcie de etapele
ciclului celular

COMPLEXUL
CDK-CICLIN

KIP
(inhibitori ai cdk)

FAZA

p21
p27
p21, p27

INK
(proteine
inhibitoare ale
kinazelor)
p15, p16
p18, p19
-

cdk 4-Ciclina D

cdk 2-Ciclina E

cdk 2-Ciclina A

cdk 2-Ciclina B

p 21

p21

G2/M

G1
G1/S

Mai explicit, activitatea cdk este controlat la cel puin 6 nivele:

1. Fiecare ciclin este sintetizat ntr-un anumit stadiu al ciclului celular. Ciclinele D
i E sunt sintetizate n faza G1, ciclina A n fazele S i G2, ciclina B n fazele G2 i
M;
2. Degradarea ciclinelor este reglat n mod riguros;
3. Ciclina poate forma un complex cu o cdk (kinaz ciclin-dependent);
4. Acest complex devine activ prin aciunea unei CAK (cdk activating kinase);

10

5. Cdk sunt inactivate prin fosforilare n poziia Thr14 i Tyr15 i pot fi reactivate
prin aciunea unei fosfataze n aceleai poziii,
6. Proteine inhibitoare de cdk pot fie preveni asamblarea complexelor cdk-ciclin, fie
inactiva cdk din complexele formate.
Complexul cdk-ciclin activat fosforileaz substratele necesare tranziiei
celulei la urmatoarea faz a ciclului.
Anumite evenimente intracelulare sau extracelulare pot determina oprirea
parcurgerii ciclului celular:
denutriia;
schimbri drastice de temperatur;
factori de stres;
alterarea ADN, etc.
Afectarea ADN celular este cel mai studiat semnal de iniiere a sistemelor de
control ale ciclului celular. Detectarea de erori de copiere a genomului celular
determin sechestrarea celulelor n faza G1 sau, dac aceasta a fost depait, n faza S,
inhibndu-se att iniierea replicrii, ct i elongaia. Blocarea ciclului celular se face
prin intermediul inhibitorilor kinazelor ciclin-dependente.
Exist mecanisme specifice de reglare a fiecrei etape ale ciclului celular:
Tranziia G1 - S
n faza G1 a ciclului celular exist un punct de control cunoscut drept punctul
de restricie, R. El marcheaz fosforilarea proteinei Rb (a retinoblastomului) prin
intervenia complexului holoenzimatic format de cdk 4 cu ciclina D. Consecina este
anularea aciunii inhibitorii pe care o are proteina Rb n forma hipofosforilat i
legarea acesteia la nivelul unor secvene specifice ale ADN prin intermediul unor
factori de transcripie de tipul proteinei myc. Aciunea inhibitorie a proteinei Rb
nainte de fosforilare se manifest prin legarea de un alt factor de transcripie, E2F.
Complexul astfel format este capabil s lege ADN, dar nu poate iniia transcripia.
E2F devine capabil s-i ndeplineasc rolul de factor de transcripie doar dup
fosforilarea proteinei Rb, cnd factorul E2F redevine liber. Astfel se activeaz
transcripia genelor ai cror produi sunt necesari pentru trecerea la faza S a ciclului
celular i pentru desfaurarea corespunztoare a copierii ADN. Se consider c
proteina Rb este factorul-cheie pentru trecerea n faza S a ciclului celular.
Alterarea ADN celulei aflate n faza G1 induce sinteza n cantiti mai mari a
proteinei oligodimerice p53. Aceasta induce transcripia genei p21, sintetizndu-se
astfel cantiti crescute de proteina p21, un inhibitor multipotent al kinazelor ciclindependente. Consecina final este inhibarea fosforilrii proteinei Rb i, deci, blocarea
progresiei ciclului celular. Se consider c proteina p53 induce i transcripia unor
compusi implicai n procesele de reparaie a ADN. n condiiile n care defectul este
mult prea grav pentru a fi reparat, p53 contribuie la declanarea apoptozei.
Faza S
Mecanismele de reglare a parcurgerii fazei S nu sunt suficient cunoscute. Se
tie c, imediat dup iniierea replicrii ADN-ului, se formeaz complexul activator,
cdk-ciclina A. Consecina este fosforilarea i, deci, activarea proteinelor care se leag
la nivelul situsurilor de replicare autonom unde debuteaz acest proces. Odat ce
ADN a fost copiat n ntregime, celula intr n faza G2.
Tranziia G2-M
Primul factor reglator descris ca fiind implicat n tranziia de la faza G2 la faza
M a fost factorul de promovare a mitozei, MPF. MPF este de fapt complexul cdk2ciclina B care, acionnd pe un substrat-cheie necunoscut, determin trecerea la faza
M.

11

Faza M
Faza debuteaz dup activarea complexului cdk2-ciclina B. Iesirea din faza
mitozei i intrarea n stadiul G1 este marcat de distrucia proteolitic a ciclinei B i
de inactivarea cdk2.
Reglarea extracelular a ciclului celular
Celula integreaz continuu semnale extracelulare cu rol n controlul
mecanismelor de diviziune celular. Statutul nutriional, contactul celul-celul i
peptidele extracelulare influeneaz evenimentele intracelulare.

SLIDE 16. Structura i funcia complexului porilor nucleari
Figura. Complexul porului nuclear, model schematic (dup Molecular Cell Biology
Lodish H., et. al., 2000)

nveliul nuclear este o barier care separ dou din cele mai importante
compartimente ale celulei, nucleul i citoplasma, porii fiind pori n aceast barier.
Contrar membranei plasmatice, care mpiedic trecerea macromoleculelor ntre
citoplasm i spaiul extracelular, anvelopa nuclear este un centru activ pentru ARN
i proteinele care se deplaseaz n cele dou sensuri, ntre compartimentele pe care
aceasta le separ. Replicarea i transcripia materialului genetic, care au loc n nucleu,
necesit participarea unui mare numr de proteine care se sintetizeaz n citoplasm i
sunt transportate prin nveliul nuclear. Invers, moleculele de ARNm, ARNt i
subunitile ribozomilor care sunt fabricate n nucleu trebuie s fie transportate prin
membrana nuclear.
Anumite elemente, cum sunt moleculele ARNsn (ARN small nuclear), se
deplaseaz n cele dou direcii. Acestea sunt sintetizate n nucleu, se asambleaz n
particule ribonucleoproteice (RNP), n citoplasm, i sunt reimportate n nucleu unde
intervin n maturarea ARNm. Acest trafic intens se realizeaz prin porii nucleari.
innd seama c particule materiale, de talia subunitilor ribozomale, pot s treac
prin porii nucleari, putem presupune c acetia sunt canale deschise dar, de fapt, este
exact contrar. Porii nucleari conin un aparat complex, n form de co, numit
Complexul Porului Nuclear (CPN) care obtureaz porul ca un dop i care se reliefeaz
n afar n citoplasm i n nucleoplasm. Structura CPN este prezentat n modelul
schematic din figura din Slide 16 i n micrografiile electronice din Slide 17.

SLIDE 17. Porul nuclear-imagini de microscopie electronic

Figura Anvelopa nuclear a ovocitelor de Xenopus vizualizat prin microscopie electronic:
a) faa citoplasmatic a complexului porului nuclear (CPN); b) faa nucleoplasmatic a
anvelopei nucleare dup ndeprtarea membranei nucleare a CPN, evideniind structura sub
form de co; c) faa nucleoplasmatic a anvelopei nucleare dup ndeprtarea membranei
nucleare prin tratament blnd cu detergent. Reeaua laminar, care se insereaz n inelul
nuclear al NPC, este expus dup acest tratament (dup Molecular Cell Biology Lodish H., et.
al., 2000)

CPN este un enorm complex molecular cu simetrie octogonal care se

estimeaz c are n structur 100 la 200 polipeptide. Masa CPN este de aproximativ
30 ori mai mare dect masa unui ribozom. Structura molecular a complexului CPN a
fost determinat de-a lungul timpului graie tehnicilor de microscopie electronic i de
analiz de imagini din ce n ce mai performante. Dac sunt injectate soluii, ale
moleculelor cu mas molecular mic, n citoplasma unei celule acestea pot penetra
rapid n porii nucleari prin simpl difuzie. Experimentul sugereaz c aceste substane
sunt capabile s treac printre fantele existente ntre razele coului.

12

Capacitatea moleculelor mai mari (proteine i nucleoproteine) de a trece din

citoplasm n nucleu depinde de sediul lor obinuit de reziden, n nucleu sau n afara
acestuia. De exemplu, dac o protein citoplasmatic, cum este albumina seric
bovin, este marcat radioactiv i injectat n citoplasm, ea are tendina de a rmne
acolo. Din contr, dac injectarea este realizat cu o protein cu localizare nuclear,
nucleoplasmina, proteina marcat va fi regsit imediat n nucleu.

SLIDE 18. Mecanisme de transport

n 1982, Robert Laskey i colaboratorii si de la Medical Research Council,
Anglia, au descoperit c nucleoplasmina, una dintre cele mai abundente proteine
nucleare din ovocitele de amfibieni, conine o secven de aminoacizi n apropierea
extremitii C terminale care funcioneaz ca un Semnal de Localizare Nuclear
(SLN), care i permite s treac prin porii nucleari i s intre n nucleu. De atunci au
fost identificate o serie de alte SLN, cea mai mare parte a acestora fiind constituite din
scurte secvene de aminoacizi cu sarcin pozitiv. n principiu, orientarea (adresarea)
proteinelor ctre nucleu este asemntoare cu transportul altor proteine care sunt
distribuite n anumite organite, de tipul mitocondriei sau peroxizomilor. n toate
cazurile, proteinele posed o etichet specific care este recunoscut de ctre un
receptor particular de la suprafaa organitului int.
Importul proteinelor n nucleu trece prin mai multe etape: i) proteina care
trebuie importat se cupleaz cu un receptor pentru SLN care pare a fi localizat la
suprafaa filamentelor deprtate de inelul extern al porului ctre citoplasm; ii)
interacia ntre proteina nuclear i receptorul pentru SLN permite acostarea proteinei
pe faa citoplasmatic a complexului porului nuclear prin formarea unui complex de
transport; iii) deplasarea complexului de transport prin por necesit energie eliberat
din hidroliza ATP. Aceasta implic o modificare a conformaiei transportorului,
structur mare n form de dop (inel intern) situat n centrul complexului porului
nuclear. Modificarea de conformaie deschide un canal n centrul transportorului i
permite moleculelor situate n proximitatea acestuia s ptrund n nucleoplasm.
Dup acelai principiu, substanele care trec din nucleu n citoplasm declaneaz,
probabil, deschiderea transportorului n sens invers.
n figura este prezentat un model schematic de import nuclear al unei proteine
(cargo) dup cuplarea acesteia cu semnalul de localizare nuclear (SLN). n
citoplasm, importinele i interacioneaz cooperativ cu proteina cargo care
urmeaz a fi transportat, prin legarea importinei la SLN. Subunitatea importinei ,
din complexul cargo trimeric rezultat, interacioneaz cu componentele CPN,
translocnd complexul n nucleoplasm prin mecanisme destul de puin cunoscute.
Aceast translocare necesit hidroliza ATP. n nucleoplasm, Ran-GTP
interacioneaz cu importina , determinnd disocierea complexului cargo i elibernd
proteina transportat n nucleoplasm. Pentru a susine un alt ciclu de import,
importina monomer i complexul importin -Ran-GTP sunt transportate napoi n
citoplasm. Proteina de activare RanGAP (Ran GTP activating protein), din
citoplasm, stimuleaz transformarea Ran-GTP la Ran-GDP avnd drept rezultat o
transformare conformaional la nivelul Ran care determin disocierea de importina .
Importina liber interacioneaz apoi cu importina i se formeaz un nou complex
cargo purttor al unui semnal bazic SLN, care iniiaz un alt ciclu de import nuclear.
Se presupune c Ran-GDP este i el translocat prin porii nucleari din citoplasm n
nucleoplasm, unde factorul nucleotidic de schimb, Ran (RCC1), determin eliberarea
GDP i relegarea GTP.

13

SLIDE 19. Influena semnalului de localizare nuclear

Un por nuclear individual este capabil s importe proteine i s exporte ARN
i ribonucleoproteine. Acest transport bidirecional poate fi vizualizat prin
microscopie electronic. De asemenea, tendina de acumulare n unul dintre cele dou
compartimente celulare a unor proteine purttoare de semnale de localizare n
citoplasm sau n nucleu poate fi vizualizat prin microscopie de fluorescen sau
confocal.
Semnalul de Localizare Nuclear (SLN) al antigenului T (SV40) poate
direciona o protein citoplasmatic n nucleu:
a) piruvat kinaza normal, localizat n citoplasm, vizualizat prin
imunofluorescen dup tratarea celulelor n cultur cu un anticorp specific;
b) piruvat kinaza himer, care conine un semnal SNL al SV40 la captul su
N-terminal, este direcionat ctre nucleu. Proteina himer a fost exprimat n urma
transfeciei unei gene modificate produs prin fuziunea unui fragment al unei gene
virale care codific NLS al SV40 cu gena piruvat kinazei (dup Molecular Cell
Biology Lodish H., et. al., 2000).

SLIDE 20. Matricea nuclear

Figura. Localizarea situsurilor de sintez i de maturare a pre-ARN cu sonde
fluorescente: a) vizualizarea procesului de transcripie prin colorare cu DAPI pentru
evidenierea genei i cu anticorpi fa de heterogen nuclear ribonucleoproteine,
marcai cu fluorescein; b) evidenierea procesului de poliadenilare prin colorare cu
poli-dT marcat cu rodamin i cu DAPI pentru evidenierea ADN; c) evidenierea
splicingului prin utilizarea de anticorpi monoclonali, fa de proteina de splicing
SC-35, marcai cu fluorescein
Nucleul este un organit organizat
Specialitii n biologie celular se bazeaz mult pe studiile biochimice pentru a
nelege activitile nucleului. Cu toate c acestea furnizeaz un numr mare de
informaii, distrug toate structurile moleculare organizate care pot exista n nucleu i
dau impresia c acesta nu este dect un sac de elemente repartizate la ntmplare. n
acelai timp, o serie de studii de microscopie ne fac s realizm c nucleul este n
realitate un compartiment foarte organizat. De exemplu, fibrele de cromatin, care
compun un cromozom interfazic, nu sunt dispersate n tot nucleul, cum am putea
crede, ci ele sunt concentrate ntr-un domeniu specific care nu se suprapune deloc cu
domeniile altor cromozomi.
Interaciunile ntre extremitile cromozomilor i anvelopa nuclear reprezint
un alt mod de organizare a cromozomilor n nucleu. Aceast asociere este evident
mai ales n meioz, cnd cromozomii pot s se ndeprteze de anvelopa nuclear i s
formeze un buchet.
De mai bine de treizeci de ani se tie c ARN ribozomal este sintetizat n
nucleol, dar se consider c celelalte molecule de ARN, i mai ales ARNm se
asamblau n tot nucleul. Cercetrile ultimilor zece ani au demonstrat clar c
moleculele de ARNm sunt sintetizate ntr-un numr limitat de situsuri discrete situate
n ntregul nucleu. Dac sunt identificate cu ajutorul unor sonde marcate fluorescent,
situsurile de sintez i de maturare a moleculelor de pre-ARNm apar sub forma unor
pete strlucitoare n nucleoplasma nemarcat. Fiecare din cele 20 la 50 de pete
observate ntr-un anumit nucleu reprezint situsul sintezei mai multor molecule de
ARNm diferite. Diferitele elemente ale nucleului sunt organizate n acest
compartiment printr-o reea interactiv complex de filamente care compun matricea
nuclear.
14

Proba cea mai clar privind importana matricei nucleare a fost furnizat de o
serie de cercetri efectuate n laboratorul lui Jeanne Lawrence de la Universitatea din
Massachusetts. Utiliznd hibridizarea fluorescent, in situ, pentru a identifica
localizarea secvenelor specifice de ADN sau ARN. Lawrence i colaboratorii si au
constatat c moleculele de ARN transcrise, pornind de la o anumit gen, apar ca o
tren ntr-o serie limitat de nuclee. Trena fluorescent apare datorit prezenei mai
multor sute de molecule de pre-ARNm transcrise pornind de la o singur gen.
Concentrarea transcripilor ntr-un loc limitat ne sugereaz c acetia nu sunt liberi s
difuzeze plecnd de la ADN de pe care au fost transcrii. Se pare c acetia sunt
meninui stabili de unele dintre elementele nucleului pe toat perioada maturrii lor.
Dac nucleele sunt tratate cu detergeni i cu sruri concentrate, practic toate
moleculele de pre-ARNm care au fost transcrise rmn asociate matricei nucleare
reziduale. De fapt, urmele de ARNm fluorescente care au fost observate nainte de
extracia dintr-un anumit nucleu i pstreaz exact poziia i dup extracie, deoarece
moleculele de ARNm nou formate sunt asociate elementelor matricei celulare. De
asemenea, orientarea trenelor sugereaz c moleculele de ARN prsesc locurile de
sintez pentru a se localiza n situsuri mai apropiate de periferia nucleului. n cursul
deplasrii moleculelor de ARNm fa de gena de la care sunt sintetizate, intronii sunt
eliminai din structura transcripilor prin mecanismul de splicing. Orientarea trenei,
dinspre interiorul nucleului ctre periferia sa, este compatibil cu un model n care
matria nuclear ghideaz moleculele de ARN, n curs de maturare, de la locul n care
sunt transcrise ctre porii nucleari pentru a iei din nucleu.

SLIDE 21. Matricea nuclear

Figura. Matricea nuclear: a) micrografie electronic a unui nucleu izolat n
prezen de detergeni i sruri 2M; b) micrografie electronic a unei regiuni de
fibroblast de oarece n urma tratamentului cu detergent i nlturare a cromatinei i
ADN
Cnd nucleele izolate sunt tratate cu detergeni anionici i o concentraie
crescut de sruri (NaCl 2M), pentru a extrage lipidele i aproape toate proteinele
histonice i nehistonice ale cromatinei, ADN apare ca un halou care nconjoar un
centru nuclear rezidual. Dac fibrele de ADN sunt apoi digerate cu nucleaz, rmne
o structur care pstreaz forma nucleului de origine, dar ea este compus din fibrile
proteice subiri care se ncrucieaz pe suprafaa spaiului nuclear. Aceast reea
fibrilar insolubil este matricea nuclear
Matricea nuclear nu este numai un schelet care menine forma nucleului sau
un eafodaj pe care se organizeaz buclele de cromatin; ea servete i n vederea
fixrii pentru mecanismele care intervin n diferite activiti ale nucleului, cum sunt
transcripia, maturarea ARN i replicarea. De exemplu, dac celulele sunt incubate n
prezen de precursori radioactivi ai ARN sau ADN n timpul unei scurte perioade,
gsim c aproape toi acizii nucleici sintetizai sunt asociai fibrilelor matricei
nucleare.

SLIDE 22. Cromozomii. Structura cromozomului mitotic

15

Figura. Comparaie ntre starea cromatinei n interfaz i a cromatinei compactate n

mitoz: a) micrografie electronic prezentnd starea dispersat a cromatinei n
interfaz; b) micrografie electronic a unui cromozom mitotic (dup Molecular Cell
Biology Lodish H., et. al., 2000)
Cromozomii se individualizeaz structural la nceputul mitozei i par s
dispar din nou la sfritul acesteia. Acetia sunt constituii dintr-un complex de
ADN i proteine numit cromatin. Cromatina exist n diverse stri n diferite faze ale
ciclului celular. Cromozomii sunt mult mai scuri dect lungimea moleculelor de
ADN pe care le conin. n medie, un cromozom uman conine o molecul de ADN de
aproximativ 5 cm. Compactarea acestui material genetic, n structura cromozomului,
presupune existena unui sistem organizat de mpachetare care s permit totui
funcionarea genomului i exprimarea genelor. Observate la microscopul electronic,
cea mai mare parte a organitelor intracelulare prezint o structur care ne ofer
informaii interesante despre funcia lor. Totui, micrografiile electronice ale
preparatelor fine ale nucleului ofer destul de puine informaii privind natura
cromozomilor n interfaz. n aceast etap, cromozomii sunt mult mai puin vizibili
deoarece cromatina se afl ntr-o stare mai relaxat.

SLIDE 23. Imagine electrono-microscopic a unui cromozom uman n

metafaz
Cromozomii eucariotelor, care constau ntr-un complex de ADN, ARN i
proteine numit cromatin, sunt entiti dinamice a cror aparen variaz considerabil
i dramatic cu stagiul ciclului celular. Cromozomii individuali se pot evidenia sub
form condensat numai n timpul diviziunii celulare (faza M a ciclului celular). n
timpul interfazei, care formeaz restul ciclului celular, cnd cromozomii sunt
transcrii i replicai, cromozomii majoritii celulelor devin foarte dispersai.
Nucleul Celular
n ciuda importanei sale pentru stocarea i utilizarea informaiei genetice,
nucleul celulei eucariote posed o morfologie destul de comun: coninutul nuclear
reprezint o mas vscoas amorf de materie nchis ntr-un nveli nuclear complex.
n nucleul unei celule tipice, n interfaz (nemitotic), se evideniaz:
i) cromozomii, prezeni sub forma unor fibre nucleoproteice foarte alungite,
cromatin;
ii) matricea nuclear care este format dintr-o reea fibrilar care conine
proteine;
iii) unul sau mai muli nucleoli, care sunt structuri amorfe opace la electronii
i care intervin n sinteza ARN ribozomal i n asamblarea ribozomilor;
iv) nucleoplasma, substan lichid care conine toate componentele i
elementele nucleului eucariot .
Cromozomii
Cromozomii par s apar la nceputul mitozei i s dispar din nou dup
mitoz, punnd astfel citologilor una dintre nntrebrile cele mai importante dar n
acelai timp i una dintre cele mai stimulante; care este natura cromozomilor n
celulele ne-mitotice. Observate la microscopul electronic, cea mai mare parte a
organitelor infracelulare demonstreaz o structur care ne ofer informaii interesante
despre funcia lor. Totui, micrografiile electronice ale preparatelor fine ale nucleului
evideniaz puine informaii privind natura cromozomului n interfaz.
mpachetarea genomului
16

O celul uman normal conine aproximativ 6 miliarde de perechi de baze

repartizate ntre 46 de cromozomi (cantitatea prezent n numrul diploid de
cromozomi ne-replicai). Fiecare cromozom conine o singur molecul de continu
de ADN; cu ct cromozomul este mai mare cu att mai lung este ADN pe care l
conine. Dat fiind c fiecare pereche de baze ocup aproximativ 0,34 nm dea lungul
moleculei de ADN, 6 miliarde de perechi de baze corespund unei molecule lungi de 2
metri. Pe de alt parte, n celul, ADN este unit prin cantiti mari de ap
(aproximativ 6 molecule de ap pentru fiecare pereche de baze), care i acestea duc la
creterea volumului. ntrebarea care se ridic este: cum este posibil intrarea a 2 m de
ADN hidratat ntr-un nucleu al crui diametru nu depete 10 m, asigurnd i
accesul proteinelor i enzimelor implicate n reglare. O alt problem la fel de
important este modul n care molecula de ADN dintr-un cromozom este organizat
pentru a nu se nnoda cu moleculele altor cromozomi. Rspunsul la toate aceste
probleme l gsim n modul remarcabil de mpachetare al moleculei de ADN. De mult
timp se tie c cromozomii sunt compui din fibre, numite cromatin, formate din
ADN i din proteine asociate. Proteinele din structura cromatinei sunt n general
mprite n dou grupe principale: histonele i proteinele cromozomale nehistonice.
Histonele reprezint o colecie de mici proteine bazice bine definite n timp ce
nonhistonele conin un numr mare de proteine diferite: structurale, enzimatice i
reglatoare, dintre care cea mai mare parte nu au fost nc caracterizate. Cromatina mai
conine i un procentaj sczut de ARN compus n principal din catene de ARN n
formare in diferite stadii de maturare i din ARNsn care intervine n procesul de
splicing al ARNm.

SLIDE 24. Centromeri/Telomeri

Figura. Hibridizarea fluorescent n situ (FISH) i aplicaiile ei: a) utilizarea de
sonde fluorescente pentru marcarea regiunii centromerice a cromozomului 16; b)
exemplu de cariotip spectral; c) evidenierea prezenei telomerilor la cromozomi de
oarece (adaptat dup Molecular Cell Biology Lodish H., et. al., 2000)
Centromerii.
Se poate remarca cci toi cromozomii reprezentai n figur posed un situs
unde suprafaa lor exterioar este net rscroit (scobit). Aceast scobitur reprezint
centromerul cromozomului. Mai sus am artat c centromerii conin heterocromatin
constitutiv. Centrometrii cromozomilor umani conin o secven lung de
aproximativ 170 nucleotide (ADN satelit ) dispuse n tandem i repetate de 2 000 la
30 000 ori per centromer. ADN centromeric fixeaz proteine specifice, ntre altele
cele care servesc drept situs de fixare microtubulilor care separ cromozomii n
timpul diviziunii mitotice.

SLIDE 25. Telomerii

Figura. Completarea capetelor ADN de ctre telomeraz: a) procesul de replicare i
evidenierea formrii capetelor incomplete ale cromozomilor pentru catena
ntrziat; b) mecanismul de aciune al telomerazei cu evidenierea motivelor
repetitive de la capetele cromozomilor
Telomerii
Cele dou extremiti ale moleculei de ADN a fiecrui cromozom posed un
segment particular de secvene repetitive numite telomeri, care formeaz un coif la
fiecare capt al cromozomilor. La om telomerii posed secvene TTAGGG/AATCCC
repetitive de mii de ori. Contrar celor mai multe tipuri de secvene repetitive, care

17

variaz mult ntre specii, chiar dac ele sunt nrudite i apropiate, n cazul telomerilor
de la om i de la toate vertebratele studiate pn n prezent gsim aceeai secven
telomeric. La alte organisme cum sunt protozoarele i drojdiile, telomerii au secvene
diferite dar, ca i pentru vertebrate, o caten este ntotdeauna bogat n resturi de
guanozin iar complementara sa n resturi de citozin. Catena bogat n G este
orientat n sensul 5-3 ctre extremitatea cromozomului i depete cu 12 la 15
nucleotide extremitatea catenei bogat n C. Datorit existenei acestui dezechilibru
catena bogat n G formeaz o scurt coad monocatenar la cele dou extremiti ale
cromozomului. Aceast dispoziie persist de la o generaie celular la alta datorit
unei enzime speciale, telomeraza, care poate aduga noi uniti repetitive la
extremitatea 3 a catenei bogate n G.
Telomeraza, ale crei proprieti au fost bine studiate de ctre Elisabeth
Blackburn i colegii si de la Universitatea din California, San Francisco, este o
transcriptaz invers care asambleaz fragmente de ADN folosind o caten (matri)
de ARN. Telomeraza este o enzim foarte neobinuit n sensul n care ARN care
servete drept model, face n realitate parte din enzim. Secvenele telomerice sunt i
situsuri de fixare a mai multor proteine specifice.
Telomerii au roluri importante:
i) sunt necesari replicrii complete a cromozomului;
ii) protejeaz cromozomii de nucleaze i de alte influene destabilizatoare;
iii) mpiedic fuziunea dintre extremitile cromozomilor n procesele de
recombinare;
iv) faciliteaz interaciile dintre extremitile cromozomilor i anvelopa
nuclear n anumite tipuri celulare.
De asemenea, telomerii i activitatea telomerazei par s fie unii dintre
principalii actori implicai n procesul de mbtrnire. Celulele normale, n cultur, nu
sunt capabile s se divid dect de un numr limitat de ori nainte de a da semne de
mbtrnire i de a muri n final. Dintre ipotezele propuse pentru a explica aceast
observaie este i scurtarea progresiv a telomerilor. Experiene recente sugereaz alte
roluri. Celulele normale nu sunt capabile s se divid n cultur dect de un numr
limitat de ori nainte de a da semne de mbtrnire i n final de a muri.
Au fost propuse diferite ipoteze pentru a explica aceast observaie: cea mai
recent este scurtarea progresiv a telomerilor. Telomerii se scurteaz deoarece cea
mai mare parte a celulelor umane par a fi lipsite de telomeraze. Contrar celulelor
normale celulele canceroase nu nceteaz s creasc n cultur; spunem c acestea
devin nemuritoare. Unul dintre factorii care ar putea contribui la imortalizarea
celulelor maligne este reactivarea telomerazei, care conserv lungimea telomerilor dea lungul generaiilor. De fapt, o seri de cercetri au demonstrat c un anumit numr de
cancere la om au o activitate a telomerazei care nu poate fi evideniat n celulele
normale. Aceast descoperire a declanat cercetarea inhibitorilor specifici ai acestei
enzime spernd c acetia ar putea opri creterea anumitor tumori.

SLIDE 26. Nucleozomii: primul nivel de organizare al cromozomului

Figura. Schema general a organizrii cromatinei cu evidenierea principalelor
nivele cunoscute de organizare (Campbell, et al., Biology 2002).
Imagine electrono-microscopic a unui cromozom uman n metafaz
Cromozomii eucariotelor, care constau ntr-un complex de ADN, ARN i
proteine numit cromatin, sunt entiti dinamice a cror aparen variaz considerabil
i dramatic cu stagiul ciclului celular. Cromozomii individuali se pot evidenia sub
form condensat numai n timpul diviziunii celulare (faza M a ciclului celular). n
18

timpul interfazei, care formeaz restul ciclului celular, cnd cromozomii sunt
transcrii i replicai, cromozomii majoritii celulelor devin foarte dispersai.
Nucleul Celular
n ciuda importanei sale pentru stocarea i utilizarea informaiei genetice,
nucleul celulei eucariote posed o morfologie destul de comun: coninutul nuclear
reprezint o mas vscoas amorf de materie nchis ntr-un nveli nuclear
complex.
n nucleul unei celule tipice, n interfaz (nemitotic), se evideniaz:
i) cromozomii, prezeni sub forma unor fibre nucleoproteice foarte alungite,
cromatina;
ii) matricea nuclear care este format dintr-o reea fibrilar care conine
proteine;
iii) unul sau mai muli nucleoli, care sunt structuri amorfe opace la electronii
i care intervin n sinteza ARN ribozomal i n asamblarea ribozomilor;
iv) nucleoplasma, substan lichid care conine toate componentele i
elementele nucleului eucariot .
Cromozomii
Cromozomii par s apar la nceputul mitozei i s dispar din nou dup
mitoz, punnd astfel citologilor una dintre nntrebrile cele mai importante dar n
acelai timp i una dintre cele mai stimulante; care este natura cromozomilor n
celulele ne-mitotice. Observate la microscopul electronic, cea mai mare parte a
organitelor infracelulare demonstreaz o structur care ne ofer informaii interesante
despre funcia lor. Totui, micrografiile electronice ale preparatelor fine ale nucleului
evideniaz puine informaii privind natura cromozomului n interfaz (fig 12.1a).
mpachetarea genomului
O celul uman normal conine aproximativ 6 miliarde de perechi de baze
repartizate ntre 46 de cromozomi (cantitatea prezent n numrul diploid de
cromozomi ne-replicai). Fiecare cromozom conine o singur molecul de continu
de ADN; cu ct cromozomul este mai mare cu att mai lung este ADN pe care l
conine. Dat fiind c fiecare pereche de baze ocup aproximativ 0,34 nm dea lungul
moleculei de ADN, 6 miliarde de perechi de baze corespund unei molecule lungi de 2
metri. Pe de alt parte, n celul, ADN este unit prin cantiti mari de ap
(aproximativ 6 molecule de ap pentru fiecare pereche de baze), care i acestea duc la
creterea volumului. ntrebarea care se ridic este: cum este posibil intrarea a 2 m de
ADN hidratat ntr-un nucleu al crui diametru nu depete 10 m, asigurnd i
accesul proteinelor i enzimelor implicate n reglare. O alt problem la fel de
important este modul n care molecula de ADN dintr-un cromozom este organizat
pentru a nu se nnoda cu moleculele altor cromozomi. Rspunsul la toate aceste
probleme l gsim n modul remarcabil de mpachetare al moleculei de ADN. De mult
timp se tie c cromozomii sunt compui din fibre, numite cromatin, formate din
ADN i din proteine asociate. Proteinele din structura cromatinei sunt n general
mprite n dou grupe principale: histonele i proteinele cromozomale nehistonice.
Histonele reprezint o colecie de mici proteine bazice bine definite n timp ce
nonhistonele conin un numr mare de proteine diferite: structurale, enzimatice i
reglatoare, dintre care cea mai mare parte nu au fost nc caracterizate. Cromatina mai
conine i un procentaj sczut de ARN compus n principal din catene de ARN n
formare in diferite stadii de maturare i din ARNsn care intervine n procesul de
splicing al ARNm.

19

In interfaz cromozomii sunt sub forma unor fibre lungi de fibre de 30 nm sub
forma unui eafod extins. In metafaz, eafodul este pliat intr-un helix i apoi ntr-o
structur mult mai compactat a crei geometrie precis nu a fost determinat.

SLIDE 27. Un model de mpachetare a cromozomilor metafazici

Comentariu figura - in interfaz cromozomii sunt sub forma unor fibre lungi de fibre
de 30 nm sub forma unui eafod extins
In metafaz, eafodul este pliat intr-un helix i apoi ntr-o structur mult mai
compactat a crei geometrie precis nu a fost determinat
O alt problem este modul n care un nucleu cu un diametru de 10 m poate
conine o cantitate de ADN a crei lungime este de 200 000 de ori mai mare dect
aceast valoare. Formarea nucleozomilor reprezint prima etap important a
procesului de condensare. Dac ntinderea ar fi complet, cele 200 perechi de baze ale
unui nucleozom individual de 10 nm diametru ar ocupa aproximativ de 70 nm, pentru
o valoare a planului nucleotidelor de 0,34 nm. n consecin, raportul c de
condensare a ADN, din structura nucleozomilor este de aproximativ 7:1.
Nivelurile structurale superioare ale cromatinei.
Deci, cel mai redus nivel de organizare al cromatinei este rsucirea moleculei
de ADN n jurul inimii nucleozomului i are un de diametru 10 nm. Totui, cromatina
nu se gsete n celul sub aceast form relativ rsucit de irag de mtnii.
Micrografiile electronice ale seciunilor de nucleu relev un umr de pete minuscule
cu un diametru de aproximativ 30 nm care reprezint seciuni transversale la nivelul
fibrelor de cromatin. Dac se separ cromatina din nucleu, n prezena ionilor
divaleni, se observ prezena unor filamente de aceeai grosime.
Structura acestui filament de 30 nm rmne nc un subiect discutabil. n
figur este prezentat modelul solenoid de suprarsucire a filamentului subire al
nucleozomilor (10 nm) pentru a forma un filament de ordin superior, mai gros. Se
presupune c, fibrele condensate se formeaz prin mpachetarea nucleozomilor ntr-o
structur spiralat (aranjament solenoid) care conine ase nucleozomi pentru fiecare
tur de rsucire. Acest nivel suplimentar de organizare al cromatinei crete de ase ori
raportul de condensare. Filamentul de 30 nm este conservat prin interaciunea ntre
moleculele de histon H1 ale nucleozomilor vecini.
Dac sunt extrase selectiv moleculele H1, filamentele groase de cromatin se
deruleaz i se transform n mrgele (mtnii) mai subiri i mai nguste.
Readugarea histonei H1 restabilete structura de ordin superior. Studii recente de
microscopie electronic sugereaz c fibrele de 30 nm sunt mai puin uniforme dect
modelul solenoid imaginat. Cromatina condensat poate fi de fapt foarte dinamic
fiind format din structuri parial depliate care se pot replia rapid n structuri
solenoide ocazionale.
Cromatina din regiunile cromozomiale care nu sunt transcrise frecvent este
predominant n forma condensat de 30 nm, n timp ce regiunile transcrise activ se
consider c adopt forma relaxat de irag de mtnii.
Urmtoarea etap de condensare a ADN, n nucleu, o reprezint organizarea
filamentelor de 30 nm ntr-o serie de bucle mari suprarsucite. Se estimeaz c fiecare
bucl conine ntre 10 i 150 kilobaze ADN. Se pare c acestea sunt fixate la baz cu
proteine specifice printre care i o topoizomeraz de tip II care intervine pentru a
controla gradul de spiralizare al ADN la nivelul buclei. Topoizomeraza elibereaz
moleculele de ADN dac o bucl se ncurc. Buclele de ADN ar putea mpri
genomul n domenii, fiecare coninnd un lot mic de gene care sunt exprimate
20

printr-un mecanism comun de reglare. Normal, buclele de cromatin sunt etalate la

interiorul nucleului i nu sunt vizibile, dar prezena lor poate fi evideniat n anumite
circumstane. De exemplu, dac tratm cromozomii mitotici izolai cu reactivi care
extrag histonele, putem observa c ADN eliberat de histone se pliaz sub form de
bucle plecnd de la eafodaj proteic, format din proteine nehistonice.

SLIDE 28. Cteva caracteristici ale histonelor

Figura: Secvena aminoacizilor histonei H4 din timus de viel. Aceast protein de
102 aminoacizi posed 25 de resturi de arginin i lizin. Histona H4 de la mazre
difer de aceasta numai prin dou resturi: Val 60 i Lys 77. Aminoacizii subliniai
sunt subiectul unor modificri post-translaionale
Capul spermatozoidului este bogat n spermin i n spermidin (de unde i
numele acestor poliamine), i n particular, pentru peti, n protamine. Acestea sunt
polipeptide care nu depesc 5 kDa (30-40 aminoacizi), foarte bazice datorit
coninutului ridicat de arginin: 21 din cei 31 de aminoacizi ai clupeinei de hering
sunt reprezentai de arginin. O parte (proporie) din aceste molecule este fixat pe
ADN. (Se consider c protaminele se fixeaz probabil la nivelul fosei mari
determinnd o conformaie cu o mare proporie de elice alfa. ADN plasat n capul
spermatozoizilor este cel mai condensat).
n celulele somatice, ADN este asociat n proporii egale cu proteine: histonele
(H) majoritare i proteinele ne-histonice. Complexul nucleoproteic care rezult i
datoreaz numele reaciei sale cu colorani bazici. Cromatina este un irag de
mtnii unde fiecare mrgea, nucleozomul, reprezint asocierea spaial precis a
dou componente.
Nucleozomii
Uniformi i repetitivi, se formeaz prin rsucirea sub form de serpentin a ADN pe
corpi sau nuclee de histone (figura 3.2).
1. Nucleul (inima) este o asociere cuaternar, prin intermediul domeniului lor
hidrofob, format din 2 copii de histone H2a, H2b, H3 i H4. Octamerul are aspectul
unui cilindru plat.
2. Prin formarea de legturi de hidrogen ntre resturile lor i sarcinile negative ale
gruprilor fosfat (din structura moleculei ADN), helixurile terminale ale histonelor H3
i H4, se ajusteaz strns la nivelul fosei mici a ADN. Ca rezultat, pe o lungime de
aproximativ 200 pb, dubla elice se contorsioneaz la suprafaa cilindrului sub forma
unei elice de stnga cu dou suprarsuciri. Astfel mpachetat, ADN prezint fosa
mare ctre exterior, secvenele bazelor fiind accesibile.
Regiunea format din ADN de legtur ntre fiecare nucleozom are lungime foarte
variabil n funcie de tipul celular (o la o sut de perechi de baze).
3. Histona H1 intervine n determinarea gradului superior de organizare. Prin
conformaia sa teriar cu trei domenii prinde nucleozomii ntre ei prin trei tipuri de
contacte prezentate n figur: H1/ADN la intrare i la ieire; H1/suprafaa nucleului
(mai ales prin intermediul H2a); H1/H1 urmtoare.
ADN supra-rsucit din nucleozom este protejat de aciunea hidrolitic a
nucleazelor, n timp ce regiunile de legtur dintre nucleozomi sunt foarte sensibile.
Cu toate c supra-rsucirea este foarte eficient aceasta nu reprezint dect
primul grad (nivel) de compactare necesar pentru ADN. Sunt necesare stivuiri n
coloane ale nucleozomilor i formarea unor tururi (ture) complexe de ordin superior
ale cromatinei, pentru a obine arhitectura final a cromozomului.
Modificrile post-traducionale reversibile ale histonelor, pe de o parte, i cele
ale bazelor, pe de alt parte (metilarea), confer suplee moleculei. Acestea modific
21

densitatea i repartiia sarcinilor i gruprilor hidrofobe, moduleaz interaciile ADNhistone i histone-histone necesare adaptrii cromozomului la funciile sale. Citologii
au denumit heterocromatin, regiunile foarte condensate i eucromatin, regiunile
mai difuze. Prima este inert, iar n cea de a doua genele au capacitate de exprimare.

SLIDE 29. Structura nucleozomal core a octamerului histonic

Figura. Structura a fost modelat ca urmare a studiilor cu raze X. Acelai model al
structurii centrale a nucleozomului (core) fiind identificat poziia histonelor
n 1974, Roger Kornberg, de la Universitatea Harvard, a propus un nou tip de
structur secundar pentru cromatin bazndu-se pe rezultatele digestiei cu nucleaze
asupra cromatinei din diferite surse. Astzi, se cunoate c nucleozomii conin o
particul care constituie nucleul nucleozomului, compus din 146 perechi de baze de
ADN suprarsucit, care face aproape dou spire n jurul unui miez proteic central care
conine 8 molecule din patru histone: H2A, H2B, H3 i H4. Particulele de nucleozomi
sunt unite unele de altele printr-un segment de ADN de legtur, de lungime variabil,
dar care are n general 60 de perechi de baze. ADN din structura unui nucleozom i
din braul de legtur reprezint aproximativ 200 de perechi de baze, ceea ce
corespunde valorii fragmentelor gsite n cursul primelor experiene cu nucleaze.
Nucleele nucleozomilor, care au un diametru de aproximativ 10 nm, i ADN de
legtur, cu un diametru de 2 nm, apar pe micrografiile electronice asemeni unui
irag de mtnii. Pentru fiecare nucleozom, o molecul de histon H1 este
poziionat n exteriorul nucleului fiind asociat la cele dou extremiti ale ADN care
intr i ies de pe suprafaa complexului proteic. Dac se realizeaz eliminarea
selectiv a moleculelor de histone H1, printr-un tratament al fibrelor cu soluii saline
de concentraie sczut, cromatina capt un aspect mult mai dezorganizat.
In general, resturile de aminoacizi bazici ale histonelor nucleului sunt grupate
la extremitile moleculei, restul structurii pstrnd un caracter relativ hidrofob.
Aceast separare convine perfect organizrii nucleozomului. Regiunile nencrcate i
hidrofobe ale histonelor ocup centrul particulei i favorizeaz agregarea ntr-un
nucleu strns. Poriunile polare, bazice, ale moleculelor din nucleu formeaz cozi
flexibile orientate ctre exteriorul particulei, unde resturile ncrcate pozitiv pot stabili
interacii ionice cu gruprile fosfat negative din structura scheletului ADN. Cu toate
c, molecula de ADN este strns asociat nucleului format din histone prin suprafaa
intern a fibrei elicoidale, suprafaa sa extern rmne expus i poate interaciona cu
moleculele de reglare.
Studii de cristalografie cu raze X au demonstrat c resturile ncrcate pozitiv
sunt reunite sub form de perechi la suprafaa octamerului histonic. Situsurile pereche
formeaz un fel de spiral pe drumul pe care se presupune c l urmeaz elicea ADN
care nconjoar nucleul nucleozomului. Acestea servesc drept puncte de fixare
pentru cele dou catene ale helixului. Deoarece toate moleculele ADN, indiferent de
origine i secvena nucleotidic, posed un schelet riboz-fosfat identic cu cel cu care
interacioneaz histonele, nu trebuie s ne surprind extrema conservare a moleculelor
aminoacizilor din structura histonelor.
Dac pentru spiralizarea a 200 de perechi de baze de ADN sunt necesare
aproximativ nou molecule de histone, o celul uman care conine 6 miliarde de
perechi de baze de ADN, poate conine aproximativ 300 milioane de histone necesare
mpachetrii primare a materialului genetic. Astfel se explic, necesitatea unui numr
mare de exemplare de gene care codific pentru histone n celulele care se divid rapid.
Interacia dintre histone i ADN este, n principal, de natur structural i
relativ independent de secvena nucleotidic. In vitro, un fragment de ADN care n
22

mod normal nu este asociat cu histone, cum este cazul bacteriofagilor sau a
polinucleotidelor bicatenare sintetice, formeaz subuniti nucleozomale dac este
incubat cu histone purificate care provin de la plante i animale. Experienele de acest
tip ilustreaz clar capacitatea de autoasamblare a nucleozomilor.
Chiar dac asamblarea histonelor cu ADN nu depinde de secven, aceasta nu
semnific neaprat c pentru o anumit gen, nucleele nucleozomilor sunt localizate
la situsuri aleatoare. De fapt, s-a demonstrat c anumite pri ale genelor manifest
interaciuni constante cu regiunile vecine. Exemplul prezentat n micrografia
electronic din figur demonstreaz c pe cromozomul virusului SV40 particulele
nucleozomale sunt distribuite periodic, cu excepia unei regiuni care este lipsit de
asocierea cu histonele.

SLIDE 30. Structura n aminoacizi a histonei H4

Histonele
Valorile de pH acide sau srurile determin dezorganizarea legturilor ionice
i separ cromatina n ADN i fraciune proteic. Prin cromatografie de excluziune,
de schimb ionic sau prin electroforez (tehnica SDS-PAGE n geluri cu porozitate
redus), au fost identificate la nivelul fraciilor proteice 5 specii de histone.
Punctele comune ale acestora sunt:
- mrime mic (au numai 100 la 200 de resturi de aminoacizi);
- coninut bogat n aminoacizi bazici: arginina i lizina reprezint aproximativ 1/4 din
totalul de resturi. La valorile pH celular aceste proteine sunt ncrcate pozitiv,
policationi;
- modificrile post-traducionale ale anumitor resturi, deci a aminoacizilor bazici, sunt
reversibile enzimatic: acetilare, metilare, fosforilare...;
- o structur teriar cu un grad nalt de helix .
**: perioad unitar de evoluie: durata necesar pentru o schimbare de 1% din
secven dup divergena a dou specii.
Studiile comparative de secvene i de structur tridimensional conduc la
divizarea familiei histonelor n dou grupuri, heterogenitate care este subliniat i de
poziia lor n nucleozom: H2, 3 i 4 pe de o parte i H1 pe de alt parte.
De fapt, histonele H4 i H3, i ntr-un grad mai mic H2a i H2b, sunt proteine
foarte conservate evolutiv. Se d ntotdeauna exemplul frapant al histonei H4 de la
bovine i de mazre, ale cror secvene nu difer dect prin dou resturi, aceste
diferene avnd influene puin perturbatoare: o Lys n locul unei arginine i o Leu n
locul unei Val (doi aminoacizi hidrofobi). Exist aceste diferene minore n condiiile
n care acest animal i aceast plant au suferit divergen acum un miliard de ani.
Structura histonei H1 este mult mai variabil de la o specie la alta.
Structura teriar a celor patru histone din primul grup demonstreaz existena
a dou domenii: un domeniu central globular, hidrofob; un domeniu N-terminal,
hidrofil, ncrcat pozitiv i flexibil.
Histona H1, mai lung, posed un al treilea domeniu la nivelul captului Cterminal, hidrofil i flexibil.
Se consider c histona H1 se leag la unuitate nucleozomal de 166 pb. ADN
face dou ture complete i poate lega H1 la intrare i la ieire de pe structura
nucleozomului. H1 se comport ca o agrafa care reunete cele dou treceri.

23

SLIDE 31. Gel electroforeza SDS a unui amestec de histone H3 i H4

Figura. Electroforeza n SDS a unui amestec de histome H3 i H4 de la viel.
Histonele H3 i H4 din timus de viel conin toate benzile anticipate pentru tetramerul
(H3)2(H4)2

SLIDE 32. Nucleosomii sunt complexe ADN-histone

Figura. Modelarea structurii nucleozomului.
mpachetarea genomului eucariot
Dup cum am evideniat mai sus, o celul uman normal conine aproximativ
6 miliarde de perechi de baze repartizate ntre 46 de cromozomi (cantitatea prezent
n numrul diploid de cromozomi ne-replicai). Fiecare cromozom conine o singur
molecul continu de ADN. Cu ct cromozomul este mai mare cu att este mai lung
molecula de ADN pe care o conine. Deoarece fiecare pereche de baze ocup
aproximativ 0,34 nm, 6 miliarde de perechi de baze corespund unei molecule lungi de
2 metri. De asemenea, n celul, ADN este hidratat cu cantiti importante de ap
(aproximativ 6 molecule de ap pentru fiecare pereche de baze), care i acestea duc la
creterea volumului. Problema cheie a fost identificarea modalitilor prin care este
posibil localizarea a 2m de ADN hidratat ntr-un nucleu al crui diametru nu
depete 10 m, asigurnd n acelai timp, accesul proteinelor i enzimelor implicate
n procesele de reglare. O alt problem, la fel de important, se refer la modul n
care molecula de ADN, dintr-un cromozom, este organizat pentru a nu se nnoda cu
moleculele altor cromozomi. Rspunsurile la toate aceste probleme l gsim n modul
remarcabil de mpachetare al moleculei de ADN. Se cunoate de mult timp c fibrele
care formeaz cromatina, i intr n structura cromozomilor, sunt formate din ADN n
asociere cu proteine. Proteinele din structura cromatinei sunt mprite n dou grupe
principale: histonele i proteinele cromozomiale nehistonice. Histonele reprezint o
colecie de mici proteine bazice bine definite, n timp ce proteinele nehistonice sunt
compuse dintr-un numr mare de proteine diferite cu rol structural, enzimatic i
reglator. Cromatina mai conine i un procentaj sczut de ARN compus, n principal,
din catene de ARNhn in diferite stadii de maturare i din ARNsn care intervine n
procesul de splicing al ARNm.
n celulele eucariote, unitatea de baz a organizrii cromatinei este
nucleozomul. Acesta reprezint o entitate n care 146 pb sunt rsucite n dou ture de
super-elice stng n jurul unui octamer de histone care conine cte dou exemplare
din moleculele H2A, H2B, H3 i H4. Nucleozomii sunt organizai n filamente de 10
nm n diametru prin interaciuni cu histona H1, care se leg la ADN care intr i iese
din nucleozom. Un al treilea nivel de organizare este obinut prin rsucirea unui
filament de 10 nm ntr-o elice care conine 6 nucleotide pe tur, cu formarea unui
solenoid cu un diametru de 30 nm. Structuri mai complexe ale cromatinei sunt
realizate prin condensarea filamentelor de 30 nm, dar detaliile privind aceste structuri
sunt mai puin cunoscute.
Microscopia electronic a furnizat dovezi decisive privind organizarea
cromatinei n regiuni, bucle i domenii distincte de 30 la 300 kpb, fixate fiecare pe o
matrice bogat n proteine. Fiecare bucl pare s aib doar o singur origine de
replicare i s se comporte ca o unitate de replicare. Buclele, sunt uniti de suprarsucire independente, structura topologic a fiecreia fiind independent de starea
celorlalte. Se pare c acest lucru este posibil datorit fixrii extremitilor buclelor n
matrice. Cu toate c fiecare bucl conine mai multe uniti de transcripie, activitatea
ntregii regiuni poate fi coordonat pentru a fi reprimat sau potenial activat.

24

Nucleozomii: primul nivel de organizare al cromozomului

mpachetarea precis a ADN de la eucariote depinde de histone, grup
remarcabil de proteine bazice care se mparte n cinci subgrupe, n principal n funcie
de coninutul lor n lizin i arginin care reprezint aproximativ din totalul
aminoacizilor. La pH fiziologic, aceste proteine sunt ncrcate pozitiv i posed o
structur teriar cu un grad mare de elice alfa. Aminoacizii bazici din structur sufer
modificri post-traducionale (acetilare, metilare, fosforilare) reversibile enzimatic.
Studiile comparative de secven i de structur tridimensional au condus la
divizarea familiei histonelor n dou grupuri: H2A, H2B, H3 i H4 pe de o parte i H1
pe de alt parte. Aceast eterogenitate este subliniat i de poziia lor n nucleozom.
De fapt, histonele H4 i H3, i ntr-un grad mai mic H2A i H2B, sunt proteine
foarte conservate evolutiv. Exemplul cel mai frapant este al histonei H4 de la bovine
i de la mazre, care au acelai numr de aminoacizi (102) i ale cror secvene
primare nu difer dect prin doi aminoacizi: o lizin n locul unei arginine i o leucin
n locul unei valine. Aceste diferene minore sunt prezente n condiiile n care
divergena dintre animal i plant s-a produs acum un miliard de ani. Structura
histonei H1 este mult mai variabil de la o specie la alta. Aceast conservare extrem
sugereaz c toi aminoacizii au un rol bine definit n funcionarea proteinei.
Structura teriar a histonelor din primul grup demonstreaz existena a dou
domenii: un domeniu central globular, hidrofob i un domeniu N-terminal, hidrofil,
ncrcat pozitiv i flexibil. Histona H1, mai lung, posed un al treilea domeniu la
nivelul captului C-terminal, hidrofil i flexibil.
La nceputul anilor 1970, s-a putut observa c n urma tratamentului
cromatinei, cu nucleaze nespecifice, cea mai mare parte a ADN era transformat n
fragmente de aproximativ 200 perechi de baze sau n multipli ai acestora.
Din contr, acelai tratament aplicat moleculelor de ADN nud determin
obinerea unei populaii de fragmente de mrimi aleatoare. Aceast descoperire i-a
fcut pe cercettori s considere c fragmentele uniforme de ADN cromozomial erau
protejate de atac enzimatic probabil prin asocierea lor periodic cu o protein.

SLIDE 33. Structura i dimensiunile nucleozomilor

Figura. Structura i dimensiunile nucleozomilor: a) sedimentarea nucleozomilor n
gradient de sucroz duce la obinerea unei serii de picuri care corespund formelor
monomere, dimere, trimere, etc., ale nucleozomilor; b) ADN extras din fraciile
individuale este supus electroforezei mpreun cu un martor ADN digerat cu
nucleaze; c) micrografie electronic a cromatinei eliberat dintr-un nucleu al unei
celule de Drosophila. Se observ c fibrele de cromatin sunt formate din nucleozomi
conectai ntre ei prin segmente scurte de ADN; d) schem care demonstreaz
structura unei particule nucleozomale cu o molecul de histon H1 asociat; e)
electroforez n SDS a unui amestec de histone H3 i H4 din timus de viel. Se
observ toate benzile corespunztoare componentelor tetramerului (H3)2(H4)2

SLIDE 34. Modul de legare al histonei H1 n structura nucleosomului

Figura. Dou ture complete ale moleculei de ADN sunt conectate prin legarea
histonei H1 care vine n contact cu molecula la capete i n mijloc. Octamerul
histonic este reprezentat printr-o sfer. Se consider c histona H1 se leag la
unuitate nucleozomal de 166 pb. ADN face dou ture complete i poate lega H1 la
intrare i la ieire de pe structura nucleozomului. H1 se comport ca o agrafa care
reunete cele dou treceri

25

SLIDE 35. Modelul solenoid de organizare a fibrelor de cromatin

condensat de 30 nm
Figura. Modelul solenoid de organizare a fibrelor de cromatin condensat de 30
nm: a) micrografia i modul de organizare a nucleozomilor din structur; b)
micrografie prezentnd fibrele de 30 nm i modelul de mpachetare solenoid cu
caracteristicile sale structurale (adaptat dup Molecular Cell Biology Lodish H., et.
al., 2000)

SLIDE 36. Cromatina exist n forme condensate i relaxate

Figura. Cromatina n form condensat i relaxat
a) Cromatina izolat la putere ionic sczut apare sub forma unor lanuri
de mrgele. Mrgelele sunt nucleosomii cu un diametru de 10nm diametru
Cromatina izolat in tampon cu putere inic fiziologic (o,15 M KCl) apare ca o
fibr condensat de 30nm diametru
Influene globale asupra expresiei genelor
Pn n prezent atenia ne-a fost ndreptat ctre reglarea transcripiei genelor
i asupra maturrii transcripilor primari. Viteza, momentul i localizarea acestor
procese sunt determinate de ctre proteinele care nu recunosc dect secvene scurte de
ADN i/sau suprafeele altor proteine. Aceste interacii influeneaz iniierea sau
terminarea transcripiei sau chiar maturarea transcripilor. Prezena sau starea
funcional a acestor proteine sunt adesea determinantul principal al expresiei genelor.
Totui, este de asemenea evident c modificrile reversibile ale strii ADN pot
influena expresia genelor, i n particular competena acestora n realizarea
transcripiei. De exemplu, modificarea gradului de superhelicitate a ADN, adic a
strii sale topologice, i modificrile conformaionale care decurg din aceasta (de ex.
trecerea de la topologie B la Z sau la alte forme de ADN) pot influena puternic
activitatea de transcripie. Starea cromatinei n care se gsete gena, n particular
gradul de compactare a nucleozomilor, adaug un grad de complexitate suplimentar
n exprimarea genelor. n general, activarea din timpul transcripiei este n raport cu
trecerea cromatinei de la o structur foarte condensat ctre o form derulat, sau
form deschis. Activitatea de transcripie este de asemenea influenat de ctre
gradul de metilare a citozinei din structura dinucleotidului 5-CG-3. Reprimarea
transcripiei este adesea asociat cu o hipermetilare la nivelul genei sau n apropierea
acesteia, activarea fiind nsoit de demetilare.
Compactarea ADN
Unitatea de baz a organizrii cromatinei n celulele eucariote este
nucleosomul, o entitate n care 145 pb sunt rsucite n dou ture de super-helix stng
n jurul unui octamer de histone care conine dou exemplare din moleculele H2A,
H2B, H3 i H4. Nucleozomii sunt organizai n filamente de 10 nm n diametru prin
interaciuni cu hostona H1, legat de ADN care intr i iese din nucleosom. Un al
treilea nivel de organizare este obinut prin rsucirea unui filament de 10 nm ntr-o
elice care conine 6 nucleotide pe tur: este vorba de formarea unui solenoid cu un
diametru de 30 nm. Structuri mai complexe ale cromatinei sunt realizate prin
condensarea filamentelor de 30 nm, dar detaliile privind aceste structuri sunt mai
puin cunoscute.
Microscopia electronic a furnizat dovezi decisive privind faptul c cromatina
este organizat n regiuni, bucle i domenii distincte de 30 la 300 kpb, fixate fiecare
pe o matrice bogat n proteine. Fiecare bucl pare s aib doar o singur origine de

26

replicare i s se comporte ca o unitate de replicare. Buclele sunt uniti de suprarsucire independente, structura lor topologic fiind independent de starea buclelor
vecine. Acest lucru este probabil posibil datorit fixrii extremitilor buclelor n
matrice. Cu toate c fiecare bucl conine mai multe uniti de transcripie, activitatea
ntregii regiuni poate fi coordonat pentru a fi reprimat sau potenial activ.
Cromatina reprimat.
Numeroase gene de la organismele eucariote multicelulare nu sunt exprimate
dect n anumite momente ale dezvoltrii i/sau n anumite esuturi. Aceasta
semnific c celulele trebuie s posede modaliti eficace pentru a reprima expresia
tuturor acestor gene care nu sunt caracteristice unui anumit tip de celule. Represarea
unor regiuni (blocuri) mari de gene prin limitarea disponobilitii factorilor de
transcripie este un mecanism destul de puin probabil pentru o astfel de reglare. Ideea
este susinut de faptul c genele care nu sunt exprimate n mod normal ntr-o celul,
pot fi produse dac sunt introduse n aceasta prin transfecie. De exemplu, genele
globinei, induse prin transfecie n fibroblaste, sunt exprimate de o mie de ori mai
puternic dect genele rezidente ale globinei; n plus aceast diferen persist n cursul
diviziunilor succesive dac genele transfectate sunt integrate la nivelul unor situsuri
cromozomice. De fapt, acesta este un efect destul de obinuit dar nu universal, ca
genele transfectate s aib o activitate mai mare dect genele endogene. Este general
admis c acest represie este rezultatul sechestrrii genelor silenioase n structuri
de cromatin superior structurate care le fac inaccesibile mainriei de transcripie.
n absena informaiei privind organizarea acestei structuri a cromatinei, este
imposbil de descris starea de tranziie care separ cromatinele reprimate i exprimate.
O indicaie este furnizat prin corelaia care exist ntre momentul n care gena este
replicat i cel n care ea poate fi transcris. Genele de meninere, exprimate n
permanen n toate celulele, cum este cea pentru dihidrofolat-reductaz, actin
citoplasmatic sau glucozo-6-fosfat dehidrogenaz, sunt replicate n prima jumtate a
fazei S; genele ne-exprimate tind s fie replicate mai trziu. n plus, replicarea genelor
este precoce n esuturile n care ele sunt exprimate i trzie n esuturile n care
acestea sunt silenioase. La fel, la mamifere, cromozomul X inactiv este replicat
dup cromozomul X activ. Aceste corelaii sugereaz c replicarea precoce creeaz o
stare mai accesibil mainriei de transcripie sau mai eficace pentru fixarea factorilor
de transcripie.

SLIDE 37. Modelul solenoid al cromatinei condensate

Figura. Modelul solenoid de organizare a fibrelor de cromatin condensat de 30 nm: a)
micrografia i modul de organizare a nucleozomilor din structur; b) micrografie
prezentnd fibrele de 30 nm i modelul de mpachetare solenoid cu caracteristicile sale
structurale (adaptat dup Molecular Cell Biology Lodish H., et. al., 2000)

SLIDE 38. Nivelurile structurale superioare ale cromatinei

Figura. Nivelurile structurale superioare ale cromatinei: a) micrografie electronic

prezentnd domenii de cromatin, n bucle la cromozomii n perie izolai dintr-un
ovocit de amfibian; b) model de structurare a buclelor fibrelor de cromatin de 30
nm imaginat n urma experienelor de hibridare in situ cu sonde (A la H) situate la
distane variabile pe ADN liniar; c) micrografie electronic a unui cromozom
metafazic din celule HeLa, lipsit de histone ca urmare a unui tratament moderat cu
detergeni

27

Micrografia electronic din figur evideniaz buclele lungi de ADN ancorate

la un schelet cromozomial compus din proteine nehistonice obinut prin ndeprtarea
histonelor din structura cromozomilor din celule HeLa, n metafaz. Acest eafodaj
flexibil are forma cromozomului metafazic i persist chiar i atunci cnd ADN este
digerat cu nucleaze.
Acelai tip de bucle se pot evidenia n cromozomii politeni interfazici din
celulele insectelor i n cromozomii meiotici n perie (lamp-brush) din ovocitele
de amfibieni, ceea ce demonstreaz c acestea nu sunt proprii cromozomilor mitotici.

O serie de experimente de hibridizare in situ, realizate pe celule umane n
interfaz, utiliznd diferite sonde fluorescente, au dus la imaginarea modelului
prezentat. Astfel, s-a evideniat c o serie de sonde (A la H) care recunoteau secvene
situate la milioane de perechi de baze distan, n structura ADN linear, erau
poziionate foarte aproape unele de altele n structura cromozomului interfazic. Se
consider c apropierea dintre aceste situsuri, numite i regiuni asociate scheletului
(denumite SARs de la scaffold-associated regions sau MARs de la matrixattachment regions) este posibil datorit asocierii lor la scheletul cromozomului. n
general, regiunile asociate scheletului se gsesc ntre unitile de transcripie. Deci,
genele sunt localizate prioritar la nivelul buclelor de cromatin ale cror baze sunt
ataate scheletului cromozomului.
Cromozomul mitotic reprezint etap ultim de condensarea a cromatinei. De
obicei, un m de cromozom mitotic conine un cm de ADN. Aceast condensare,
realizat ca urmare a unui proces nc puin cunoscut, este nsoit de fosforilarea
practic a tuturor moleculelor de histone H1 la nivelul celor cinci resturi de serin din
molecul.

SLIDE 39. Demonstraie experimental a formrii buclelor de
cromatin la cromozomii interfazici

Figura. Hibridizarea in situ a celulelor n interfaz a fost realizat cu diferii

markeri fluoresceni (sonde) specifici pentru secvene separate prin distane
cunoscute pe cromozomul linear. Literele din figur reprezint sondele care pot fi
identificate prin culoarea lor diferit. Acestea arat c secvenele A i B care sunt
separate ntre ele printr-un milion de baze sunt evideniate n nucleu ca fiind foarte
apropiate. Siturile A-F sunt separate de milioane de perechi de baze de secvene
lineare dar sunt fizic apropiate unele de altele n nucleul n interfaz

SLIDE 40. Prezentare generala a structurii cromozomilor si genelor.

ADN de la eucariotele superioare consta in secvente unice si repetitive
SLIDE 41. Micrografie electronic a cromatinei la
Drosofila melanogaster

Fibrele de 100 A sunt separate de nururi ntre nucleosomi

Cromatina n form condensat i relaxat
O imagine electronomicroscopic a cromatinei de la Drophila melanogaster
evideniind fibrele de 100A care leag nucleosomii ntre ei.
Topologia i conformaia ADN

28

Influena super-helicitii asupra reglrii transcripiei

Numeroase observaii indic c expresia genelor eucariote este modulat de
starea de super-helicitate a ADN. Mutaii care afecteaz topoizomerazele sau
inhibitorii acestora, care la rndul lor influeneaz starea de super-helicitate a ADN,
activeaz transcripia anumitor gene nhibnd expresia altora. Deoarece legtura
proteinelor cu ADN supra-rsucit negativ este facilitat printr-o modificare favorabil
a energiei libere, i este posibil ca variaiile super-helicitii ADN s influeneze
accesul ARN polimerazei sau a proteinelor activatoare sau represoare la secvenele
reglatoare. Alterrile strii de super-helicitate sau gradul de supra-rsucire pot i ele
s afecteze replierea ADN i astfel capacitatea sa de a interaciona cu proteinele
implicate n transcripie.
Am vzut c cromatina de la eucariote este organizat ntr-o serie de bucle de
lungimi variabile, ale cror extremiti sunt ancorate n matricea proteic. Aceast
organizare confer fiecrei bucle o super-helicitate proprie i independent de cea a
buclelor vecine. Este interesant de reinut c topoizomeraza II, responsabil de
relaxarea ADN supra-rsucit este o protein major a structurii cromozomiale la care
sunt acroate buclele. Efectele negative sau pozitive asupra transcripiei structurilor
care se intercaleaz n ADN sau inhib topoizomerazele i altereaz astfel ntreaga
superhelicitate a ADN, au contribuit i ele la noiunea c topologia ADN este un
parametru important, care guverneaz reglarea transcripiei. Totui, absena
fenotipului care s afecteze transcripia la mutani de drojdii deficieni n
topoizomeraza I sau II sugereaz c, dac o activitate topoizomerazic este necesar
transcripiei ADN de la eucariote, una dintre aceste activiti poate fi suficient.
Cea mai mare parte a indicaiilor care implic topoizomeraze i efectele lor
asupra topologiei ADN n reglarea transcripiei, sunt indirecte i puin concludente.
De fapt, nu exist nici o prob pentru sau contra ideii c modificarea super-helicitii
unei bucle a cromozomului influeneaz activitatea de transcripie a ntregii regiuni
sau a genelor care sunt localizate la acest nivel.
Conformaiile B i Z ale ADN i transcripia
ADN poate prezenta o conformaie de dreapta (B) sau de stnga (Z). La
echilibru proporiile relative ale celor dou forme sunt influenate de secvenele de
ADN, superhelicitatea sa i diversele condiii de mediu, cum sunt fora ionic,
temperatura i prezena metalelor. n circumstane adecvate regiunile de dreapta i se
stnga pot fi intercalate ntr-un segment de ADN. n acest caz, secvenele situate la
jonciuni, sau apropiate de acestea, se comport ca substrate anormale pentru diferite
enzime.
Cu toate c formarea ADN-Z a fost stabilit in vitro, de o varietate de metode
fizice, existena sa in vivo, fiind pn de curnd problematic. Prezena sa este acum
bine verificat att n celule de pro i eucariote. Cum a fost prevzut, proporia de
ADN-Z este puternic influenat, in vivo, de ctre gradul de super-helicitate al ADN.
Formarea sa este de asemenea favorizat de secvenele nucleotidice care conin o
alternan de purine i pirimidine. De exemplu, segmentele de secvene repetitive
d(CA)n d(GT)n au tendina s adopte conformaia Z. n plus, metilarea resturilor C n
semente care conin o alternan de C i G (5-CGCGCG-3) favorizeaz conformaia
Z corespunztoare situsurilor de hipersensibilitate prezente n regiunile de reglare ale
anumitor gene,
Proteinele care se fixeaz specific la ADN-Z au fost identificate i purificate.
Astfel, mai multe proteine care se fixeaz la ADN-Z sunt asociate cu elementul
activator (enhancer) al promotorului regiunii precoce a SV40. Totui, n ciuda punerii
n eviden a segmentelor ADN-Z n sau n apropierea regiunilor de reglare astfel

29

nct proteinele care acopera aceast structur, rolul su n reglarea transcripiei

rmne speculativ. n acest caz, o protein care se leag la ADN-Z a fost implicat n
recombinarea ADN, dar rolurile conformaiei ADN i a proteinei n acest proces nu
sunt neledse.

SLIDE 42. Imagini electrono-microscopice ale cromatinei

SLIDE 43. Proteinele ne-histonice furnizeaz un schelet pe toat
lungimea buclelor de cromatin
Figura: Imagine electrono-microscopic a cromozomilotr n metafaz lipsii de
histone preparai din celulele HeLa prin tratament cu detergeni. Se poate observa
prezena unor proteine ne-histonice care formeaz un anumit tip de eafodaj de-a
lungul buclelor de ADN extinse.
Masa totala a histonelor asociate cu ADN n cromatin este aproximativ egal
cu cea a ADN. Cromatina n interfaz i cromozomii n metafaz conin i mici
cantiti dintr-un set complex de alte proteine. De exemplu, multi dintre factorii
transcripionali au fost identificati ca fiind asociati cu cromatina din interfaz.
Structura i funcia acestor proteine nehistonice critice, implicate n realizarea
transcripiei va fi detaliata mai departe. Alte proteine nehistonice puin abundente sunt
cele implicate in realizarea replicrii.
Cteva proteine nehistonice sunt considerate a fi prezente n cantiti mai mari
dect factorii de transcripie i de replicare. Unele dintre acestea manifest o
mobilitate electroforetic mare i au fost denumite: proteine HMG (high mobility
group). Cteva dintre aceste HMG se consider c se leag cooperativ la ADN cu
factorii de transcripie, stabiliznd complexele multi-proteice care regleaz
transcripia genelor nvecinate.

SLIDE 44. n timpul interfazei cromozomii umani rmn plasai n

domenii specifice n nucleu.
Limfocitele fixate n interfaz au fost hibridizate in situ cu sonde specifice
marcate cu biotin pentru secvene complementare cu lungimea ntregului cromozom
7 i apoi vizualizate cu sistemul avidin marcat cu fluorescein. n celulele diploide
prezentate n figur, fiecare dintre cei doi cromozomi 7s este restricionat ntr-un
anumit teritoriu sau domeniu n interiorul nucleului mai degrab dect s fie
dispersate n ntregul nucleu.

SLIDE 45. Evidenierea heterocromatinei

Figura. Evidenierea heterocromatinei: a) micrografie electronic a unei celule stem
din mduva spinrii. Regiunile nchise de la periferia nucleului i din afara
nucleolului reprezint heterocromatin; b) prezena cromozomului X inactivat sub
forma corpusculului Barr ntr-o celul de femeie

Heterocromatina i eucromatina
Dup terminarea mitozei, cea mai mare parte a cromatinei care compune
cromozomii mitotici foarte condensai se disperseaz i revine la starea sa interfazic
difuz. Totui, n cea mai mare parte a celulelor, aproximativ 10% din materialul
cromozomial i pstreaz forma condensat compact pe tot parcursul interfazei,
cromatina condensat putnd fi evideniat la periferia nucleului. Termenul de
heterocromatin desemneaz cromatina care rmne condensat n timpul interfazei

30

pentru a o distinge de eucromatina care desemneaz starea dispersat. Dac celulele

sunt puse n prezena unui precursor ARN radiomarcat, la nivelul uridinei (uridin
3
H), i apoi fixate, secionate i observate dup autoradiografie, se constat c
regiunile de heterocromatin rmn nemarcate deoarece acestea sunt puin transcrise
sau chiar netranscrise. Cercetrile din ultimii ani demonstreaz clar posibilitatea
trecerii reversibile dintr-o form n alta, aceast clasificare fiind mai degrab
didactic.
Numeroase gene de la eucariotele multicelulare nu sunt exprimate dect n
anumite momente ale dezvoltrii i/sau n anumite esuturi. Deci, celulele trebuie s
posede modaliti eficace pentru a reprima expresia tuturor genelor care nu sunt
caracteristice unui anumit tip de celul ntr-o anumit etap a dezvoltrii sale.
Represia unor blocuri mari de gene, prin limitarea disponibilitii factoriilor de
transcripie, este un mecanism destul de puin probabil pentru o astfel de reglare.
Ideea este susinut de faptul c unele gene, care nu sunt exprimate n mod normal
ntr-o celul, pot fi transcrise dac sunt introduse prin transfecie n aceasta. De
exemplu, genele globinei, induse prin transfecie n fibroblaste, sunt exprimate de o
mie de ori mai puternic dect genele rezidente ale globinei. Aceast diferen persist
n cursul diviziunilor succesive dac genele transfectate sunt integrate la nivelul unor
situsuri cromozomiale. De fapt, posibilitatea ca genele transfectate s aib o activitate
mai mare dect genele endogene este un efect destul de obinuit dar nu universal. Este
general admis c aceast represie este rezultatul sechestrrii genelor silenioase n
complexe de cromatin superior structurate care le fac inaccesibile mainriei de
transcripie.
n absena informaiei privind organizarea acestei structuri a cromatinei, este
imposibil de descris starea de tranziie care separ cromatinele reprimate i exprimate.
O indicaie este furnizat de corelaia care exist ntre momentul n care gena este
replicat i cel n care ea poate fi transcris. Genele de meninere, exprimate n
permanen n toate celulele (exemplu: dihidrofolat-reductaz, actin citoplasmatic,
glucozo-6-fosfat dehidrogenaza) sunt replicate n prima jumtate a fazei S. n acelai
context, genele neexprimate tind s fie replicate mai trziu. De asemenea, replicarea
genelor este precoce n esuturile n care ele sunt exprimate i trzie n esuturile n
care acestea sunt silenioase". DE exemplu, la mamifere cromozomul X inactiv este
replicat dup cromozomul X activ. Aceste corelaii sugereaz c replicarea precoce
creeaz o stare mai accesibil mainriei de transcripie crescnd eficiena fixrii
factorilor de transcripie.
Heterocromatina
Heterocromatina poate fi divizat n dou categorii: constitutiv i facultativ,
n funcie de permanena strii condensate. Heterocromatina constitutiv rmne
condensat tot timpul i reprezint regiunile din structura ADN care rmn silenioase
permanent. n celulele de mamifere, cea mai mare parte a heterocromatinei
constitutive se gsete n apropierea centromerului tuturor cromozomilor i n alte
cteva regiuni particulare, cum este braul distal al cromozomului Y la masculi. La
multe plante, extremitile cromozomului (telomerii) sunt i ele formate din
heterocromatin constitutiv. n principal, ADN din structura heterocromatinei
constitutive este format din secvene nalt repetitive i se presupune c este lipsit de
gene care codific pentru proteine. Se consider c, heterocromatina conine elemente
a cror influen se face simit la o anumit distan i poate afecta starea fiziologic
a genelor nvecinate. Astfel, dac unele gene active, care i-au schimbat poziia ca
urmare a unei transpoziii sau a unei translocri, se afl poziionate n apropierea

31

heterocromatinei, ele prezint tendina de a deveni inactive. Acest fenomen poart

numele de efect de poziionare.
Contrar formei constitutive, heterocromatina facultativ este inactivat
specific n cursul anumitor stadii de via ale organismului. Un exemplu tipic de
heterocromatin facultativ este furnizat de inactivarea unui cromozom X n celulele
femele de la mamifere. Celulele masculine au un mic cromozom Y i un cromozom X
mult mai mare. Cromozomii X i Y au puine gene n comun astfel nct brbaii nu
posed dect un exemplar al genelor situate pe cromozomii sexuali. Dei, celulele de
la femele conin doi cromozomi X, unul singur este funcional n procesul de
transcripie. Cellalt cromozom rmne condensat sub forma unei mase de
heterocromatin, numit corpuscul Barr, dup numele cercettorului care l-a descoperit
n anul 1949. Se consider c, producerea corpusculului Barr este un mecanism
normal, graie cruia celulele femele i mascule dispun de acelai numr de
cromozomi X activi i sintetizeaz cantiti echivalente de produi codificai de
genele situate pe cromozomul X.

SLIDE 46. Heterocromatin este compus din regiuni cromozomiale

ne-desfurate
Heterocromatina i eucromatina - Dup terminarea mitozei, cea mai mare parte a
cromatinei care compune cromozomii mitotici foarte condensai se disperseaz i
revine la starea sa interfazic difuz. n cea mai mare parte a celulelor totui,
aproximativ 10% din materialul cromozomic i pstreaz forma condensat compact
pe tot parcursul interfazei (aceast cromatin condensat se vede la periferia
nucleoidului). Termenul de heterocromatin desemneaz cromatina care rmne
condensat n timpul interfazei pentru a o distinge de eucromatin care desemneaz
starea dispersat. Dac celulele sunt puse n prezena unui precursor de ARN
radiomarcat la nivelul uridinei (uridin 3H) i apoi fixate, secionate i observate dup
autoradiografie se constat c pachetele de heterocromatin rmn ne-marcate; deci
acestea sunt puin transcrise sau netranscrise.
Heterocromatina poate fi divizat n dou categorii: constitutiv i
facultativ , n funcie de permanena strii condensate. Heterocromatina constitutiv
rmne condensat tot timpul i reprezint ADN care rmne silenios n mod
permanent. n celulele de mamifere, cea mai mare parte a heterocromatinei
constitutive se gsete n apropierea centromerului tuturor cromozomilor i n cteva
locuri particulare, cum este braul distal al cromozomului Y la masculi. La multe
plante, extremitile cromozomului (telomerii) sunt i ele formate din heterocromatin
constitutiv. ADN din structura heterocromatinei constitutive este n principal format
din secvene nalt repetitive i se presupune c este lipsit de gene care codific pentru
proteine. De fapt, dac gene, n mod normal active, se afl n apropierea
heterocromatinei (dup ce i-au schimbat poziia ca urmare a unei transpoziii sau a
unei translocri), ele prezint tendina de a deveni inactive: este ceea ce numin efect
de poziionare. Se presupune c heterocromatina conine elemente a cror influen se
face simit la o anumit distan i poate afecta starea fiziologic a genelor
nvecinate.
Contrar formei constitutive, heterocromatina facultativ este inactivat
specific n cursul anumitor stadii de via ale organismului. Putem gsi un exemplu de
heterocromatin facultativ comparnd celulele unei femele cu cele ale unui mascul
de la mamifere. Celulele masculine au un mic cromozom Y i un cromozom X mult
mai mare. Cromozomii X i Y au puine gene n comun astfel nct brbaii nu posed
dect un exemplar al genelor situate pe cromozomii sexuali. Cu toate c celulele de la
32

femele conin doi cromozomi X, unul singur este funcional pentru transcripie.
Cellalt cromozom rmne condensat sub forma unei mase de heterocromatin, numit
corpuscul Barr, numele venind de la cercettorul care l-a descoperit n anul 1949. Se
consider c producerea corpusculului Barr este un mecanism graie cruia celulele
femele i masculine dispun de acelai numr de cromozomi X activi i sintetizeaz
deci cantiti echivalente de produi codificai de genele situate pe cromozomul X.
Inactivarea cromozomului X
n 1961, geneticiana britanic Mary Lyon emite ipoteza c un cromopzom X
devine heterocromatic n toate celulele de la femelele de mamifere ntr-un stadiu
precoce al dezvoltrii embrionare. Acest mecanism este numit inactivarea
cromozomului X i s-a demonstrat ulterior c acest fenomen se produce n embrioni n
momentul gastrulaiei. Inactivarea n embrion este un proces aleator n sensul c
cromozomul X de origine matern sau patern prezint aceeai probabilitate de a fi
inactivai n oricare dintre celule. n consecin, cromozomul X patern poate fi
inactivat ntr-o celul embrionar n timp ce cromozomul X maternal poate fi
inactivat ntr-o celul vecin. Din acel moment, totui, acelai cromozom X este
inactiv n toat descendena unei celule particulare. Cel de al doilea cromozom X este
reactivat n celulele germinale nainte de nceputul meiozei. Cei doi cromozomi X
sunt deci activi n timpul ovogenezei i toi gameii primesc un cromozom X activ.
Cum cromozomii X pot proveni de la tat i de la mam pot purta alele diferite
pentru acelai caracter, femelele adulte sunt, ntr-un anumit sens, un mozaic genetic,
deoarece alele diferite funcioneaz n celule diferite. Mozaicismul cromozomului X
se traduce prin pete de culoare la blana anumitor mamifere, cum sunt pisicile calico
. La om, genele de pigmentare nu sunt localizate pe cromozomul X, de unde absena
femeilor calico. Existena mozaicismului datorat inactivrii cromozomului X la
femei a fost totui demonstrat. De exemplu, cei doi ochi ai unei femei heterozigote
pentru daltonism rou-verde sunt luminai de un fascicol de lumin roie sau verde, se
poate detecta n retin, plaje de celule care prezint o proast percepie a culorilor,
dispersate printre plajele unde vederea este normal.
Mecanismul responsabil de inactivarea cromozomului X a atras atenia dup
ce n 1992 o publicaie a sugerat c inactivarea este iniiat de o molecul de ARN
mai degrab dect o protein, transcris plecnd de la gena Xist localizat pe
cromozomul X de altfel inactiv. (Gena omolog a cromozomului X activ nu este
transcris, ceea ce reprezint un exemplu rar de expresie ntr-o poriune cromozomic
devenit heterocromatin). Aceast descoperire, i multe altele, au stat la originea idei
conform creia moleculele de ARN pot funciona direct ca reglatori ai genelor, ceea
ce reprezenta o funcie nc necunoscut a ARN. De cnd biologii consider ARN ca
o macromolecul primitiv purttoare de informaie, s-au prezis noi roluri pentru
ARN care sunt i demonstrate.

SLIDE 47. Sensibilitatea la nucleaze

Figura. Structura genomului SV40. Se evideniaz regiunea lipsit de nucleozomi n
partea superioar a figurii. Micrografiile electronice ale minicromozomilor izolai de
la SV40 evideniaz o zon liber de nucleozomi n ADN
Absena particulelor nucleozomale, la nivelul acestui fragment, care conine i
originea de replicare a cromozomului viral, presupune legarea n acel loc, a unei
proteine nehistonice situs-specific care poate influena poziionarea particulelor
nucleozomale.

33

Poziionarea nucleozomilor poate fi influenat i de capacitatea ADN de a se

rsuci n jurul nucleului histonelor. Astfel, segmentele de ADN bogate n A-T sunt
mai flexibile i se curbeaz mult mai uor dect regiunile bogate n G-C. n
consecin, nucleozomii au tendina s se formeze n regiunile n care raportul A-T i
G-C este optim deoarece este diminuat energia necesar pentru rsucirea ADN n
jurul octamerilor de histone. S-a constatat c regiunile bogate n A-T se gsesc
preferenial n locurile unde fosa mic a dublei elice este orientat ctre nucleul
histonic, n timp ce regiunile bogate n G-C se gsesc, cu predilecie, n zonele n care
fosa mic este orientat ctre exterior. De fapt, poziionarea nucleozomilor poate fi
foarte important pentru exprimarea genelor.
Regiuni lipsite de nucleozomi
Situsurile de hipersensibilitate la nucleaze apar probabil acolo unde exist o
discontinuitate n aranjarea nucleozomilor. Acest fapt a fost demonstrat pentru prima
dat, prin corelaiile care exist ntre situsurile de hipersensibilitate i zonele lipsite de
nucleozomi n genomul SV40. Micrografiile electronice ale minicromozomilor izolai
de la SV40 evideniaz o zon liber de nucleozomi n ADN. Aceast zon se ntinde
de la situsul de iniiere a transcripiei genei precoce la extremitatea n amont a
elementului activator (enhancer). Cnd segmentul de 400 pb este transferat ntr-o alt
regiune a genomului SV40 sau este integrat n ADN-ul unei plasmide ne-nrudite, se
formeaz o zon liber de nucleozimi i de situsuri de hipersensibilitate la DN-aza I n
aceste locuri. Acesta indic c cele dou proprieti sunt probabil consecina secvenei
nucleotidice a acestui segment de ADN. Totui, sensibilitatea la nucleaz este
probabil modulat de proteine ne-histonice legate la aceast regiune, probabil proteine
care se fixeaz la ADN-Y i factori de transcripie legai la elementul activator
(enhancer).
Judecnd dup sensibilitatea la DN-aza I sau la nucleaza din Micrococus,
regiunile cromatinei activ transcripional sunt mai puin compacte dect cele ale
genelor silenioase. Acest sensibilitate la nucleaze se ntinde adesea pe mai multe mii
de perechi de baze de o parte i de alta a unitii de transcripie. Bazele acestei
sensibiliti diferite nu au fost stabilite, dar studiile biochimice sugereaz c
nucleosomii genelor active sunt sraci n histone H1 i bogai n histone acetilate,
legate prin ubicuitin i complexate cu mai multe tipuri de proteine foarte acide
(HMG pentru High Mobility Group). Aceste modificri altereaz asocierea histonelor
cu ADN i ar putea favoriza separarea neregulat a nucleosomilor, fcnd ADN mai
sensibil la digestie. Astfel, periodicitatea normal a situsurilor de clivare cu nucleaze
ale genelor proteinelor de oc termic este modificat n timpul inducerii acestora de
ctre cldur. Aceeai variaie a situsurilor de clivare se poate observa i pentru gena
ovalbuminei n oviduct i n ficat i a genelor IgL (k) din limfocite dup reorganizare
ntr-o form transcripional activ.

SLIDE 48. Hipersensibilitatea la nucleaze

Genele transcrise activ prezint, pe lng sensibilitatea lor la nucleaze, situsuri
de hipersensibilitate n jurul unitii lor de transcripie. O astfel de hiper-sensibilitate
la DN-aza I nu apare ntr-un ADN gol corespunztor. n general, situsurile de
hipersensibilitate sunt situate imediat n amont de situsul de iniiere a transcripiei, dar
sunt adesea situate i la extremitatea 3 a unitii de transcripie; trebuie s ne amintim
c aceste situsuri pot s conin secvene de amplificare sau de terminare. n plus,
anumite gene posed situsuri de hipersensibilitate la DN-aza I situate la distane mari
n amont de situsul de adugare a coifului (la mai multe kb n amont de genele globinei umane). n cea mai mare parte a cazurilor, aceast hipersensibilitate este
34

restrns la esuturile sau celulele n care genele sunt exprimate sau programate s fie
exprimate. Situsul de hipersensibilitate situat n 5 de gena pre-proinsulinei, de
exemplu, este prezent n insulele ale celulelor pancreatice dar nu se gsesc n
celulele hepatice. La fel, situsurile de hipersensibilitate sunt asociate genelor
reorganizate ale imunoglobulinelor rearanjate n celulele B, dar nu n esuturile
hematopoietice.
Situsurile de hipersensibilitate la nucleaze i lipsite de nucleozomi sunt
prezente i n elementele activatoare ale genelor IgH i IgL(k) i n secvenele UAS
asociate extremitii 5 a genelor GAL ale metalotioneinei. Situsuri de hipermetilare
apar n elementele genelor care rspund la glucocorticoizi n minutele care urmeaz
adugrii de hormon la celule i dispar rapid dup eliminarea acestuia. Situsuri de
hipersensibilitate la DN-aza I sunt asociate i cu activarea transcripiei ADNr i apar
n amont de situsul de iniiere i n apropierea regiunilor separatorilor intergenici.
Astfel, hipersensibilitatea la nucleaze a devenit un indicato al regiunilor de reglare a
transcripiei.
Deoarece localizarea secvenelor care regleaz transcripia coincide cu
situsurile de hipersensibilitate la nucleaze i cu situsurile lipsite de nucleozomi,
considerm c aceste caracteristici sunt corelate. Fixarea factorilor de transcripie
deplaseaz probabil nucleozomii sau altereaz mpachetarea acestora avnd drept
consecin un vid vizibil n aranjarea cromatinei sau chiar perturbri mai subtile
care permit nucleoliza. Dac totui, mpachetarea dens a nucleozomilor este
stabilizat de ctre histona H1 sau prin replierea sub forma unei structuri mai aerate,
accesul proteinelor eseniale transcripiei la secvenele semnal poate fi restrns,
mpiedicnd astfel iniierea transcripiei.
n acest domeniu al cercetrilor privind diferenele dintre cromatina exprimat
i cea reprimat, precum i a trecerii de la o stare la alt rmn o serie ntreag de
ntrebri care nu si-au gsit rspuns. Pn n prezent tim c exist regiuni ale
cromatinei care pot fi meninute n stare condensat i ne-exprimat timp de mai
multe cicluri de replicare dup care sunt apoi disociate i devim exprimabile sub
aciunea unor stimuli adecvai, exogeni sau endogeni. Pentru moment nu putem spune
dac activarea regiunilor specifice ale cromatinei implic intervenia proteinelor care
acioneaz pozitiv, sau eliminarea unor proteine care joac rol de represor sau ambele
situaii.
Modelul solenoid al fibrei de 30nm condensat
Octamerul de histone este prezentat ca un disc oranj. Fiecare nucleozom
asociat cu o molecula de H1 i cu fibrele care sunt rsucite ntr-o structur solenoid
cu un doametru de 30 nm.
Hibridizarea in situ a celulelor n interfaz a fost realizat cu diferii markeri
fluoresceni (sonde) specifici pentru secvene separate prin distane cumoscute pe
cromozomul linear. Literele din figur reprezint sondele care pot fi identificate prin
culoarea lor diferit.Acestea arat c secvenele A i B care sunt separate ntre ele
printr-un milion de baze sunt evideniate n nucleu ca fiind foarte apropiate.

SLIDE 49. Cromozomii politeni de la Drosophila

Evidenierea benzilor de la cromozomii politeni din glandele salivare de la
Drosophila. Toi cei 4 cromozomi sunt inui mpreun de cedntromerii lor.

35

SLIDE 50. CARIOTIP

Etapele realizarii unui cariotip. Figura. Cariotipul cromozomilor mitotici de la om:
a) tehnic folosit pentru obinerea de preparate de cromozomi mitotici
din leucocitele sngelui
periferic; b) dup obinerea unei fotografii a cromozomilor eliberai din nucleu,
acetia sunt
aranjai perechi i dup mrime.
Dispersarea cromatinei n celulele n interfaz face mult mai uoar replicarea
i transcripia ADN. Din contr, cromatina celulelor mitotice este sub forma cea mai
condensat, care uureaz livrarea unui pachet intact de ADN fiecrei celule fiice.
Cromozomii mitotici sunt foarte utili, att pentru biologi ct i pentru medici,
deoarece ei conin un lot complet de material genetic celular i pot fi pui n eviden
prin tehnici simple. Cnd un cromozom se condenseaz n timpul profazei mitotice, el
adopt o form distinct i constant determinat, n principal, de lungimea moleculei
de ADN i de poziia centromerului. Se pot evidenia cromozomii mitotici ai unei
celule n diviziune prin tehnica descris n figura a. n aceast tehnic, celulele sunt
sparte dup oprirea diviziunii celulare n mitoz n urma folosirii colchicinei.
Cromozomii mitotici sunt fixai la suprafaa unei lame unde ocup o suprafa foarte
mic i colorai cu diferite tipuri de reactivi. De exemplu, tehnica n care se realizeaz
o proteoliz limitat i colorarea cu reactiv Giemsa poart numele de bandare G.
Prin aceasta se evideniaz prin benzi nchise la culoare regiunile bogate n AT i prin
benzi pale cele bogate n GC.
Dup fotografiere cromozomii individuali sunt decupai i aranjai n perechi.
Se realizeaz un cariotip n care cromozomii omologi sunt dispui n ordinea
descresctoare a mrimii aa cum se prezint n figur. Celulele somatice de la om
conin 46 cromozomi care pot fi grupai n 22 de perechi omologe i cromozomii
sexuali care sunt XX la femei i XY la brbai. Studiul cariotipului este o tehnic de
baz pentru citogeneticieni. Cu colorantul Giemsa se obin ntre 400 i 800 benzi
pentru un set haploid de cromozomi. Preparatele de cromozomi mitotici sunt curent
realizate pornind de la culturi de celule sanguine pentru a identifica indivizii purttori
de anomalii cromozomale. Exist posibilitatea determinrii cromozomilor
suplimentari, absena lor sau o serie de alte modificri vizibile la microscopul optic.

SLIDE 51. Tehnici de colorare folosite pentru bandarea cromozomilor

O alt modalitate de prelucrare o reprezint colorarea cu quinacrin (bandarea

Q) care evideniaz striuri transversale. Deoarece distribuia benzilor Q este
caracteristic, fiecrui cromozom de la fiecare specie, tehnica permite identificarea
rapid a cromozomilor i realizarea unor comparaii ntre specii. De asemenea, se pot
detecta anomalii minime din structura cromozomului prin identificarea modificrilor
care apar n repartiia benzilor. Benzile Q strlucitoare conin, de obicei, secvene de
ADN bogate n A-T i un numr redus de gene care codific pentru proteine.
Braul scurt al cromozomului este desemnat cu litera p (petit), iar braul lung
cu litera q (urmtoarea liter din alfabet). n tehnicile de bandare, fiecare bra al
cromozomului este mprit n dou sau mai multe regiuni prin benzi mari. Regiunile
sunt numerotate cu 1, 2, 3 pornind de la centromeri ctre capete. Fiecare regiune este
divizat n benzi i subdiviziuni ale benzilor. De exemplu, Xp21.2 se refer la
segmentul cromozomial localizat pe braul scurt al cromozomului X, n regiunea 2,
banda 1 i sub-banda 2.

36

SLIDE 52. Elementele morfologice i funcionale ale cromozomilor de

la eucariote
Figura: In ciuda diferenei privind numrul de cromozomi de la aceste animale, cele
dou genoame conin aproximativ aceeai cantitate de ADN. Un cariotip se obine
prin tratarea celulelor n metafaz cu un reactiv de colorare a ADN urmat de
ntinderea (etalarea) cromozomilor pe o lam de microscop. Cromozomii omologi
identificai n fotografie sunt decupai i cuplai n perechi. Fiecare numr
desemneaz o pereche de cromozomi omologi iar ntregul consdtituie cariotipul.
Structura cromozomului mitotic
Dispersarea cromatinei n celulele n interfaz face mult mai uoar replicarea
i transcripia ADN. Din contr, cromatina celulelor mitotice este sub forma cea mai
condensat, care uureaz livrarea unui pachet intact de ADN fiecrei celule fiice.
Cromozomii mitotici sunt foarte utili att pentru biologi ct i pentru medici deoarece
ei conin un lot complet de material genetic celular i pot fi pui n eviden prin
tehnici simple.
Cnd un cromozom se condenseaz n timpul profazei mitotice, el adopt o
form distinct i constant, determinat n principal de lungimea moleculei sale de
ADN i de poziia centromerului. Se pot evidenia cromozomii mitotici ai unei celule
n diviziune prin tehnica descris n figura. n aceast tehnic, celulele sunt sparte i
cromozomii mitotici ai unuia dintre nuclei sunt fixai la suprafaa unei lame unde
ocup o suprafa foarte mica. Dac decupm cromozomii individuali din aceast
fotografie este posibil dispunerea lor pe perechi (23 la om) i realizarea unui cariotip
n care cromozomii omologi sunt dispui n ordinea descresctoare a mrimii aa cum
se prezint n figura. Preparatele de cromozomi mitotici sunt curent realizate pornind
de la culturi de celule sanguine pentru a identifica indivizii purttori de anomalii
cromozomale. Exist posibilitatea determinrii cromozomilor suplimentari, absena
lor sau modificrile grosiere.
Cromozomii din figura au fost colorai cu quinacrine colorant florescent
care face s apar pe cromozomi striuri transversale. Distribuia acestor benzi Q, cum
au fost numite, este foarte caracteristic, fiecrui cromozom al fiecrei specii; acestea
permit identificarea rapid a cromozomilor i realizarea unor comparaii de la o specie
la alta. De asemenea se poate detecta anomaliile relativ minime din structura
cromozomului prin identificarea modificrilor care apar repartiia benzilor. Benzile Q
strlucitoare conin de obicei secvene de ADN bogate n A-T i un numr redus de
gene care codific pentru proteine.
O metod dezvoltat relativ recent pentru diferenierea distinct a fiecrui
cromozom uman numit Colorarea cromozomilor simplific mult distincia dintre
cromozomii cu mrimi i forme similare. Acedast tehnic folosete sonde specifice
pentru siturile dispuse de-a lungul lungimii fiecrui cromozom. Sondele sunt colorate
cu unul din doi colorani fluoresceni care prezint lungimi de und diferite. Sondele
specifice pentru fiecare cromozom sunt marcate cu o fracie predeterminat pentru
fiecare din cei doiu colorani. Dup ce sondele sunt hibridizate cu cromozomii i
excesul ndeprtat, proba este plasat la un microscop fluorescent unde un detector
determin fracia fiecrui colorant prezent n fiecare poziie fluorescent din cmpul
microscopic. Informaiile sunt acumulate de un computer unde un program special
furnizeaz o imagine a fiecrui tip de cromozom. Combinarea dintre colorarea
cromozomilor i hibridizarea in situ fluorescent, numit FISH multicolor, poate
detecta translocarile cromozomale.

37

Centromerii.
Se poate remarca cci toi cromozomii reprezentai n figura posed un situs la
unde suprafaa lor exterioar este net rscroit (scobit). Aceast scobitur reprezint
centromerul cromozomului. Mai sus am artat c centromerii conin heterocromatin
constitutiv. Centrometrii cromozomilor umani conin o secven lung de
aproximativ 170 nucleotide (ADN satelit ) dispuse n tandem i repetate de 2 000 la
30 000 ori per centromer. ADN centromeric fixeaz proteine specifice, ntre altele
cele care servesc drept situs de fixare microtubulilor care separ cromozomii n
timpul diviziunii mitotice.
Telomerii
Cele dou extremiti ale moleculei de ADN a fiecrui cromozom posed un
segment foarte particular de secvene repetitive numite telomeri, care formeaz un
coif la fiecare capt al cromozomilor. La om telomerii posed secvene
TTAGGG/AATCCC repetitive de mii de ori. Contrar celor mai multe tipuri de
secvene repetitive, care variaz mult ntre specii, chiar dac ele sunt nrudite i
apropiate, n cazul telomerilor de la om i de la toate vertebratele studiate pn n
prezent gsim aceeai secven telomeric. La alte organisme cum sunt protozoarele
i drojdiile, telomerii au secvene diferite dar, ca i pentru vertebrate, o caten este
ntotdeauna bogat n resturi de guanozin iar complementara sa n resturi de citozin.
Catena bogat n G este orientat n sensul 5-3 ctre extremitatea cromozomului i
depete cu 12 la 15 nucleotide extremitatea catenei bogat n C. Datorit existenei
acestui dezechilibru catena bogat n G formeaz o scurt coad monocatenar la cele
dou extremiti ale cromozomului. Aceast dispoziie persist de la o generaie
celular la alta datorit unei enzime speciale, telomeraza, care poate aduga noi
uniti repetitive la extremitatea 3 a catenei bogate n G.
Telomeraza, ale crei proprieti au fost bine studiate de ctre Elisabeth
Blackburn i colegii si de la Universitatea din California, San Francisco, este o
transcriptaz invers care asambleaz fragmente de ADN folosind o caten (matri)
de ARN. Telomeraza este o enzim foarte neobinuit n sensul n care ARN care
servete drept model face n realitate parte din enzim. Secvenele telomerice sunt i
situsuri de fixare a mai multor proteine specifice.
Telomerii au roluri importante: ei sunt necesari replicrii complete a
cromozomului; protejeaz cromozomii de nucleaze i de alte influene
destabilizatoare; mpiedic fuziunea dintre extremitile cromozomilor i faciliteaz
interaciile dintre extremitile cromozomilor i anvelopa nuclear n anumite tipuri
celulare. Experiene recente sugereaz alte roluri. Celulele normale nu sunt capabile
s se divid n cultur dect de un numr limitat de ori nainte de a da semne de
mbtrnire i n final de a muri. Au fost propuse diferite ipoteze pentru a explica
aceast observaie: cea mai recent este scurtarea progresiv a telomerilor. Telomerii
se scurteaz deoarece cea mai mare parte a celulelor umane par a fi lipsite de
telomeraze. Contrar celulelor normale celulele canceroase nu nceteaz s creasc n
cultur; spunem c acestea devin nemuritoare. Unul dintre factorii care ar putea
contribui la imortalizarea celulelor maligne este reactivarea telomerazei, care
conserv lungimea telomerilor de-a lungul generaiilor. De fapt, cercetri recente au
demonstrat c un anumit numr de cancere la om au o activitate a telomerazei care nu
poate fi evideniat n celulele normale. Aceast descoperire a declanat cercetarea
inhibitorilor specifici ai acestei enzime spernd c acetia ar putea opri creterea
anumitor tumori.
La ADN eucariotelor, originile de replicare au fost pentru prima dat
identificate prin funciile lor n studiile de transformare la drojdii. Dac celulelor de

38

drojdii le lipsete o gen particular (ex, una dintre genele implicate n biosintaza
leucinei), ele pot fi transformate cu plasmide care conin clonat gena lips (ex, gena
LEU). Transformanii LEU+, care pot crete pe mediu fr leucin sunt obinui cu o
frecven mai mare dac plasmida conine mai multe secvene din genomul de drojdie
de aproximativ 100 pb, numite secvene replicative autozomale (ARS). O ARS
acioneaz ca o origine de replicare, permitnd plasmidei circulare s se replice n
nucledul de drojdii.
Centromerii. ntr-o cultur celulele transformate cu o plasmid simpl circular care
conine fragmentul LEU/ARS, numai aproximativ 5-20 % dintre progenituri conin
plasmida datorit segregrii mitotice greite a plasmidelor; ca rezultat, majoritatea
plasmidelor ADN nu intr n nmugurire. Totui, dac fragmentele de restricie ale
ADN genomic de la drojdii sunt clonate ntr-o astfel de plasmid circular, o mic
fraciune dintre fragmente confer o segregare egala a plasmidelor att n celulele
mam ct i fiice dup mitoz. Deoarece fragmentele cu acest efect au fost gsite ca
facnd parte din centromerii fiecrui cromozom de drojdie, ei au fost numii secvene
CEN. Astfel de experimente au condus la izolarea secvenelor care folosesc
segregarea mitotic pentru extinderea la mai mult de 90% a numrului progeniturilor
Leu- care conin plasmida LEU. Aceste celule i majoritatea descendenilor lor cresc
foarte bine pe mediu fr leucin.
Dac plasmidele circulare care conin att secvene CEN ct i ARS sunt tiate
cu o enzim de restricie, ele devin lineare. Astfel de plasmide lineare nu se replic n
drojdii dect dac ele conin secvene telomerice speciale ligate la capetele lor. Primul
experiment de succes care a implicat transfecia celulelor de drojdie cu plasmide
lineare a fost realizat folosind capetele unei molecule de ADN care este cunoscut ca
replicndu-se liniar n protozoarul ciliat Tetrahymena.
Cercetrile au artat c ADN telomeric posed un tip de structur
caracteristic care este adugat la capetele moleculelor de ADN de ctre o enzim
special telomer terminal transferaz sau telomeraz. Au fost determinate structurile
telomerilor pentru o serie de organisme, inclusiv la om; majoritatea sunt secvene
oligomere repetitive cu un coninut ridicat n G la nivelul catenei orientate 5-3 ctre
telomer. Aceste secvene simple sunt repetitive la capetele terminale ale
cromozomilor i variaz de la cteva sute de de perechi de baze la drojdii i
protozoare la cteva mii la vertebrate. Captul 3 ale catenelor bogate n G sunt
extinse cu 12-16 nucleotride dincolo de captul 5 al catenei complementare bogate in
C. Aceast regiune este legat de proteine specifice care protejeaz capetele
cromozomilor lineari de atacul exonucleazelor.
Enzimele care adaug secvene telomerice sunt complexe formate att din
proteine ct i din ARN. Deoarece secvena ARN servete drept matri pentru
adugarea de dezoxiribonucleotide la capetele telomerilor, sursa de enzim i nu sursa
primerului ADN telomeric determin secvena adgat. Astfel telomeraza este o
form specializat de revers-transcriptaz care posed propria sa matri ARN pentru
a realiza sinteza direct a ADN.
Aciunea telomerazei este important pentru prevenirea scurtrii
cromozomilor n timpul replicrii ADN. oarecii knockout care nu pot produce
ARN-ul asociat telomerazei nu exprim activitate telomerazic i telomerii lor se
scurteaz considerabil cu fiecare generaie. Astfel de oareci se pot reproduce normal
timp de trei generaii nainte ca absena telomerilor s determine fuziunea terminal a
cromozomilor i pierderea acestora. Dup patru generaii potenialul de reproducere a
acesto oareci knockout intr n declin i se oprete la a asea generaie.

39

O dat ce regiunile centromerice de la drojdii care confer segregare mitotic

au fost clonate, secvenele lor pot fi determinate si comparate. Compararea
centromerilor diferii de la drojdii au evideniat trei regiuni (I, II i III) care sunt
necesare unui centromer s funcioneze. Regiunea II pare s aib o lungime constant
(78-86 baze) i conine secvene consens nedefinite dar bogate n resturi A i T. O
secven simpl de la Drosphila care provine din regiunea centromeric prezint
unelele similitudini cu regiunile I i III de la drojdii, sugernd c mecanisme similare
con troleaz segregarea la drojdii i la eucariotele superioare.

SLIDE 53. Colorarea difereniat a cromozomilor furnizeaz

posibilitatea evidenierii fiecrei perechi de cromozomi
O alt tehnic, mult mai recent, dar care a intrat n setul analizelor de de
rutin pentru stabilirea cariotipului este hibridizarea fluorescent, in situ - FISH
(Fluorescence In Situ Hybridization). O metod dezvoltat relativ recent pentru
diferenierea distinct a fiecrui cromozom uman numit Colorarea cromozomilor
simplific mult distincia dintre cromozomii cu mrimi i forme similare. Aceast
tehnic folosete sonde specifice pentru siturile dispuse de-a lungul lungimii fiecrui
cromozom. Sondele sunt colorate cu unul din doi colorani fluoresceni care prezint
lungimi de und diferite. Sondele specifice pentru fiecare cromozom sunt marcate cu
o fracie predeterminat pentru fiecare din cei doi colorani. Dup ce sondele sunt
hibridizate cu cromozomii i excesul ndeprtat, proba este plasat la un microscop
fluorescent unde un detector determin fracia fiecrui colorant prezent n fiecare
poziie fluorescent din cmpul microscopic. Informaiile sunt acumulate de un
computer unde un program special furnizeaz o imagine a fiecrui tip de cromozom.
Combinarea dintre colorarea cromozomilor i hibridizarea in situ fluorescent, numit
FISH multicolor, poate detecta translocarile cromozomiale.
Metoda prezint o limitare tehnic pentru stabilirea cariotipului deoarece nu
poate fi aplicat dect celulelor n diviziune sau celor la care diviziunea este indus, in
vitro. Aceast problem poate fi depit dac se folosesc sonde ADN care recunosc
secvene specifice de pe cromozomi. Astfel de sonde, marcate fluorescent, sunt
folosite pentru tratarea nucleelor interfazici. Sondele se leag la secvenele
complementare de pe cromozomi i marcheaz specific cromozomii care pot fi
vizualizai prin microscopie de fluorescen. Astfel, FISH poate fi folosit pentru
identificarea cromozomilor din nucleii n interfaz. Aplicaiile nu se limiteaz numai
la acest aspect. Prin folosirea unor sonde specifice, pentru regiuni bine definite de pe
cromozom, FISH se folosete pentru identificarea microdeleiilor fine i translocrilor
complexe care nu pot fi detectate prin tehnici clasice. De asemenea, FISH reprezint o
metod de cartare a genelor, de interes clinic, nou izolate. O variant extins a tehnicii
FISH, numit Chromosome Painting, permite identificarea tuturor cromozomilor
unei celule prin folosirea unor seturi de sonde marcate fluorescent care recunosc
secvene particulare de-a lungul cromozomilor. Numrul cromozomilor care pot fi
detectai simultan poate fi limitat numai de disponibilitatea coloranilor fluoresceni
care pot fi excitai la diferite lungimi de und. De exemplu, tehnica nu poate fi
folosit pentru vizualizarea simultan a tuturor celor 46 de cromozomi de la om.
Aceast limit a fost depit prin introducerea cariotipului spectral care presupune
folosirea unor combinaii de cinci fluorocromi i semnale adecvate controlate de
computer. n acest fel este posibil vizualizarea fluorescent a tuturor cromozomilor.

40

SLIDE 54. Aberaiile cromozomiale

Aberaiile cromozomiale
Mutaiile modific informaia coninut n genele individuale, dar cromozomii
suport, ntre altele, modificri importante care apar cel mai adesea n timpul
diviziunilor celulare. Astfel, buci de cromozomi se pot pierde sau segmente se pot
schimba ntre cromozomi diferii. Aceste aberaii cromozomiale apar ca urmare a
unor rupturi, frecvena lor fiind crescut prin expunerea la ageni capabili s modifice
ADN: infeciile virale, radiaiile X sau agenii chimici. Exist printre altele la
cromozomii unor indivizi, zone fragile care sunt particular susceptibile la rupere.
Anumite maladii ereditare rare, ca sindromul Bloom, anemia Fanconi i ataxia
telangiectazic induc o instabilitate a cromozomilor care crete mult tendina de
rupere.
Consecina unei aberaii cromozomiale depinde de genele afectate i de tipul
de celul atins. Dac modificarea (alterarea) intervine ntr-o celul somatic nereproductoare, consecinele sunt n general minore deoarece numai cteva celule ale
organismului vor fi afectate. Totui, n cazuri rare o celul purttoare de aberaii se
poate transforma ntr-o celul malign i poate dezvolta o tumor canceroas.
Aberaiile cromozomiale care apar n timpul meoizei, particular dup un
crossing-over anormal pot fi transmise generaiei urmtoare. Dac un cromozom
anormal este transmis printr-un gamet, toate celulele descendenei sale vor avea
aberaia i individul nu depete n general stadiul dezvoltrii embrionare.
Exist mai multe tipuri de anomalii cromozomiale:
Inversiunile. Un cromozom este adesea rupt n dou locuri i segmentul situat ntre
cele dou poziii este reataat dar n ordine invers. Aceast aberaie este o inversie.
Pan la 1% din indivizii umani sunt purttori ai unei inversii care poate fi detectat
ntr-un cariotip. Deoarece un cromozom care conine o inversie posed, de obicei,
toate genele cromozomului normal, individul nu este afectat defavorabil. Totui, dac
o celul cu o inversie cromozomial intr n meioz, cromozomul aberant nu se poate
mperechia corect cu omologul su normal deoarece ordinea genelor este diferit. n
acest caz, mperecherea cromozomial este nsoit de formarea unei bucle. Dac se
produce un crossing-over n bucl, ca n figur, gameii rezultani din meioz posed
o copie suplimentar a anumitor gene (duplicare). Cnd un gamet care conine un
cromozom modificat fuzionat cu un gamet normal n momentul fecundrii, zigotul
care rezult este dezechilibrat la nivelul numrului de cromozomi care de obicei este
invariabil.
Translocrile. Dac un cromozom sau un fragment de cromozom se ataeaz la altul,
anomalia se numete translocare. Ca i inversiunile, o translocare care survine ntr-o
celul somatic nu are efect deloc asupra funcionrii celulei i a descendenei sale.
Totui, anumite translocri cresc probabilitatea ca celulele s devin canceroase.
Exemplul cel mai bine cunoscut este cel al cromozomului Philadelphia, pe care l
gsim n celulele maligne (dar nu i n celulele normale) ale indivizilor care sufer de
anumite forme de leucemie. Cromozomul Philadelphia, denumit astfel deoarece a fost
descoperit n acest ora n 1960, reprezint o versiune scurtat a cromozomului 22 de
la om. De-a lungul anilor, s-a crezut c segmentul care lipsea reprezenta o simpl
deleie dar, odat cu ameliorarea tehnicilor de observare a cromozomilor, s-a
demonstrat c fragmentul care lipsea era transferat unui alt cromozom (nr. 9).
Cromozomul 9 posed o gen care codific pentru o protein kinaz care intervine n
proliferarea celular. Ca urmare a translocrii, o mic parte a acestei proteine este
nlocuit prin aproximativ 600 aminoacizi suplimentari codificai de ctre fragmentul
translocat care provine de pe cromozomul 22. Aceast nou protein mult mai lung
41

conserv activitatea catalitic a formei originale, dar nu mai este supus

mecanismelor de reglare normal ale celulei.
Ca i inversiunile, translocrile sunt o surs probleme n procesul de meioz.
Coninutul genetic al unui cromozom alterat prin translocare este diferit de cel al
omologului su. n consecin, gameii formai n urma meiozei posed copii
suplimentare ale anumitor gene sau sunt lipsite de aceste gene. S-a demonstrat c
translocrile joac un rol important n evoluie producnd modificri de mare
anvergur care pot fi la originea separrii liniilor evolutive distincte provenite dintr-un
strmo comun. Acest accident genetic s-a produs probabil n timpul propriei noastre
istorii evolutive recente. Comparaia celor 23 perechi de cromozomi ale celulelor
somatice de la om cu cele 24 perechi de cromozomi de la cimpanzeu, goril i
urangutan evideniaz asemnri frapante. Observarea precis a doi cromozomi de
maimu care nu au echivalen la om demonstreaz c n ansamblu acetia corespund
band cu band cromozomului 2 de la om. ntr-un anumit moment, n cursul evoluiei
ctre om, un cromozom ntreg a fost translocat ctre altul pentru a da natere unui
singur cromozom prin reducerea numrului haploid de la 24 la 23.
Deleiile: reprezint pierderea unui fragment de cromozom. n funcie de localizare
acestea pot fi:
i) terminale care sunt rezultatul unei singure rupturi la nivelul unui bra al
cromozomului, producnd un fragment fr centromer care este nlturat;
ii) interstiiale care sunt rezultatul a dou ruperi i care se soldeaz cu pierderea
regiunii dintre acestea.
Cum am vzut mai sus, zigoi cu o deleie cromozomial se formeaz adesea cnd un
gamet provine dintr-o meioz anormal. Pierderea unei poriuni cromozomiale
antreneaz de obicei pierderea de gene eseniale i are consecine severe, chiar dac
cromozomul omolog este normal. Cea mai mare parte din embrionii umani purttori
ai unei deleii semnificative nu ajung la termen iar cei care reuesc demonstreaz
existena a numeroase malformaii. Jerome Lejeune a fost primul, n 1963, care a
stabilit o relaie ntre o malformaie la om i o deleie cromozomial; acest genetician
francez descoperise mai nainte cauza genetic a sindromului Down. Lejeune a gsit
c un copil cu diferite malformaii ale feei i o dezvoltare anormal a laringelui
(organ vocal) era lipsit de o parte a cromozomului 5. Datorit unei deficiene a
larinxului, iptul copilului seamn cu cel al unui pisoi (pisic) care sufer. Din
aceast cauz cercettorii au numit boala iptul pisicii.
Duplicrile. O duplicare provine din repetarea unei poriuni de cromozom. S-a pus
problema rolului acestor duplicaii n formarea familiilor multigenice. Alte duplicaii
cromozomiale mai importante sunt responsabile de prezena a trei exemplare ale mai
multor gene n locul a dou copii normale (trisomie parial). Activitile celulare sunt
foarte sensibile la numrul de copii ale genelor i exemplarele suplimentare pot avea
deci consecine negative grave.
Aberaiile cromozomiale. O serie de mutaii accidentale care modific informaia
coninut n genele individuale apar cel mai adesea n cursul replicrii ADN sau
datorit aciunii unor ageni de mediu. Fr a minimaliza importana acestora, pentru
buna funcionare a organismului, trebuie s artm c modificri mult mai importante
pot suporta cromozomii, cel mai adesea n timpul diviziunilor celulare. Astfel, buci
de cromozomi se pot pierde sau segmente importante se pot schimba ntre cromozomi
diferii. Aceste aberaii cromozomiale apar ca urmare a unor rupturi iar frecvena lor
este crescut n urma expunerii la ageni de mediu capabili s modifice ADN:
infeciile virale, radiaiile X, agenii chimici, etc. De asemenea, cromozomii unor
indivizi prezint zone fragile care au o susceptibilitate particular la rupere.

42

Anumite maladii ereditare rare, ca sindromul Bloom, anemia Fanconi, i ataxia

telangiectazic induc o instabilitate a cromozomilor care crete mult aceast
instabilitate.
Consecina unei aberaii cromozomiale depinde de genele afectate i de tipul
de celul atins. Dac modificarea intervine ntr-o celul somatic ne-reproductoare,
consecinele sunt n general minore, deoarece numai cteva celule ale organismului
vor fi afectate. Totui, n cazuri rare, o celul purttoare de aberaii se poate
transforma ntr-o celul malign i poate dezvolta o tumor canceroas.
Pot fi transmise generaiei urmtoare, aberaiile cromozomiale care apar n
timpul meiozei, particular dup un crossing-over anormal. Dac un cromozom
anormal este transmis printr-un gamet, toate celulele descendenei sale vor avea
aberaia i, n general, individul nu depete stadiul dezvoltrii embrionare.
Exist mai multe tipuri de anomalii cromozomiale:
Inversiuni: un cromozom este adesea rupt n dou locuri i segmentul situat ntre cele
dou poziii este reataat n ordine invers. Pn la 1% din oameni sunt purttori ai
unei inversii care poate fi detectat n urma realizrii unui cariotip. Inversiunile pot fi
de dou tipuri: i) paracentric, dac implic numai un bra al cromozomului; ii)
pericentric, dac rupturile se produc de o parte i de alta centromerului. Deoarece, de
obicei, un cromozom care conine o inversie posed toate genele cromozomului
normal, individul nu este ntotdeauna afectat defavorabil. Totui, dac o celul cu o
inversie cromozomial intr n meioz, cromozomul aberant nu se poate mperechea
corect cu omologul su normal deoarece ordinea genelor este diferit. n acest caz,
mperecherea cromozomial este nsoit de formarea unei bucle. Dac n bucl se
produce un crossing-over, gameii rezultai din meioz posed o copie suplimentar a
anumitor gene i apare o duplicare. Dac un gamet care conine un cromozom
modificat fuzioneaz cu un gamet normal n momentul fecundrii, zigotul rezultat
poart un dezechilibru la nivelul numrului de cromozomi, care de obicei este
invariabil.
Translocri: ataarea unui cromozom sau a unui fragment de cromozom la un altul.
Ca i inversiunile, translocrile care survin ntr-o celul somatic pot s nu aib deloc
efect asupra funcionrii celulei i a descendenei sale. Totui, anumite evenimente de
acest tip cresc probabilitatea ca celulele s devin canceroase. Exemplul cel mai bine
cunoscut este cel al cromozomului Philadelphia, pe care l gsim n celulele maligne
(nu i n celulele normale) ale indivizilor care sufer de anumite forme de leucemie.
Cromozomul Philadelphia, denumit astfel deoarece a fost descoperit n acest ora n
1960, reprezint o versiune scurtat a cromozomului 22 de la om. De-a lungul anilor,
s-a crezut c segmentul care lipsea reprezenta o simpl deleie dar, odat cu
ameliorarea tehnicilor de observare a cromozomilor, s-a demonstrat c fragmentul
care lipsea era transferat unui alt cromozom (nr. 9). Cromozomul 9 posed o gen
care codific pentru o protein-kinaz care intervine n proliferarea celular. Ca urmare
a translocrii, o mic parte a acestei proteine este nlocuit prin aproximativ 600
aminoacizi suplimentari codificai de ctre fragmentul translocat care provine de pe
cromozomul 22. Aceast nou protein, mult mai lung, conserv activitatea catalitic
a formei originale, dar nu mai este supus mecanismelor de reglare normal ale
celulei.
Ca i inversiunile, translocrile sunt o surs de probleme n procesul de meioz.
Coninutul genetic al unui cromozom alterat prin translocare este diferit de cel al
omologului su. n consecin, gameii formai n urma meiozei posed copii
suplimentare ale anumitor gene sau sunt lipsite de acestea. n figura sunt prezentate
dou tipuri de translocri: i) translocare reciproc balansat, n care se produce cte o

43

singur ruptur pe cei doi cromozomi, cu schimb de material genetic. O astfel de

translocare nu poate fi evideniat fr utilizarea unor tehnici de bandare avansate; ii)
fuziune centric sau translocare robertsonian, care presupune fuziunea dintre doi
cromozomi acrocentrici. De obicei, ruperile apar n apropierea centromerilor fiecrui
cromozom. Transferul de segmente duce la formarea unui cromozom foarte mare i a
unuia foarte mic care se pierde.
S-a demonstrat c translocrile joac un rol important n evoluie producnd
modificri de mare anvergur care pot fi la originea separrii liniilor evolutive
distincte provenite dintr-un strmo comun. Acest accident genetic s-a produs
probabil n timpul propriei noastre istorii evolutive recente. Comparaia celor 23
perechi de cromozomi ale celulelor somatice de la om cu cele 24 perechi de
cromozomi de la cimpanzeu, goril i urangutan evideniaz asemnri frapante.
Observarea precis a doi cromozomi de maimu, care nu au echivalen la om,
demonstreaz c n ansamblu acetia corespund, band cu band, cromozomului 2 de
la om. Se presupune c, ntr-un anumit moment al evoluiei, un cromozom ntreg a
fost translocat ctre altul i a dat natere unui singur cromozom prin reducerea
numrului haploid de la 24 la 23.
Cromozomul sub form de inel reprezint o form special de deleie. Aceast
anomalie apare cnd la ambele capete ale cromozomului se produc rupturi urmate de
fuziunea regiunilor afectate. Dac se pierd fragmente importante apar anomalii
fenotipice. Din pcate, cromozomii sub form de inel nu se normalizeaz nici n
meioz i nici n mitoz, avnd drept rezultat consecine serioase asupra organismului.
Duplicrile: presupun repetarea unei poriuni de cromozom. Se discut problema
rolului acestora n formarea familiilor multi-genice. Unele duplicri cromozomiale,
mai importante, sunt responsabile de prezena mai multor exemplare ale anumitor
gene (ex, trisomie parial). Cele mai cunoscute duplicri afecteaz genele globinei.
Deoarece echilibrul activitilor metabolice ale organismului este foarte sensibil,
existena unor exemplare suplimentare pentru anumite gene poate avea consecine
negative grave.
Izocromozomii: se obin cnd unul dintre braele cromozomului este pierdut i braul
care rmne este duplicat. Se obine un cromozom care conine dou brae scurte sau
dou lungi, identice. Cele mai frecvente cazuri se ntlnesc pentru cromozomul X.

SLIDE 55. Analiza translocrilor cromozomiale prin bandare

Figura: Analiza translocrilor cromozomale prin bandarea i colorarea

cromozomilor (a) i prin marcarea fluorescent a cromozomilor (b). Se observ
formarea cromozomului Philadelfia datorit translocrii unei regiuni din
cromozomul 22 pe cromozomul 9
Anumiti colorani coloreaz selectiv anumite regiuni ale cromozomilor
metafazici mult mai intens dect alte regiuni producnd benzi specifice fiecrui
cromozom individual. Cu toate c bazele moleculare ale regularitii benzilor
cromozomilor rmn necunoscute, aceste benzi sunt foarte utile. Cnd cromozomii
colorai sunt vizualizai la microscopul optic, aceste benzi servesc drept repere de-a
lungul fiecrui cromozom i folosesc i la diferenierea cromozomilor cu mrimi i
profil diferit.
Quinarina, un colorant fluorescent care se intercaleaz ntre perechile de baze
ale helixului ADN, produce benzile Q. Totui, deoarece benzile Q se estompeaz cu
timpul, n laborator sunt preferate alte tehnici. De exemplu cromozomii sunt supui
unei nclziri i proteolize uoare i apoi colorai cu reactiv Giemsa, un colorant
permanent care produce benzile G. Tratamentul cromozomilor cu soluie alcalin
44

cald nainte de colorare cu Giemsa produce benzile R cu un profil care este

aproximativ invers dect cel al benzilor G. Diferenele ntre aceste profile permite
citologilor s identifice pri specifice ale cromozomilor i s localizeze situsurile de
rupere cromozomal i translocare. De asemenea diferite sonde care hibridizeaz
specific cu secvenele cromozomilor pot fi localizate n benzi particulare.
Translocrile caracteristice cromozomilor sunt asociate cu unele maladii
genetice i cu unele tipuri specifice de cancer. De exemplu, aproape la toi pacienii
cu leucemie cronic mieloid, celulele leucemice conin cromozomul Philadelphia 22
anormal i un cromozom 9 anormal. Acesta rezult din traslocrile care apar ntre
cromozomii 9 i 22. Translocrile pot fi evideniate prin tehnici clasice de bandare
sau prin hibridizare in situ - tehnica FISH.

SLIDE 56. Numrul de cromozomi la diferite organisme (celula

haploid)
Genoamele nucleare eucariote au mrimi variabile care pot varia de la 10 Mpb
la peste 100 000 Mpb. Adesea, mrimea acestora coincide cu complexitatea
organismelor, genoamele organismelor eucariote fiind mai mari dect cele ale
eucariotelor inferioare. Totui, mrimea nu este determinat numai de numrul de
gene, ci i de cantitatea de secvene de ADN repetitiv. Cele mai mari genoame au un
numr de copii de secvene repetitive este foarte mare.

SLIDE 57. Mrimea genoamelor, numrul de gene i distribuia

acestora
Dup cum am constatat n paragrafele anterioare, la eucariote genomul nuclear
este mprit ntr-un set de molecule de ADN lineare, fiecare fiind mpachetat n
structura unui cromozom. Din acest punct de vedere nu au fost evideniate excepii n
lumea eucariotelor, toate organismele cunoscute avnd cel puin doi cromozomi n
care molecula de ADN este liniar. Variabilitatea la acest nivel se manifest numai n
ceea ce privete numrul de cromozomi, care pare s nu fie corelat cu trsturile
biologice ale organismului.
De exemplu, drojdia Saccharomyces cerevisiae, un eucariot relativ simplu are
de patru ori mai muli cromozomi dect musculia Drosophila melanogaster. De
asemenea, numrul cromozomilor nu pare s fie corelat cu mrimea genomului sau cu
poziia evolutiv a organismului. Anumite salamandre posed genoame de
aproximativ 30 de ori mai mari dect omul, dar au un numr de cromozomi redus la
jumtate. O situaie similar se poate consta i n cazul unor plante, cum este
porumbul. Aceste comparaii sunt foarte interesante, dar din pcate nu sunt destul de
informative pentru genoamele n sine. Adesea, ele reprezint numai o reflectare a
neuniformitii evenimentelor evolutive care au modificat arhitectura genomic la
diferite organisme.

SLIDE 58. Mrimea coninutului n ADN a genomului haploid de la

diferite organisme
Mrimea coninutului n ADN a genomului haploid de la diferite organisme.
Complexitatea morfologic a organismelor, estimat n funcie de numrul tipurilor
celulare pe care le prezint, crete de jos n sus
Figura. Mrimea coninutului n ADN a genomului haploid de la diferite organisme.
Complexitatea morfologic a organismelor, estimat n funcie de numrul tipurilor

45

celulare pe care le prezint, crete de jos n sus (dup Molecular Cell Biology Lodish
H., et. al., 2000)
Complexitatea morfologic a ADN se poate corela cu valoarea C, care
reprezint cantitatea de ADN din genomul haploid. Pe de alt parte complexitatea
morfologic a unui organism ar trebui s reflecte complexitatea genetic. Cu toate
acestea, corespondena dintre cei doi parametrii este cunoscut drept Paradoxul
Valorii C, deoarece unele organisme au valori C neateptat de mari. De exemplu
genomul petelui-plmn este de 10-15 ori mai mare dect cel de la mamifere. Adesea
paradoxul valorii C este aplicabil i unor specii nrudite (de exemplu valorile C de la
diferite specii de Drosophile sunt uneori foarte diferite).

SLIDE 59. Clasificarea secvenelor ADN de la eucariote

Analiza molecular ncearc s explice i paradoxul aparent pe care l
reprezint faptul c genoamele eucariotelor par s conin o cantitate nsemnat de
ADN care nu este necesar celulei. Acum mai bine de 30 de ani se consider c
eucariotele conin aproximativ 50 000 gene. Cum fiecare secven codant era
considerat ca avnd, n medie, 1 200 pb, genomul acestora ar fi trebuit s conin
numai aproximativ 6 x 107 pb. Acum se cunoate c genoamele unor ciuperci sunt
mai mici dect aceast valoare i c cea mai mare parte a genoamelor de mamifere i
de plante conin de 50 la 100 ori mai mult ADN.

SLIDE 60. Variabilitatea numrului de introni i exoni i mrimea

acestora la diferite specii
Iniial, pentru estimarea numrului de gene, o serie de cercettori au extrapolat
situaia cunoscut de la E. coli unde de 4,7 milioane pb codific pentru 3000 de gene.
Pstrnd proporionalitatea, ei considerau c genomul haploid uman de 2,9 miliarde
pb trebuia s aib un numr mult mai mare de gene (de 600 ori mai mare). Odat cu
ncheierea secvenializrii genomului uman a fost posibil identificarea tuturor fazelor
de lectur i realizarea unei estimri ct mai corecte a numrului genelor de la om. n
prezent se discut de 30-40 000 n loc de 60-80 000 gene cum se considera n
momentul nceperii acestui program. De asemenea, evoluia tehnicilor de biologie
molecular i utilizarea unor aparate de secvenializare performante permite
definitivarea secvenializrii unui numr din ce n ce mai mare de organisme i
estimarea din ce n ce mai corect a numrului genelor coninute de acestea. n tabel
se realizeaz o prezentare a mrimii unora dintre cele mai cunoscute genoame, a
numrului genelor precum i a distribuiei acestora/Mb.
Aceast variaie inexplicabil a mrimii genoamelor apare deoarece
cromozomii eucariotelor conin, pe lng informaia genetic din structura genelor,
cantiti variabile de ADN, plasate n: i) introni; ii) n regiunile intra-genice i intergenice; iii) regiuni repetitive n tandem sau dispersate pe toat lungimea genomului.
Acest ADN, a crui funcie nu a fost nc demonstrat, este adesea compus din
repetiii de secvene, unele dintre ele nefiind niciodat transcrise. El mai este denumit
i ADN nefuncional. n tabel sunt trecute n revist principalele tipuri de secvene
prezente n structura genomului eucariotelor.
Mrimea, adesea excesiv a genoamelor eucariote se poate datora
urmtoarelor aspecte:
i) cea mai mare parte a genelor care codific pentru polipeptide posed cel
puin un intron, un numr mare de gene avnd mai muli. Totui, prezena intronilor
nu este obligatorie existnd i gene lipsite de acetia. Genele care codific pentru

46

moleculele de ARN funcionale cum sunt ARNt i ARNr pot s posede i ele secvene
intercalate, dar ntreruperile la nivelul acestora sunt mai puin frecvente. n general,
cantitatea de ADN prezent n introni depete cu mult pe cea din exoni.
ii) anumite gene apar de mai multe ori ntr-un genom eucariot i contribuie la
creterea taliei. Existena de copii multiple ale unei anumite gene nu este ns o
proprietate exclusiv a eucariotelor. De exemplu, E. coli posed apte gene pentru
ARNr, probabil pentru a satisface necesitile, n ribozomi, ale unei creteri rapide.
Eucariotele posed i ele gene n copiii multiple pentru a rezolva astfel de probleme.
iii) o alt cauz a mrimii excesive a genoamelor eucariote este prezena unor
familii mari de secvene de ADN repetitiv a cror funcie este, pentru moment,
necunoscut. Astfel de familii reprezint adesea ntre 10% la 50% din genom . Aceste
secvene au fost pentru prima dat identificate n urma analizei cineticii de reaciei de
renaturare a ADN. Astfel, s-a demonstrat c mari cantiti de ADN se reasociaz mult
mai rapid dect era prevzut pentru secvenele unice. Viteza mare de reasociere indic
faptul c genoamele conin segmente care se repet de sute de mii sau de milioane de
ori. Curbele de reasociere Cot sunt informative pentru identificarea regiunilor care
conin secvene repetitive sau satelii. Clonarea molecular i secvenializarea au
confirmat existena unor astfel de secvene nalt repetitive care, asemenea genelor
repetitive, sunt aranjate n tandem sau sunt dispersate la nivelul a numeroase locusuri
necorelate.

SLIDE 61. Prezentare comparativ a structurii genice a cromozomului

III de la Saccharomyces cerevisiae
Figura Prezentare comparativ a structurii genice a cromozomului III de la
Saccharomyces cerevisiae (a) i clusterului globinei de la om situat pe cromozomul
11(b). Dreptunghiurile albastre marcheaz fazele de lectur. Se poate constata c
genomul de S. cerevisiae are un numr foarte mic de secvene nefuncionale. La om
clusterul globinei conine secvene intergenice necodante, pseudogene (1 i 2)
i secvene repetitive dispersate lungi (secvenele Alu care aparin tipului SINES)
(dup Molecular Cell Biology Lodish H., et. al., 2000)

La mamifere exist mai multe sute de gene care codific pentru ARNr. O alt
parte important din excesul de ADN este determinat de prezena copiilor
nefuncionale ale genelor. n general, aceste copii sunt numite pseudogene i sunt
inactive din cauza existenei unor deleii sau altor alterri ale secvenei ADN.
Numrul pseudogenelor pentru un anumit tip de gen variaz foarte mult. Astfel, n
genoamele eucariotelor, o gen poate fi prezent o singur dat, sau foarte bine, poate
s fac parte dintr-o familie de gene funcionale strns nrudite. Acestea pot fi
exprimate n momente diferite sau n esuturi i celule diferite. Astfel de familii pot
include i pseudogene. n figur este prezentat clusterul -globinei care conine dou
pseudogene. De asemenea, se remarc cantitatea mare de ADN nefuncional
prezent la om comparativ cu drojdia Saccharomyces cerevisiae.
ADN repetitiv const n secvene scurte repetitive sub forma unor copii
identice sau nrudite n genom. Componenta care se renatureaz cel mai rapid n
genomul eucariotelor este reprezentat de secvenele nalt repetitive, i const n
secvene foarte scurte care se repet de multe ori n tandem formnd clustere mari.
Datorit unitilor repetitive scurte, aceste secvene de ADN sunt adesea denumite
secvene ADN simple sau secvene satelit.

47

SLIDE 62. Curbele de reasociere (Cot) pentru ADN dublu catenar din
sursele indicate pe grafic
Figura. Curbele de reasociere (Cot) pentru ADN dublu catenar din sursele indicate pe grafic.
Se observ procesul de renaturare rapid a secvenelor repetitive sau care conin satelii
(dup Molecular Cell Biology Lodish H., et. al., 2000)

Acest tip de secvene sunt prezente n aproape toate genoamele eucariote, dar
cantitatea lor total este extrem de variabil. n genoamele mamiferelor acestea
reprezint, n mod normal, < 10% dar la Drosophila virilis, cantitatea este de 50%.

SLIDE 63. Tipuri de secvene ADN repetitive i distribuia acestora

Secvenele repetitive n tandem pot fi corelate cu modificarea alinierilor care

apar n urma mperecherii cromozomilor. Astfel, mrimea clusterelor n tandem
tinde s fie foarte polimorf, cu variaii largi ntre indivizi. De fapt, clusterele mai
mici, formate din astfel de secvene, pot fi folosite pentru caracterizarea genoamelor
individuale folosind tehnica fingerprinting sau genotiparea automat. Compararea
secvenelor simple de ADN, de la diferite specii, ofer informaii interesante despre
mecanismele procesului de evoluie. Pentru moment nu putem spune cu precizie dac
aceste secvene au o funcie structural.
Mari familii de repetiii dispersate n genomul mamiferelor
Analiza clasic a profilelor de dispersie demonstreaz c genomul uman i
genoamele altor mamifere posed profile de dispersie apropiate. Aceste concluzii sunt
confirmate de detaliile moleculare furnizate prin analiz de restricie, clonare i
secvenializare. Cu toate c exist diferite familii i sub-familii de repetiii dispersate,
un numr mic dintre acestea prezint un numr foarte mare de copii i domin
genoamele. O familie dominant poate reprezenta mai mult de 5% din ADN total, iar
totalitatea familiilor pot reprezenta 20% din acesta. Unele familii sunt constituite din
secvene de 100 la 500 pb i sunt denumite secvene SINEs (Short Interspersed
Repeats). Altele, ale cror membri pot avea 6 kpb sau mai mult, sunt denumite LINES
(Long Interspersed Repeats). Organisme cum sunt miomicetele, lcustele,
echinodermele, petii i amfibienii conin repetiii dispersate care se aseamn cu
SINES de la mamifere. La plante i la nevertebrate exist secvene comparabile cu
LINES de la mamifere.
Fiecare specie (ordin) posed un joc caracteristic de familii de secvene
SINES. Una dintre familiile SINES cele mai bine studiate este familia ALU de la
primatele lumii vechi, denumit aa datorit prezenei n aceast secven a unui situs
de restricie Alu I. Unitile Alu se gsesc n regiuni care flancheaz genele, n introni,
n ADN satelit i grupate cu alte secvene repetitive dispersate.
Pe lng multiplele familii SINES, genoamele mamiferelor posed toate o
abundent familie LINES, familia LINE-1, ale crei membri pot avea 6 la 7 kpb. n
unele dintre aceste genoame, exist i alte familii LINE dar ele nu sunt la fel de
frecvente. Familiile LINE-1 de la diferite mamifere sunt toate nrudite dar divergente:
cu ct speciile sunt mai apropiate cu att familiile sunt mai similare. Secvenele
LINE-1 sunt prezente n regiunile care flancheaz genele, n introni i inserate n
repetiiile ADN satelit.

48

SLIDE 64. Trei elemente funcionale sunt necesare replicrii i

motenirii stabile a cromozomilor de la eucariote
Centromerii: se poate remarca c toi cromozomii posed un situs la unde suprafaa
lor exterioar este net rscroit (scobit). Aceast scobitur reprezint centromerul
cromozomului. Mai sus am artat c centromerii conin heterocromatin constitutiv.
Centrometrii cromozomilor umani conin o secven lung de aproximativ 170
nucleotide (ADN satelit ) dispuse n tandem i repetate de 2 000 la 30 000 ori per
centromer. ADN centromeric fixeaz proteine specifice, ntre altele cele care servesc
drept situs de fixare microtubulilor care separ cromozomii n timpul diviziunii
mitotice.
Telomerii: cele dou extremiti ale moleculei de ADN a fiecrui cromozom posed
un segment foarte particular de secvene repetitive numite telomeri, care formeaz un
coif la fiecare capt al cromozomilor. La om telomerii posed secvene
TTAGGG/AATCCC repetitive de mii de ori. Contrar celor mai multe tipuri de
secvene repetitive, care variaz mult ntre specii, chiar dac ele sunt nrudite i
apropiate, n cazul telomerilor de la om i de la toate vertebratele studiate pn n
prezent gsim aceeai secven telomeric. La alte organisme cum sunt protozoarele
i drojdiile, telomerii au secvene diferite dar, ca i pentru vertebrate, o caten este
ntotdeauna bogat n resturi de guanozin iar complementara sa n resturi de citozin.
Catena bogat n G este orientat n sensul 5-3 ctre extremitatea cromozomului i
depete cu 12 la 15 nucleotide extremitatea catenei bogat n C. Datorit existenei
acestui dezechilibru catena bogat n G formeaz o scurt coad monocatenar la cele
dou extremiti ale cromozomului. Aceast dispoziie persist de la o generaie
celular la alta datorit unei enzime speciale, telomeraza, care poate aduga noi
uniti repetitive la extremitatea 3 a catenei bogate n G.
Telomeraza, ale crei proprieti au fost bine studiate de ctre Elisabeth
Blackburn i colegii si de la Universitatea din California, San Francisco, este o
transcriptaz invers care asambleaz fragmente de ADN folosind o caten (matri)
de ARN. Telomeraza este o enzim foarte neobinuit n sensul n care ARN care
servete drept model face n realitate parte din enzim. Secvenele telomerice sunt i
situsuri de fixare a mai multor proteine specifice.
Telomerii au roluri importante: ei sunt necesari replicrii complete a
cromozomului; protejeaz cromozomii de nucleaze i de alte influene
destabilizatoare; mpiedic fuziunea dintre extremitile cromozomilor i faciliteaz
interaciile dintre extremitile cromozomilor i anvelopa nuclear n anumite tipuri
celulare. Experiene recente sugereaz alte roluri. Celulele normale nu sunt capabile
s se divid n cultur dect de un numr limitat de ori nainte de a da semne de
mbtrnire i n final de a muri. Au fost propuse diferite ipoteze pentru a explica
aceast observaie: cea mai recent este scurtarea progresiv a telomerilor. Telomerii
se scurteaz deoarece cea mai mare parte a celulelor umane par a fi lipsite de
telomeraze. Contrar celulelor normale celulele canceroase nu nceteaz s creasc n
cultur; spunem c acestea devin nemuritoare. Unul dintre factorii care ar putea
contribui la imortalizarea celulelor maligne este reactivarea telomerazei, care
conserv lungimea telomerilor de-a lungul generaiilor. De fapt, cercetri recente au
demonstrat c un anumit numr de cancere la om au o activitate a telomerazei care nu
poate fi evideniat n celulele normale. Aceast descoperire a declanat cercetarea
inhibitorilor specifici ai acestei enzime spernd c acetia ar putea opri creterea
anumitor tumori.

49

SLIDE 65. Experiment pentru evidenierea importanei originii de

replicare (a)
La ADN eucariotelor, originile de replicare au fost pentru prima dat
identificate prin funciile lor n studiile de transformare la drojdii. Dac celulelor de
drojdii le lipsete o gen particular (ex. una dintre genele implicate n biosinteza
leucinei), ele pot fi transformate cu plasmide care conin clonat gena lips (ex. gena
LEU). Transformanii LEU+, care pot crete pe mediu fr leucin sunt obinui cu o
frecven mai mare dac plasmida conine mai multe secvene din genomul de drojdie
de aproximativ 100 pb, numite secvene replicative autozomale (ARS). O ARS
acioneaz ca o origine de replicare, permitnd plasmidei circulare s se replice n
nucleul de drojdii.

SLIDE 66. Experiment pentru evidenierea importanei originii de

replicare (b)
Centromerii. ntr-o cultur, celulele sunt transformate cu o plasmid simpl circular
care conine fragmentul LEU/ARS. Se constata ca numai aproximativ 5-20 % dintre
progenituri conin plasmida datorit segregrii mitotice greite a plasmidelor.
Rezultatul este ca majoritatea plasmidelor ADN nu intr n nmugurire. Totui, dac
fragmentele de restricie ale ADN genomic de la drojdii sunt clonate ntr-o astfel de
plasmid circular, o mic fraciune dintre fragmente confer o segregare egala a
plasmidelor att n celulele mam ct i fiice dup mitoz. Deoarece fragmentele cu
acest efect au fost gsite ca facnd parte din centromerii fiecrui cromozom de
drojdie, ei au fost numii secvene CEN. Astfel de experimente au condus la izolarea
secvenelor care folosesc segregarea mitotic pentru extinderea la mai mult de 90% a
numrului progeniturilor Leu- care conin plasmida LEU. Aceste celule i majoritatea
descendenilor lor cresc foarte bine pe mediu fr leucin.

SLIDE 67. Experiment pentru evidenierea importanei telomerilor (c)
Dac plasmidele circulare care conin att secvene CEN ct i ARS sunt tiate
cu o enzim de restricie, ele devin lineare. Astfel de plasmide lineare nu se replic n
drojdii dect dac ele conin secvene telomerice speciale ligate la capetele lor. Primul
experiment de succes care a implicat transfecia celulelor de drojdie cu plasmide
lineare a fost realizat folosind capetele unei molecule de ADN care este cunoscut ca
replicndu-se liniar n protozoarul ciliat Tetrahymena.
Cercetrile au artat c ADN telomeric posed un tip de structur
caracteristic care este adugat la capetele moleculelor de ADN de ctre o enzim
special telomere-terminal transferaz sau telomeraz. Au fost determinate structurile
telomerilor pentru o serie de organisme, inclusiv la om; majoritatea sunt secvene
oligomere repetitive cu un coninut ridicat n G la nivelul catenei orientate 5-3 ctre
telomer. Aceste secvene simple sunt repetitive la capetele terminale ale
cromozomilor i variaz de la cteva sute de de perechi de baze la drojdii i
protozoare la cteva mii la vertebrate. Captul 3 ale catenelor bogate n G sunt
extinse cu 12-16 nucleotride dincolo de captul 5 al catenei complementare bogate in
C. Aceast regiune este legat de proteine specifice care protejeaz capetele
cromozomilor lineari de atacul exonucleazelor.
Enzimele care adaug secvene telomerice sunt complexe formate att din
proteine ct i din ARN. Deoarece secvena ARN servete drept matri pentru
adugarea de dezoxiribonucleotide la capetele telomerilor, sursa de enzim i nu sursa
primerului ADN telomeric determin secvena adgat. Astfel telomeraza este o

50

form specializat de revers-transcriptaz care posed propria sa matri ARN pentru

a realiza sinteza direct a ADN.
Aciunea telomerazei este important pentru prevenirea scurtrii
cromozomilor n timpul replicrii ADN. oarecii knockout care nu pot produce
ARN-ul asociat telomerazei nu exprim activitate telomerazic i telomerii lor se
scurteaz considerabil cu fiecare generaie. Astfel de oareci se pot reproduce normal
timp de trei generaii nainte ca absena telomerilor s determine fuziunea terminal a
cromozomilor i pierderea acestora. Dup patru generaii potenialul de reproducere a
acestor oareci knockout intr n declin i se oprete la a asea generaie.

SLIDE 68. Secvene consens la drojdii

O dat ce regiunile centromerice de la drojdii care confer segregare mitotic
au fost clonate, secvenele lor pot fi determinate i comparate. Compararea
centromerilor diferii de la drojdii au evideniat trei regiuni (I, II i III) care sunt
necesare unui centromer s funcioneze. Regiunea II pare s aib o lungime constant
(78-86 baze) i conine secvene consens nedefinite, dar bogate n resturi A i T. O
secven simpl de la Drosphila care provine din regiunea centromeric prezint
unele similitudini cu regiunile I i III de la drojdii, sugernd c mecanisme similare
controleaz segregarea la drojdii i la eucariotele superioare.

SLIDE 69. Concluzii

Cromozomii eucariotelor pot fi vizualizai n timpul mitozei cnd ei
condenseaz n metafaz. Setul de cromozomi, n metafaz, al unei celule se numete
cariotip. Speciile nrudite pot prezenta diferene importante la nivelul cariotipului,
indicnd c informaii genetice similare pot fi organizate n diferite feluri;
Fiecare cromozom este compus dintr-o singur molecul de ADN,
mpachetat n nucleozomi i pliat n fibre de 30 nm, care este ataat cu o protein
agraf care se leag la anumite situsuri. Plieri suplimentare conduc la formarea unei
structuri mult mai compacte care se condenseaz suplimentar odat cu formarea
cromozomilor metafazici;
Cnd cromozomii metafazici decondenseaz n timpul interfazei, anumite
regiuni, numite heterocromatin, rmn mult mai condensate dect regiunile de
cromatin numite eucromatin;
Trei tipuri de secvene sunt necesare moleculelor lineare lungi de ADN pentru
a funciona ca un cromozom n celulele de drojdii: o origine de replicare (ARS la
drojdii) o secven centromeric (CEN) i dou secvene telomerice (TEL) situate la
capete;
Toi cromozomii eucariotelor conin una sau mai multe origini de replicare,
secvene TEL, care sunt necesare replicrii ADN, i o secven CEN, care este util
pentru segregarea eficient a cromozomilor n cele dou celule fiice;
Descoperirea elementelor funcionale de la nivelul cromozomilor de drojdii,
care permit construcia unor cromozomi artificiali (vectorii YAC), face posibil
clonarea unor fragmente de ADN de aproximativ un milion de pb.

SLIDE 70. Organitele care conin ADN

Dei majoritatea ADN de la eucariote se afl dispus n nucleu, anumite
cantiti de ADN sunt prezente i n mitocondriile animalelor, plantelor i fungilor i
n cloroplastele plantelor. Aceste organite sunt principalele situri de producere a ATP,
n timpul fosforfilrii oxidative din mitocondrie i a fotosintezei din cloroplaste.

51

Multe dovezi indic evoluia cloroplastelor i mitocondriilor din bacterii printr-un

proces de endocitoz ancestral, cu formare de endosimbioni. O dat cu evoluia, o
parte a genelor bacteriene au fost transferate nucleului. Totui, mitocondriile i
cloroplastele actuale au pstrat o molecule de ADN circular care codific pentru
proteine eseniale funcionrii organitelor i pentru ARNr necesar procesului de
transcripie de la acest nivel.
Mitocondriile conin mai multe molecule de ADNmt
Mitocondriile sunt destul de mari pentru a putea fi vizualizate la microscopul
optic, iar ADN mitocondrial poate fi evideniat prin microscopie de fluorescen.
ADNmt este localizat n interiorul mitocondriei, n regiunea numit matri. Dac
judecm dup numrul de puncte fluorescente galbene dintr-o celul de Euglena
gracilis, aceasta conine cel puin 30 de molecule de ADNmt.
Dac coloranii folosii pentru a vizualiza ADN nuclear i mitocondrial, nu
afecteaz creterea celular i diviziunea, replicarea ADNmt i diviziunea reelei
mitocondriale poate fi urmrit microscopic.
Astfel de studii demonstreaz c ADNmt se replic n timpul interfazei. n
mitoz fiecare celul fiic primete aproximativ acelai numr de mitocondrii, dar
cum nu exist mecanisme pentru mprirea exact a mitocondriilor, unele celule
conin mai mult ADNmt dect altele. Toate mitocondriile din celulele eucariote conin
mai multe molecule de ADNmt. Astfel numrul total de ADNmt ntr-o celul depinde
de numrul de mitocondrii, de mrimea ADNmt i de numrul de ADNmt per
mitocondrie.

SLIDE 71. Dual staining reveals the multiple mitochondrial DNA

molecules in a growing Euglena gracilis cell

SLIDE 72. Genoamele mitocondriale de la om si la Saccharomyces
cerevisiae
SLIDE 73. Caracteristicile genelor mitocondriale
SLIDE 74. Motenirea citoplasmatic a mitocondriilor mutante
Motenirea citoplasmatic a mitocondriilor mutante
Studiile asupra mutanilor de drojdii i a altor organisme unicelulare indic c
mitocondria exprim motenire citoplasmatic i deci trebuie s conin propriul su
sistem genetic. De exemplu, mutaiile petite de drojdii manifest anormaliti
structurale la nivelul mitocondriilor i sunt incapabile s realizeze forforilare
oxidativ. Ca rezultat, celulele mici cresc mult mai ncet dect tipul slbatic i
formeaz colonii mici. ncruciarea genetic ntre diferitele tulpini haploide de drojdii
demonstreaz c mutaia petite nu segreg cu nici o gen sau cromozom nuclear
cunoscut. n ultimile studii, s-a constatat c la majoritatea mutanilor petite exist
deleii la nivelul ADNmt.
Motenirea mitocondrial la drojdii este biparental: n timpul fuziunii
celulelor haploide, ambii prini contribuie egal cu citoplasm la formarea diploidului.
La mamifere i la majoritatea altor animale, totui sperma contribuie cu puin
citoplasm la zigot, virtual toate mitocondriile din embrion sunt derivate din cele ale
ovulului i nu din sperm. Studiile pe oareci au demonstrat c 99,99% din ADNmt
este motenit pe cale matern. La plantele superioare ADNmt este motenit exclusiv
ntr-o manier uniparental de la printele femel (oul) i nu mascul (polenul).
52

ntregul genom mitocondrial de la un numr mare de organisme a fost deja

clonat i secvenializat. ADNmt din aceste surse codific pentru ARNr, ARNt i
proteine mitocondriale eseniale. Toate proteinele codificate de ctre ADNmt sunt
sintetizate la nivelul ribozomilor mitocondriali. Toate polipeptidele sintetizate
mitocondrial nu sunt enzime complete ci numai subuniti ale unor complexe
multimere implicate n transportul electronilor i n sinteza ATP. Majoritatea
proteinelor localizate n mitocondrie, cum sunt ADN i ARN polimerazele, sunt
sintetizate de ribozomii citoplasmatici i sunt importate n organite.
Mutaiile n ADNmt determin diferite boli genetice
Severitatea bolii cauzate de o mutaie n ADNmt depinde de natura mutaiei i
de proporia de mutani si de tip slbatic prezente ntr-un tip particular de celul. n
general, cnd se detecteaz mutaii n ADNmt, celulele conin amestecuri de ADNmt
slbatec i mutant condiie numit heteroplasmie. De fiecare dat cnd se divide o
celul germinal sau somatic de mamifere, tipul mutant i slbatec vor segrega
aleator n celulele fiice, aa cum se ntmpl la drojdii. Astfel, genotipul ADNmt
fluctueaz de la o generaie i de la o diviziune celular la alta i se poate deplasa fie
spre tipul slbatec dominant, fie spre tipul mutant. Dac toate enzimele pentru
replicare i cretere, cum sunt ADN i ARN polimerazele, sunt importate din
citoplasm, ADNmt mutant nu va prezenta vreun dezavantaj replicativ; mutanii care
presupun deleii mari ale ADNmt pot chiar s prezinte un avantaj selectiv n replicare.
Toate celulele au mitocondrii, dar mutaiile n ADNmt afecteaz numai
anumite esuturi. Cele mai afectate care necesit mult ATP produs prin fosforilare
oxidativ, i esuturile care necesit ca majoritatea sau ntreg coninutul de ADNmt
din celul pentru a sintetiza preteine mitocondriale funcionale. De exemplu,
neuropatia optic ereditar Leber (degenerarea nervului optic acompaniat de orbire)
este cauzat de o mutaie missense n ADNmt al genei care codific subunitatea 4 a
NADH-CoQ reductaza.
Unele din deleiile mari ale ADNmt cauzeaz un alt set de maladii care
include oftalmopplegia extern cronic progresiv i sindromul Kearns-Sayre care
sunt caracterizate prin defecte ale ochiului i n sindrom prin degenerarea sistemului
nervos. O a treia condiie care determin fibre musculare neregulate (cu mitocondrii
asamblate impropriu) i micri brute necontrolate asociate, este datorat unei
singure mutaii n bucla TYCG a ARNt pentru lizin. Ca rezultat al acestei mutaii,
translaia mai multor proteine mitocondriale este aparent blocat.
Aa cum am discutat anterior structura cloroplastelor este similar n multe
privine cu aceea a mitocondriilor. Ca i acestea, cloroplastele conin mai multe copii
de ADN i ribozomi care codific pentru proteine ale cloroplastelor folosind codul
genetic standard. Alte proteine din cloroplaste sunt fabricate n citosol i sunt
ncorporate n cloroplaste dup translaie.
ADN din cloroplaste sunt molecule circulare de aproximativ 120 000-160000
pb, n funcie de specie. Completa secvenializare a a ADN din mai multe cloroplaste
de exemplu plmn (121024 pb) i tutun (155844). Genomul cloroplastelor din
plmn prezint dou secvene repetitive inverse fiecare constnd n 10058 pb care
conin genele ARNr i alte cteva gene duplicate. n ciuda diferenei de mrime,
ntreaga organizare i compoziia genelor de la plmn i de la tutun este foarte
similar. Diferena de mrime provine n primul rnd repetiiilor inversate n care
anumite gene sunt duplicate.
Din aproximativ 120 de gene din cloroplaste, aproape 60 sunt implicate n
transcripia i translaia ARN i include genele care codific pentru ARNr, ARNt,
subunitile ARN polimerazei i proteinele ribozomale. Aproximativ 20 de gene

53

codific pentru subunitile complexelor transportoare de electroni din cloroplast i

pentru complexul FoF1 ATP-azic. De asemenea sunt codificate de ctre genomul
cloroplastelor cele dou subuniti mari ale ribulozo 1,5 difosfat carboxilaza, care este
implicat n fixarea dioxidului de carbon n timpul fotosintezei.
Reflectnd originea endosimbiotic a cloroplastelor unele regiuni ale ADN din
cloroplaste sunt similare cu cele ale ADN actual de bacterii. De exemplu, ADN din
cloroplaste codific patru subuniti ale ARN polimerazei care sunt omologe cu
subunitile ARN polimerazei de la E. coli. Un alt segment al ADN din cloroplaste
codific 8 proteine care sunt omologe cu 8 proteine ribozomale de la E. coli; ordinea
acestor gene este similar n cele dou tipuri de ADN. ADN din cloroplastele
plmnului posed cteva gene care nu sunt n ADN din cloroplastele tutunului i
invers. Acest lucru indic probabil existena unui schimb ancestral de gene ntre ADN
din cloroplaste i din nucleul plantelor studiate.

SLIDE 75. ADN mitocondrial uman

Surprinztor, mrimea moleculelor de ADNmt, numrul i natura proteinelor
pe care acestea le codific, i chiar codul genetic mitocondrial, variaz mult ntre
diferitele organisme.
ADNmt uman, o molecul circular care a fost complet secvenializat, este
printre cele mai mici molecule de ADNmt cunoscute deoarece conine 16 569 perechi
de baze. Acesta codific pentru dou molecule de ARNr prezeni n robozomii
mitocondriali i pentru cei 22 ARNt folosii n procesul de translaie mitocondrial.
ADNmt uman conine 13 secvene care ncep cu codonul ATG (metionin) i
terminate cu un codon STOP i sunt destul de lungi pentru a codifica o polipeptid
mai mare de 50 aminoacizi; toate proteinele posibil codificate de aceste faze de
lectur au fost identificate. ADNmt de la mamifere, spre deosebire ADN nuclear, este
lipsit de introni i nu conine secvene necodante.
ADNmt de la nevertebrate are aproximativ aceeai mrime cu ADNmt uman,
dar ADNmt de la drojdii este de aproximativ de 5 ori mai mare (78 000 pb).
Moleculele de ADNmt de la drojdii i alte eucariote superioare codific muli dintre
produii acelorai gene ca i cele de la mamifere, ca i pentru alte gene care la
mamifere sunt dispuse n nucleii celulelor de mamifere.
In contrast cu alte eucariote, care conin un singur tip de ADNmt, plantele
conin mai multe tipuri de ADNmt care par s se recombine unele cu altele. ADNmt
de la plante este mult mai mare ca mrime dect la alte organisme. Se poate ntmpla
ca la o singur specie s existe diferene foarte mari n mrimea ADNmt (la pepenele
verde 330 000 pb; la pepenele galben 2 500 000 pb).
Spre deosebire de animale, drojdii i fungii, ADNmt de la plante conin gene
care codific ARNr 5S, care este prezent numai n ribozomii mitocondriilor plantelor
i a subunitii alfa a ATP-azei F1. ARNr de la plante este mult mai mare dect cel de
la alte eucariote. Secvenializarea recent a uneia dintre cele mai mici molecule de
ADNmt de la plante a evideniat c mrimea este datorat existenei regiunilor
necodante i a secvenelor duplicate.
Diferenele de mrime i de capacitate codant a ADNmt de la diferite
organisme reflecteaz micarea ADN ntre mitocondrie i nucleu n timpul evoluiei.
Dovezi directe ale acestei micri vin de la observaia c multe proteine codificate de
ADNmt de la diferite specii sunt codificate de ADN nuclear la altele. Se pare c este
vorba de o deplasare a genelor de la mitocondrie la nucleu i invers, n timpul
evoluiei.

54

Cel mai elocvent exemplu este cel al genei cox II, care codific subunitatea 2
a citocrom c oxidazei. Aceast gen se gsete n ADNmt de la toate organismele
studiate cu excepia unei specii de legume numit Bob (mung bean) unde gena cox II
este nuclear.
Multe molecule de ARN transcripi de la plante sunt procesate (editate) prin
aciunea unei enzime care catalizeaz transformarea unor resturi selecionate C n U i
ocazional a U n C. Gena nuclear cox II de la mung bean corespunde mai bine
transcripilor procesai dect genei mitocondriale cox II prezent n alte legume.
Aceste date sunt dovezi clare ale deplasrii genei cox II din mitocondrie n nucleu
printr-un proces care implic participarea unei molecule de ARN. Probabil, un
mecanism de revertranscripie similar celui prin care pseudogenele procesate sunt
generate n genomul nuclear prin intermediul ARNm codificat nuclear.

SLIDE 76. Codul genetic mitocondrial difer de codul genetic standard

Toi transcripii ARN mitocondriali i produii lor de translaie rmn n
mitocondrie. Unele proteine ribozomale (una sau dou) depinznd de specie sunt
importate din citosol.
Reflectnd vechimea bacterian a mitocondriilor, ribozomii mitocondriali se
aseamn cu cei de la bacterii i difer de ribozomii citoplasmatici prin moleculele de
ARN i prin compoziia n proteine. De exemplu cloramfenicolul blocheaz sinteza
proteic la bacterii dar i n mitocondrii, dar nu i ribozomii citoplasmatici.
Cicloheximida inhib sinteza proteic a ribozomilor citoplasmatici dar nu o afecteaz
pe cea de la bacterii sau din mitocondrii. n culturile de celule de mamifere numai
proteinele sintetizate n prezenta cicloheximidei sunt codificate de ADNmt i produse
de ribozomii mitocondriali.
Codul genetic folosit n mitocondriile animale i ale fungilor este diferit de
codul standard folosit de toate genele procariote i eucariote; de remarcat c acest cod
difer chiar i pentru mitocondrii de la specii diferite. Cum a aprut acest fenomen n
cursul evoluiei este misterios. De exemplu, UGA, este n mod normal un codon
STOP, dar este citit ca triptofan n mitocondriile umane i de fungi; totui n
mitocondriile plantelor UGA este nc un codon STOP. AGA i AGG, codonii
nucleari standard pentru arginin codific de asemenea pentru arginin n
mitocondriile fungilor i plantelor, dar reprezint codoni STOP pentru ADNmt de la
mamifere i pentru serin la ADNmt de la Drosophila.
Mitocondriile plantelor par s utilizeze codul genetic standard. Totui,
comparaiile secvenelor n aminoacizi ale proteinelor mitocondriale de la plante cu
secvena nucleotidic a ADNmt sugereaz c CGG poate codifica fie pentru arginin
(aminoacidul standard) sau triptofan. Aceast nespecificitate aparent a codului
mitocondrial este explicat prin editarea transcripilor ARN mitocondriali, care pot
transforma resturile de citozin n uracil. Dac o secven CGG este editat n UGG,
codonul specific triptofanul, aminoacidul standard pentru UGG, n timp ce codonii
CGG ne-editai codific pentru arginin. Astfel sistemul de translaie n mitocondriile
plantelor utilizeaz codul genetic standard.

SLIDE 77. Mrimea genoamelor mitocondriilor i cloroplastelor

Genoamele organitelor din celulele eucariote
Majoritatea celulelor eucariote posed genoame mitocondriale i toate
eucariotele capabile de fotosintez au genoame n structura cloroplastelor. Iniial, s-a
considerat c genoamele organitelor sunt molecule de ADN circulare. Aceasta
deoarece hrile genetice i fizice obinute, prin analiza de restricie a genoamelor din
55

mitocondrii i din cloroplaste, erau circulare. n anumite organite, studiile de

microscopie electronic au evideniat att molecule circulare ct i liniare. La nceput,
s-a presupus c formele liniare ar putea reprezenta fragmente ale genoamelor circulare
care s-au rupt n procesul de preparare. Din 1998 a fost admis c unele eucariote
inferioare (Paramecium, Chlamydomonas i multe sue de drojdii) posed structuri
lineare la nivelul genoamelor mitocondriale.
Surprinztor, mrimea moleculelor de ADN mitocondrial (ADNmt), numrul
i natura proteinelor pe care acestea le codific, i chiar codul genetic mitocondrial,
variaz mult ntre diferitele tipuri de organisme.
Majoritatea animalelor multicelulare au genoame mitocondriale mici cu o
organizare genetic compact, genele fiind separare numai de spaii foarte reduse.
ADNmt uman este tipic pentru aceast categorie. Genomul mitocondrial este o
molecul circular care a fost complet secvenializat i care conine 16 569 perechi
de baze, fiind printre cele mai mici molecule de acest tip. Acesta codific pentru dou
molecule de ARNr prezente n ribozomii mitocondriali i pentru cei 22 ARNt folosii
n procesul de translaie de la acest nivel. ADNmt uman conine 13 secvene care
ncep cu codonul ATG (metionin) i se termin cu un codon STOP. Aceste faze de
lectur, destul de lungi pentru a codifica polipeptide de aproximativ 50 aminoacizi, au
fost identificate cu proteinele codificate. ADNmt de la mamifere, spre deosebire ADN
nuclear, este lipsit de introni i nu conine secvene necodante.
ADNmt de la nevertebrate are aproximativ aceeai mrime cu cel uman, n
timp ce ADNmt de la drojdii este de aproximativ de 5 ori mai mare (78 000 pb).
Moleculele de ADNmt de la drojdii i de la alte eucariote superioare posed gene care
la mamifere sunt dispuse n nucleii celulelor.
In contrast cu alte eucariote, care conin un singur tip de ADNmt, plantele
conin mai multe tipuri de ADNmt care par s se recombine unele cu altele. Aceste
molecule de la plante sunt mult mai mari dect la alte organisme. Se poate ntmpla
ca la o singur specie s existe diferene foarte mari n mrimea ADNmt (la pepenele
verde 330 000 pb; la pepenele galben 2 500 000 pb).
Spre deosebire de animale, drojdii i fungii, ADNmt de la plante conine gene care
codific pentru ARNr 5S, care este prezent numai n ribozomii mitocondriilor
plantelor, i pentru subunitatea a ATP-azei F1. ARNr de la plante este mult mai
mare dect cel de la alte eucariote. Secvenializarea recent a uneia dintre cele mai
mici molecule de ADNmt de la plante a evideniat c mrimea este datorat existenei
de regiuni necodante i de secvene duplicate.
Diferenele de mrime i de capacitate codant a ADNmt de la diferite
organisme poate reflecta un anumit schimb de ADN, ntre mitocondrie i nucleu, n
cursul evoluiei. Dovezi directe, n favoarea acestei afirmaii au fost furnizate de
evidenierea unor proteine ale cror gene sunt la unele specii localizate n nucleu i la
altele n mitocondrie. Se pare c este vorba de o deplasare a genelor din mitocondrie
n nucleu i invers, n timpul evoluiei. Cel mai elocvent exemplu este cel al genei cox
II, care codific subunitatea 2 a citocrom c oxidazei. Pentru toate organismele
studiate, aceast gen se gsete n ADNmt, cu excepia unei specii de legume numit
Bob (mung bean) unde gena cox II este nuclear.

SLIDE 78. Caracteristicile genelor mitocondriale

Multe molecule de ARN transcrise de la plante sunt procesate prin aciunea

unei enzime care catalizeaz transformarea unor resturi selecionate C n U i
ocazional a U n C. Gena nuclear cox II de la bob este mai apropiat structural de
moleculele de ARN procesate dect de gena mitocondrial cox II prezent la alte
56

legume. Aceste date sunt dovezi ale deplasrii genei cox II din mitocondrie n nucleu
printr-un proces care implic participarea unei molecule de ARN. Este posibil un
mecanism de reverstranscripie similar celui prin care pseudogenele procesate sunt
generate n genomul nuclear prin intermediul ARNm.
Structura cloroplastelor este similar n multe privine cu aceea a
mitocondriilor. Ca i acestea, cloroplastele conin mai multe copii de ADN i
ribozomi care codific pentru proteine din cloroplaste, folosind codul genetic
standard. Alte proteine specifice din cloroplastelor sunt fabricate n citoplasm i sunt
transportate, dup traducere.
ADN din cloroplaste sunt molecule circulare de aproximativ 120 000-160 000
pb, n funcie de specie. Multe dintre moleculele de ADN din cloroplaste au fost
complet secvenializate. Genomul cloroplastelor din planta a crei denumire popular
este plmn prezint dou secvene repetitive inverse fiecare constnd n 10 058 pb
care conin genele ARNr i alte cteva gene duplicate. n ciuda diferenei de mrime
(plmn 121 024 pb; tutun 155 844), ntreaga organizare i compoziia genelor de
la plmn i de la tutun este foarte similar. Diferena de mrime apare, n primul
rnd, de la repetiiile inversate provenite din duplicarea anumitor gene.
Din aproximativ 120 de gene codificate de ADN din cloroplaste, aproape 60
sunt implicate n transcripia i translaia ARN i includ genele care codific pentru
ARNr, ARNt, subunitile ARN polimerazei i proteinele ribozomale. Aproximativ
20 de gene codific pentru subunitile complexelor transportoare de electroni din
cloroplast i pentru complexul FoF1 ATP-azic. De asemenea, sunt codificate de ctre
genomul cloroplastelor cele dou subuniti mari ale ribulozo 1,5 difosfat carboxilaza,
care este implicat n fixarea dioxidului de carbon n timpul fotosintezei.
Reflectnd originea endosimbiotic a cloroplastelor unele regiuni din genomul
acestora sunt similare cu cele ale ADN de la bacteriile actuale. De exemplu, ADN din
cloroplaste codific patru subuniti ale ARN polimerazei care sunt omologe cu
subunitile ARN polimerazei de la E. coli. Un alt segment al ADN din cloroplaste
codific 8 proteine care sunt omologe cu 8 proteine ribozomale de la E. coli. Ordinea
genelor este similar n cele dou tipuri de ADN. ADN din cloroplastele plmnului
posed cteva gene care nu sunt n ADN din cloroplastele tutunului i invers. Acest
lucru poate indica un posibil schimb ancestral ntre cloroplaste i nucleu.

SLIDE 79. CONCLUZII

Se consider c mitocondriile au evoluat din bacterii care prezint o relaie
simbiotic cu celulele ancestrale care conin un nucleu eucariot. Majoritatea genelor
originale din aceste organite au fost transferate genomului nuclear n timpul evoluiei,
organitele diferitelor organisme pstrnd diferite gene;
ADNmt de la mamifere are numai aprox 16 kb; acesta nu conine introni i
prezint numai o mic regiune neconcordant. ADNmt de la plante i drojdii este mult
mai mare. Toate tipurile de ADNmt codific pentru ARNr, ARNt i pentru cteva
proteine implicate n transportul mitocondrial al electronilor i n sinteza ATP;
Majoritatea ADNmt este motenit mai degrab din ou (ovul) dect din sperm,
mutaiile n ADNmt fiind motenite pe linie matern;
Ribozomii mitocondriali se aseamn cu ribozomii bacterieni, ca structur,
sensibilitate la cloramfenicol i rezisten la cicloheximid;
Codul genetic pentru ADNmt de la animale i fungi difer de cel bacterian i
de cel al genomului nuclear prin aceea c numeroi codoni codific pentru aminoacizi
sau semnale STOP alternative; Mitocondriile plantelor par s foloseasc codul
standard nuclear i bacterian;
57

Mutaiile ADNmt pot determina maladii neuromusculare umane, probabil

datorit necesitii crescute de ATP a acestor esuturi. n general, pacienii prezint, n
celule, un amestec de mitocondrii care conin ADNmt normal i mutant
(heteroplasmie). Severitatea fenotipic este mai mare cu ct proporia de ADNmt este
mai mare;
ADN din cloroplaste este circular i conine aproximativ 120-160 kb, n
funcie de speciile de plante. Acestea codific pentru aproximativ 120 de proteine i
folosesc codul genetic standard.
Aa cum am discutat anterior structura cloroplastelor este similar n multe privine
cu aceea a mitocondriilor. Ca i acestea, cloroplastele conin mai multe copii de ADN
i ribozomi care codific pentru proteine ale cloroplastelor folosind codul genetic
satndard. Alte proteine din cloroplaste sunt fabricate n citosol i sunt incorporate n
cloroplaste dup translaie.
ADN din cloroplaste sunt molecule circulare de aproximativ 120 000-160000
pb, n funcie de specie. Completa secvenializare a a ADN din mai multe cloroplaste
de exemplu plmn (121024 pb) i tutun (155844). Genomul cloroplastelor din
plmn prezint dou secvene repetitive inverse fiecare constnd n 10058 pb care
conin genele ARNr i alte cteva gene duplicate. n ciuda diferenei dee mrime,
ntreaga organizare i compotiia genelor de la plmn i de la tutun este foarte
similar; Diferena de mrime provine n primul rnd repetiiilor inversate n care
anumite gene sunt duplicate.
Din aproximativ 120 de gene din cloroplaste, aproape 60 sunt implicate n
transcripia i translaia ARN i include genele care codific pentru ARNr, ARNt,
subunitile ARN polimerazei i proteinele ribozomale. Aproximativ 20 de gene
codific pentru subunitile complexelor transportoare de electroni din cloroplast i
pentru complexul FoF1 ATP-azic. De asemenea sunt codificate de ctre genomul
cloroplastelor cele dou subuniti mari ale Ribulozo 1,5 difosfat carboxilaza, care
este implicat n fixarea dioxidului de carbon n timpul fotosintezei.
Reflectnd originea endosimbiotic a cloroplastelor unele regiuni ale ADN din
cloroplaste sunt similare cu cele ale ADN actual de bacterii. De exemplu, ADN din
cloroplaste codific patru subuniti ale ARN polimerazei care sunt omologe cu
subunitile ARN polimerazei de la E. Coli. Un alt segment al ADN din cloroplaste
codific 8 proteine care sunt omologe cu 8 proteine robozomale de la E. Coli; ordinea
acestor gene este similar n cele dou tipuri de ADN. ADN din cloroplastele
plmnului posed cteva gene care nu sunt n ADN din cloroplastele tutunului i
invers. Acest lucru indic probabil existena unui schimb ancestral de gene ntre ADN
din cloroplaste i din nucleul plantelor studiate.

58

NOTE DE CURS BM2

ORGANIZAREA MOLECULAR, EXPRESIA I REGLAREA
GENELOR EUCARIOTE
SLIDE 2. Structura i expresia genelor eucariote
Pot fi obinute segmente de ADN pur i specific din orice genom, n cantitate
suficient astfel nct s permit o caracterizare chimic complet; utilizarea
endonucleazelor de restricie i analiza secvenelor nucleotidice au fcut din aceste
caracterizri nite analize de rutin.
Mrimea i complexitatea genoamelor eucariote este formidabil. Secvena
nucleotidic a unei gene i a segmentelor care o flancheaz nu ne furnizeaz
informaii privind: i) modul de aciune al genei; ii) modului de reglare a expresiei sale
n timpul dezvoltrii i diferenierii celulare i nici n cazul adaptrii la modificrile de
mediu; iii) modul n care expresia genelor este coordonat pentru a asigura echilibrul
fiziologic caracteristic al celulelor i organismelor sntoase; iv) modul n care,
apariia unui produs al genei sau variaia vitezei de expresie a unei gene pot afecta
funcionarea normal sau pot determina maladii.
Informaii suplimentare: genele clonate sunt introduse ntr-o celul prin
transfecie sau microinjecie, ele sunt adesea exprimate i pot chiar rspunde unor
influene reglatoare specifice.
Permite: a) analiza activitilor relative ale genelor normale i mutante i a
semnalelor de reglare; b) evidenierea alelelor mutante spontan; c) construirea de
mutanii experimental care pot fi analizai.
Consecina real a dezvoltrii tehnicilor ADN recombinat este realizarea de
studii de interdependen ntre structur i funcie.
Mrimea i complexitatea genoamelor eucariote este formidabil, aceasta nu
mai reprezint o barier n cunoaterea detaliilor moleculare de organizare i
structur. Singurele obstacole existente sunt timpul i resursele necesare unei cercetri
de o asemenea amploare. La nceput au fost necesare cinci persoane, timp de un an,
pentru a determina secvena de 50 kpb a genomului fagului . Acum, folosind
metodele perfecionate de secvenializare au fost nregistrate progrese substaniale
reuindu-se deja determinarea celor 4 milioane de perechi de baze din genomul E.
coli, secvenializarea genomului Saccharomices cerevisiae i demararea cu succes a
secvenializrii genomului uman (de 10 ori mai mare dect E. coli).
Secvena nucleotidic a unei gene i a segmentelor care o flancheaz nu ne
furnizeaz informaii privind modul de aciune al genei, asupra modului de reglare a
expresiei sale n timpul dezvoltrii i diferenierii celulare i nici n cazul adaptrii la
modificrile de mediu. Secvena nu relev nici modul n care expresia genelor este
coordonat pentru a asigura echilibrul fiziologic caracteristic al celulelor i
organismelor sntoase i nici cum apariia unui produs al genei sau variaiei vitezei
de expresie a unei gene pot afecta funcionarea normal sau pot determina maladii.
Pentru a nelege semnificaia fiziologic a detaliilor moleculare este necesar o
analiz biochimic. n aceste situaii tehnicile de biologie molecular furnizeaz o
abordare experimental puternic. Dac genele clonate sunt introduse ntr-o celul
prin transfecie sau microinjecie, ele sunt adesea exprimate i pot chiar rspunde unor
influene reglatoare specifice. Aceasta permite analiza activitilor relative ale genelor

59

normale i mutante i a semnalelor de reglare; alelele mutante spontan i mutanii

construii experimental pot fi analizai. Astfel, consecina real a dezvoltrii tehnicilor
ADN recombinat este faptul c permite realizarea de studii de interdependen ntre
structur i funcie. Aceast abordare analitic, genetica invers, nlocuiete
numeroasele metode ale geneticii clasice i amplific extraordinar posibilitile
cercetrilor genetice.
Aplicaiile geneticii clasice i abordrile citogenetice sunt n mod necesar
limitate pentru organisme de tipul omului, dar genomul acestora poate fi studiat
actualmente la nivel fundamental, ceea ce acum un deceniu nu era imaginabil dect
pentru bacterii. Cteva micrograme de ADN izolat din limfocite i transformat ntr-o
banc pot fi utilizate pentru a determina relaia care exist ntre genotip i fenotip.
Mai mult, universalitatea tehnicilor ADN recombinat semnific c genoamelor tuturor
organismelor contemporane (i chiar a organismelor vechi sau disprute, dar din ale
cror resturi se poate prepara ADN) sunt accesibile i c este posibil stabilirea
diferenelor dar i similitudinilor existente ntre acestea. Se pot obine indicaii
importante relativ la evoluia diferitelor genoame plecnd de la aceste comparaii,
adugnd astfel modaliti de analiz geneticii clasice care studiaz problemele de
evoluie.
Cu toat evoluia metodelor de biologie molecular i progreselor deosebite
realizate n domeniu este necesar o munc susinut deoarece marea majoritate a
caracteristicilor sistemelor genetice eucariote rmne de descoperit. Cu toate aceste
n cei peste 20 de ani de cnd aceste metode au fost dezvoltate au fost elucidate o
serie de aspecte unice ale genoamelor organismelor eucariote.
Primele noiuni relativ la structura molecular a genelor i a organizrii lor n
genomul eucariotelor au fost rezultatul studiului iniial pe organisme procariote.
Structura i expresia genelor eucariote
Chiar nainte de cunoaterea structurii genelor eucariote i procariote, se tia
c sistemele genetice procariote i eucariote posed proprieti fundamentale comune.
n cele dou cazuri materialul genetic este ADN, replicarea este semiconservativ,
fluxul de informaie genetic este direcionat de la ADN ctre ARN i proteine i
codul genetic este universal. Pare rezonabil s considerm c organismele eucariote,
mai ales cele multicelulare, conin mai multe gene dect procariotele i c posed
mecanisme de control suplimentare care permit reglarea proceselor de dezvoltare
pentru a realiza integrarea diferitelor lor funciuni. Dar, era general admis c structura
de baz a genelor i organizarea informaiei genetice este asemntoare n cele dou
tipuri de genoame. Aceste convingeri au disprut dup primele analize ale genelor i
genoamelor eucariote.

SLIDE 3. Definiia molecular a unei gene; gene ntrerupte

Gene ntrerupte
La sfritul anilor 1970, era evident c secvenele care codificau pentru
proteine n genele de mamifere nu erau, n mod necesar, furnizate de un singur
segment de ADN, cum este cazul virtual al tuturor genelor procariote. Din contr,
regiunile codante sunt discontinue, ntrerupte de segmente de ADN care nu codific
(necodante); acestea au fost denumite secvene intercalare sau introni iar secvenele
codante sunt numite exoni. n continuare, a devenit evident faptul c intronii sunt
prezeni la marea majoritate a genelor de mamifere dar, n acelai timp, sunt prezente
n genoamele altor eucariote i a anumitor virusuri animale.

60

Primele suspiciuni privind existena intronilor au aprut n momentul studierii

virusurilor animale. La acestea s-a demonstrat lipsa de colinearitate ntre secvena
nucleotidic a ADN i cea a ARNm care deriv din acesta; de fapt se prea c ARNm
este obinut din fragmente de ADN viral care nu prezint continuitate. n acelai mod,
secvenele ARNm pentru globin erau capabile s se hibridizeze cu o colecie de
fragmente din genom obinute prin aciunea endonucleazelor de restricie care,
asociate, formau un segment mult mai lung dect lungimea mesagerului nsui.
Aceast descoperire sugera c segmentele care constituiau mesagerul erau diseminate
de-a lungul genomului corespunztor.

SLIDE 4. Comparaie ARNm la procariote i eucariote

Procariote: operonii bacterieni ARNm este policistronic; Eucariote: ARNm
este monocistronic i conine exoni i introni.
Figura:ARN transcris de la nivelul unei uniti complexe (albastru) poate fi procesat
pe mai multe ci pentru a conduce la unul sau la mai multe uniti ARNm
monocistronice funcionale. Liniile punctate marchez nlturarea intronilor.
a)
O unitate de transcripie al crui transcript primar posed dou situsuri
poli(A) poate da natere la dou molecule de ARNm diferite prin folosirea alternativ
a exonilor sitiuai n 3.
b) O unitate transcripional complex al crei transcript primar sufer nlturarea
exonilor n timpul procesrii produce molecule alternativede ARNm care au aceeai
exoni n 5 i n 3. n acest exemplu, unele tipuri celulare exprim ARNm care
conine exonul 3 n timp ce altele exonul 2 este alipit exonului 4 n care lipsete
exonul 3. Mutaiile produse n (a) i (b) afecteaz proteinele ambelor forme
alternative de ARNm. n contrast, mutaiile (desemnate prin c i d) prezente n
interiorul exonului unic al uneia dintre formele alternative de ARNm afecteaz numai
proteina codificat de ctre acest ARNm.
Cea mai mare parte a genelor care codific pentru polipeptide posed cel puin
un intron, un numr mare de gene avnd mai muli. Totui, prezena intronilor nu este
obligatorie existnd i gene lipsite. Genele care codific pentru moleculele de ARN
funcionale cum sunt ARNt i ARNr pot s posede i ele secvene intercalare, dar
ntreruperile la nivelul acestor gene sunt mai puin frecvente. n general, cantitatea de
ADN prezent n introni depete cu mult pe cea din exoni. Existena intronilor i
enorma diversitate a numrului i a mrimii lor explic numrul mare de molecule de
ARN nuclear la eucariote i totodat eterogenitatea foarte pronunat i lungimea lor
considerabil. Moleculele de ARN nuclear eterogen (ARNh) reprezint o colecie de
transcripi pentru numeroase gene nucleare. Unii dintre acetia sunt transcripi
primari, mrimea lor fiind identic cu cea a genei, iar alii sunt molecule parial
maturate care sunt lipsite de un numr variabil de introni. Este foarte interesant c
moleculele de ARNm citoplasmatic sunt produsul unei astfel de colecii complexe de
precursori.

SLIDE 5. Genomul eucariotelor: uniti de transcripie simple i

complexe
Moleculele de ARN nuclear heterogen (ARNh) reprezint o colecie de
transcripi pentru numeroase gene nuclare:
i) transcripi primari, mrimea lor este identic cu cea a genei;

61

ii) molecule parial maturate care sunt lipsite de un numr variabil de introni.
Moleculele de ARNm citoplasmatic sunt produsul unei astfel de colecii complexe de
precursori.
Figura:
ARN transcris de la nivelul unei uniti complexe (albastru) poate fi procesat pe mai
multe ci pentru a conduce la unul sau la mai multe uniti ARNm monocistronice
funcionale. Liniile punctate marchez nlturarea intronilor.
a) O unitate de transcripie al crui transcript primar posed dou situsuri poli(A)
poate da natere la dou molecule de ARNm diferite prin folosirea alternativ a
exonilor sitiuai n 3.
b) O unitate transcripional complex al crei transcript primar sufer nlturarea
exonilor n timpul procesrii produce molecule alternativede ARNm care au aceeai
exoni n 5 i n 3. n acest exemplu, unele tipuri celulare exprim ARNm care
conine exonul 3 n timp ce altele exonul 2 este alipit exonului 4 n acre lipsete
exonul 3. Mutaiile produse in (a) i (b) afecteaz proteinele ambelor forme
alternative de ARNm. n contrast, mutaiile (desemnate prin c i d) prezente n
interiorul exonului unic al uneia dintre formele alternative de ARNm afecteaz numai
proteina codificat de ctre acest ARNm.
Cea mai mare parte a genelor care codific pentru polipeptide posed cel puin
un intron, un numr mare de gene avnd mai muli. Totui, prezena intronilor nu este
obligatorie existnd i gene lipsite. Genele care codific pentru moleculele de ARN
funcionale cum sunt ARNt i ARNr pot s posede i ele secvene intercalare, dar
ntreruperile la nivelul acestor gene sunt mai puin frecvente. n general, cantitatea de
ADN prezent n introni depete cu mult pe cea din exoni. Existena intronilor i
enorma diversitate a numrului i a mrimii lor explic numrul mare de molecule de
ARN nuclear la eucariote i totodat eterogenitatea foarte pronunat i lungimea lor
considerabil. Moleculele de ARN nuclear eterogen (ARNh) reprezint o colecie de
transcrpi pentru numeroase gene nucleare. Unii dintre acetia sunt transcripi primari,
mrimea lor fiind identic cu cea a genei, iar alii sunt molecule parial maturate care
sunt lipsite de un numr variabil de introni. Este foarte interesant c moleculele de
ARNm citoplasmatic sunt produsul unei astfel de colecii complexe de precursori.

SLIDE 6. Variabilitatea numrului de introni i exoni i mrimea

acestora la diferite specii
Analizele de structur i funcie ale genelor eucariote au evideniat c genele
procariote i eucariote sufer puternic din punct de vedere al complexitii secvenelor
scurte (motive) responsabile de reglarea transcripiei. Au fost evideniate trei tipuri de
motive n genele procariote. Un prim tip include secvenele care determin debutul
transcripiei: n E. coli, promotorii sunt definii prin dou regiuni de ADN prezente la
10 i 35 perechi de baze n amonte fa de situsul de iniiere a transcripiei. Un al
doilea tip de element marcheaz terminarea genei sau a unui grup de gene i
favorizeaz terminarea transcripiei. n sfrit, exist secvene de ADN adiacente sau
nclecate n raport cu promotorii, care sunt recunoscute de efectori specifici cum
sunt represorii, activatorii i terminatorii, care moduleaz transcripia. Toate aceste
secvene de reglare specific depind de interaciunile care le realizeaz cu proteinele
specifice care au rolul de a influena expresia secvenelor codante vecine.

62

SLIDE 7. Reglarea expresiei genelor procariote

Analizele de structur i funcie ale genelor eucariote au evideniat c genele
procariote i eucariote sufer puternic din punct de vedere al complexitii secvenelor
scurte (motive) responsabile de reglarea transcripiei. Au fost evideniate trei tipuri de
motive n genele procariote. Un prim tip include secvenele care determin debutul
transcripiei: n E. coli, promotorii sunt definii prin dou regiuni de ADN prezente la
10 i 35 perechi de baze n amont fa de situsul de iniiere a transcripiei. Un al
doilea tip de element marcheaz terminarea genei sau a unui grup de gene i
favorizeaz terminarea transcripiei. In sfrit, exist secvene de ADN adiacente sau
nclecate n raport cu promotorii, care sunt recunoscute de efectori specifici cum sunt
represorii, activatorii i terminatorii, care moduleaz transcripia. Toate aceste
secvene de reglare specific depind de interaciunile care le realizeaz cu proteinele
specifice care au rolul de a influena expresia secvenelor codante vecine.

SLIDE 8. Reglarea expresiei genelor eucariote (a)

La eucariote:
i) secvene cu localizri variabile, situate la distane variabile i cu orientri
diverse n raport cu situsul de demarare i de oprire a transcripiei.
ii) 3 polimeraze diferite, I, II i III, transcriu trei clase de gene distincte fiecare
asociat cu semnale specifice de control a transcripiei i terminrii acesteia.
Secvenele reglatoare: suit complex de motive de ADN relativ scurte.
Fiecare motiv - situsul de fixare al unei proteine specifice, un factor de
transcripie (ex).
Concluzie: reglarea transcripiei fiecrei gene reflect cooperarea particular
(asortarea) i aranjamentul anumitor motive, prezena factorilor de transcripie
adecvai i modul n care aceti factori influeneaz iniierea transcripiei.
Fixarea mai multor factori de transcripie n regiunea de reglare faciliteaz fie
asamblarea ARN polimerazei ntr-un complex de transcripie, fie activarea acestui
complex, fie ambele.
Studii de genetic molecular i de biochimie au evideniat temele care
guverneaz reglarea transcripiei i care furnizeaz bazele de nelegere a expresiei
difereniate a genelor. Astfel, secvenele reglatoare sunt formate dintr-o suit
complex de motive de ADN relativ scurte. Fiecare motiv este situsul de fixare al unei
proteine specifice, un factor de transcripie. De exemplu, genele care nu sunt
transcrise dect n celulele limfoide conin o serie de motive care sunt recunoscute de
factori de transcripie specifici acestor celule. La fel, genele care nu sunt transcrise
dect n anumite momente i n condiii particulare conin motive de reglare care
interacioneaz cu proteine specifice care nu sunt prezente sau active dect n aceste
momente sau n aceste circumstane. n consecin, reglarea transcripiei fiecrei gene
reflect cooperarea particulare (asortarea) i aranjamentul acestor motive, prezena
factorilor de transcripie adecvai i de modul n care aceti factori influeneaz
iniierea transcripiei. Fixarea mai multor factori de transcripie n regiunea de reglare
faciliteaz fie asamblarea ARN polimerazei ntr-un complex de transcripie, fie
activarea acestui complex, fie ambele procese.
Secvenele de ADN care regleaz expresia genelor eucariote au localizri
variabile, sunt situate la distane variabile i au orientri diverse n raport cu situsul de
demarare i de oprire a transcripiei. n plus, trei polimeraze diferite, I, II i III,
transcriu trei clase de gene distincte fiecare asociat cu semnale specifice de control a
transcripiei i terminrii acesteia. Studii de genetic molecular i de biochimie au

63

evideniat temele care guverneaz reglarea transcripiei i care furnizeaz bazele de

nelegere a expresiei difereniate a genelor. Astfel, secvenele reglatoare sunt formate
dintr-o suit complex de motive de ADN relativ scurte. Fiecare motiv este situsul de
fixare al unei proteine specifice, un factor de transcripie. De exemplu, genele care
nu sunt transcrise dect n celulele limfoide conin o serie de motive care sunt
recunoscute de factori de transcripie specifici acestor celule. La fel, genele care nu
sunt transcrise dect n anumite momente i n condiii particulare conin motive de
reglare care interacioneaz cu proteine specifice care nu sunt prezente sau active
dect n aceste momente sau n aceste circumstane. n consecin, reglarea
transcripiei fiecrei gene reflect cooperarea particulare (asortarea) i aranjamentul
acestor motive, prezena factorilor de transcripie adecvai i de modul n care aceti
factori influeneaz iniierea transcripiei. Fixarea mai multor factori de transcripie n
regiunea de reglare faciliteaz fie asamblarea ARN polimerazei ntr-un complex de
transcripie, fie activarea acestui complex, fie ambele procese.
O caracteristic extraordinar a acestor mecanisme o reprezint universalitatea
lor. Este remarcabil faptul c aceste mecanisme cu origini foarte diverse (cum este
cazul drojdiei, Drosophilei sau celulelor de mamifere) s fie interschimbabile. Astfel,
un factor de la drojdii sau de la Drosophila poate interaciona cu motive nucleotidice
de la mamifere i cu celelalte proteine ale complexului de transcripie la fel de bine ca
i factorii de transcripie de la mamifere. Situaie invers este adesea adevrat.
Aceasta implic o conservare cert a acestor structuri n cursul evoluiei.
Mecanismul de terminare a transcripiei este diferit pentru cele trei ADN
polimeraze: fiecare depinde de motivele de secven situate la, sau aproape de
extremitatea unitii de transcripie. La acest nivel, motivele interacioneaz cu
proteine adecvate, factorii de terminare. Reglarea terminrii este consecina
aranjamentului motivelor ADN i formarea unui ansamblu multiproteic care
faciliteaz terminarea i modificarea extremitii ARN.

SLIDE 9. Reglarea expresiei genelor eucariote (b)

O caracteristic extraordinar a acestor mecanisme o reprezint universalitatea lor.
Remarcabil - mecanisme cu origini foarte diverse (drojdie, Drosophila, celule
de mamifere) sunt interschimbabile o conservare evolutiv cert a acestor structuri.
Mecanismul de terminare a transcripiei este diferit pentru cele 3 ADN
polimeraze. Motivele interacioneaz cu proteine adecvate, factorii de terminare.
Reglarea terminrii este consecina aranjamentului motivelor ADN i formarea unui
ansamblu multiproteic care faciliteaz terminarea i modificarea extremitii ARN.
Expresia anumitor gene este afectat de schimbri epigenetice care altereaz
capacitatea unei gene de a se exprima fr a fi afectat secvena sa nucleotidic.
O form de modificare epigenetic identificat este asociat cu gradul de
metilare a citozinelor la nivelul secvenelor 5-CG care flancheaz regiunea 5 a unei
gene: a) creterea metilrii este corelat cu o reducere sau chiar cu o absen a
expresiei genei sau genelor vecine; b) reducere a metilrii se traduce printr-o expresie
crescut.
Modificrile de structur intrinsec a cromatinei (acetilare, fosforilare) pot
influena nivelul expresiei genelor apropiate.
Nivel crescut de expresie exist numai n regiunile decondensate ale
cromatinei.
Expresia anumitor gene este afectat de schimbri epigenetice care altereaz
capacitatea unei gene de a se exprima (de a fi exprimat) fr a fi afectat secvena sa
nucleotidic. O form de modificare epigenetic identificat este asociat cu gradul de
64

metilare a citozinelor la nivelul secvenelor 5-CG care flancheaz regiunea 5 a unei

gene. O cretere a metilrii n aceast regiune este corelat cu o reducere sau chiar cu
o absen a expresiei unei gene vecine, n timp ce o reducere a metilrii se traduce
printr-o expresie crescut. Modificrile de structur a cromatinei (n structura sa
intrinsec), cu toate c nu sunt nc bine caracterizate pentru moment, pot influena,
de asemenea, nivelul expresiei genelor apropiate, un nivel ridicat de expresie
neexistnd dect n regiuni decondensate ale cromatinei.

SLIDE 10. Comparaie ntre operonul lac (a) i gena ovalbuminei

Figura:
a) hart genetic a operonului lac de la E. Coli, care reprezint genele care mediaz
metabolismul lactozei i situsurile genetice care controleaz expresia acestora.
Genele Z, Y i A codific pentru beta-galactozidaz, galactozid permeaz,
tiogalactozid transacetilaz.
I = regiunea genelor reglatoare; P = regiunea promotoare i O = regiunea
operatoare
b) Secvena etapelor de producere a ARNm matur n cazul genei ovalbuminei de pui.
Dup transcriere, transcriptului primar i se adaug structura coif i coada poli(A).
n continuare sunt excizai intronii pentru a forma molecula matur de ARNm.
Caracteristicile neateptate ale genelor eucariote au favorizat discuiile privind
subiectul definiiei unei gene ca unitate de informaie ereditar. Mai multe definiii
sunt posibile dar nici una dintre ele nu este total satisfctoare sau adecvat tuturor
genelor. n optica acestui curs am adoptat o definiie molecular. O gen eucariot
este o combinaie de segmente de ADN care, mpreun, formeaz o unitate de
expresie, aceasta conducnd la formarea unuia sau mai multor produi specifici,
ARN, polipeptide. Segmentele unei gene conin: regiunea transcris (unitatea de
transcripie) care conine secvenele codante, secvenele intercalare, secvenele
din regiunea 5 leader i 3 trailer netraduse, care flancheaz aceste secvene
codante i segmentele reglatoare incluse n unitatea de transcripie astfel c
secvenele reglatoare care flancheaz unitatea de transcripie sunt necesare
expresiei sale specifice.
La procariote, iniierea i oprirea transcripiei par s fie primul nivel de control
al expresiei genelor, chiar dac n anumite cazuri pot s intervin alte mecanisme:
atenuarea, terminarea, anti-terminarea, controlul traducerii sau reglarea proporiei de
rennoire a ARN i a proteinelor. De altfel, aceste mecanisme de iniiere (pornire) i
de oprire a transcripiei sunt elemente critice pentru reglarea expresiei genelor
eucariote. Maturarea i particular schema de maturare (excizie-epissage), influeneaz
natura mesagerilor formai i n consecin natura proteinelor produse. Exist, de
asemenea, argumente foarte bune n favoarea reglrii prin atenuare sau terminare a
transcripiei i exist i indicaii c traducerea i rennoirea ARN intervin de asemenea
n reglarea producerii de proteine. n plus, caracteristicile unice ale celulelor eucariote
i structura genelor lor furnizeaz posibiliti particulare de control al fluxului de
informaie genetic. De exemplu, transcriptul unei gene nu este funcional atta timp
ct intronii nu au fost eliminai convenabil. De altfel, chiar i transcripii destinai s
devin ARNm trebuie s fie modificai la extremitatea lor 5 i 3: numai astfel
moleculele de ARNm pot traversa membrana nuclear ctre citoplasm nainte de a fi
tradui. Fiecare dintre aceste evenimente poate constitui un punct de control.

65

SLIDE 11. Genoamele eucariotelor superioare conin mult ADN nefuncional

Figura: Diagramele regiunii de aprox 80 kb de pe cromozomul III al S. cerevisiae i
a clusterului genei globinei umane situat pe cromozomul 11.
a) La cromozomul de drojdie, ADN (csuele albastre) indic fazele deschise de
lectur; nu este clar dac toate aceste secvene care codific potenial pentru
prtoteine sunt gene funcionale.
b) n ADN uman, dreptunghiurile albastre reprezint regiuni transcrise care
codific proteinele tip globin indicate. Fiecare gen tip globin are un aranjament
similar de exoni i introni (care nu sunt evideniai). Clusterul genei Beta-globinei
uman conine dou pseudogene (marcate cu diagonale); aceste regiuni sunt nrudite
cu genele funcionale ale globinelor dar nu sunt transcrise. Sgeile roii indic
localizarea secvenelor Alu (secvene repetitive de aproximativ 300 pb care sunt
relativ abundente n genomul uman). De reinut proporia mare a secvenelor
necodante n raport cu cele codante n structura genomului uman fa de cel al
dojdiilor.
Structura genomului eucariotelor
Cu toate c genele procariote difer puternic de genele procariote, prin
structura lor, organizarea informaiei genetice este foarte diferit n cele dou grupe
de organisme. n genomul bacterian, genele sunt continue (contigue) dea lungul ADN,
adesea chiar secvenele lor se ncalec. Genele care codific pentru enzime care
particip la aceeai cale metabolic, ale cror activiti sunt apropiate, sunt frecvent
asociate ntr-o singur unitate de transcripie. Acest aranjament permite o utilizare
foarte eficace a secvenei ADN. Economia pare s fie mult mai puin important n
cursul evoluiei eucariotelor. n ciuda enormei cantiti de ADN prezent n introni,
genele eucariotelor sunt separate i de secvene necodante foarte lungi. Cum s-a
menionat mai nainte, sunt rare genele multiple ntr-o singur unitate de transcripie.
Repartiia ADN n mai muli cromozomi este un punct fundamental n
organizarea genomului eucariotelor. Cromozomii celulari conin probabil ntotdeauna
ADN bicatenar linear chiar dac de formeaz bucle de ADN duplex care dau natere
unor domenii circulare situate de-a lungul scheletului linear. n timpul interfazei
fiecare cromozom conine o singur dubl elice ADN, ca cele dou cromatide surori
ale unui cromozom n metafaz. Genoamele a numeroase virusuri ale eucariotelor, ca
i cromozomii cloroplastelor i marea majoritate a mitocondriilor, sunt uniti de
ADN circular.
Exist tipuri de ADN eucariot care nu sunt niciodat transcrise
Abundena secvenelor necodante n genoamele organismelor superioare este
ilustrat n figur.
Clusterul genelor beta-globinei este neobinuit de bogat n secvene codante pentru
proteine n comparaie cu alte secvene de la vertebrate.
De ex: n regiunea de 50 kb care conine gena de pui pentru lizozim, totalul exonilor
este de mai puin de 500 pb.
Deoarece pentru majoritatea ADN ne-codant nu au fost nc identificate
funcii, este foarte uor s l considerm ca nefuncional.

66

SLIDE 12. Duplicarea genelor - rezultatul crossing-over-ului inegal

Figura.Duplicarea genelor rezultat n urma unui crossing-over inegal. Fiecare
cromozom parental conine o gen ancestral pentru globin ce prezint 3 exoni si 2
introni.Secvena repetitiv homoloag necodant L1 se gsete ntre genele globinei
3 i 5. Cromozomii parentali sunt dispui relaviv unul fa de cellalt, n aa fel nct
secvenele L1 s fie aliniate. Recombinarea omoloag ntre secvenele L1, dup cum
se poate observa ar trebui s genereze un cromozom recombinant cu cte dou copii
ale genelor globinei i un cromozom cu o deleie n una dintre genele pentru globin.
Mutaii subsecveniale independente la nivelul genelor duplicate pot conduce la
uoare modificri n secven, ce ar putea avea ca rezultatproprieti modificate ale
proteinelor codificate. Un crossing-over inegal poate avea drept rezultat recombinri
rare ntre secvene nenrudite. [See D. H. A. Fitch et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 88:7396.]

SLIDE 13. Exist tipuri de ADN eucariot care nu sunt niciodat

transcrise
Abundena secvenelor necodante n genoamele organismelor superioare este
ilustrat n figur. Clusterul genelor beta-globinei este neobinuit de bogat n secvene
codante pentru proteine n comparaie cu alte secvene de la vertebrate.
De ex: n regiunea de 50 kb care conine gena de pui pentru lizozim, totalul exonilor
este de mai puin de 500 pb.
Deoarece pentru majoritatea ADN ne-codant nu au fost nc identificate
funcii, este foarte uor s l considerm ca nefuncional.
Nu exist un principiu determinant al distribuiei genelor de-a lungul
cromozomilor. Acest lucru a fost sugerat n timpul cartografiei genelor de la
Drosophila melanogaster prin tehnici genetice i citogenetice. Totui, aceste hri nu
in cont dect de o cantitate sczut din ADN total, hrile genetice ale genoamelor de
mamifere fiind nc destul de incomplete. n 1973, erau localizate numai 60 de gene
umane la nivelul autozomilor i n 1981 un numr de 400. n ultimul timp, graie
clonrii segmentelor de ADN, acest numr a crescut la peste 1000 n 1992 i la
secvednierea genomului uman n anul 2000. Totui, crile genetice cele mai
complete nu furnizeaz i nu evideniaz o localizare sistematic a genelor. Gene
nrudite sau gene prezente n mai multe copii pot fi grupate sau dispersate pe mai
muli cromozomi. Astfel, genele care codific pentru actinele cardiace i scheletice se
gsesc, respectiv pe cromozomii 15 i 1. De altfel, cu toate c genele care codific
pentru cinci tipuri diferite de polipeptide de -globine umane sunt grupate pe
cromozomul 11, cele care specific polipeptidele -globinelor sunt grupate pe
cromozomul 16, cu toate c aceste gene sunt nrudite i c cele dou tipuri de
polipeptide sunt necesare la formarea hemoglobinei.
Genele clonate sunt adesea obinute mpreun cu fragmente lungi de ADN
care le flancheaz. Un segment care se ncalec poate fi clonat plecnd de la o banc
genomic i un segment de ADN unic prezent la nivelul ADN flancant este sub-clonat
i folosit drept sond. Prin repetarea acestei operaii se pot obine hri detaliate
pentru regiuni cromozomice lungi. Aceste hri conin informaii structurale i
funcionale. De exemplu: cele 65 kpb care conin cele cinci gene ale -globinei
umane au fost clonate n segmente nclecate i secvena nucleotidic este cunoscut
n ntregime, permind localizarea regiunilor codante, a regiunilor de reglare i a
intronilor.

67

Hrile se restricie ale unei regiuni cromozomice sunt foarte utile pentru detectarea
variaiilor de secven de la o alel la alta, mai ales n cazul alelelor modificate
(alterate). Astfel, folosind ca sond de hibridizare un segment de -globin uman
clonat specific, putem examina la numeroi indivizi, regiunea ADN care codific
pentru -globin, doar efectund o digestie cu endonucleaze de restricie i un
transfer de ADN (Southern blotting). O modificare a mrimii segmentului care se
hibridizeaz cu sonda indic fie o alterare a unui situs de restricie m fie o deleie sau
o inserie ntre dou situsuri de restricie. Absena hibridizrii cu o anumit sond
indic deleia (lipsa) ntregii regiuni studiate. Astfel de modificri sau polimorfism de
restricie, RFLP (Restriction Fragment Lengh Polymorfism), chiar dac sunt lipsite de
consecine fenotipice, furnizeaz markeri genetici, la fel de utili ca i markerii clasici,
pentru analiza genetic a unor familii mari n populaia uman. Aceast tehnic a fost
utilizat pentru studierea transmiterii hemoglobinopatiilor i altor maladii genetice. n
plus, o serie de fragmente polimorfe obinute cu ajutorul endonucleazelor de restricie
pornind de la diferite poriuni de cromozom pot fi utilizate ca markeri pentru o analiz
de legtur genetic, fcnd posibil construcia unei hri genetice chiar i n absena
markerilor fenotipici. Acest tip de analiz a fost utilizat pentru ordonarea mai multor
gene pe braul scurt al cromozomului 11 uman: centromer * catalaz hormon
paratiroidian - -globin - -globin - insulin - pepsinogen.
Una dintre surprizele care au derivat din aceste analize este marea frecven a
diferenelor de secvene nucleotidice ntre indivizi. Prin definiie, analizele mutaiilor
realizate prin genetica clasic utilizeaz modificrile genomice cu evidente consecine
fenotipice. Era normal s considerm c genoamele indivizilor normali (slbatici) s
prezinte puine diferene. aceste mod de abordare simplist a fost adesea accentuat prin
accentul pus pe existena alelelor dominante i recesive, considerndu-se c nu pot
exista dect dou sau cel mult un numr redus de alele pentru un anumit tip de gen.
Totui, polimorfismul lungimii fragmentelor de restricie este foarte frecvent att la
nivelul regiunilor codante ct si necodante, demonstrnd marea diversitate a
genoamelor indivizilor unei specii, fr consecine fenotipice identificabile. Unele
dintre aceste polimorfisme pot avea efecte subtile, dar marea majoritate a acestora se
relev a nu avea consecine detectabile.

SLIDE 14. Experimentele de reasociere evideniaz trei fracii majore

pentru ADN eucariot
Copii ADN unice (singulare) (50-60%) o copie/genom haploid;
- Secvene ADN moderat repetitive/intermediar (< 106 copii/genom haploid)
repetitive (25-40%); sunt incluse elementele de ADN mobile;
- Secvene nalt repetitive (> 106/genom haploid) - secvene simple de ADN
sau ADN satelit (10-15%) (repetiiile n tandem ale secvenelor scurte creaz
adesea adesea o fraciune distinct cu proprieti fizice care permit izolarea sa);
- Secvene inversate sau fold back structures
n concluzie: cantitatea total de ADN de la diferite animale i plante nu
variaz concordant cu complexitatea organismelor. De asemenea cantitatea de ADN
poate varia i ntre specii nrudite.
Secvene repetitive n genom
ADN repetitiv este definit prin rata sa rapid de renaturare. Tpic acesta const
n secvene scurte care sunt repetitive n copii identice sau nrudite n genom.
Componenta care se renatureaz cel mai rapid n genomul eucariotelor este
reprezentat de secvenele nalt repetitive, i const n secvene foarte scurte care se

68

repet de multe ori n tandem sub forma unor clustere mari. Datorit acestor uniti
repetitive scurte, aceste secvene de ADN sunt adesea denumite secvene simple de
ADN. Acest tip de secvene ADN sunt prezente n aproape toate genoamele
eucariote, dar cantitatea lor total este extrem de variabil. n genoamele mamiferelor
acestea reprezint, n mod normal, < 10%m dar (de exemplu) la Drosophila virilis,
cantitatea este de 50%. Pe lng clusterele mari n care au fost descoperite iniial
aceste secvene, exist clustere mao mici separate de secvene de ADN nerepetitive.
Repetiiile n tandem ale secvenelor scurte creaz adesea adesea o fraciune
distinct cu proprieti fizice care permit izolarea sa. n unele cazurim secvena
repetitiv posed o compoziie n baze distinct fa de compozoia normal a
genomului care i permite formarea unei fracii separate i distincte datorit densitii
sale. O fracie de acest tip este numit ADN satelit. Termenul satelit este
sinonimul esenial pentru secvene simple ADN.
Secvenele repetitive n tandem sunt special corelate cu modificarea alinierilor
care apar n urma mperecherii cromozomilor, i astfel mrimea clusterelor n tandem
tinde s fie foarte polimorf, cu variaii largi ntre indivizi. De fapt, cele mai mici
clustere de astfel de secvene pot fi folosite pentru a caracteriza genoame individuale
folosind tehnica fingerprinting.
Comparaii ale regiunilor corespunztoare secvenelor simple de ADN din
interiorul speciilor ne ofer informaii despre mecanismele implicate n manipularea
secvenelor ADN din perioade evolutive diferite. Pentru moment nu putem spune cu
precizie dac aceste secvene au o funcie structural.

SLIDE 15. Variabilitatea n cadrul unei familii de secvene repetitive

Aa cum am discutat secvenele nucleotidice ale membrilor unei anumite
familii de gene pot fi identice sau pot varia prin una sau mai multe perechi de baze. n
ultimul caz se consider c familia este polimorf. Dup cum am constatat n unele
cazuri divergena poate fi considerabil. Termeni de sub-familii i super-familii sunt
adesea desemnai sunt folosii pentru a numi grupuri de membri ai unei familii care
prezint o similitudine mai mare sau mai mic. Divergena dintre membrii unei familii
poate fi estimat prin patru metode a cror sensibilitate este din ce n ce mai mare:
a) compararea hrilor de restricie;
b) compararea capacitii de a forma hibrizi;
c) msurarea termostabilitii hibriziolor duplex formai ntre membrii familiei;
d) compararea secvenelor lor nucleotidice.
Condiii stricte de hibridizare (de obicei o temperatur ridicat de 650C, i
concentaie salin destul de slab, n jur de 0,45 M NaCl) nu permit n general
formarea unui duplex ntre segmentele de ADN care posed mai puin de 85%
complementaritate Prin reducerea temperaturii i creterea concemtraiei saline
(reducerea sensibilitii testului), este posibil hibridarea unor segmente mai puin
nrudite, dar limita inferioar de detectare se situeaz n jur de 70%
complementaritate. Stabilitatea heteroduplexului format este estimat msurnd
transformarea n monocatene n funcie de temperatur. Regula reste ca temperatura
de fuziune Tm (melting) s fie diminuat cu 100C pentru 100 de baze nemperechiate.
Segmentele de ADN bicatenar se numesc omologe dac secvenele lor sunt
identice. Totui, termenul de omolog este adesea folosit pentru a descrie segmentele
de ADN similare dar nu i identice. Frecvent, un calificativ este folosit pentru a indica
gradul de identitate. Dac secvenele sunt cunoscute, este posibil realizarea de
comparaii cantitative. Astfel, dac dou segmente de ADN sunt descrise ca
69

reprezentnd 70% omologie (sau 70% similitudine) nseamn c 70% din bazele lor
(resturi de nucleotide) sunt identice i colineare. Aceast modalitate de exprimare
decurge din conceptul de cromozom omolog, dar se distaneaz de cel folosit clasic n
literatur asupra evoluiei biologice. Aici, omolog semnific, n general, c structuri
morfologice sau de secven ADN provin dintr-un strmo comun, i n acest caz
termenul de procentaj de omologie este lipsit de sens. Deci, folosirea frecvent a
termenului de procentaj de omologie este un pic ambigu n lucrrile de genetic
molecular. Termenul de procentaj de similitudine evit mai bine ambiguitatea cu
toate c este rar ntlnit n litaratur.
Secvene consens
Atunci cnd o familie de secvene repetitive posed numeroi membri, unde
fiecare nu difer de ceilai dect prin cteva poziii n secvena nucleotidic, este
adesea comod s definim un fel de secven medie sau consens sau canonic pentru
membrii familiei. O secven consens conine baza cel mai frecvent ntlnit la fiecare
poziie n ansamblul membrilor familiei i nu este neaprat identic cu secvena
oricruia dintre membri. Exist dou moduri de a obine o secven consens. Adesea
este posibil izolarea unei populaii mari de uniti repetitive, lipsite de secvene nemperechiate i apoi realizarea unei analize de secven a amestecului. Chiar dac
fiecare molecul din populaie difer de celelalte n cteva poziii, se obine adesea o
secven nucleotidic unic deoarece metodele de secvenializare nu detecteaz
concentraiile mici de nucleotide pentru fiecare poziie. ntr-un alt tip de abordare se
realizeaz compararea unui anumit numr de secvene ai membrilor unei familii care
au fost clonate individual, ar baza cea mai frecvent din fiecare poziie este
determinat folosind un anumit soft pe calculator.
Este util s amintim c definiia unei familii de secvene repetitive este
pragmatic. n absena datelor despre secvena real, o familie este n general
considerat ca un ansamblu de secvene care se hibridizeaz ntre ele, sau cu un
membru clonat din familie, aceasta n condiii stricte. n general, aceasta semnific c
secvenele care prezint diferene de 15-20% de o secven consens sunt abia
decelabile, i c secvene mai divergente nu pot fi considerate membri ai familiei.
Printre altele, identificarea prin hibridizare a familiilor de secvene repetitive exclude
sistematic toate familiile ale cror membri sunt prea scuri pentru a se reasocia.
Astfel, membri familiei de secvene 5 ACT(A sau T)nTA care preced genele ARNt
nu pot fi adesea detectate. Adesea, rezultatele secvenializrilor evideniaz c dou
secvene de ADN care nu se hibridizeaz ntre ele se aseamn suficient (30 la 50%)
pentru a fi grupate n cadrul unei familii sau a unei super-familii.

SLIDE 16. Secvenele simple de ADN sunt concentrate specific la

nivelul cromozomilor
Figura: cromozomi umani n metafaz colorai fluorescent i hibridizai in
situ cu o secev ADN monocatenar particular marcat cu un derivat fluorescent
al biotinei. Cnd se ilumineaz cu o lungime de und adecvat, ADN apare rou i n
poziia la care se hibridizeaz secvena monocatenar apare o band galben pe
cromozomul 16, indicnd localizarea secvenei numai intr+un singur loc din genom.
Analiza molecular a relevat c anumite tipuri de secvene de ADN sunt asociate cu
caracteristici morfologice particulare ale cromozomilor. Regiunile numite
organizator nucleolar conin genele pentru ARNr. Regiunile telomerice i
centromerice ale cromozomilor eucariotici conin secvene repetitive (repetate) n
tandem. Aa cum am artat, cu toate c adesea aceste reprezint peste 10% din
genom, funciile lor nu sunt cunoscute. Astfel de secvene ar putea s nu fie
70

importante n funcionarea centromerilor deoarece ele lipsesc la cromozomii de

drojdii (Saccharomyces cerevisiae) unde centromerii funcioneaz normal n cursul
mitozei sau meiozei.
Rearanjamentul secvenelor ADN
Aranjamentul genelor i a marii majoriti a segmentelor ADN n cromozomi
este virtual stabil ceea ce face posibil stabilirea hrilor genetice. Informaia
genetic poate fi redistribuit ntre cromozomii omologi, fie n timpul meiozei fie n
timpul mitozei, prin crossing-over reciproc. Cu toate c aceste evenimente creeaz noi
combinaii de alele, ele nu determin rearanjamente ale secvenelor ADN. De fapt,
numeroase grupuri de gene sunt mult mai vechi dect speciile individuale, i gene
sintenice situate pe acelai cromozom la un anumit mamifer, sunt adesea prezente i
la alte mamifere care nu sunt nrudite din punct de vedere evolutiv. Totui, acestei
stabiliti a organizrii genomului i se suprapune o capacitate de reorganizare a
informaiei genetice. Rearanjarea se poate face la ntmplare, provocnd cel mai
adesea mutaii duntoare, dar anumite rearanjamente sunt procese normale care
influeneaz expresia genelor n mod ordonat i programat.
De mult timp se cunosc aberaii cromozomiale cum sunt rupturile,
translocrile unor poriuni de cromozom pe un cromozom neomolog sau formarea de
cromozomi dicentrici sau acentrici. La nivel molecular, toate aceste modificri
morfologice se manifest prin modificri ale structurii ADN. Toate organismele
posed n programul lor genetic informaia pentru mainria enzimatic (angrenajul
enzimatic) necesar acestor rearanjamente. Acest proces cuprinde:
1) crossing-over omolog nereciproc i nealelic i conversii genetice;
2) transpoziii de segmente de ADN de la un locus la altul;
3) formarea de copii suplimentare de secvene de ADN fie n tandem fie
dispersate, proces numit amplificare;
4) deleia de secvene de ADN;
5) recombinrii neomoloage. Recunoaterea instabilitii organizrii genomice
este una din cele mai mari descoperiri ale geneticii moleculare i este n mod
particular remarcabil deoarece rearanjamentele sunt evenimente rare. Aceasta
deoarece pentru cea mai mare parte consecina combinrii preciziei geneticii
moleculare cu modalitile foarte selective ale analizei genetice clasice.
Rearanjamentele genomice aleatoare
Rearanjamentele neprogramate sunt, de obicei, rezultatul hazardului att n
ceea ce privete momentul n care se produc ct i secvenele implicate. Astfel de
rearanjamente produc adesea mutaii nefaste. Totui, ele pot furniza sau au putut
furniza, n trecut ocazia unor rspunsuri noi mediului i au putut astfel facilita
modificrile evolutive. Evident, pentru ca aceste rearanjamente aleatorii s influeneze
evoluia, ele trebuie s aib loc n celulele germinale sau n precursorii acestora;
aceleai evenimente dac au loc n celule somatice rmn fr consecine pentru
organismul individual. Totui, dac celula somatic este o celul su (celul stem)
rearanjamentele aleatoare pot mpiedica formarea unei descendene funcionale i
difereniate sau modificarea poate fi oncogen i poate conduce la formarea unei
tumori.
Printre tipurile cunoscute de rearanjamente genomice aleatoare, unul particular
a atras atenia cercettorilor i anume transpoziia segmentelor de ADN de la un situs
la altul. Genele mobile au fost vedete chiar i pentru literatura tiinific de
popularizare. Existena elementelor ADN mobile a pornit de la studiile genetice i
citogenetice asupra porumbului care au demarat pentru prima dat n anii 40.
Douzeci de ani mai trziu, geneticieni care se ocupau de bacterii au obinut rezultate

71

experimentale care au condus la aceleai concluzii: anumite segmente de ADN se pot

deplasa. n cele din urm, a fost stabilit c mai multe tipuri de elemente mobile exist
n genomul celulelor eucariote. Clonarea molecular a fcut posibil determinarea
structurilor multora dintre aceste elemente i a permis elucidarea mecanismelor prin
care se realizeaz schimbarea poziiei n genom. Elementele mobile sunt factori de
modificare genetic i sunt responsabile de diferite mutaii la eucariote ct i la
procariote. Cnd acestea se inser n secvena codant a unei gene, funcia acesteia se
pierde. Cnd elementul se inser n vecintatea unei gene expresia acesteia poate fi
influenat complex. De fapt, multe dintre mutaiile care s-au dovedit utile, la
nceputul secolului, pentru studiul D. melanogaster sunt la ora actual cunoscute ca
fiind rezultatul inserrii unor elemente mobile n gene.
Rearanjamente programate
Acum este evident c expresia genelor poate fi modificat profund prin
modificarea mediului lor genomic. O gen poate fi silenioas cnd se afl n
vecintatea unui anumit tip de secven i poate fi exprimat cnd secvena de ADN
care o flancheaz se modific. Astfel de rearanjamente sunt utile pentru o mare
varietate de organisme pentru reglarea expresiei genelor i stabilirea astfel a unor
funciuni specifice n celulele difereniate. De exemplu, exist programe genetice care
provoac rearanjarea anumitor segmente ADN n momente oportune sau n tipuri
specifice de celule.
Mult timp nainte de a putea analiza genele i genoamele la nivel molecular,
geneticienii presupuneau c anumite fenomene biologice neateptate pot fi explicate
prin rearanjamente specifice. Unul dintre acestea era alternana a dou tipuri de flageli
diferii la nivelul celulelor de Salmonella thyphimurium. Un alt caz, cu implicaii mult
mai profunde, era extraordinara diversitate a anticorpilor pe care i pot produce
mamiferele. Analiza molecular a demonstrat n prezent c cele dou fenomene, ca i
multe altele, sunt rezultatul rearanjamentelor programate ale secvenelor ADN
(exemplul imunoglobulinelor). n aceste dou exemple, reorganizarea genomului este
folosit pentru a proteja organismul. Prin schimbarea flagelilor, Salmonella scap de
aprarea imunologic a organismului gazd. Prin crearea de noi anticorpi organismul
se apr mai bine de agenii externi.
Implicaii evolutive
Istoria evoluiei organismelor este nscris n genomul lor. Mutaiile i
rearanjamentele furnizeaz variaiile genetice de care depinde procesul evolutiv. n
trecut, relaiile evolutive nu puteau fi studiate dect prin raportare la consecinele
asupra informaiei genetice oglindite n fenotipurile organismelor. Astfel, informaia
biologic era furnizat de studiul anatomic al fosilelor i de anatomia, fiziologia i
embriologia comparat a speciilor contemporane. La mijlocul acestui secol, chimia
comparativ a proteinelor a introdus o alt msur fenotipic a relaiilor filogenetice.
Descoperirea c structura anumitor proteine este conservat la un larg spectru de
organisme a asamblat mai multe ramuri (philum) n ci de evoluie comune ntr-un
mod n care studiul fosilelor nu l putea face. De exemplu, citocromul C, este prezent
n mitocondriile tuturor plantelor i animalelor. El este indispensabil respiraiei i
trebuie s fie printre primele molecule proteice eseniale. n cursul evoluiei,
citocromul C s-a modificat foarte puin; numai 35 din cei 104 aminoacizi ai
citocromului C s-au modificat de la drojdii la mamifere (fr a ine cont de
aminoacizii terminali suplimentari care exist n proteina de la drojdii).
Citocromul C i alte proteine foarte conservate nu sunt utile n analiza
genetic a relaiilor filogenetice ntre specii foarte nrudite deoarece n acest caz nu
exist prea multe variaii: este cazul citocromului C de la om i de la cimpanzeu. Dar
72

alte proteine evolueaz mult mai rapid. Un exemplu este anhidraza carbonic:
diferenele din structura sa la nivelul primatelor sunt suficiente pentru a putea stabili
un arbore filogenetic. Aceast metod se bazeaz pe observaia c numrul
aminoacizilor diferii este groso-modo proporional cu timpul scurs ntre divergena
de strmoul comun, aa cum o demonstreaz i datele obinute prin analiza fosilelor.
n fine, toate metodele de analiz a procesului evolutiv care se bazeaz pe
expresia fenotipic sunt indirecte deoarece responsabile de apariia unor noi fenotipuri
sunt modificrile pe care le sufer genele i genoamele. Chiar dac studiul formelor
strvechi se va continua prin studiul fosilelor, compararea structurilor ADN va suplini
rapid celelalte metode n studiul relaiilor existente ntre speciile contemporane.
Astfel, tehnica ADN recombinat a avut deja un impact major asupra biologiei
evoluiei i cu siguran influena sa n acest domeniu va fi enorm n viitor.
Genatica molecular comparativ
Chiar nainte de a avea posibilitatea de a clona i secvenializa, importana
comparrii diferitelor secvene de ADN n studiul evoluiei era evident, diferite
metode de msurare a gradului de nrudire dintre genoame fiind dezvoltate pe parcurs
(n timp). Aceste tehnici includeau compararea stabilitii dublului helix ADN format
din monocatene de origini diferite (heteroduplex) sau a catenelor cu aceeai origine
(homoduplex). Cu toate c erau utile, studiile de acest tip nu ddeau dect valori
medii pentru divergena dintre dou tipuri de ADN. Alelele nu pot rivaliza cu bogia
detaliilor obinute prin anatomie comparat sau biochimia proteinelor. n aceste
condiii comparaiile directe ale secvenelor nucleotidice ADN furnizeaz detalii
importante i clarific aspectele care nainte nu puteau fi abordate evolutiv. Astzi,
este mult mai uor tehnic s se realizeze clonarea i secvenializarea unui grup
omolog de gene dect s se izoleze i s se determine secvena n aminoacizi a
produilor peptidici ai acestora.
n ceea ce privete regiunile codante, secvena ADN furnizeaz mai multe
informaii dect secvena peptidic deoarece degenerescena codului genetic permite o
modificare a structurii genei fr modificarea secvenei n aminoacizi
corespunztoare. De altfel, faptul c putem ti c un aminoacid s-a schimbat nu indic
neaprat numrul de modificri care au intervenit la nivelul perechilor de baze; nu
este permis dect o estimare a numrului minim de modificri necesare nlocuirii
unui aminoacid de ctre altul. Astfel, nlocuirea unei alanine cu o valin n poziia 11
a citocromului C poate fi rezultatul modificrii uneia (GCU GUU) sau a dou (GCU
GUA) perechi de baze.
Un avantaj unic al secvenelor ADN este c se poate realiza compararea
secvenelor necodante, implicit a secvenelor reglatoare. Acest lucru poate avea o
importan foarte mare pentru faptul, deja recunoscut, c evoluia proteinelor i
evoluia morfologic se realizeaz cu viteze diferite n grupe diferite de organisme.
Modificri fenotipice importante pot reprezenta nu numai rezultatul structurii
proteinelor dar i, de exemplu, a abundenei relative a proteinelor individuale n
momentul expresiei genelor. Compararea secvenelor ADN poate elucida rolul
reglrii unei gene n evoluia speciilor prin analiza elementelor situate n vecintatea
secvenelor genice luate n studiu. Aceste modificri pot, n anumite cazuri, implica
numai modificarea unei singure perechi de baze dar pot exista i rearanjamente
genomice importante cum ar fi transpoziiile de elemente mobile.
Secvenele de ARNr, i particular cele de ARN 16 i 18S care intr n
constituia subunitilor mici ale ribozomilor, sunt foarte utile pentru determinarea
relaiilor filogenetice. Cum ribozomii sunt abundeni la toate speciile, molecule de
ARN funcional pot fi izolate i secvenializate direct dup trecerea lor n ADNc. Cu

73

toate c funcia subunitii mici este aceeai la toate organismele vii, regiunile
moleculei posed grade variabile de conservare. Regiunile cele mai conservate pot fi
utilizate pentru a compara organismele cu grade de nrudire slabe (ndeprtate
evolutiv) i segmentele care evolueaz mai rapid n compararea organismelor cu grad
de nrudire mai mare. Astfel, toate speciile pot fi comparate folosind un singur tip de
molecul a crei funcie a fost foarte bine conservat. Astfel, au fost analizate specii
virtual reprezentative pentru toate clasele taxonomice putnd fi analizate relaiile
filogenetice detaliate i realizndu-se clarificarea unor momente ale procesului
evolutiv.
Istoria evoluiei genelor
Pn n prezent, evoluia a fost analizat din punct de vedere al relaiilor cu
istoria diferitelor specii. Dar o alt istorie biologic este nscris n structura ADN, n
cunoaterea originii genelor. Dou sau mai multe gene (sau secvene de ADN)
nrudite n aceeai specie deriv adesea dintr-o singur secven ancestral. Dac
segmentul ADN ancestral a fost amplificat (ca urmare a unor evenimente aleatoare), o
singur copie poate fi suficient pentru realizarea funciei originale. Mutaiile ce pot
s apar n copiile suplimentare i care sunt libere de constrngerea ce determin
limitarea acumulrii mutaiilor n gena funcional pot conduce la noi capaciti
funcionale, care la rndul lor, pot fi pstrate de ctre selecie. Copiile suplimentare
pot de asemenea achiziiona semnale de reglare noi sau modificate care le pot permite
s se exprime n momente diferite ale evoluiei sau n esuturi particular difereniate.
O alt posibilitate este ca copiile suplimentare s fie inactivate prin mutaie i s fie
meninute sub form de pseudogene. Familia genelor globinei conine exemple pentru
toate cele trei posibiliti.
Anumite gene par s se fi format prin asocierea copiilor de secvene codante
(cazul exonilor). n anumite cazuri aceasta implic amplificare n tandem a unui
singur exon, structura repetitiv a genei regsindu-se n multiplele repetiii ale
segmentelor peptidice nrudite n protein. n alte cazuri, genele par s fie o
construcie n mozaic format din exonii prelevai din diferite. Astfel, exonii avnd un
strmo comun pot s apar n mai multe gene care nu par a avea un grad de nrudire.
Exonii existeni n mai multe proteine codific probabil pentru domenii care dau
acestor proteine diferite proprieti structurale sau funcionale nrudite, cum ar fi o
structur secundar particular sau capacitatea de a fixa un anumit ligand (ex., ATP).
O ipotez interesant privind asamblarea genelor prin repetiia sau amestecul
exonilor propune existena anumitor recombinri la nivelul intronilor care servesc la
asocierea exonilor, lsnd intacte regiunile codante. Aceast manier de a vedea
lucrurile implic acceptarea faptului c intronii sunt structuri strvechi, prezente nc
n primele gene i celule i care au fost pierdute n cursul evoluiei procariotelor. O
alt ipotez total diferit consider c intronii reprezint inserii la nivelul regiunilor
codante preexistente printr-un mecanism mai frecvent la eucariote dect la procariote.
Ideea c intronii sunt strvechi rezolv multe probleme inerente privind explicarea
modelului de inserie, i printre altele problema mutaiilor care pot interveni n cazul
inserrii generalizate i la ntmplare a segmentelor necodante i a necesitii de a
elabora simultan un mecanism de excizie. Din contr, dac intronii erau prezeni n
primele genoame, excizia i episajul trebuia s fie procese strvechi. Descoperirea c
anumii introni provoac propria lor eliminare fr ajutorul proteinelor a crescut
ansele ipotezei existenei anumitor introni din timpuri foarte strvechi. Totui,
deplasarea intronilor de pe un segment de ADN pe altul a fost bine caracterizat n
multiple cazuri. exemplele cunoscute, care se refer la intronii genelor mitocondriale
de la drojdii i genelor pentru ARNr de la Mixobacterii, formeaz o clas aparte de

74

introni (grupul I). Inseria pare s fie rezultatul unei conservri genetice specifice unui
anumit situs. Intronii putea s apar n diferite moduri.
Compararea structurilor proteice a furnizat suficiente date pentru a permite
formularea de diverse ipoteze privind rolul procesului de amplificare n evoluia
genomului. Totui, de cnd exist posibilitatea clonrii genelor, aceste ipoteze au fost
puternic extinse i mbogite. Unul dintre punctele importante, demonstrate prin
analiz molecular, este c procesul de amplificare, de divergen, de repetiie i de
amestec de exoni nu sunt rare i nu constituie numai contribuii ocazionale n evoluia
genomului. Istoria unei pri importante a ADN de la eucariote, secvenele codante
sau necodante contopite reflect un astfel de proces. Varietatea rearanjamentelor
observate n genoamele contemporane reflect procese strvechi care au fost, i
probabil sunt nc, motoarele eseniale ale modificrilor aprute n cursul evoluiei.
Originea sistemelor genetice
ntrebarea care se pune este dac vechimea intronilor poate furniza informaii
despre primele sisteme genetice i dac poate rspunde ntrebrii privind natura
primelor molecule purttoare de informaie: ADN sau ARN. Exist o serie de
argumente n favoarea ipotezei c ARN a aprut primul i c a furnizat bazele
primelor sisteme de codificare. De exemplu, moleculele de ARNr, ARNt i ARNm
reprezint elemente centrale n sistemul de translaie, n aparatul de traducere al
ntregului organism i de interpretare a codului genetic. Aceasta sugereaz c aceste
molecule au precedat divergena dintre procariote i eucariote i c trebuie s fi fost
prezente n primele sisteme genetice. n plus, molecule mici de ADN pot fi sintetizate
de pe o matrice ARN, ntr-o manier pur chimic, n absena oricrei proteine. Deci,
este posibil ca moleculele de ARN s fi avut capaciti autoreplicative i s fi putut fi
transcrise i traduse dup mecanisme primitive. Moleculele de ARN pot de asemenea
reaciona ca enzime pentru a modifica alte molecule de ARN. Fracia ARN a RN-azei
din E. coli catalizeaz clivarea specific a unui situs la nivelul precursorilor ARNr.
Aa cum s-a menionat deja, intronii precursorilor ARNr de la anumite protozoare i
drojdii pot fi clivai fr intervenia proteinelor. Din contr, moleculele de ADN nu
sunt capabile de astfel de reacii.
Deci, strmoul sistemelor genetice contemporane se poate s fi utilizat
molecule ARN informaionale. n aceste molecule de ARN, scurte regiuni codante
formate la ntmplare (exonii primitivi) puteau alterna cu regiuni necodante (intronii
primitivi). La un moment dat au aprut polipeptide mici care facilitau maturarea ARN
i replicarea acestuia. Una dintre aceste ar fi putut avea activitate de transcriptaz
invers, cataliznd formarea de molecule de ADN care au putut deveni, mai trziu,
formele de stocarea informaiei genetice celulare. Aceste molecule de ADN au putut
conserva alternana exon-intron existent n ARN. Sistemul genetic care conine ADN
a devenit astfel strmoul organismelor celulare. O evoluie divergent ar fi putut da
natere liniilor de eucariote i de procariote n care reinerea sau pierderea intronilor
au fost respectiv favorizate. Dup acest model, mu este surprinztor s gsim
ocazional un intron prezent ntr-un genom procariot. De fapt, n genomul
bacteriofagului T4 al E. coli exist introni, la fel ca i n genele ARNt de la
archeobacterii (n ultimul timp au fost descoperii i ali introni la procariote i
archeobacterii).
Unul dintre aspectele cele mai tulburtoare ale modelului este originea
independent, plecnd de la celule ancestrale, a procariotelor i eucariotelor. Anterior,
cea mai mare parte a speculaiilor referitor la debuturile evoluiei presupuneau c
eucariotele deriv din procariote. Aceast ipotez se baza pe ideea c celulele
procariote contemporane, relativ simple, se aseamn cu celulele primitive n timp ce

75

celulele eucariote, rezultate din procariote mai simple, au devenit n cursul evoluiei
mai mari i mai complexe. Descoperirea intronilor, a maturrii (splicing) fenomenelor
de transcripie celular inverse i a proprietilor catalitice ale ARN au forat
cercettorii s reevalueze vechile concepte. Cu siguran capacitatea noastr de a
analiza aspectele moleculare ale sistemelor biologice informaionale ne va ajuta din ce
n ce mai mult s rspundem ntrebrilor eseniale pe care le ridic biologia evoluiei.

SLIDE 17. Generarea diferenelor de lungime a unei secvene ADN

simple prin crossing-over inegal n timpul meiozei
Exemplu de crossing-over inegal n interiorul unei secvene de ADN care
conine 6 copii ADN (16) dintr-o anumit secven repetitiv simpl conduce la
apariia de celule germinale cu 8 i 4 uniti repetitive aranjate n tandem

SLIDE 18. Tehnica fingerprinting se bazeaz pe diferena de lungime

a secvenelor simple de ADN
Figura: Secvene consens ale unitii repetitive a minisateliilor umani numii
33.1 i 33.5 bazate pe analiza a mai mult de zece seturi de uniti repetitive pentru
fiecare caz. Literele roii indic poziiile la nivelul crora au fost identificate
diferene. Punctele roii indic deleii. Unitatea de 62 pb a 33.1 este mult mai
conservat dect unitatea de 17 pb a minisatelitului 33.5
Minisateliii sunt folositori n cartarea genetic
Secvenele care se aseamn sateliilor prin faptul c sunt constituite din
repetiii n tandem ale unei uniti scurte, dar mult mai scurte, constnd n (de
exemplu) 5-50 repetiii, sunt comune genoamelor de la mamifere. Acestea au fost
descoperite din ntmplare ca fragmente a cror mrime este extrem de variabil n
bncile genomice de ADN genomic uman. Variabilitatea se poate constat (vedea)
cnd o populaie conine fragmente de mrimi diferite care reprezint aceeai regiune
genomic; cnd indivizii sunt examinai, se evideniaz existena unui polimorfism
extins i faptul c pot fi gsite alele diferite.
Aceste secvene sunt numite minisatelii sau regiuni VNTR (variable number
of tandem repeats). Cauza variaiilor este aceea c alelele individuale au numere
diferite de uniti repetitive. De exemplu, un astfel de minisatelit are o lungime
repetitiv de 64 pb, i se gsete n populaie avnd urmtoarea distribuie:
7%
18 repetiii
11% 16 repetiii
43% 14 repetiii
36% 13 repetiii
4%
10 repetiii
Cauza acestei variaii este recombinarea genetic ntre unitile repetitive
necomplementare (misaligned), n acelai mod n care am discutat deja pentru ADN
satelit. Rata de modificare genetic a secvenelor minisatelit este mare, 10-4 per kb
de ADN. (Frecvena modificrilor per locus actual se consider a fi proporional cu
lungimea unui minisatelit). Aceast rat este de 10x mai mare dect rata
recombinrii omologe n meioz, care este caracteristic oricrei secvene ADN
aleatoare. Deci sateliii pot fi considerai puncte fierbini pentru recombinarea
meiotic.
Adesea prezena unui minisatelit este corelat cu o rat crescut (ridicat) de
modificare (schimb) n vecintate, dar n umele cazuri evenimente de recombinare
apar ntre cromatide surori (n astfel de cazuri se modific lungimea minisatelitului
76

dar nu sunt afectai markerii care l flancheaz pe acesta, deoarece sunt identici pentru
ambele molecule recombinate de ADN).
Variabilitatea crescut a minisateliilor i face pe acetia extrem de utili pentru
cartarea genomic, deoarece exist o mare probabilitate ca indivizii s prezinte
variaii ale alelelor prezente la nivelul unor astfel de locusuri. Un exemplu de cartare
cu ajutorul minisateliilor este ilustrat. SE prezint un caz extrem n care doi indivizi,
ambii heterozigoi pentru un locus minisatelit, i de fapt pentru toate cele patru alele
sunt diferii. n mod normal, toi descendenii vor moteni o alel de la fiecare printe
fiind astfel posibil fr ambiguitate determinarea sursei fiecrei alele ale progeniturii.
n terminologia geneticii umane, meiozele descrise n aceast figur sunt foarte
informative, datorit variaiei dintre alele.
O familie de minisatelii a fost determinat n genomul uman ca prezentnd o
secven core comun. Secvena core este o secven bogat ntr-o secven de 1015 pb bogat n G-C, cu o asimetrie a distribuiei prinelor/pirimidinelor pe cele dou
catene. Fiecare minisatelit individual conine o variant a secvenei core, dar 1000
minisatelii pot fi detectai pe Southern blot cu ajutorul unei sonde care const n
secvena core.
S considerm c situaia prezentat n figur trebuie multiplicat cu 1000x.
Efectul variaiei la nivelul locilor individuali este de a crea un profil unic pentru
fiecare individ. Aceasta face posibil desemnarea fr ambiguitate a ereditii dintre
prini i progenitur, artnd c 50% dintre benzile oricrui individ sunt derivate de
la un anumit printe. Acestea stau la baza tehnicii numite ADN fingerprinting
Sumar
ADN satelit const din secvene foarte scurte repetate de mai multe ori n
tandem. Proprietile distincte manifestate la centrifugare reflect compoziia n baze.
ADN satelit este concentrat n heterocromatin, dar funcia sa este necunoscut.
Unitile repetitive individuale din sateliii artropodelor sunt identice. Cele ale
sateliilor de la mamifere sunt corelate, i pot fi organizate ntr-o anumit ierarhie care
reflect evoluia satelitului prin amplificarea i divergena secvenelor alese la
ntmplare. Crossing-overul inegal pare s fie un determinant major n organizarea
ADN satelit. Fixarea crossing-over explic capacitatea variaiilor de a se ntinde ntrun cluster. Minisateliii au proprieti similare sateliilor, dar sunt mult mai mici; ei
sunt foarte utili pentru cartarea genomic.

SLIDE 19. Imagini fingerprint ADN uman

Sondele de minisatelii ADN pot fi folosite pentru evidenierea fragmentelor
unice de restricie (DNA fingerprints) care pot identifica indivizi diferii. Probe ADN
de la 3 indivizi (1, 2 si 3) au fost supuse analizei Southern blot folosind enzima de
restricie Hinf1 i trei minisatelii marcai diferit ca sonde (liniile a, b si c). ADN de la
fiecare individ produce un profil de benzi unice pentru fiecare individ. Condiiile de
electroforez pot fi ajustate astfel nct pentru fiecare persoan s se evidenieze cel
puin 50 de benzi cu aceast enzim de restricie. Lipsa de identitate ntre cele 3 probe
poate fi uor difereniat. [From A. J. Jeffreys et al., 1985, Nature 316:76; courtesy of
A. J. Jeffreys.]

SLIDE 20. Mari familii de repetiii dispersate n genomul mamiferelor

Analiza clasic a profilelor de dispersie demonstreaz c genomul uman i
genoamelor altor de mamifere posed profile de dispersie apropiate. Aceste concluzii
sunt confirmate de detaliile moleculare furnizate prin analiz de restricie i prin

77

clonare i secvenializare. Cu toate c exist diferite familii i sub-familii de repetiii

dispersate, un numr mic dintre acestea prezint un numr foarte mare de copii i
domin genoamele. O familie dominant poate reprezenta mai mult de 5% din ADN
total, iar totalitatea familiilor pot reprezenta 20% din acesta. Anumite familii sunt
constituite din secvene de 100 la 500 pb i sunt denumite secvene SINEs (Short
Interspersed Repeats). Altele, ale cror membri pot avea 6 kpb i mai mult, sunt
denumite LINES (Long Interspersed Repeats). Alte organisme cum sunt miomicetele,
lcustele, echinodermele, petii i amfibienii conin repetiii dispersate care se
aseamn cu SINEs de la mamifere. La plante i la nevertebrate exist secvene
comparabile cu LINEs de la mamifere.
SINEs
Secvenele scurte, foarte repetitive i dispersate de la mamifere au fost nc de
la nceput adunate sub denumirea SINEs pur i simplu pe baza lungimii i abundenei
lor. O proprietate comun mai semnificativ a fost descoperit recent. SINEs par s
fie pseudogene mature derivate din genele din clasa III care codific pentru mici
molecule de ARN citoplasmatic, printre care i moleculele de ARNt i cele pentru
ARN 7SL. Deci, SINEs sunt omologe cu secvenele acestor ARN (sau ale genelor
lor). SINEs sunt adesea flancate de repetiii directe care sunt duplicate ale secvenelor
int inserate i posed secvene 3 terminale bogate n A.
Fiecare specie (sau fiecare ordin) posed un joc caracteristic de familii de
secvene SINEs. Pentru a ilustra complexitatea i diversitatea acestor secvene vom da
cteva exemple. Una dintre familiile SINEs cele mai bine studiate este familia ALU
de la primatele lumii vechi, denumit aa datorit prezenei n aceast secven a unui
situs de restricie Alu I. Unitile Alu se gsesc n regiuni care flancheaz genele, n
introni, n ADN satelit i grupate cu alte secvene repetitive dispersate. Pentru o
anumit specie determinat, secvenele Alu diverg una de alta cu aproximativ 15% :
Cnd primatele lumii vechi sunt comparate ntre ele, secvenele membrilor familiei
Alu variaz la fel ca n interiorul unei singure specii.
Secvenele Alu tipice primatelor sunt dimere, compuse din dou secvene de
aproximativ 130 pb. Cei doi monomeri repetitivi nu sunt identici iar diferena cea mai
marcant este prezena unui segment suplimentar de 31 pb n cea de a doua unitate.
Fiecare monomer se termin, n poziia 3 a catenei superioare, cu o serie de resturi A
de lungime variabil. Monomerii Alu conin secvene omologe cu regiuni 5 i 3 ale
moleculelor ARN 7SL; cele 155 pb centrale ale ARN 7SL sunt absente n secvenele
Alu.
Primele secvene din familia Alu au fost izolate i clonate plecnd de la ADN
uman. A fost stabilit o secven consens. Membrii clonai din familia Alu au fost
apoi folosii ca sonde pentru a determina numrul de copii folosind metoda de analiz
a cineticii de reasociere. Rezultatele indic prezena a aproximativ 9 x 105 copii par
genom haploid (aproximativ 9% din totalul ADN de la om). n medie, o secven Alu
este prezent la fiecare 5 kpb n genomul uman i n cel al altor primate ale Lumii
vechi. Mai mult de 90% dintre fagii prezeni ntr-o banc genomic uman tipic se
hibridizeaz cu o sond Alu, i cea mai mare parte a segmentelor de 15 -20 pb clonate
conin mai mult de un membru al acestei familii. Secvenele Alu vecine pot avea
orientri opuse. Acestea pot fi incluse n fracia de ADN genomic pliat. De exemplu,
cinci din opt secvene Alu prezente ntr-un fragment de 65 kpb de ADN uman care
conine familia multigenic a -globinei sunt orientate n direcia sens i trei n
direcia antisens.
Dac considerm c nu exist dect trei gene funcionale care codific pentru
ARN 7SL n ADN uman, caracterul ubicuitar al secvenelor Alu este remarcabil. n

78

plus, apariia acestor secvene Alu la primate trebuie s se fi produs dup divergena
major a ordinelor mamiferelor n cursul evoluiei. Aceast afirmaie este susinut i
de faptul c familia SINE la roztoare care este omolog cu genele pentru ARN 7SL,
este net diferit de familiile Alu de la primate. Cele 105 copii ale familiei de tip I de la
rztoare au aproximativ 130 pb, adic sunt echivalentul unuia dintre cei doi
monomeri repetitivi direci tipici familiei Alu de la primate. Alte secvene SINES de
la roztoare, cum sunt familiile de tip II i ID sunt omologe cu diferite gene pentru
ARNt.
Omologia dintre membrii familiei SINE i genele din clasa III cu care acestea
sunt nrudite includ elemente promotoare interne, cum sunt cutiile A i B, unitile
SINEs coninute n segmente de ADN clonate fiind adesea transcrise in vitro de ctre
ARN polimeraza III. Transcripia ncepe foarte precis la extremitatea 5 a unitii i se
termin la nivelul primului grup care conine patru resturi A sau mai multe de pe
catena considerat matrice. Totui, n ciuda faptului c unitile SINE pot fi transcrise
efectiv in vitro, cea mai mare parte dintre ele nu sunt matrie active pentru ARN
polimeraz III in vivo. Modelele cele mai interesante care au fost propuse pentru a
explica modul de amplificare a secvenelor SINEs i inserarea lor n ADN fac apel la
intervenia unui proces de transcripie invers realizat de ctre ARN polimeraza III.
Secvenele SINE sunt transcrise i de ctre ARN polimeraza II. Este cazul
SINE prezente n introni, la nivelul secvenei 5 leader sau a cozii 3 a unei uniti
de transcripie din clasa II ne-nrudit. Din aceast cauz, moleculele de ARNhn
conin numeroi transcripi ai secvenelor SINE repartizai printre alte secvene. n
urma maturrii unui transcript primar n ARNm, secvena SINE este n general
eliminat astfel nct ARN citoplasmatic conine de dou ori mai puine secvene
SINE dect ARN nuclear.
LINEs
Pe lng multiplele familii SINEs, genoamele mamiferelor posed toate o
abundent familie LINEs, familia LINE-1, ale crei membri pot avea 6 la 7 kpb. Alte
familii LINE exist n unele dintre aceste genoame dar ele nu sunt la fel de frecvente.
Familiile LINE-1 de la diferite mamifere sunt toate nrudite dar divergente: cu ct
speciile sunt mai nrudite cu att familiile sunt mai similare. Mai muli membri ai
familiei LINE-1au mai puin de 6 la 7 kpb. Astfel de segmente trunchiate sunt n
general deposedate de secvenele situate la extremitatea 5. Adesea, secvena intern
lipsete (secvenele reprezint o deleie n raport cu membrii mai lungi ai familiei). n
plus, toi membri familiei nu sunt colineari. La unii dintre acetia, exist regiuni
inversate sau rearanjate unele n raport cu altele. Exist mult mai muli membri
trunchiai dect membri cu lungime normal n genoamele de oarece i de la primate.
n consecin, numrul de copii par genom ale sub-regiunilor secvenelor lungi LINE1 variaz, i crete de la extremitatea stng la extremitatea dreapt. De exemplu, la
om exist aproximativ 3,5 x 103 copii de secvene la extremitatea stng i
aproximativ 105 copii de secvene la extremitatea dreapt.
Secvenele LINE-1 sunt prezente n regiunile flancante ale genelor, n introni
i inserate n repetiiile ADN satelit. Analiza membrilor familiei LINE-1 pe segmente
genomice clonate, ca i hibridizarea in situ a sondelor LINE-1 cu cromozomi ntregi,
demonstreaz c secvenele LINE sunt dispersate n numeroase situsuri cromozomice.
Nu se tie dac dispersia este aleatoare sau nu. Anumite situsuri pot conine grupe de
LINE-1. De exemplu, exist un numr surprinztor de membri ai familiei ntr-un
segment de 65 kpb de ADN uman care conine genele -globinei.

79

Asemeni secvenelor SINE, unitile LINE-1 sunt adesea nconjurate de

repetiii directe scurte care par s fie duplicri ale situsurilor int, i ele posed un
segment 3 terminal bogat n A. Totui, contrar SINE, unitile LINE-1 nu par s fie
versiuni pseudo-genice ale unor gene ordinare. Unele din unitile cele mai lungi ale
LINE-1 pot fi mai degrab elemente mobile care au fost amplificate i transpozate
ntr-un situs nou n genom printr-un mecanism care implic transcripia ntr-un ARN
intermediar, apoi transcripia invers n ADN. Transcriptaza invers poate fi
codificat de o regiune de aproximativ 4 kpb a unitii LINE-1, o poriune care este
relativ bine conservat printre speciile de mamifere i care conine un cadru de lectur
lung la nivelul celor dou catene. Unitile LINE-1 trunchiate i rearanjate ar putea
proveni din transcripi sau din transcripi inveri aberani sau incomplei, sau n urma
unor evenimente aleatoare de recombinare care nsoesc inserarea.
Secvenele familiei LINE-1 sunt transcrise n momentul n care ARN
polimeraza II citete regiunea ne-codant a unei gene, n care un membru al familiei
este inserat. n consecin, molecule omologe de ARN cu fiecare caten a secvenelor
LINE-1 sunt relativ abundente n ARNhn. Nu au fost detectai transcripi n ARN
citoplasmatic poliadenilat dect n linii celulare de teratocarcinom uman sau de
limfocite de oarece care conin transcripi complei ai catenei purttoare de faz
deschis de lectur. Nu a fost identificat nici o protein codificat de acest ARN.

SLIDE 21. Densitatea de flotaie a ADN de la D. Virilis. Secvenele

nalt repetitice sunt adesea poziionate la nivelul centromerilor. Este
exemplu comportamentului sateliilor de la D. Virilus (centrifugare in
gradient de CsCl). Densitatea de flotaie crete odat cu creterea
coninutului n G+C.
Secvenele de ADN satelit sunt adesea corelate n heterocromatin
Densitatea de flotaie a duplexului ADN depinde de coninutul su n G-C n
concordan cu formula empiric:
D = 1, 660 + 0,00098 (%G-C) g/cm3
Densitatea de flotaie este determinat n mod normal prin centrifugare n
gradient de densitate de CsCl. ADN formeaz o band n poziia corespunztoare
propriei sale densitii. Fraciile de ADN care difer printr-un coninut de G-C mai
mare de 5% pot fi separate normal n gradient de densitate.
Cnd ADN eucariotic este centrifugat n gradient de densitate, pot fi distinse
dou tipuri de material:
n majoritatea ADN genomic formeaz o band de fragmente continue care ca un pic
destul de larg centrat la nivelul densitii corespunztoare coninutului n G-C al
genomului. Aceata formeaz banda principal.
n adesea se poate observa un pic mai mic (sau picuri) la o valoare diferit a
densitii. Acest material este denumit ADN satelit.
Sateliii sunt prezeni n multe genoame eucariote. Acetia pot avea fie o
densitate mai mare fie una mai mic dect banda principal. Ceea ce au n comun
aceste secvene este c ele reprezint > 5% din ADN total. Un exemplu clar este
oferit de ADN dela D. virilus. Graficul reprezint o scanare cantitativ a benzilor
obinute cnd se realizeaz centrifugarea ADN genomic n gradient de CsCl. Banda
principal conine 92% din ADN genomic i este centrat la nivelul unei densiti de
flotaie de 1, 701g/cm3 (corespunztoare unui coninut de G-C de 42% tipic i pentru
mamifere, de exemplu oarece). Picul mai mic reprezint 8% din genom i posed o
80

densitate de flotaie distinct de 1, 671 g/cm3. Aceasta conine ADN satelit de

oarece, al crui coninut n G-C corespunde valorii de 30%, mult mai sczut dect
alte regiuni din genom.
Comportamentul ADN satelit n gradient de densitate este adesea anormal.
Cnd se realizeaz determinarea compoziiei n baze a sateliilor, se poate constata c
aceasta este diferit de densitatea dedus prin evaluarea densitii de flotaie.
Motivaia acestui fapt este aceea c nu depinde stric de compoziia n baze, ci de
constituia secvenei n ceea ce privete capacitatea de mperechere a secvenelor
alturate. De exemplu, pentru secvenele simple, acestea prezint un comportament
deviat de la relaiile de mperechere aleatoare necesare pentru a corespunde ecuaiei
densitii de flotaie. De aemenea, ADN satelit poate fi metilat, ceea ce modific
densitatea sa.
Adesea majoritatea secvenelor de ADN nalt repetitive dintr-un genom pot fi
izolate sub form de satelii. Cnd un component de ADN nalt repetitiv nu se separ
asemeni uni satelit, dup izolare proprietile sale se pot dovedi adesea similare cu
cele ale ADN satelit. Aceasta nseamn c ele constau n repetiii multiple n tandem
care se caracterizeaz prin centrifugare anormal. Materialul izolat n acest fel este
adesea denumit ADN satelit criptic. Regiunile ADN satelit criptic i aparent
formeaz mpreuun blocurile de uniti repetitive n tandem de ADN nalt repetitiv.
Cnd un genom posed mai mult de un tip de ADN nalt repetitiv, fiecare tip exist
sub forma unui bloc propriu (adesea blocuri diferite pot avea poziii adiacente).
Unde sunt localizate n genom blocurile de ADN nalt repetitive? O extindere
a tehnicilor de hibridizare a acizilor nucleici permite ca localizarea secvenelor satelit
s fie determinat direct prin complementare pe cromozom. Tehnica de hibridizare
in situ sau de hibridizare citologic presupune denaturarea ADN cromozomal prin
tratarea celulelor dup au fost etalate (strivite) pe o lam. Apoi se adaug o soluie
care conine o sond ADN sau ARN radioactiv. Sonda hibridizeaz cu secvenele
sale complementare din genomul denaturat. Localizarea situsurilor de hibridizare
poate fi determinat prin autoradiografie.
Astfel secvenele de ADN satelit au putut fi localizate la nivelul
heterocromatinei. Heterocromatina este termenul folosit pentru descrierea regiunilor
de pe cromozom care sunt permanent strns condensate, n contrast cu eucromatina
prezent n majoritatea genomului. Heterocromatina se gsete de obicei la nivelul
centromerilor (regiunile unde kinetocorii sunt formai n mitoz i meioz pentru a
controla micarea cromozomului).
Localizarea centromeric a ADN satelit la nivelul centromerilor sugereaz
existena unei funcii structurale n cromozom. Aceast funcie poate fi corelat cu
procesul de segregare a cromozomului. Pentru moment aceasta este singura
informaie pe care o avem despre rolul su. n concordan cu secvena lor simpl i
condensat, sateliii ADN nu sunt transcrii sau tradui.
Sateliii de la artropode posed repetiii identice foarte scurte
La artropode, simbolizate de insecte i de crabi, fiecare satelit pare s fie mai
degrab omogen. n mod normal, o singur unitate repetitiv foarte scurt reprezint
mai mult de 90% din ADN satelit. Aceasta a fcut ca aceste secvene s fie mult mai
uor de determinat.
Drosophila virilis are trei satelii major i un satelic criptic, care mpreun
reprezint > 40% din genom. Secvenele sateliilor sunt prezentate n figur. Cei trei
satelii majori prezint secvene strns nrudite. Substituia unei singure baze este
suficient pentru a genera sateliii II i III din secvena satelitului I.

81

Secvena satelitului I este prezent i la alte specii de Drosaphila nrudite cu

virilis. Secvenele sateliilor II i III par s fie specifice pentru D. virilis, care este
posibil s fi aprut din satelitul I dup speciaie.
Sateliii ADN de la D. virilis sunt nrudite. Mai mult de 95% din structura
fiecrui satelit const n repetiii n tandem a secvenei predominante.
Trstura principal a acestor satelii este aceea c sunt uniti repetitive foarte
scurte: numai 7 pb. Satelii similari au fost evideniai i la alte specii. D.
melanogaster prezint o varietate de satelii, muli dintre acetia conin uniti
repetitive foarte scurte (5, 7, 10 sau 12 pb). Satelii cu structuri comparabile au fost
determinai i la crabi.
Relaiile strnse gsite ntre sateliii de la D. virilis nu este neaprat o trstur
i a altor genoame, unde sateliii pot avea secvene nenrudite. Fiecare satelit a aprut
ca urmare a unei amplificri laterale ale unei secvene foarte scurte. Aceast
secven poate reprezenta o variant a unui satelit anterior (ca i la D. virilis), sau
poate avea o alt origine.
Sateliii sunt generai i pierdui continuu din genom. Acest lucru face dificil
determinarea unor relaii evolutive, dac un anumit satelit curent ar fi putut s
evolueze dintr-un satelit anterior care apoi a fost pierdut. O trstura important a
acestor satelii este aceea c ei reprezint lanuri lungi de ADN ce conin secvene de
complexitate foarte sczut, n interiorul crora poate fi meninut constana acestor
secvene.
O trstur a multora dintre aceti satelii este o pronunat asimetrie n
orientarea perechilor de baze pe cele dou catene. n exemplu sateliilor de la D.
virilis, n fiecare dintre sateliii majori una dintre catene fiind mai bogat n baze T i
G. Aceasta crete densitatea de flotaie, astfel nct dup denaturare catena grea
(heavy strand-H) poate fi separat de catena sa complementar (light strans L).
Acest lucru poate fi foarte util n secvenializatea satelitului.

SLIDE 22. Organizarea diferitelor gene pentru ARNr

Genele pentru ARNr conin o unitate repetitiv n tandem
n majoritatea cazurilor discutate, exist diferene ntre membrii individuali ai
unui cluster de gene care permit presiunii selective s acioneze independent asupra
fiecrei gene. O situaie inser este furnizat de dou cazuri de clustere mari de gene
care conin multe copii identice ale aceleiai sau acelorai gene. O astfel de situaie
ridic cteva ntrebri interesante asupra evoluiei. Majoritatea organismelor conin
mai multe copii ale genelor care codific pentru proteinele histonice care sunt
componente majore ale cromozomilor; exist puine organisme care nu conin copii
multiple ale genelor care codific pentru ARN ribozomal.
ARN ribozomal este indiscutabil produsul predominant al transcripiei,
constituind 80-90% din masa total de ARN celular att la procariote ct i la
eucariote. Exist mai multe molecule de ARNt, dar cu siguran c acestea sunt mai
mici dect ARNs ribozomal. Att ARNr ct i ARNt sunt reprezentai de ctre gene
multiple.
Numrul genelor pentru ARNr major variaz de la 7 la E. coli, la 100-200
pentru eucariotele inferioare, la mai multe sute n cazul eucariotelor superioare.
Aproape n toate cazurile, genele pentru moleculele de ARNr ale subunitii mari i a
celei mici formeaz un tandem (singura excepie a fost evideniat la mitocondriile de
la drojdii).

82

La bacterii i la unele eucariote inferioare, genele pentru ARN 5S fac parte din
aceeai unitate, astfel nct numrul total al genelor 5S este acelai cu numrul
genelor pentru ARNs ribozomal major; la eucariote, acesta este transcris independent.
La eucariotele superioare, genele pentru ARNr 5S sunt organizate separat n propriul
lor cluster, numrul lor depind pe cel al genelor pentru ARNr major.
Numrul exact al genelor pentru ARNt este dificil de determinat, deoarece
structura secundar extins a moleculei creeaz dificulti tehnice reaciilor de
hibridizare. Probabil c numrul actual este sub-estimat.
Lipsa oricrei variaii detectabile n secvenele moleculelor ARNr implic
identitatea tuturor copiilor fiecrei gene, sau existena unor diferene care s se
manifeste sub pragul de detecie pentru ARNr (1%). Un punct de interes major este
acela privind mecanismele care sunt utilizate pentru a mpiedica variaiile care ar
putea s apar la nivelul secvenelor individuale.
La bacterii, perechile de gene multiple ARNr 16S-23S sunt dispersate. n
majoritatea nucleilor de la eucariote, genele pentru ARNr sunt coninute ntr-un
cluster sau clustere n tandem. Adesea aceste regiuni sunt numite ADNr (n unele
cazuri, proporia de ADNr din ADN total, mpreun cu compoziia sa atipic n baze
este destul de mare pentru a permite separarea direct a fraciilor). O trstur a
clusterului n tandem este c acesta genereaz o hart de restricie circular.
Presupunem c fiecare unitate repetitiv are 3 situsuri de restricie.
Fragmentele A i B sunt n ntregime coninute ntr-o unitate repetitiv, i fragmentul
C conine captul unei uniti repetitive i nceputul urmtoarei. Cnd cartografiem
aceste fragmente prin metode convenionale, gsim c A i urmeaz lui B, B i
urmeaz lui C, care i urmeaz lui A, genernd o hart circular. Dac clusterul este
mare, fragmentele interne (A, B, C) vor fi prezente n cantiti mult mai mari dect
fragmentele terminale (X, Y) care conecteaz clusterul la regiunea de ADN adiacent.
ntr-un cluster cu 100 de repetiii, X i Y vor fi prezente la un nivel de 1% din nivelul
lui A, B, C. Acest lucru face dificil obinerea capetelor unui cluster de gene n scopul
construirii unei hri.
Regiunea nucleului unde are loc sinteza ARNr prezint o caracteristic aparte;
este o regiune core (miez) de natur fibrilar nconjurat de un cortex granular.
Miezul fibrilar reprezint regiunea n care ARNr este transcris de pe matria ADN;
cortexul granular este format din ribonucleoparticulele n care este asamblat ARNr.
ntreaga suprafa este numit nucleol.
Regiunile particulare ale cromozomului asociate nucleolului se numesc
organizatori nucleolari. Fiecare organizator nucleolar corespunde unui cluster de
gene ARNr repetitive n tandem situate pe un cromozom. Nucleolii au o morfologie
caracteristic datorit concentraiei mari a genelor repetitive n tandem i a intensitii
lor de transcriere.
Perechea de sARNr este transcris ca un singur precursor att la bacterii ct i
n nucleii eucariotelor. Dup transcripie, precursorul este clivat pentru a elibera
moleculele individuale de ARNr. Transcriptul ncepe la captul 5 leader, este urmat
de secvena pentru ARNr mic, apoi de o regiune numit transcribed spacer
(spacer transcris), i n final de secvena moleculei de ARNr mare care este
orientat ctre captul 3 al moleculei. (Spacerul transcris nu trebuie confundat cu
nontranscribed spacer care separ unitile de transcripie. Numele su reflect
faptul c acesta este parte a unitii de transcripie, dar nu este reprezentat n produii
maturi ARN).

83

Unitatea de transcripie este mai lung dect lungimea total a moleculelor de

sARNr. n tabelul sunt prezentate cteva exemple ale relaiei dintre transcriptul
primar i moleculele de sARNr.
Unitatea transcripional este mai scurt la bacterii, unde secvenele ARNr
constituie 80% din lungimea total de 6 kb. Nu se observ nici o caracteristic
sistematic la nivelul eucariotelor la care lungimea transcriptului variaz de la 7 la 8
kb, 70-80% din secven reprezentnd sARNr. Precursorul este mai lung la mamifere
(unde este cunoscut ca ARN 45S, n funcie de viteza de sedimentare). Aici secvenele
ARNr matur ocup numai un pic mai mult de 50% din transcriptul complet.
Ce se ntmpl cu regiunile ne-ribozomale ale precursorului ARN ? *leaderul
i regiunile spacer transcrise sunt nlturate n timpul maturrii ARNr. Spacerul
transcris conine cteva secvene scurte care sunt eliberate prin clivare. La mamifere
i amfibieni, o secven scurt formeaz ARN 5,8S, o secven scurt care se leag n
ribozom, prin legturi de hidrogen, cu ARNr 28S. La bacterii, secvenele ARNt sunt
localizate n spacerul transcris i (adesea) de asemenea la captul 3 al transcriptului
primar. Restul spacerului transcris, i toate secvenele leader sunt probabil
degradate n nucleotide.
Clusterul ADNr conine multe uniti de transcripie, fiecare separat de
urmtoarea printr-un spacer ne-transcris. Alternana unitilor de transcripie i a
spacerului (separatorului) ne-transcris se poate observa direct la microscopul
electronic. n cazul tritonului N. viridescens fiecare unitate de transcripie este intens
exprimat, astfel nct mai multe ARN polimaraze sunt angajate simultan n
transcripia unei uniti repetitive. Polimerazele sunt att de aproape localizate nct
alungire produilor lor formeaz o matri caracteristic care se deplaseaz de-a
lungul unitii de transcripie. Separatorul netranscris variaz destul de mult ca
lungime (uneori) chiar n interiorul aceleiai specii.
La drojdii exist un separator netranscris scurt, relativ constant ca lungime. La
D. melanogaster, exist variaii mari ale lungimii separatorului netranscris prezent
ntre diferite copii ale unitii repetitive. O situaie similar este caracteristic X.
laevis. n fiecare dintre aceste cazuri, toate unitile repetitive sunt prezente sub forma
unui singur cluster n tandem poziionat pe un anumit cromozom (n cazul D.
melanogaster acesta este cromozomul sexual. Clusterul de pe cromozomul X este mai
mare dect cel de pe cromozomul Y, astfel nct femelele posed mai multe copii ale
genelor ARNr dect masculii).
La mamifere unitatea repetitiv este foarte mare, cuprinznd unitatea de
transcripie de 15 kb i un separator netranscris de 30 kb. n mod normal, genele
sunt localizate n mai multe clustere dispersate-n cazul omului i a oarecelui este
vorba de cinci i ase cromozomi.
O ntrebare interesant: cum reuesc mecanismele de corecie, care se
presupune c funcioneaz n interiorul unui singur cluster pentru a asigura o secven
ARN constant, s se manifeste i n cazul existenei mai multor clustere ?
Variaiile lungimii separatorului netranscris ntr-un singur cluster contrasteaz
cu ideea conservrii unei uniti de transcripie. n ciuda acestei variaii, secvenele
separatorilor netranscrii mai lungi rmn omologe cu cele ale separatorilor
netranscrii mai scuri. Aceasta implic c fiecare separator ne-transcris prezint
repetiii interne, astfel nct variaiile de lungime sunt rezultatul modificrilor
numrului de repetiii ale unora dintre subuniti.
Natura general a separatorului ne-transcris este ilustrat cu ajutorul
exemplului de la X. laevis. Regiunile care sunt fixe ca lungime alterneaz cu regiunile
care variaz. Fiecare dintre cele trei regiuni repetitive cuprind un nunr variabil de

84

repetiii ale unei secvene scurte. Un tip de regiune repetitiv este cea care conine
uniti repetitive de 97 pb; cealalt care are dou localizri, are o unitate repetitiv n
dou forme (din dou componente), de 60 pb i respectiv 81 pb. Variaia numrului
de uniti repetitive la nivelul regiunilor repetitive influeneaz variaia lungimii totale
a separatorului.
Una dintre regiunile fixe (de la nceputul unitii) este unic ca lungime i
secven. Celelalte sunt secvene scurte constante numite insule Bam. (Aceast
regiune are acest nume datorit enzimei de restricie cu ajutorul creia a fost izolat).
Din acest tip de organizare, se poate observa evoluia clusterului prin duplicri n care
a fost implicat regiunea promotor.
Separatorul ne-transcris are rol n transcripie. Repetiiile 60/81 pb au rol de
iniiere, probabil comparabil cu rolul pe care activatorii l au pentru genele transcrise
de ctre ARN polimeraza II. Prezena unui separator crete frecvena de iniiere,
aparent prin faptul c determin mai multe ARN polimeraze I s se lege succesiv la
promotor. Nu putem nc nelege natura exact a acestei relaii, i ct de mult
depinde ea de similitudinile de secven dintre separator i promotor.

SLIDE 23. Organizarea clusterului genelor histonelor la diferite

organisme
Genele pentru histone: conservarea secvenei codante i divergen la nivelul
organizrii genei
Proprietile generale ale genelor pentru histone
Structurile primare ale histonelor sunt bine conservate, chiar i la eucariote
foarte diferite. Acest lucru nu este surprinztor, dat fiind rolul fundamental i comun
pe care histonele l au n strutura cromatinei. Totui, histonele variaz. Secvenele
histonelor H1 sunt cele care posed cel mai mare grad de divergen, cele ale H3 i
H4 fiind cele mai puin divergente. Pentru o anumit specie, n diferite etape de
dezvoltare sau ale ciclului celular sau n esuturi diferite pot fi sintetizate molecule de
histone uor diferite. De exemplu, expresia majoritii genelor pentru histone n faza S
a ciclului celular i deci n timpul replicrii. Alte gene, numite gene de nlocuire, se
exprim ntr-o proporie redus n timpul ntregului ciclu celular. n contrast cu
conservarea secvenelor polipeptidice, numrul de aranjamente ale genelor pentru
histone difer considerabil ntre specii. Aceasta subliniaz, cum o face de altfel i
organizrea genelor pentru ARNt, c pstrarea (conservarea) secvenelor codante nu
presupune neaprat conservarea numrului de copii sau a organizrii genomice.
Genele diferitelor familii de histone au tendina de a fi legate (unitate de
linkage) dar contrar genelor pentru ARNr, unde trei gene sunt prezente ntr-o singur
unitate de transcripie, fiecare gen pentru histone este transcris ca o unitate separat,
adesea chiar de pe o catena opus. O alt diferen fa de genele pentru ARNr este c
ordinea genelor pentru histone nu este neaprat aceeai de la o specie la alta i nici
chiar n aceeai specie. n plus, cu toate c genele legate pentru histone sunt
repetitive n anumite organisme, ele sunt dispersate la psri i mamifere. Cea mai
mare parte a genelor pentru histonele de tip replicativ (care sunt exprimate n faza
replicrii ADN) sunt lipsite de introni iar moleculele de ARNm nu posed coad
poliA.
Pentru obinerea de informaii privind organizarea genelor pentru histone
nainte de apariia tehnicilor ADN recombinat au fost folosite dou abordri
experimentale. n primul rnd, separarea genelor pentru histone la nivelul benzilor
sateliilor dup centrifugarea ADN total n gradient de densitate a dus la evidenierii

85

numrului de copii i a organizrii n tandem la ariciul de mare. Apoi a fost posibil

purificarea parial a ARNmpentru histone pornind de la o surs mbogit.
Clonarea genelor pentru histone
n primele zece ore dup fecundare, oulele de arici de mare se divid de 2x109
la 2x1010 ori. Aceste diviziuni celulare sunt nsoite de o replicare rapid a ADN i de
o sintez important de histone. n timpul acestei perioade, 30% dintre proteinele
sintetizate sunt proteine nucleare iar moleculele de ARNm care codific pentru
histone sunt foarte abundente. Mrimea lor caracteristic face ca acestea s se
concentreze n fracia de ARNm care sedimenteaz la 9S. Prin electroforez n gel de
poliacrilamid se pot separa moleculele de ARNm pentru histonele individuale care
pot fi apoi identificate prin traducere in vitro. Moleculele de ARNm de arici de mare
au putut fi astfel folosite drept sonde pentru clonarea genelor de histone de la plante,
ciuperci i animale.
La ariciul de mare genele pentru histone sunt un grup particular de gene care
asigur sinteza rapid a histonelor n timpul stadiilor embrionare foarte precoce. Dup
formarea stadiului de blastul, are loc stimularea unui alt grup de gene care este
responsabil de sinteza histonelor n timpul urmtoarei perioade de dezvoltare i la
organismul adult. Aceste dou grupe sunt denumite ca grupul de gene precoce i
grupul de gene tardive de la ariciul de mare. Organizarea lor variaz de la o specie
de arici de mare la alta. n continuare vom exemplifica cu situaia genelor de la
Strongylocentrotus purpuratus.
Segmentele genomice care conin genele histonelor precoce au fost clonate
plecnd de la o banc de fragmente de ADN obinute prin digestie cu EcoRI i
folosind drept sond ARNm total de histone. Au fost obinute dou fragmente care nu
se hibridizeaz ntre ele Totui, prin cartografie genomic s-a constat c aceste dou
fragmente sunt legate (linkate) ntr-un interval de 7 kb n genom. Prezena i ordinea
celor cinci gene pentru histone n cele dou clone, a fost stabilit prin hibridizarea
ADN cu ARNm separat prin electroforez. Heteroduplexurile formate au fost
analizate prin microscopie electronic.
De asemenea, fiecare molecul de ARNm a fost testat prin hibridizare cu
catenele separate ale segmentelor clonate; moleculele de ARNm se hibridizeaz toate
pe aceeai fibr, ceea ce demonstreaz c cele cinci gene sunt transcrise n acelai
sens. n continuare, analiza secvenei nucleotidice a confirmat toate concluziile i a
stabilit mrimea exact a regiunilor codante i a separatorilor dintre acestea. Cele
cteva sute de exemplare linkate de gene pentru histone precoce sunt formeaz lungi
alinieri n tandem. Aranjamente comparabile se regsesc la mai multe specii de arici
de mare.
Genele histonelor tardive nu sunt repetate dect de aproximativ 10 ori,
situaia fiind diferit de cea a genelor precoce. n afar de numrul lor redus de copii,
genele tardive se difereniaz de cele precoce din multe ale puncte de vedere. n
primul rnd, ele nu sunt linkate n grupe de cinci i nici organizate n repetiii n
tandem. Anumite gene sunt vecine (de exemplu, H3 i H4) situate la 1 kb una de alta,
n timp ce altele sunt mult mai izolate, separate prin cel puin 6 kb de orice alte gene
pentru histone. Nici ordinea genelor, nici sensul de transcriere al acestora nu sunt
corelate cu aranjamentul genelor precoce echivalente. n plus, organizarea genelor
tardive este variabil de la o specie la alta de arici de mare.
Genele histonelor precoce i tardive clonate corespunztoare nu se
hibridizeaz ntre ele n condiii stricte de hibridizare cu toate c produii genelor au
structuri foarte asemntoare (uneori chiar identice). Diferenele dintre secvenele
codante reflect folosirea unor codoni diferii pentru acelai aminoacid. Secvenele

86

care flancheaz genele precoce i tardive corespunztoare sunt i mai divergente,

cu excepia secvenelor nucleotidice eseniale necesare transcrierii de ctre ARN
polimeraza II.
Genele pentru histone la alte specii. La Drosophila, hibridizarea in situ a
genelor clonate cu cromozomii politeni, a permis localizarea tuturor genelor pentru
histone ntr-o regiune a cromozomului 2. Cele 5 gene sunt legate n cadrul uneu
uniti repetitive de aproximativ 100 de ori; ordinea i sensul de transcripie a genelor
sunt total diferite de cele ale genelor de la ariciul de mare. Trecerea de la o sintez
ridicat de histone la cantiti sczute n timpul embriogenezei la Drosophila nu se
bazeaz aparent pe expresia unor gene difeite, ca la arici, ci este rezultatul modulrii
expresiei aceluiai grup de gene.
ADN de la drojdii (S. cerevisiae) conine dou copii ale unui segment care
conine o gen pentru H2A i o gen pentru H2B, i dou copii ale unui alt segment
care conine o gen pentru H3 i una pentru H4. Genele omologe n perechile de
segmente pot codifica pentru proteine puin diferite (de ex pentru H2A) sau identice
(ex. H3). Nu se tie dac aceste variaii prezint semnificaie funcional.
Ca i la nevertebrate, vertebratele prezint o diversitate foarte mare a
organizrii genelor pentru histone. La Xenopus, exist mai multe grupe de gene
legate pentru cele cinci histone, dar genele sunt ordonate diferit, Dou dintre grupe
se disting prin variaii ale genei H1. Fiecare dintre aceste gene H1 se hibridizeaz cu
molecule ARNm diferite din ovocit, i cei doi mesageri produc, prin traducere in
vitro, proteine H1 diferite. De asemenea, genomul de Xenopus conine mai multe
aliniamente n tandem ale grupelor de gene pentru histone, dar contrar genelor
precoge pentru histone de la arici, grupele vecine din interiorul aceleiai
alinieriprezint polimorfism de restricie.
Localizarea celor aproximativ 700 de gene pentru histone de la Triton
demonstreaz c poziia genelor are importan sczut pentru anumite aspecte ale
expresiei acestora. Segmentele de ADN care conin genele celor cinci histone au o
lungime de 9 kpb i fiecare este situat ntr-o lung serie de repetiii n tandem ale unei
secvene ne-nrudite situat pe acelai bra al cromozomului. Se pot observa ntre 50
la 100 kpb din aceast secven repetitiv n tandem ntre fiecare grup de gene pentru
histone. Aceeai secven repetitiv n tandem apare i la nivelul centromerilor.
Animalele cu snge cald au relativ puine gene pentru histone. Acestea nu sunt
nici grupate sistematic i nici repetate n tandem, dar se pot evidenia adesea gene
vecine

SLIDE 24. Dou mecanisme posibile pentru meninerea omogenitii

unei familii multigenice n tandem
O dilem evolutiv: Cum pot fi meninute mai multe copii active
Aceeai problem se pune i atunci cnd gena a fost duplicat. Cum poate
selecia s previn acumularea de mutaii modificatoare?
Duplicarea unei gene are ca rezultat o relaxare imediat a presiunii evolutive
asupra secvenei sale. Acum exist dou copii identice, modificarea secvenei uneia
nu va lipsi organismul de o protein funcional, atta timp ct secvena original n
aminoacizi continu s fie codificat de o alt copie. Astfel presiunea selectiv asupra
celor dou gene este difuzat, pn cnd una dintre ele achiziioneaz un numr
suficient de mutaii i se ndeprteaz destul de mult de funcia sa original nct toat
presiunea selectiv s se reflecte asupra celeilalte.

87

Imediat dup o duplicare genic, modificrile se pot acumula mult mai rapid
ntr-una din copii, conducnd eventual la o funcie nou (sau la modificarea genei sub
forma unei pseudogene). Dac se dezvolt o nou funcie, gena va evolua cu aceiai
vitez sczut ca i funcia sa original. Probabil acesta este tipul de mecanism
responsabil de separarea funciilor genelor embrionare i adulte ale globinei.
Exist i situaii n care genele duplicate rmn cu aceeai funcie, codificnd
pentru proteine identice sau aproape identice. Genele -globinei umane codific
proteine identice, iar ntre cele dou proteine i -globin exist numai un singur
aminoacid diferit. Cum se exercit presiunea selectiv pentru a menine secvene
identice?
Au fost propuse dou tipuri generale de mecanisme. Ele se bazeaz pe
principiul c genele nealelice nu sunt motenite independent, dar trebuie regenerate
continuu dup una dintre copiile generaiei anterioare. n cazul cel mai simplu a dou
gene identice, cnd o mutaie apare n una dintre copii, fie este eliminat din
ntmplare (deoarece secvena altor copii este eliminat), fie aceasta este extins la
cele dou replici (gene duplicate) (deoarece copia mutant devine versiunea
dominant). Aceast extindere expune mutaia seleciei. Rezultatul este c cele dou
gene evolueaz mpreun. Acest fenomen se numete evoluie concertat
(coincident) (coevoluie ocazional). Ea este aplicabil unei perechi de gene
identice sau unui cluster care conine multe gene.
Unul dintre mecanisme presupune c secvenele genelor ne-alelice sunt
comparate direct una cu cealalt i omogenizate de enzime care recunosc orice
diferen. Acest lucru poate fi realizat prin schimbarea monocatenelor ntre ele, pentru
a forma gene ale cror catene deriv dintr-o copie i cealat dintr-o alt copie. Orice
diferen care apare ntre secvene i care determin o mperechere
necorespunztoare, poate atrage atenia unor enzime capabile s nlture i s
nlocuiasc o baz, astfel nct numai mperecherile A-T i G-C s fie viabile. Acest
tip de eveniment este numit conversie genic i este asociat cu procesele de
recombinare genetic.
Apare necesitatea certificri (stabilirii) scopului unor astfel de evenimente prin
compararea secvenelor genelor duplicate. Dac ele sunt subiectul unei evoluii
concertate, nu trebuie s constatm acumularea unor substituii la nivelul situsurilor
silenioase ale acestora (deoarece procesul de omogenizare se aplic i acestora la fel
de bine cai n cazul situsurilor de substituie). Se tie c extinderea mecanismului de
meninere nu se extinde dincolo de gena nsi, astfel nct cazuri de gene duplicate
ale cror secvene flancante sunt total diferite. ntradevr, se poate constata existena
unoe catene abrupte care marcheaz capetele secvenelor care au fost omogenizate.
Trebuie s ne reamintim c existena unui astfel de mecanism poate invalida
povestea (determinarea) istoriei unor astfel de gene prin intermediul divergenei lor,
deoarece divergena reflect numai timpul de la ultimul eveniment de
omogenizare/regenerare, i nu duplicarea original.
Cnd exist mai multe copii ale genei, efectele imediate al mutaiei pentru
orice copie trebuie s fie foarte uoare. De exemplu, n cazul clusterului ADNr, exist
sute de copii de gene, aproape toate identice. Cosecinele unei mutaii individuale sunt
diluate de numrul mare de copii ale genei care pstreaz secvena slbatic. Aceasta
sugereaz c o proporie apreciabil de copii muante se pot acumula nainte ca efectul
s devin destul de puternic pentru a fi eliminate de ctre evoluie.
Letalitatea devine cantitativ, concluzie susinut de observaia c se poate
realiza nlturarea a jumtate dintre unitile clusterului ADNr de la X. laevis i D.
melanogaster fr nici un efect. Deci cum se realizeaz prevenirea acumulrii unor
88

mutaii modificatoare? Ce ans au mutaiile favorabile s i demonstreze avantajele

n cadrul unui cluster?
Concluzia inevitabil este c anumite mecanisme trebuie s permit anumitor
variante s fie analizate de ctre evoluie (s fie cntrite n procesul evolutiv). i n
acest caz au fost propuse dou tipuri de mecanisme.
Modelul corectrii neateptate (sudden corection) presupune c destul de
frecvent un cluster de gene este nlocuit de un nou set de copii derivat din una sau din
mai multe copii prezente n generaia anterioar. Pentru a se putea realiza (impune) o
for selectiv, destul de frecvent (every so often) trebuie s fie de cteva generaii
(trebuie s reprezinte cteva generaii); dar n termeni practici, orice mecanism trebuie
s fie structurat pe baze periodice regulate, ceea ce nseamn la fiecare generaie.
Numrul mic de copii care dau natere unui nou cluster formeaz un set
master asupra cruia acioneaz selecia; copiile nlturate sunt irelevante pentru
selecie. Copiile master pot constitui un set particular care poate fi ales la
ntmplare. Mecanismul se poate presupune c este asemntor celui de amplificare,
sau de conversie pozitiv a genelor.
Dificultatea acestui model este c el presupune regenerarea unui cluster din
cteva uniti repetitive. Aceasta nseamn c att unitile de transcripie ct i
separatorii trebuie regenerai, astfel nct ntreaga unitate repetitiv s fie omogen ca
secven (sau cel puin, s nu aib o variabilitate mai mare dect numrul mic de copii
master). Dar de fapr separatorii manifest o variabilitate continu, n timp ce numai
unitile de transcripie sunt constante.
Cellalt model, crossover fixation, presupune c ntregul cluster este supus
unui mecanism de rearanjare continu prin crossing-over inegal. n esen, este vorba
de aplicarea la nivelul unui cluster n tandem a mecanismului deja discutat pentru
genele globinei pe baze mult mai restrictive i ocazionale. Astfel de evenimente pot
explica evoluia concertat a genelor multiple dac prin intermediul unui crossingover se poate determina regenerarea fizic pornind de la o copie.
Urmnd mecanismul descris, de exemplu, cromozomul care poart un locus
triplu poate suferi deleia uneia dintre gene. Din cele dou gene rmase, 11/2
reprezint secvena uneia din copiile originale i numai 1/ secvena celellalte copii
originale. Orice mutaie existent n prima regiune va exista acum n ambele gene i
va fi subiectul presiunii selective.
Analiznd consecinele crossing-overului inegal este evident c clusterele n
tandem furnizeaz anse frecvente pentru mperecherea neadecvat a genelor ale
cror secvene sut aproximativ aceleai, dar care sunt situate n diferite poziii ale
clusterului. Prin expansiune continu i contractare a numrului de uniti prin
crossing-over inegal, este posibil ca toate unitile s derive dintr-o regiune mic a
unui cluster ancestral. Lungimea variabil a separatorilor este concordant cu ideea c
crossing-overul inegal care loc cu implicarea unor separatori ntre care se realizeaz
imperechere inadecvat intern. Aceasta poate explica omogenitatea genelor
comparativ cu variabilitatea separatorilor. Genele sunt supuse seleciei cnd unitile
repetitive individuale sunt amplificate n interiorul unui cluster; dar separatorii sunt
irelevani i pot acumula modificri.

89

SLIDE 25. Evoluia sintezei genelor globinei n dezvoltarea embrionar

i fetal
Gene eseniale i numrul total al genelor
Cte gene sunt eseniale? O alt abordare a chestiunii numrului de gene este
s determinm numrul genelor eseniale prin analize mutaionale. Dac se realizeaz
saturarea unor regiuni specifice de pe cromozom cu mutaii care sunt letale, numrul
grupurilor de complementare n care aceste mutaii sunt distribuite va identifica
numrul total de loci letali din acea regiune. Prin extrapolare la ntregul genom,
putem calcula numrul total de gene eseniale.
Cele mai extinse analize asupra numrului esenial de gene au fost realizate la
Drosophila unde s-a putut realiza corelarea aspectului vizibil al cromozomilor cu
numrul de uniti genetice. Acest lucru a fost posibil prin urmrirea prezenei
benzilor la nivelul cromozomilor politeni de la D. melanogaster. (Aceti cromozomi
pot fi evideniai n anumite stadii de dezvoltare i reprezint o form fizic neobinuit
de extins, n care se pot vedea serii de benzi, denumite mai mult formal cromomere).
Pornind de la conceptul iniial c benzile pot reprezenta o ordine linear a genelor, s-a
ajuns la ideea corelrii organizrii genelor cu organizarea benzilor. Exista peste 5 000
de benzi n setul haploid de la D. melanogaster; acestea variaz adesea cu un ordin de
mrime, dar media este poate fi de aprox 20 kb/band.
Abordarea de baz este de a satura o regiune cromozomiala cu mutaii. De
obicei mutaiile sunt colectate simplu ca letale, fr a analiza cauza letalitii. Orice
mutaie care este letal este luat n seam (n eviden) pentru a identifica un locus
care este esenial pentru organism. Cnd mutaiile sunt plasate ntr-un grup de
complementare, numrul acestora poate fi comparat cu numrul benzilor prezente n
regiune, sau grupuri individuale de complementare pot fi alocate unor benzi
individuale. Scopul acestor experiene este determinarea existenei unei corelaii
consistente ntre benzi i gene; de exemplu dac fiecare band conine o singur gen?
Un exemplu de regiune cartografiat, n care 12 grupuri de complementare au
fost cartografiate ntr-o regiune rosy de 16 benzi. n acest caz, grupul a fost
cartografiat cu ajutorul unor markeri ADN de mrime cunoscut, astfel nct a fost
posibil constatarea c ntreaga regiune conine 300 kb. Aceast distribuie a
grupurilor de complementare este n general paralel cu distribuia benzilor, dar nu se
poate spune c exist o corelaie de 1:1. Se demonstreaz o corelaie rezonabil ntre
numrul de benzi (265) i numrul de grupuri de complementare (215). Aceasta
corespunde la aproximativ 5% din genomul D. melanogaster. n cazurile n care
grupurile au fost cartografiate folosind ADN, se constat existena unei regiuni de 1020 kb pentru un grup de complementare letal, distan care este de dou ori mai mare
dect mrimea medie a unei gene.
Diferena dintre numrul total de gene i numrul de gene letale adus din nou
n discuie datorit datelor genetice i biochimice. La nivel molecular, se cunoate c
multe gene sunt localizate n aceeai vecintate, de exemplu, ele pot fi linkate pe
aceleai fragmente genomice. Aceasta nseamn c astfel de gene sunt localizate n
interiorul aceleiai benzi. Aceasta este totui un contrast ntre echivalena aparent a
locilor letali i a benzilor i prezena mai multor gene ntr-o band. Exist
posibilitatea ca o band s conin mai multe gene, dar multe dintre acestea sau chiar
toate s nu fie gene eseniale. Pn n prezent nu putem spune c exist posibiliti
clare de definire a unor criterii dup care s se poat decide care sunt genele eseniale
i care cele ne-eseniale.

90

Un experiment care a ncercat s determine ce proporie din genele actuale

este esenial s-a soldat cu rezultate foarte interesante n cazul S. cerevisiae. Genomul
acestei drojdii este relativ mic, i o mare parte este transcris (>50% dac comparm cu
eucariotele superioare). n urma introducerii unor inserii la ntmplare n genom, s-a
constatat c numai 12% dintre acestea sunt letale, i alte 14% mpiedic creterea.
Majoritatea inseriilor (70%) nu au avut nici un efect. Dac toate inseriile utilizate
conineau semnale de terminare a transcripiei ne puteam atepta ca acestea s
mpiedice expresia oricrei gene n care se integrau.
Se presupune c toate ntreruperile care nu aveau nici un efect erau poziionate
n regiuni netranscrise. Proporia ntreruperilor de acest tip poate fi de 50% astfel
nct rmne o proporie de 20% din ntreruperi fr efect cu toate c sunt poziionate
n regiuni transcrise (Regiunile transcrise reprezint 50% din genom dar reprezint
coninutul tuturor genelor). n urma acestor rezultate se poate considera c
ntreruperea a 20% din regiuni reprezint ntreruperea a 40% dintre gene. Aceasta
implic c 40% dintre genele exprimate la drojdii nu sunt eseniale.
Cum pot fi explicate aceste rezultate? O posibilitate o reprezint existena unei
redundane extinse, astfel nct multe gene sunt prezente n mai multe copii. Acest
punct de vedere este cu siguran adevrat pentru anumite cazuri, n care mai multe
gene trebuie inactivate pentru a obine un efect. Pentru moment nu avem la ndemn
nici o modalitate de control (supraveghere) sistematic cu ajutorul creia s
determinm cte dintre genele actuale posed funcii unice i cte sunt redundante sau
pur i simplu organismul se poate dispensa de ele. Ideea c anumite gene nu sunt
eseniale (sau cel puin c nu pot fi evideniate efecte serioase asupra fenotipului)
ridic cteva ntrebri importante. Conine genomul gene autentic dispensabile, sau au
aceste gene actuale efect semnificativ asupra fenotipului cel puin n timpul lungului
progres al evoluiei? Are fiecare gen o funcie unic (aa cum ne putem atepta dac
este esenial) sau exist redundan: sunt prezente unele gene sub forma mai multor
copii?
Nu ne putem pronuna dac la eucariotele superioare exist funcii de care
celula s se poat dispensa, dar dac exist, trebuiesc re-gndite unele din ntrebrile
asupra evoluiei. tim c unele gene par s fie redundante. Exist multe cazuri n care
mutaiile locilor individuali de la drojdii i Drosophila nu prezint efecte aparente, dar
n prezena altor mutaii la nivelul altor loci devin letale. ntrebarea dac exist cu
adevrat gene redundante este foarte dificil i ea la rndul ei conduce la o alt
ntrebare dificil: cum se realizeaz presiunea selectiv pentru aceste gene?
Alte ntrebri cheie sunt: care este proporia de gene eseniale din numrul
total de gene; ce numr de mutaii produce pn la urm efecte detectabile; exist
gene care sunt autentic dispensabile? Dac acesta este cazul n care se gsesc multe
gene i anume de a nu codifica pentru proteine specifice care nu sunt eseniale pentru
supravieuirea organismului (n sensul n care modificri mutaionale nu determin
nici un efect detectabil), trebuie s rspundem de ce aceste continu s fie exprimate.
Alte ntrebri secundare despre genom ca ntreg sunt: are ADN vreo funcie (dac
exist vreuna) care nu este codificat de gene (care nu rezid n structura genelor)? Ce
efect are o modificare important (este cazul amfibienilor) a mrimii totale asupra
operabilitii genomului?

SLIDE 26. Organizarea structural a diferitelor gene pentru globine

Genele globinei sunt organizate n dou clustere
Exemplul cel mai bine caracterizat pentru un cluster de gene este reprezentat
de genele globinei, care constituie o familie veche, i responsabile de o funcie cu rol
91

central n lumea animal: transportul oxigenului de ctre snge. Constituentul major

al celulelor roii ale sngelui este tetramerul de globin, asociat cu gruparea hem (ion
binding-care leag fierul) pentru a forma hemoglobina. Genele funcionale ale
globinei de la toate speciile au aceeai structur, fiind mprite n trei exoni. Putem
concluziona c toate genele globinei deriv dintr-o singur gen ancestral; astfel
nct trasnd (urmrind) dezvoltarea (evoluia) genelor individuale n interiorul unei
specii i ntre acestea, putem nelege (nva) despre mecanismele implicate n
evoluia familiilor de gene.
n celulele adulte, tetramerul de globin const n dou lanuri i dou
identice. Genele i sunt poziionate la nivelul unor loci genetici diferii a cror
exprimare trebuie coordonat pentru a asigura o sintez echivalent a ambelor
polipeptide. Acest sistem furnizeaz n consecin un exemplu de control simultan a
unor gene dispersate pentru a genera un anumit fenotip celular.
Celulele roii embrionare conin tetrameri de hemoglobin care sunt diferii de
formele adulte. Fiecare tetramer conine dou catene asemntoare lanurilor i
dou lanuri identice cu , fiecare dintre acestea fiind nrudite cu polipeptidul
caracteristic adultului fiind mai trziu nlocuit de acesta. Acesta este un exemplu de
control al dezvoltrii, n care diferite gene sunt supuse procesului de switched on and
off (de schimbare a direciei/orientrii) pentru a furniza produi alternativi care
ndeplinesc aceeai funcie n diferite etape de timp.
Detaliile asupra relaiilor dintre hemogobinele adulte i embrionare variaz n
funcie de organism. Etapele urmate la om constau n trei stadii: embrionar, fetal, i
adult. Distincia dintre embrionar i adult este comun la mamifere, dar numrul de
stadii pre-adulte variaz. La om catenele zeta i alfa sunt cele dou lanuri
asemntoare cu (like ), i beta sunt chiar lanurile obinuite. Catenele
exprimate n diferite stadii de dezvoltare sunt prezentate n tabel.
(zeta) este prima caten like- exprimat, dar este foarte repede nlocuit de
ctre adevrata catena . La nivelul ci sintezei lanurilor de tip , sunt exprimate mai
nti catenele (epsilon) i (gama), fiind nlocuite cu (delta) i (beta) mai trziu.
La aduli, formele 22 constituie 97% din totalul structurii hemoglobinei, 22
aproximativ 2%, i 1% este reprezentat de persistena formei de la fetus 22.
Divizarea lanurilor globinei n lanuri like- i like- reflect organizarea
genelor ntr-un singur cluster. Structurile celor dou clustere prezente la primatele
superioare sunt prezentate n figura.
ntr-o regiune de peste 50 kb, clusterul conine cinci gene diferite (, dou ,
i ) i o pseudogen (). Cele dou gene difer n secvena codant prin numai
doi aminoacizi; varianta G posed o glicin n poziia 136 unde varianta A are o
alanin.
Tabel. Hemoglobinele umane se modific n cursul dezvoltrii
Stadiu de dezvoltare
Hemoglobine
Embrionar (< 8 sptmni)
22, 22, 22
Fetal (3-9 luni)
22
Adult (dup natere)
22, 22
Clusterul este mult mai compact i include ntr-o regiune de peste 28 kb, o
gen activ (zeta), o pseudogen (zeta), dou gene , dou pseudogene m i o
gen (teta) a crei funcie nu este cunoscut. Cele dou gene codific pentru

92

aceeai protein. Dou sau (mai multe) gene identice prezente pe acelai cromozom
sunt considerate copii ne-alelice.
Genele funcionale sunt definite prin expresia lor n ARN, i pn la urm prin
proteinele pe care le codific. Pseudogenele sunt denumite astfel datorit incapacitii
lor de a codifica proteine; motivaia inactivitii variaz iar deficienele pot fi la nivel
transcripional sau translaional (sau la ambele). Cteodat (din cnd n cnd) una
dintre gene nu poate fi plasat n nici una din clase. De exemplu structura genei a
fost descoperit la unul dintre capete dup ce s-a considerat c structura clusterului
era bine definit. Nu a fost nici o problema ca aceasta s fie clasificat ca o
pseudogen, atta timp ct nu a fost posibil identificarea unui produs de reacie. De
asemenea rolul su rmne neclar.
O organizare similar a fost gsit pentru clusterele genelor globinei de la alte
vertebrate, dar detalii ca tipul, numrul i ordinea genelor pot varia. n poziia n care
la o specie este localizat o pseudogen la alt specie poate fi localizat o gen activ;
de exemplu, pseudogena de la primatele superioare este localizat ntr-o poziie
echivalent cu o gen embrionar activ de la capr.
Caracterizarea acestor clustere de gene marcheaz un punct general foarte
important. Pot exista mai muli membri ai unei familii de gene att funcionali ct i
ne-funcionali, pe care i putem suspecta pe baza analizelor proteinelor. Genele extrafuncionale pot reprezenta duplicate care codific pentru polipeptide identice; sau ele
pot fi nrudite cu proteine cunoscute, cu toate c sunt diferite de ele (i care se
presupune c sunt exprimate numai o perioad scurt de timp i n cantiti mici).
innd cont de toate aceste trsturi, este greu s fim siguri c toi membrii unui
cluster au fost identificai i c regiunile care flancheaz clusterul reprezint ultimii
membri ai acestuia.
Cu privire la ntrebarea ct de mult ADN este necesar pentru a codifica o
anumit funcie, constatm c pentru regiunea care codific pentru catene like- la
mamifere sunt necesare ntre 20-50 kb. Aceast regiune este mult mai mare dect neam fi ateptat analiznd proteinele -globine cunoscute sau lund n considerare
genele individuale. Regiunea clusterului , pare s codifice numai pentru -globine,
dar cu ct sunt descoperite mai multe gene sau clustere de gene care codific pentru
proteine particulare, cu att mai mult nu se va putea identifica rapid tipul de
aranjament caracteristic.
Crossing-overul inegal rearanjeaz clusterele de gene
Pentru rearanjarea unui cluster care conine gene identice sau nrudite exist
diferite oportuniti. Chiar dac clusterele codific pentru aceeai funcie, i toate
posed aceeai organizare general, fiecare este diferit ca mrime, exist variaii ale
numrului total i a tipurilor de gene care codific pentru -globine, i este diferit
numrul i structura pseudogenelor. Toate acest modificri au aprut de cnd a avut
loc marea radiaie a mamiferelor, acum 58 milioane de ani n urm (ultimul punct al
evoluiei comun tuturor mamiferelor).
Comparaiile demonstreaz c procese generale cum sunt duplicarea genelor,
rearanjarea, i variaia, reprezint factori la fel de importani n evoluie ca i
acumularea lent a mutaiilor punctiforme n genele individuale. Ce tipuri de
mecanisme sunt responsabile de reorganizarea genelor ?
Un cluster de gene se poate mri sau contracta prin crossing-over inegal, cnd
recombinarea apare ntre gene ne-alelice. n mod normal, recombinarea implic
secvene corespunztoare de ADN aliniate exact ntre doi cromozomi omologi.
Totui, cnd exist dou copii ale aceleiai gene pe fiecare cromozom, o este posibil

93

ca o aliniere ocazional s permit mperecherea acestora (Aceasta implica ca

regiunile adiacente rmn nemperechiate).
Cnd evenimentul de recombinare apare ntre copii nepotrivite ale genelor, se
genereaz cromozomi recombinai ne-reciproci (nonreciprocal recombinant
chromosomes), unul dintre acetia avnd o duplicare a genei iar cellalt o deleie.
Primul recombinat are astfel o cretere a numrului de copii ale genei de la 2 la 3, n
timp ce al doilea descrete de la 2 la 1.
n acest exemplu, noi am considerat copiile genelor ne-echivalente 1 i 2 ca
fiind n ntregime omologe. Totui, crossing-overul inegal poate s apar i cnd
genele adiacente prezint un grad ridicat de nrudire (dei probabilitatea este mai mic
dect n cazul genelor identice).
O problem a crossing-overului inegal este reprezentat de ntreruperea
structurii genelor. ntr-un caz ca al globinelor, exonii corespunztori copiilor genelor
adiacente se pare c sunt destul de nrudite pentru a se mperechia; dar secvenele
intronilor prezint o divergen apreciabil. Reducerea mperecherii numai la exoni
reduce considerabil continuitatea lungimii ADN care poate fi implicat. Aceasta
nseamn c exist anse mai mici s se produc un eveniment de crossing-over
inegal. Aceast divergen a intronilor (dintre introni) poate determina (controla) o
stabilitate a clusterelor de gene prin mpiedicarea (potenarea) apariiei crossingoverului inegal.
Talasemiile sunt rezultatul mutaiilor care reduc sau mpiedic sinteza
lanurilor sau . Incidena crossing-overului inegal la nivelul clusterelor genelor
globinei este evideniat prin natura anumitor talasemii.
Multe din cele mai severe talasemii sunt rezultatul deleiilor unei pri a
clusterului. Cel puin n unele cazuri, capetele deleiei sunt poziionate n regiuni
omologe, deleiile fiind exact aa cum ne ateptam generate prin crossing-over inegal.
n cazul -talasemiilor au fost determinate dou tipuri de deleii. Deleia thal-1 elimin ambele gene . Numele se refer la cromozomul individual care poart
deleia. n funcie de combinaia diploid a cromozomilor talasemici (purttoare de
modificri care genereaz talasemia), un individ afectat poate avea orice numr de
lanuri cuprins ntre zero i trei. Indivizii cu dou sau trei gene manifest puine
modificri (diferene) fa de tipul slbatec (patru gene ). n cazul celor cu o singur
gen se formeaz tetramerul anormal 4, care determin maladia HbH. Absena
complet a genelor determin apariia hydrops fetalis (hidropsie fetal), care este
fatal nainte de natere.
Deleiile care pot cauza -talasemii. Deleiile -thal-1 sunt lungi, variaz ca
localizare la captul stng, poziiile capetelor din dreapta fiind localizate ntre gene
cunoscute. Deleiile -thal 2 sunt scurte. n cazul formei L sunt eliminate 4,2 kb din
ADN, care includ gena 2. Acesta este probabil rezultatul unui crossing-over inegal,
deoarece capetele deleiei sunt localizate n regiuni omologe, chiar la dreapta genelor
i respectiv 2. Forma R rezult prin ndeprtarea a 3,7 kb din ADN, distana
exact dintre genele 1 i 2. Se pare c aceasta este i ea generat prin crossing-over
inegal ntre genele 1 i 2.
n acelai crossing-over inegal n urma cruia sunt generai cromozomii
talasemici se obine i un cromozom care posed trei gene . Indivizi cu astfel de
cromozomi au fost identifici n numeroase populaii. n unele populaii, frecvena
locusului triplu este aproape aceeai ca a celor cu un singur locus ; n altele gena
tripl este mult mai puin comun dect gena single . Aceasta sugereaz factori

94

selectivi necunoscui opereaz la nivelul diferitelor populaii i ajusteaz nivelul

genelor.
Variaii ale numrului de gene s-au observat relativ frecvent, ceea ce
reprezint un argument c crossing-overul inegal la nivelul clusterului este destul de
comun. El apare mult mai frecvent n clusterul dect n cel , probabil deoarece
intronii genelor sunt mult mai scuri mpiedicnd mai puin mperecherea inexact
dintre genele ne-omologe.
Deleiile care provoac -talasemii. n unele cazuri (rare), este afectat
numai gena . Aceasta prezint o deleie de 600 pb, care se ntinde de la cel de al
doilea intron ctre limita regiunii 3. n alte cazuri, sunt afectate mai multe gene.
Multe dintre deleii sunt foarte lungi extinzndu-se ctre captul 5 (pe hart sunt
indicate ca depind 50kb spre dreapta).
Tipul Hb Lepore furnizeaz informaia clasic c deleiile pot rezulta n urma
crossing-overului dintre gene linkate (linked genes). Genele i difer numai prin
7% din secven. Prin recombinare inegal se nltur materialul genetic dintre ele,
astfel nct genele fuzioneaz. Genele fuzionate produc un singur lan proteic care
conine la captul N-terminal secvena polipeptidei unit cu cea a polipeptidei la
captul C-terminal.
n prezent sunt cunoscute diferite tipuri de hemoglobine Lepore, diferena
dintre acestea constnd n poziia punctului de tranziie de la secvena la secvena .
Astfel, cnd genele i se mperechiaz prin crossing-over inegal, punctul exact de
recombinare determin poziia la care se trece (switch) de la secvena la cea la
nivelul lanului de aminoacizi.
Forma reciproc a acestui eveniment a fost gsit n hemoglobina Hb antiLepore, care este produs de ctre gena care are la captul N-terminal o parte din gena
i la captul C-terminal o parte din gena . Fuziunea se produce ntre genele
normale i .
Dovada c un eveniment de crossing-over inegal poate avea loc i ntre gene
mult mai ndeprtate (ca structur) a fost furnizat prin identificarea Hb Kenya, o alt
hemoglobin fuzionat. Aceasta conine secvena N-terminal a genei i secvena
C-terminal a genei . Fuziunea trebuie s fi rezultat n urma unui crossing over
inegal ntre i , care au o diferen de secven de peste 20%.
O varietate de deleii care mpiedic att sinteza catenelor ct i determin
formarea a dou fenotipuri. n cazul HPFH (hereditary persistence of fetal
hemoglobin), n general nu exist simptome clinice; boala este ameliorat deoarece
sintezele hemoglobinelor fetale (22) continu i dup perioada de dezvoltare n care
n mod normal este dictat ncheierea sa. n talasemia exist simptome de anemie,
deoarece dei expresia genei continu la adult, ea este mult mai slab dect n cazul
HPFH. Diferena dintre HPFH i talasemiile depinde probabil de deleia unor
secvene reglatoare prezente n interiorul clusterului, dar situate n afara structuri
genelor i .

SLIDE 27. Arbore filogenetic stabilit prin analiza clusterului genelor

pentru beta-globine la diferite populaii
Clusterele de gene sufer reorganizri continue
Pornind de la diferenele observate ntre clusterele genelor globinei de la
diferite mamifere, putem concluziona c duplicrile urmate (uneori) de variaie
reprezint o trstur important a evoluiei fiecrui cluster. Deleiile prezente n

95

talasemiile umane demonstreaz c procesul de crossing-overul inegal continu s

apar pentru ambele clustere ale genelor globinei. Fiecare astfel eveniment de acest
gen genereaz, n acelai timp, duplicare i deleie, fapt care trebuie luat n
consideraie pentru ambele tipuri de loci din populaie. Deleiile pot s apar i (n
principiu) prin recombinare ntre secvene omologe poziionate pe acelai cromozom.
Aceasta nu genereaz o duplicare corespunztoare.
Este dificil s estimm frecvena natural a acestor evenimente, deoarece
forele selective ajusteaz rapid nivelele clusterelor variabile din populaie. Se poate
realiza o corelaie grosier ntre nivelul crossing-overului inegal i genele nrudite, cu
ct acestea sunt mai nrudite (att la nivelul exonilor ct i a intronilor), cu att este
mai mare ansa de mperechere imperfect (totui, unele evenimente de recombinare
inegal nu implic genele nsi, ci sunt determinate de secvene apropiate de
acestea).
n general o reducere a numrului genelor poate fi datorat apariiei unei
deleii nsoit apoi de selecia acesteia. Totui, n unele populaii, poate s existe un
echilibru avantajos care s menin forma purttoare de deleie la o frecven redus.
Care este rezultatul unei astfel de expansiuni? Singurul exemplu care a fost
bine caracterizat este locusul -triplu i anti-Lepore. Indivizii care posed 5 gene
pentru globin (un locus normal i un locus triplu) nu manifest nici o modificare n
ceea ce privete sinteza hemoglobinei. Totui, este posibil ca o cretere viitoare (al
homozigotului triplu) poate s determine modificri, prin dezechilibrarea sintezei
globinei ctre producerea unui exces de lanuri . Indivizii cu anti-Lepore posed o
gena de fuziune i au i una dintre genele normale i . Este posibil ca prezena
unor lanuri n plus s interfere cu asamblarea normal a hemoglobinei.
Nu este de dorit ca aceste modificri particulare ale numrului de gene s aib
un avantaj selectiv care le-ar putea asigura rspndirea n populaie. Dar structurile
actualelor clustere de la om posed numeroase duplicri care atest importana acestui
mecanism. Secvenele funcionale includ dou gene care codific pentru aceeai
protein, genele destul de bine nrudite i m i genele aproape identice . Aceste
duplicri independente relativ recente au aprut n populaie fr a mai meniona
duplicrile mai ndeprtate (mai vechi) care au generat diferitele tipuri de gene care
codific pentru globine. Alte duplicri au dat natere pseudogenelor sau au fost
pierdute. Este de ateptat ca duplicrile continue i deleiile s fie o trstur a tuturor
clusterelor de gene.
Pornind de la organizarea genelor globinei la o varietate de specii, se poate
trasa evoluia actualelor gene care codific pentru globine pornind de la o gen
ancestral
Dat fiind nclinaia (orientarea/proprietatea) intronilor de a se pierde n
timpul evoluiei, gena leghemoglobinei de la plante, care este nrudit cu genele
globinelor, poate fi prezentat ca o form strveche. Aceasta are un intron n plus,
care mparte domeniul de legare al hemului n dou pri.
Ultima etap n procesul evoluiei genelor globinei, nainte de apariia genelor
actuale, este cea reprezentat de secvena monocatenar a mioglobinei, care ncepe o
evoluie divergent fa de linia globinei (diverge fa de) acum aproximativ 800
milioane de ani. Gena mioglobinei are aceeai organizare ca i genele globinei, deci
putem considera structura cu trei exoni ca reprezentnd structura strmoului lor
comun, generat ntr-o anumit etap dup separarea de plante (dup divergena de
plante).
Anumite forme de peti primitivi au numai un singur tip de lan pentru
globin, deci acetia trebuie s fi suferit o evoluie divergent de la linia evolutiv
96

nainte ca gena ancestral a globinei s fi suferit procesele de duplicare care au dat

natere variantelor i . Aceste fenomen pare s fi avut loc acum aproximativ 500
milioane de ani n urm, n timpul evoluiei petilor osoi.
Urmtorul stadiu al evoluiei este reprezentat de starea genelor globinei la
broasca X. laevis, care are dou clustere pentru genele globinei. Totui, fiecare cluster
conine att genele ct i , att la formele adulte ct i la formele larvare. Clusterul
trebuie s fi evoluat aadar prin duplicarea grupelor de gene linkate -, proces urmat
de divergena copiilor individuale. Mai trziu ntregul cluster a fost duplicat.
Amfibienii s-au separat de linia mamifere/psri aproximativ acum 350
milioane de ani, deci separarea genelor i ale globinelor trebuie s fie rezultatul
unei transpoziii la nivelul unui precursor al mamiferelor/psrilor dup etapa de
separare a amfibienilor. Acest fenomen a aprut probabil n perioada timpurie a
evoluiei vertebralelor. Odat ce s-au evideniat clustere separate ale genelor care
codific pentru i globine att la psri ct i la mamifere, genele i trebuie s
se fi separat fizic nainte de divergena mamiferelor i psrilor din acest strmo
comun. Un astfel de eveniment este posibil s se fi produs acum aproximativ 270
milioane de ani.
Modificri la nivelul clusterelor i globinelor au mai aprut destul de
recent, aa cum vom vedea mai departe din descrierea divergenei genelor individuale.
Divergena secvenelor distinge dou tipuri de situsuri la nivelul ADN
Majoritatea modificrilor secvenei proteice apar ca urmare a acumulrii ncep
n timp de mici mutaii. Mutaiile punctiforme (point mutation), inseriile i deleii
mici apar la ntmplare cu o probabilitate mai mare sau mai mic n toate regiunile
genomului, cu excepia regiunilor fierbini (hotspots) n care mutaiile apar mult
mai frecvent. Majoritatea mutaiilor care schimb un aminoacid n secvena
polipeptidic sunt vtmtoare (duntoare/deleterious) i vor fi eliminate de ctre
selecia natural.
Puine mutaii pot fi avantajoase, dar acelea care se pot rspndi n populaie,
nlocuind probabil secvenele fondatoare/formatoare. Cnd o nou variant nlocuiete
versiunea anterioar a genei, se spune despre aceasta c este fixat n populaie.
Un problem discutabil este ce proporie din mutaiile care determin
modificarea unui aminoacid sunt neutre, adic fr nici un efect asupra funcionalitii
proteinei, i sunt capabile s se acumuleze ca rezultat al random drift and fixation
(micrii/evoluiei ntmpltoare i fixaiei).
Viteza (rata) cu care se acumuleaz modificrile determinate de mutaii
(mutaionale) este caracteristic fiecrui tip de protein, i se presupune c depinde
cel puin n parte de flexibilitatea acesteia fa de modificare. n interiorul unei specii,
o protein evolueaz prin substituii mutaionale, urmate de eliminarea sau fixarea n
interiorul fondului de cretere individual. Prezena n populaie a dou (sau mai multe)
variante alelice este numit polimorfism. Polimorfismul poate fi stabil, n care caz
nici una din forme nu are nici un avantaj relativ, sau poate fi tranzitoriu, cazurile n
care o variant este nlocuit cu alta. Cnd analizm fondul de gene al unei specii
evideniem numai variantele care au supravieuit.
Cnd o specie se separ n alte dou specii noi, fiecare entitate nou constituit
are un fond independent pentru evoluie. Dac comparm proteinele corespunztoare
de la dou specii, vedem diferenele pe care acestea le-au acumulat ntre ele din
momentul n care strmoii lor au ncetat s se interpun. Anumite proteine sunt nalt
conservate, fr sau cu mici diferene de la specie la specii. Aceasta indic c aproape
orice modificare este dezavantajoas i este eliminat prin selecie.

97

Diferena dintre dou proteine este exprimat prin divergena lor, care
reprezint procentul de aminoacizi diferii. Divergena dintre proteine poate fi diferit
de cea dintre secvenele corespunztoare de acizi nucleici. Sursa acestor diferene este
dat de faptul c fiecare aminoacid este codificat de un codon compus din trei baze, n
care modificarea celei de a treia baz nu are neaprat efect asupra citirii mesajului.
Secvena nucleotidic a unei regiuni codante poate fi mprit n replacement
sites (situsuri de substituie) i silent sites (situsuri mute/silenioase): i) la nivelul
replacement sites, o mutaie modific aminoacidul care este codificat. Efectul
mutaiei (deteriorat, neutru, avantajos) depinde de rezultatul nlocuirii aminoacidului;
ii) la nivelul silent sites, mutaiile determin nlocuirea unui codon sinonim cu altul,
deci n acest caz nu este vorba de o modificare a proteinei. De obicei situsurile n care
se realizeaz substituia constituie aproximativ 75% din secvena codant i cele
silenioase numai 25%.
Pe lng secvena codant o gen conine i regiuni ne-traduse. La acest nivel
mutaiile pot de asemenea s fie potenial neutre, n afar de cele care afecteaz
structura secundar sau secvena semnal reglatoare. Dei mutaiile silenioase sunt
neutre n ceea ce privete proteina, ele pot afecta expresia genei datorit modificrii
secvenei ARN. De exemplu, modificarea structurii secundare poate influena
transcripia, procesarea sau translaia. O alt posibilitate este c modificarea ntr-un
codon sinonim necesit un alt ARNt necesar pentru traducere, acest fapt putnd
influena eficiena translaiei.
Mutaiile la nivelul situsurilor de substituie pot s corespund cu divergena
aminoacizilor, care n esen reprezint procentajul de modificri. O divergen a
secvenelor de acizi nucleici de 0,45% la nivelul situsurilor de substituie corespunde
unei divergene n aminoacizi de 1% (lund n considerare c media numrului
situsuri de substituie pentru un codon este 2,25). n realitate divergena msurat
supraestimeaz diferenele care au aprut n timpul evoluiei, datorit frecvenei
evenimentelor la nivelul unui codon. De obicei aceste estimri sunt supuse unei
corecii.
De exemplu, lanurile globinelor i de la om, prezint 10 diferene n 146
de resturi, divergena fiind de 6,9% la nivelul proteinei. Secvena de ADN are 31 de
modificri n 441 resturi nucleotidice. Totui, aceste modificri sunt distribuite foarte
diferit la nivelul situsurilor de substituie i a celor silenioase. Astfel, exist 11
modificri pentru 330 situsuri de substituie, i 20 de modificri n 111 situsuri
silenioase. Ratele de divergen corecte sunt de 3,7% pentru situsurile de substituie
i de 32% pentru situsurile silenioase, ceea ce reprezint deja un ordin de diferen.
Aceast impresionant diferen n divergena constatat pentru situsurile de
substituie i cea pentru situsurile silenioase demonstreaz existena unor
constrngeri mult mai mari la nivelul poziiilor nucleotidelor care influeneaz
constituia proteinei relativ la cele nu o influeneaz. Astfel, probabil foarte puine
modificri ale aminoacizilor sunt neutre.
Ceasul evolutiv traseaz dezvoltarea genelor globinei
Cnd o anumit protein este analizat la o serie de specii, divergena dintre
secvenele fiecrei perechi comparate este (mai mult sau mai puin) proporional cu
perioada de timp de cnd acestea sunt separate. Aceasta furnizeaz un ceas evolutiv
care msoar acumularea mutaiilor la o rat aparent egal n timpul evoluiei unei
proteine date. Rata divergenei poate fi msurat ca procentul de diferen per milion
de ani, sau prin reciproca sa, unitatea de perioad evolutiv (UEP), timpul n milioane
de ani care este necesar pentru apariia unui procent de divergen de 1%. Odat
stabilit ceasul evolutiv prin comparaii ntre perechi de specii (s ne amintim

98

dificultile practice de stabilire a timpului actual de speciaie), el poate fi aplicat

genelor nrudite de la aceeai specie. Din divergena lor putem calcula timpul scurs de
la evenimentul de duplicare care le-a generat.
Prin compararea secvenelor genelor omologe, se poate determina rata de
divergen att a situsurilor de substituie ct i a celor silenioase.
Pe baza comparrii diferitelor perechi de gene (de la dou specii), s-a constat
existena unei divergene medii de 10% la nivelul situsurilor de substituie fie pentru
genele sau -globinei de la mamifere care au fost separate nainte de marea radiaie
a mamiferelor acum aproximativ 85 de milioane ani. Aceasta corespunde unei rate a
divergenei de substituie de 0,12% per milion de ani.
Rata este constant cnd comparaia este extins la gene a cror divergen
este mult mai veche (mai ndeprtat n timp). De exemplu, media divergentei de
substituie dintre genele globinelor corespunztoare de la mamifere i psri (pui) este
de 20%. Raportat la separarea care s-a produs acum aproximativ 270 milioane de ani,
se ajunge la o rat de 0,09 per milion de ani.
ntorcndu-ne n timp putem compara genele i globinelor n interiorul
speciilor. Acestea au suferit proces de divergen de cnd s-au separat tipurile de gene
acum aprox 500 milioane de ani. Ele au o divergen medie de substituie 50%, care
determin o rat de 0,1% per milion de ani. Aceste date arat c divergena de
substituie n genele globinei prezint o rat medie de 0,096% per milion de ani (sau o
UEP din 10,4). Lund n considerare incertitudinile care pot s apar n estimarea
timpului la care s-a produs divergena speciilor, rezultatele constituie un suport bun
pentru ideea existenei unui ceas linear.
Datele privind divergena la nivelul situsurilor silenioase sunt mai puin clare.
n fiecare caz, este evident c situsurile silenioase au o divergen mai mare dect cea
a situsurilor de substituie (variaz dup un factor 2 la 10). Deoarece divergena la
nivelul situsurilor silenioase este prea mare n cazul comparaiilor perechi
consideram c nu poate fi aplicat un ceas evolutiv acestor situsuri (trebuie s ne
bazm numai pe situsurile de substituie)
Rata divergenei situsurilor silenioase nu este linear n timp. Dac
considerm c divergena trebuie s fie zero la zero ani de separare, constatm c rata
de divergen pentru situsurile silenioase este mai mare n primele 100 de milioane
de ani de la separare. O interpretare este c o fracie considerat, grosier ca
reprezentnd jumtate din situsurile silenioase este rapid (n aproximativ 100
milioane ani) saturat n mutaii; aceast fracie se transform n situsuri neutre.
Cealalt fraciune acumuleaz mutaii mult mai ncet, la o rat de aproximativ egal
cu cea caracteristic situsurilor de substituie; aceast fracie se identific situsurile
care sunt silenioase n ceea ce privete proteina, dar care sunt supuse presiunii
selective din alte motive.
Dac inversm modul de calcul aplicat pentru rata de divergen putem estima
timpul de separare a genelor ntr-o specie (de cnd s-au separat anumite gene n
cadrul unei specii). Diferena ntre genele umane i este de 3,7% pentru situsurile
de substituie. Unei UEP (Unit Evolutionary Period ) de 10,4, aceste gene trebuie s
se fi separat (suferit divergen) 10,4 x 3,7 40 milioane de ani nainte de separarea
liniilor care au condus la formarea maimuelor Lumii Noi (New World monkeys),
maimuelor Lumii Vechi (Old World monkeys), primatele mari i omul. Toate aceste
primate mari au ambele tipuri de gene i , ceea ce sugereaz c divergena acestor
gene a nceput imediat dup acest punct evolutiv.
Dac analizm genele i constatm c divergena dintre situsurile de
substituie ale acestora este de 10% i corespunde unui timp de separare de 100
99

milioane de ani. Separarea dintre genele globinei embrionare i fetale trebuie s fi

precedat sau s fi nsoit radiaia mamiferelor.
Arbore al evoluiei genelor umane ale globinei. Caracteristici (trsturi)
care s-au dezvoltat nainte de radiaia mamiferelor, cum este separarea formelor /
de , trebuie s fie prezente la toate mamiferele. Caracteristicile care au evoluat dup,
cum este separarea genelor i ale globinei, vor fi regsite n linii individuale ale
mamiferelor. Se consider c n fiecare specie au avut loc modificri recente n
structura clusterelor, atta timp ct constatm diferene n numrul genelor (o singur
gen la omul adult i dou la oarece) sau n tipul acestora (nu exist nc
certitudinea existenei unei separri a genelor embrionare sau -like n cazul
globinelor de iepure i oarece). Este clar c evoluia cercetrilor va furniza date
suficiente asupra secvenelor unor gene particulare, i atunci exist mari anse ca
aceste argumente s fie contrazise sau confirmate. Un lucru este totui sigur:
comparaiile dintre gene de la diferite specii pot fi folosite pentru trasarea corelaiilor
taxonomice dintre specii pe baze moleculare.
Pseudogenele sunt capete moarte ale evoluiei
Pseudogenele sunt definite prin faptul c posed secvene nrudite cu cele ale
genelor funcionale, dar care nu pot fi traduse ntr-o protein funcional. O
pseudogen este adesea notat cu simbolul .
Unele pseudogene posed aceeai structur general ca i genele funcionale,
cu secvene care corespund exonilor i intronilor din poziiile normale. Acestea au
devenit inactive prin mutaii care pot afecta unul sau mai multe etape ale expresiei
genelor. Modificrile pot fi semnale de desfiinare (ntrerupere) a iniierii transcripiei,
mpiedicarea splicingului la nivelul jonciunilor exon-intron, sau terminarea
prematur a translaiei.
n mod normal o pseudogen are numeroase mutaii care provoac modificri,
deoarece odat ce gena a ncetat s mai fie activ, nu exist nici un impediment ca ea
s acumuleze n continuare mutaii. Pseudogene care reprezint versiuni ale genelor
active curent au fost evideniate n multe sisteme, incluznd globinele,
imunoglobulinele, antigenele de histocompatibilitate, unde acestea sunt localizate n
vecintatea clusterului genelor active sau chiar n interiorul acestuia intercalate ntre
gene.
Un exemplu tipic este pseudogena de la iepure, 2, care are o organizare
obinuit n exoni i introni, i este poziionat foarte aproape de gena 1 a globinei.
Eliminarea (deleia) unui perechi de baze la nivelul codonului 20 a 2 determin o
modificare de faz care duce la terminarea fazei deschise de lectur imediat dup
aceast poziie (codon stop). n secven exist i alte numeroase mutaii care
determin modificarea altor codoni care semnific aminoacizi bine conservai n
structura -globinelor. De asemenea, nici unul dintre introni nu mai posed capetele
de recunoatere a separrii lor de exoni, astfel nct este posibil ca intronii s nu mai
poat fi eliberai chiar dac gena ar fi transcris. Totui, nu au fost evideniai
transcripi corespunztori genei, probabil deoarece exist modificri i la nivelul
regiunii 5 care flancheaz secvena codant.
Cnd exist o astfel de list de mutaii care mpiedic potenial fiecare stadiu
al expresiei genei, nu exist modaliti prin care s putem detecta evenimentul
original care a determinat inactivarea acestei gene. Totui, prin divergena dintre o
pseudogen i o gen funcional, putem estima cnd a aprut pseudogena i cnd au
nceput s se acumuleze mutaiile la nivelul su.

100

Dac pseudogena a devenit inactiv destul de repede dup generarea sa prin

duplicare din forma 1, ne putem atepta la o rat crescut de divergen (probabil
aceeai) att pentru situsurile de substituie ct i pentru cele silenioase (Nu mai este
nici o motivaie ca acestea s difere dac gena nu mai este tradus). n acest caz sunt
mai puine substituii/mutaii n situsurile de substituie dect n cele silenioase.
Aceasta sugereaz c n primul rnd (n timpul n care gena era exprimat) a existat o
selecie a mutaiilor la nivelul situsurilor de substituie. Din dispunerea/extinderea
relativ a modificrilor/mutaiilor/substituiilor la nivelul celor dou situsuri, putem
calcula c pseudogena 2 s-a separat (a suferit divergen) de gena 1 acum 55
milioane de ani, fiind o gen funcional timp de 22 milioane de ani i devenind
pseudogen de cel puin 33 milioane de ani.
Calcule similare pot fi fcute i pentru alte pseudogene. Unele par s fi fost
active un timp nainte de a deveni pseudogene, dar altele se pare c au fost inactivate
destul de repede dup generarea lor iniial. Punctul general de vedere obinut cu
ajutorul structurilor acestor pseudogene este c fiecare a evoluat independent n
timpul dezvoltrii clusterului genelor globinei la fiecare specie. Aceasta ntrete
concluzia c crearea de noi gene, urmat de acceptarea lor ca duplicate funcionale, cu
variaii ntre apariia unei noi gene funcionale, sau inactivarea acestora ca
pseudogene, este un proces continuu ntr-un cluster de gene.
Pseudogena 3 a genei globinei are o proprietate interesant: i lipsesc ambii
introni. Aceast secven poate fi mperechiat cu ARNm pentru -globin (innd
cont de mutaiile acumulate/avnd n vedere). Timpul aparent de inactivare coincide
cu duplicarea original, ceea ce sugereaz c evenimentul de inactivare a fost asociat
cu pierderea intronilor. Cum au fost pierdui intronii? Nu exist nici o motivaie ca
sistemele de reconstituire a ADN s recunoasc graniele exon-intron, acest fapt fiind
un argument important pentru acceptarea idei implicrii ARNm n procesul de
duplicare. Este probabil ca transcriptul invers al ARNm s fi fost inserat n genom,
probabil n urma aciunii unui retrovirus.
Secvenele genomice care se aseamn unor molecule de transcript ARN sunt
numite pseudogene procesate/prelucrate (processed pseudogenes). Pornind de la ideea
c acestea au luat natere prin inserarea unui produs derivat din ARN, la nivelul unui
situs ntmpltor, ele pot fi localizate n orice regiune a genomului, i nu neaprat pe
acelai cromozom ca gena activ.
Ce trsturi sunt comune pseudogenelor? Majoritatea familiilor de gene
posed membrii care sunt pseudogene. De obicei pseudogenele reprezint o
minoritate redus din numrul total al genelor. ntr-un caz excepional, totui, exist o
singur gen activ care codific pentru o protein ribozomal la oarece i exist 15
pseudogene procesate relative. O astfel de situaie trebuie luat n considerare cnd se
ncearc calcularea numrului de gene folosind rezultatele hibridizrii acestora.
Dac pseudogenele sunt capete moarte din punct de vedere evolutiv, fiind
simple secvene ne-dorite care nsoesc genele funcionale, de ce sunt ele nc
prezente n genom? ndeplinesc ele vreo funcie sau nu au nici un scop, n acest caz de
ce nu sunt supuse presiunii selective pentru a fi ndeprtate?
Trebuie s ne reamintim c noi putem detecta genele care au rezistat (sunt nc
prezente) n populaiile actuale. Este posibil, ca n trecut un anumit numr de
pseudogene s fi fost eliminat. Aceast eliminare poate aprea prin eliminarea
secvenei sub forma unui eveniment neateptat sau prin localizarea de mutai la unu
asemenea nivel nct gena s nu mai poat fi recunoscut ca o secven membr a
familiei originale (este probabil soarta final a oricrei pseudogene care nu este
eliminat pe neateptate).
101

Este posibil ca relicve ale evoluiei s fie duplicate. n cazul genelor pentru
globin de la capr, exist dou specii adulte A i C. Fiecare dintre acestea are o
pseudogen de cteva kilobaze n amonte (numite Z i X). Cele dou
pseudogene sunt mai bine nrudite una cu cealalt dect cu oricare dintre cele dou
gene de la adult; n particular, ele manifest multe mutaii care le inactiveaz. De
asemenea, cele dou gene pentru -globin de la adult sunt mult mai bine nrudite una
cu alta dect cu pseudogenele. Aceasta implic c structura original - a fost
duplicat, dnd dou gene funcionale (care mai departe au suferit o evoluie
divergent ducnd la A i C) i la dou gene ne-funcionale (care au suferit o
evoluie divergent ctre pseudogenele actuale).
Mecanismele responsabile pentru duplicarea genelor, deleie, i evenimente
de rearanjare/redistribuire acioneaz asupra tuturor secvenelor care sunt
recunoscute ca membrii ai unui cluster, n condiiile n care acetia sunt sau nu
funcionali. Este dificil ca selecia s poat discrimina ntre produi.

SLIDE 28. Concluzii (1)

Genoamele procariotelor i eucariotelor inferioare conin puine secvene
nefuncionale, n timp ce ale vertebratelor conin multe secvene care nu codific
pentru ARN sau care nu au nici o funcie structural sau funcional. Numai 5% din
ADN genomic uman codific pentru proteine sau ARN funcional;
Lipsa unei relaii consistente ntre cantitatea de ADN din genomul haploid de
la animale i plante i complexitatea sa filogenetic este denumit paradoxul valorii
C;
Aproximativ jumtate din genele care codific pentru proteine n genomul
vertebratelor sunt gene solitare, a cror secven este prezent numai o dat n
genomul haploid. Restul sunt gene duplicate, care au aprut prin duplicarea unei gene
ancestrale urmat de mutaii ulterioare independente;
Genele duplicate cum sunt cele care codific pentru familia genelor globinei, codific proteine nrudite i n general apar sub forma unui cluster ntr-o
anumit regiune a ADN. Proteinele codificate de o familie de gene au o secven de
aminoacizi omolog dar nu identic i exprim proprieti similare puin diferite;

SLIDE 29. Concluzii (2)

La nevertebrate ct i la vertebrate moleculele de ARNr, ARNt i histone sunt
codificate de copii multiple ale genelor care sunt localizate n anumite regiuni ale
ADN genomic
Copiile singulare de ADN constau n gene solitare care codific pentru
proteine, familii de gene slab duplicate i secvene ADN spacer;
Secvenele moderat repetitive includ genele repetitive n tandem care codific
pentru ARNr, ARNt i histone; familii mari de gene duplicate i elemente de ADN
mobile;
Secvenele de ADN simple, care constau n secvente scurte i nalt-repetitive
n regiuni extinse n tandem, sunt preferenial localizate la nivelul centromerilor,
telomerilor sau prezint localizri specifice pe braele anumitor cromozomi;
Lungimea regiunii tandem a anumitor secvene simple este destul de variabil
ntre indivizii unei specii, probabil datorit crossing-overul inegal care apare n
meioz. Diferenele de lungime ale acestor secvene simple n tandem stau la baza
fingerprinting-ului ADN.

102

SLIDE 30. ADN mobil

Secvenele ADN moderat-repetitive i mobile sunt distribuite de-a lungul genomelor
procariote, plante superioare i animale.
Sunt formate din grupuri de sute la mii perechi de baze
Secvenele sunt copiate i inserate n poziii noi prin procesul de transpoziie
Par s fie secvene nefolositoare
Secvenele de ADN mobile care sunt presrate n genomul plantelor i
animalelor variind de la cteva sute la cteva mii de pb au fost pentru prima dat
descoperite la eucariote dar se gsesc i la procariote. Procesul prin care aceste
secvene sunt copiate i inserate ntr-un nou situs n genom se numeste transpoziie.
Elementele mobile ADN sau elementele mobile simple sunt n esen molecule
parazite, care par s nu aib funcii specifice n funcionalitatea gazdelor lor, dar
exist numai pentru a se automenine. Francis Crick le-a numit secvene selfish.
Transpoziia elementelor ADN se crede c se datoreaz unei acumulri
progresive (ncete) n genoamele eucariote n timpul unei perioade evolutive. Aceste
elemente pot fi i pierdute cu o vitez foarte sczut prin procesul de deleie ale
segmentelor de ADN care le conin dar i prin acumularea mutaiilor pn cnd aceste
nu mai sunt recunoscute ca fiind nrudite cu elementul mobil original ADN. Deoarece
elementele mobile sunt eliminate din genoamele eucariote destul de ncet, acestea
sunt acumulate pn la punctul n care ele constituie a proporie semnificativ a
genoamelor multor eucariote.

SLIDE 31. Dou clase de elemente mobile

Figura: a) inseria secvenelor i transpozomilor prin intermediarul ADN
b) Retrotranspozomii sunt mai nti transcrii ntr-o molecul de ARN, care apoi este
revers-transcris n ADN dublu-catenar. n ambele cazurim intermediarii dublu
catenari sunt integrai la nivelul secvenei int ADN.
Deplasarea elementelor mobile implic ADN sau ARN ca intermediari.
Primul element mobil a fost descoperit de Barbara McClintock la porumb n
1940. Ea a caracterizat aceste entiti ca fiind capabile s intre i s ias din gene,
modificnd fenotipul plantelor. Teoria sa a fost foarte controversat pn cnd
elementele mobile au fost descoperite la bacterii, unde au fost caracterizate ca
secvene specifice de ADN, i bazele moleculare ale transpoziiei lor au fost
descifrate. Cnd aceste elemente au fost descoperite, nu au fost corelate cu secvenele
moderat repetitive, care au fost anterior identificate n experimentele de reasociere.
Astfel studiul elementelor mobile la eucariote a condus la detectarea elementelor
mobile ADN la bacterii cu toate c aparent nu existau conexiuni. O dat cu evoluia
cercetrilor elementele mobile au fost mprite de dou categorii: 1) cele care sunt
transpozate direct ca ADN; 2) cele care sunt transpozate prin intermediul ARN
transcris de pe structura elementului mobil de ctre o ARN polimeraz i apoi
transformat n ADN dublu catenar de ctre o revers-transcriptaz.
Elementele mobile care transpozeaz prin intermediul unui ADN sunt
denumite transpozomi. Cele care transpozeaz la nivelul unor noi situsuri printr-un
intermediar ARN sunt numii retrotranspozomi deoarece deplasarea lor este analog
cu procesul de infecie al retovirusurilor. Intradevr, retrovirusurile pot fi considerate
ca retrotranspozomi care implic gene care codific anvelopa viral i care permit
acestora s transpozeze ntre celule. Att transpozomii ct i retrotranspozomii pot fi
clasificai n funcie de mecanismul lor specific de transpoziie

103

SLIDE 32. Elementele mobile sunt secvene ADN sau ARN

La bacterii majoritatea elementelor mobile sunt transpozate direct ca ADN.
Din contr, majoritatea elementelor mobile de la eucariote sunt retrotranspozomi dar
au fost identificai i transpozomi (ex cei iniial descoperii).

SLIDE 33. Structura general a elementelor bacteriene IS

Prezena elementelor mobile la bacterii a fost pentru prima dat evideniat la
E. coli cnd au fost evideniate mutaii ca urmare a inserrii spontane a unei secvene
de aprox 1-2 kb, n mijlocul unei gene. Astfel de elemente se numesc elemente IS
(insertion sequences). Au fost vizualizate prima dat prin analiza microscopic a
hibrizilor (heteroduplexurilor) formate dintre tipul slbatic i cel mutant. Deoarece
elementul IS integrat ntr-o caten mutant nu gsete complement pe catena
slbatic, formnd o bucl monocatenar extins care se evideniaz relativ uor la
nivelul heteroduplexului. Astfel, la E. coli au fost evideniate peste 20 de elemente IS
diferite. Cu toate acestea transpoziiile elementelor IS este un eveniment foarte rar,
care apare numai la 105-107 celule/per generaie. Rate mai mari de transpoziie vor
mri ratele de mutaii ale celulelor bacteriene. Cu rate foarte sczute de transpoziie,
majoritatea celulelor gazd supravieuiesc i astfel propag elementul parazit IS. La
transpoziia elementului IS la nivelul unor situsuri aleatoare anumite secvene
transpozate se plaseaz n regiuni neeseniale ale genomului (ex. regiunile dintre
gene), crescnd numai numrul de elemente IS din celul. Elementele IS se pot insera
i n plasmide sau virusuri lizogene cnd sunt transferate n alte celule. Cnd se
ntmpl acest lucru, elementele IS vor fi transpozate n celule virgine.
Figura reprezint structura general a elementelor IS. Repetiiile inversate, de
aproximativ 50 pb sunt invariabil prezente la capetele IS i au secvene caracteristice
fiecrui tip de element. ntre repetiiile inversate exist o regiune codant pentru
proteine care codific una sau dou enzime necesare transpoziiei elementului ntr-un
nou situs.
Un important semn distinctiv al al elementelor IS o reprezint prezena
repetiiilor directe scurte, care conin 5-11 pb, imediat adiacente ambelor capete ale
elementului inserat. Lungimea repetiiei directe este caracteristic fiecrui element IS,
dar secvena sa depinde de situl secvenei int la nivelul creia elementul IS este
inserat. Cnd secvena unei gene mutante care conine un element IS este comparat
cu secvena slbatec dinainte de transpozare, se evideniaz numai o singur copie
a secvenei repetitive directe n gena slbatic. Duplicarea acesteia pentru a da
natere unei noi secvene repetitive adiacente elementului IS apare n timpul
procesului de inserare.

SLIDE 34. Structura general a transpozomilor bacterieni

Enzima care caracterizeaz transpoziia unui element IS este numit
transpozaz. n cel mai simplu mecanism de transpoziie, un element IS este este
excizat dintr-o anumit localizare i este inserat ntr-o nou poziie n cromozomul
bacterian printr-un proces nereplicativ.
n acest mecanism, moleculele transpozabile leag secvenele repetitive
inversate prezente la fiecare capt al elementului IS din ADN donor i l cliveaz cu
precizie (la un situs precis). Moleculele de transpozaz se leag i ele i fac tieturi
decalate ntr-o secven scurt din ADN int genernd capete monocatenare. Aceast
enzim remarcabil leag apoi capetele terminale 3 ale secvenei int, umplnd
breele monocatenare i genernd o secven repetitiv scurt chiar la capetele

104

elementului IS nou inserat. Aceasta este originea repetiiilor directe scurte care
flancheaz elementele IS. Anumite elemente IS transpozeaz printr-un mecanism
replicativ mult mai complicat; n acest caz o copie a elementului IS original este
generat n secvena int n timp ce copia original este reinut n secvena donoare
ADN.
Transpozomii bacterieni. Pe lng elementele IS, bacteriile conin elemente
genetice mobile compuse care sunt mai mari dect elementele IS i conin una sau
mai multe gene care codific pentru proteine, altele dect cele necesare pentru
transpoziie. Denumite transpozomi bacterieni, aceste elemente sunt compuse din
gene de rezisten la antibiotice flancate de dou copii ale aceluiai element IS.
Inserarea unui transpozom ntr-o plasmid sau n ADN cromozomial este uor
detectabil datorit achiziionrii rezistenei la un anumit antibiotic. Transpoziia
produce o repetiie direct scurt a secvenei int de fiecare parte a transpozomului
nou integrat, ca i pentru elementele IS.
Transpozomii sunt unelte importante pentru genetica bacterian. Acestea pot fi
introduse n plasmidele celulare sau n genoamele virale. O dat transferai ntr-o
celul, transpozomii acioneaz ca mutageni care afecteaz numai o singur gen
celular. Deoarece transpoziia este un eveniment rar, celulele mutante sunt izolate
datorit, mai ales, rezistenei la antibiotice pe care o achiziioneaz. Situsul unei
transpoziii poate fi determinat prin cartare de restricie care evideniaz inseria mai
ales n cazul transpozomilor mari ADN. Secvena precis a ADN bacterian la nivelul
situsului de inserie poate fi determinat prin secveniere, folosind un primer
complementar cu secvena cunoscut a repetiiilor inversate de la captul
transpozomilor.

SLIDE 35. Model pentru transpozitia IS

Etape: 1) Transpozaza, care este codificata de elementul IS (IS10 in acest
exemplu), taie ambele catene ale ADN donor n imediata proximitate a repetiiilor
inversate (rosu nchis), exciznd elementul IS10. Transpozaza taie la nivelul unui situs
ADN int ales aleator. n cazul IS10, cele dou tieturi sunt la o distan de 9 bp. 2)
Ligarea capetelor 3 ale elementelor IS la capetele tiate ale secventei int este de
asemenea catalizat de ctre transpozaz; 3) Cele 9-bp ale tieturii monocatenare
ADN, rmase n structura intermediar format, sunt umplute de ctre ADN
polimeraza celular; n final o ADN ligaz formeaz legturi 3-5 fosfodiester ntre
capetele 3 ale secventei ADN int extinse i capetele 5 ale elementului IS10. Acest
proces are ca rezultat duplicarea secvenei int la fiecare dintre capetele elementului
IS inserat. De retinut ca elemental IS nu este figurat la scal. [See H. W. Benjamin
and N. Kleckner, 1989, Cell 59:373, and 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4648.]

SLIDE 36. Retrotranspozomii virali conin secvene LTR i se

comport n genom asemeni retrovirusurilor
Transpozomii de la eucariote.
Barbara McClintock care a descoperit prima elementele mobile a fcut
observaia c anumite mutaii spontane care afecteaz producerea unora dintre
enzimele necesare formrii antocianiunei, un pigment purpuriu. O clas din aceste
mutaii este reversibil cu o frecven destul de mare n timp ce a doua clas nu sufer
reversii numai dac ele apar n prezena primei clase de muataii. McClintock a numit
agentul responsabil de prima clas de mutaii element activator (Ac) i l-a considerat
responsabil de elementele celei de a doua clase elemente disociative (de disociere)
(Ds) deoarece aceste tind i ele s se asocieze cu ruperile (scindrile) cromozomale.
105

La muli ani dup aceast descoperire, clonarea i secvenierea au evideniat

c elementele Ds sunt deletate de ctre elementul AC cruia i lipsete o regiune a
secvenei care codific pentru transpozaz. Totui, la plantele care posed elementul
Ac i care posed o tranpozaz funcional, elementele Ds nu se pot deplasa singure.
Structura acestor elemente eucariote este similar cu elementele IS de la bacterii i par
s se deplaseze printr-un mecanism nereplicativ. O serie de elemente mobile au fost
descoperite i la alte eucariote. De exemplu, aproximativ jumtate din mutaiile
spontane observate la Drosophila sunt datorate inseriei elementelor mobile. Totui
majoritatea elementelor mobile de la Drosophila funcioneaz ca retrotranspozomi.
Cel puin unul-elementul P fucioneaz ca un transpozom, deplasndu-se printr-un
mecanism nereplicativ similar cu cel folosit de secvenele de inserie de la bacterii.
Metodele curente de contruire a drosophilelor transgenice depind de utilizarea
expresiei crescute a elementului P i folosirea intelor repetitive terminale pentru
transpoziie.
Retrotranspozomii virali conin LTR i se comport ca retrovirusurile n genom
Toate eucariotele studiate, de la drojdii la oameni, conin retrotranspozomi,
elemente mobile ADN care transpozeaz prin intermediul ARN folosind o
reverstranscriptaz. Aceste elemente mobile se pot mpri n dou categorii majore:
retrotranspozomi virali i nevirali. Retrotranspozomii virali sunt abundeni la drojdii
(ex elementele Ty) i la Drosophila (elementele copia). La mamifere,
retrotranspozomii neretrovirali sunt cele mai comune tipuri de elemente mobile (vor fi
descrise n continuare). Cu toate acestea, se estimeaz c retrotranspozomii umani
reprezint aproape 4% din ADN uman.
Structura general a retrotranspozomilor virali de la eucariote este prezentat
n figur. n plus, pe lng repetiiile directe scurte din 5 i 3 toi retrotranspozomii
virali sunt marcai prin prezen unor repetiii terminale lungi (LTR-long terminal
repeats) de 250-600 pb care flancheaz regiunea care codific pentru protein. LTR
sunt caracteristice ADN retroviral integrat i sunt critice pentru ciclul de via al
retrovirusurilor. Mai mult, elementele Ty i copia implic mecanisme similare celor
prin care ADN retroviral este integrat n gennomul unei celule gazd i ARN
retroviral este generat.

SLIDE 37. Generarea ARN genomic retroviral din ADN integrat

retroviral
Trebuie s inem seam de funciile distincte ale ale celor dou LTR ale ADN
retroviral integrat, n generarea ARN genomic retroviral, care corespund
intermediarului ARN implicat n transpoziia elementelor Ty i copia. LTR din stnga
funcioneaz ca un promotor care direcioneaz ARN polimeraza II din celula gazd
pentru iniierea transcripiei ncepnd de la captul 5 al secvenei R. Dup ce ntregul
ADN retroviral a fost transcris, secvena ARN corespunztoare LTR din partea
dreapt direcioneaz enzimele care proceseaz ARN n celula gazd pentru a cliva
transcriptul primar i a aduga coada poli (A) la captul 3 al secvenei R. Genomul
retroviral rezultat este total lipsit de LTR. Totui, dup ce virusul infecteaz celulele,
revers-transcripia genomului ARN de ctre revers-transcrptaza codificat de ctre
virus conduce la un ADN dublu-catenar cu secvene LTR.

106

SLIDE 38. Generarea secvenelor LTR n timpul reverstranscripiei ADN genomic retroviral (1)
Figura: O serie complicat de 9 evenimente genereaz o copie ADN dublucatenar a genomului ARN al retrovirusului. ARN genomic este mpachetat ntr-un
virion cu un ARNt retroviral specific hibridizat cu o secven complementar situat
n apropierea captului 5 i numit Primer Binging Site (PBS). ARN retroviral are o
secven scurt repetitiv la fiecare capt al secvenei R. ntreaga reacie este
catalizat de ctre revers-transcriptaz care realizeaz sinteza ADN i diger ARN din
hibridul ADN/ARN. ntregul proces conduce la o molecul dublu-catenar de ADN
care este mai lung dect matria ARN i posed LTR la fiecare capt.
Integraza, o alt enzim codificat de ctre retrovirus, insereaz apoi ADN
dublu-catenar retroviral n genomul celulei gazd; n acest proces, secvenele
repetitive scurte directe ale secvenei int sunt generate la fiecare capt al secvenei
virale inserate. Ca i ADN retroviral, elementele Ty i copia codific
reverstranscriptaza i integraza; se consider c aceste enzime funcioneaz
transformnd intermediarl ARN n ADN i insernd ADN n situsul int ntr-o
manier similar retrovirusurilor.
Elementele Ty transpozeaz ntr-o proporie foarte sczut, probabil datorit
inseriei aleatoare a elementelor Ty n fiecare genom, care conin un spacer relativ
mic i un intron ADN, care adesea inactiveaz genele. Totui, cnd celulele de drojdii
sunt transformate cu plasmide care conin elementul Ty clonat dup un promoter
sensibil la galactoz, producerea ARNm pentgru Ty i transpoziia Ty este mai mare
n prezena galactozei dect n absena acesteia. Aceast cretere a fenomenului de
transpoziie a Ty este rezultatul creterii ARNm al Ty, care poate funciona ca o
matri pentru revers-transcriptaza i integraza exprimat de Ty.
n contrast cu elementele Ty, regiunea codant de a elementelor Ac de la
porumb conine introni. Prezena intronilor n elementele Ac susine concluzia c ei
transpozeaz prin directa deplasare a secvenelor de ADN i nu prin rfeverstranscrierea unui intermediar ARN.

SLIDE 39. Generarea secvenelor LTR n timpul reverstranscripiei ADN genomic retroviral (2)
SLIDE 40. Plasmidele recombinante folosite pentru a demonstra
ca elementul Ty de la drojdii transpozeaza prin intermediul ARN
Cnd celulele de drojdii sunt transformate cu plasmida care conine elementul
Ty, elementul Ty poate s fie transpozat n noi situsuri, proces care n mod normal
apare cu o rat sczut. Folosind elementele diagramate n partea de sus a figurii,
cercetatorii au obinut doi vectori plasmidiali diferii care conin elementele Ty
adiacente unui promotor sensibil la galactoza. Aceste plasmide au fost utilizate pentru
transformarea celulelor de drojdie care au fost crescute pe mediu cu galactoza i pe
mediu fr galactoz. n experimentul 1, creterea celulelor pe mediu cu galactoz a
determinat apariia unui numr mai mare de transpoziii dect n cazul celor crescute
pe mediu fr galactoz. Acest experiment demonstreaz necesitatea existenei unui
transcript ARNm intermediar n vederea transpoziiei elementului Ty. n experimentul
2, un intron strin (care nu are legtur cu gena de drojdie) a fost inserat n faza
codant de lectur care codific pentru proteina recombinant galactoz-elementul
Ty. Lipsa intronului n elementele Ty transpozate reprezint o eviden clar a
faptului c mecanismul procesului de transpoziie presupune prezena unui
107

intermediar ARNm care n urma procesului de maturare (splicing) pierde intronul, aa

cum se poate vedea n figur. n contrast, transpozomii ADN de la eucariote, cum este
cazul elementului Ac de la porumb, conin introni n gena care codific pentru
transpozaz, indicnd astfel c acetia nu se deplaseaz (nu transpozeaz) printr-un
mecanism care necesit prezena unui intermediar ARN [See J. Boeke et al., 1985,
Cell 40:491.].

SLIDE 41. Retrotranspozomii ne-retrovirali sunt lipsii de

secvene LTR
Retrotranspozomii ne-retrovirali nu posed LTR i se deplaseaz printr-un
mecanism neobisnuit
Cele mai abundente elemente mobile la mamifere sunt retrotranspozomii neretrovirali crora le lipsesc LTR. Multe dintre acestea aparin la dou clase de
elemente moderat repetitive care se gsesc la mamifere: Long Interspersed Elements LINES i Short Interspersed Eledments SINE. La mamifere a fost identificat o
clas de secvene SINE i peste 10 clase de secvene LINE. LINE au fost evideniate
i la protozoare, insecte i plante dar din motive necunoscute posed o distribuie mult
mai larg la mamifere.
Numrul mare de secvene SINE i LINE la eucariotele superioare au fost
acumulate evolutiv prin copierea repetat a unei secvene la nivelul ctorva poziii din
genom i inserarea copiilor n noi poziii. Nu conin secvene LTR.

SLIDE 42. Retrotranspozomii ne-retrovirali se deplaseaz printrun mecanism neobinuit. Elementele LINE L1
Cele mai comune elemente LINE la mamifere sunt familia L1. n genomul
uman sunt peste 600 000 copii ale L1 (aprox 15% toatal genom). Structura general a
L1 se bazeaz pe o secven consens (medie) prezentat n figur. Elementele L1 sunt
de obicei flancate de scurte repetiii directe, marca elementelor mobile. Secvena
consens conine dou faze de lectur de aprox 1 kb i 4 kb. ORF1 codific pentru o
protein de legarea a ARN iar ORF2 este similar cu secvena reverstranscriptazei din
retrovirusuri sau din retrotranspozomii virali.
Dovezile privind deplasarea elementelor L1 vin din analizele ADN uman
clonat de la pacienii cu diferite maladii genetice. Analiza ADN de la aceti pacieni a
evideniat c mutaiile pe care le purtau se datorau inseriei unui element L1 la nivelul
unei gene, fr ca un astfel de elemt s fie prezent la prini.
Deoarece elementele L1 nu conin secvene LTR nseamn c mecanismul lor
de transpoziie prin intermediul ARN trebuie s difere de cel al reztrotranspozomilor
virali la care LTR au rol crucial. Studiile in vitro au indicat c transcripia lui L1 este
direcionat de secvene promotoare localizate la captul stng al elementului. La
captul din dreapta a fost evideniat o regiune bogat n A/T care se continu cu
resturi A n transcripii ARN.
Adesea secvenele L1 conin codoni STOP i mutaii frameshift la nivelul ORF1 i
ORF2, acestea fiind acumulate n L1 n timpul evoluiei. Meninerea transpoziiei L1
necesit ca mcar o secven L1 s i pstreze intacte fazele de lectur care codific
pentru reverstranscriptaze i celelalte proteine necesare transpoziiei L1.

SLIDE 43. Structura general a LINE, una din cele dou clase de
retrotranspozomi non-LTR n ADN de mamifere

108

Lungimea situsurilor int care conin repetiii directe variaz prin numrul de
copii pentru fiecare element la diferitele situsuri int din genom. Dei, lungimea
total a secvenei L1 este de 6kb, n 90% din situri de integrare n care acest element a
fost evideniat, nu au fost evideniate variaii n regiunea 5 (regiunea bogat n AT).
Faza deschis de lectur 1(ORF1), mai scurt, de aproximativ 1kb, codific pentru o
proteina de legare la ARN (RNA-binding protein). Faza deschis de lectur 2
(ORF2), de aproximativ 4kb, codific pentru o protein bifuncional cu activitate
reverstranscriptazic i endonucleazic.

SLIDE 44-45. Mecanisme propuse pentru revertranscrierea si

integrarea LINE
Este prezentat numai proteina produs de ORF2. Secvenele ADN LINE nou
sintetizate sunt colorate n negru [Adapted from D. D. Luan et al., 1993, Cell
72:595.]

SLIDE 46. Elementele ADN mobile au probabil o influen

semnificativ n evoluie
Cu toate c elementele ADN mobile nu par s aib o funcie direct alta dect
meninerea propriei existene, prezena lor probabil a avut i are un impact major n
evoluia organismelor.
De exemplu:
- elementele mobile evideniate ca inducnd mutaii spontane la Drosophila ca
urmare a inserrii ntr-o sau n apropierea unei uniti de transcripie;
- elemtele mobile detectate n genele mutante.
n plus, recombinarea omolog ntre elementele mobile disxpersate de-a
lungul genoamelor ancestrale pot avea un important rol n duplicarea genelor i n alte
rearanjamente de-a lungul evoluiei. Clonarea i secvenializarea clusterului betaglobinelor de la diferite specii de primate au evideniat c genele G i A au aprut
ca urmare a crossing-overului omolog inegal dintre dou secvene L1.
Astfel de duplicri i rearanjamente ale ADN contribuie mult la evoluia noilor
gene. Se poate considera c duplicarea genelor este anterioar evoluiei unui numr
mic de familii de gene care ulterior au achiziionat funcii utile i distincte.
ADN mobil a putut influena i evoluia genelor care conin mai multe copii a
unor exoni similari care codific domenii proteice similare (de ex gena fibronectinei).
Recombinarea omolog ntre elementele mobile inserate n introni contribuie probabil
la evoluia intronilor unor astfel de gene. Unele studii sugereaz c n timpul evoluiei
eucariotelor superioare, apare recombinare ntre intronii unor gene distincte, genernd
noi gene formate din noi combinaii de exoni pre-existeni. De exemplu, activatorul
tisular al plasminogenului, receptorul Neu, factorul de cretere epidermal conin un
domeniu EGF

SLIDE 47. Amestecarea exonilor (Exon shuffling) prin recombinare

ntre repetiii interspaiatoare omologe
Recombinarea ntre repetiii interspaiatoare omologe situate ntre intronii
genelor separate determin producerea unor uniti de transcripie cu noi combinaii
de exoni. n exemplul din figur, este demonstrat un dublu crossing-over ntre dou
poziii care conin repetiii Alu care determin schimbul de exoni ntre dou gene.

109

SLIDE 48. Amestecarea exonilor (Exon shuffling) prin transpoziie

(a) Transpoziia unui exon flancat de transpozomi ADN omologi ntr-un intron al unei
a doua gene. Asa cum se vede n figur, ntr-o prim etap transposaza poate
recunoate i cliva ADN la capetele repetitive inversate ale transpozomului din gena 1
determinnd eliberarea transpozomului. Tot transpozaza este responsabil de
inserarea ulterioar a transpozomului n gena 2, ntr-un situs int de inserie care se
afl la nivelul unui intron. Rezultatul net se traduce prin inseria exonului din gena 1
n gena 2. (b) Integrarea unui exon dintr-o gen n alta prin intermediul transpoziiei
secvenelor LINE. Anumite secvene LINE posed semnale slabe poliA. n astfel de
situaii, este posibil ca transcripia acestor elemente LINE, n ARNm, s se continue i
cu exonul genei 1 poziionat n 3 fiind astfel trancrise i semnalele de clivare i de
poliadenilare proprii genei 1. Aceast molecul de ARNm poate fi ulterior reverstranscris i integrat de ctre LINE n faza deschis de lectur a proteinei 2 (ORF2)
la nivelul unui intron al acestei gene, introducnd astfel un nou exon n 3 la nivelul
acestei gene.

SLIDE 49. Domeniile structurale i funcionale sunt module ale

structurii teriare
Evoluia genelor care codific aceste proteine ar fi putut implica recombinri
ntre elemente mobile care au avut drept rezultat inseria unui exon care codific EGF
ntr-un intron al unei forme ancestrale ale fiecreia dintre aceste gene. Termenul
exon shuffling (amestecare a exonilor) a fost introdus pentru a defini acest tip de
proces evolutiv.
Recombinarea dintre elementele mobile poate s fi jucat un rol i n
determinarea genelor specifice care sunt exprimate n anumite tipuri celulare
particulare i privind nivelul expresiei acestora n anumite momente ale dezvoltrii
celulare sau a organismului.
Aa cum am discutat genele eucariote posed regiuni de control a transcripiei,
numite ENHANCER care pot opera la o distan de mii de perechi de baze. De
asemenea transcripia unei gene poate fi controlat prin efectul combinat a mai multor
sevene enhancer. Recombinarea elementelor mobile inserate aleator lng
enhancer poate contribui la evoluia combinaiilor de enhancers care controleaz
genele la organismele moderne.

SLIDE 50. Concluzii (1)

Majoritatea secvenelor ADN moderat repetitive de la nivelul a numeroase
situsuri din genomul eucariotelor superioare provin din elementele ADN mobile;
Elementele ADN mobile codific enzime care le insereaz secvena n noi
situsuri ale ADN genomic;
Elementele ADN mobile care transpozeaz direct ctre noi situsuri sunt
numite transpozomi; cele care sunt mai nti transcrise n ARN i apoi sunt reverstranscrise n ADN sunt denumite retrotranspozomi. Ambele tipuri produc secvene
repetitive scurte la situsul de inserare, care flancheaz elementul mobil. Lungimea
repetiiilor directe depinde de tipul de element mobil.
Elementele mobile de la bacterii IS- i transpozomii bacterieni se deplaseaz
prin intermediari ADN. Ambii codific pentru transpozaz, dar trapozomii mai lungi
conin i alte gene care codific pentru proteine, n general, gene pentru rezisten la
antibiotice.

110

Transpozomi cu structur similar elementelor IS sunt prezeni i la eucariote

(ex, elementul P de la Drosophila), dar retrotranspozomii sunt mult mai abundeni la
eucariotele superioare.
Retrotranspozomii virali sunt flancai de secvene repetitive terminale lungi
(LTR), similare celor de ADN retroviral i care, asemeni retrovirusurilor, codific
revers-transcriptaz i integraz. Ei se deplaseaz n genom prin transcriere n ARN,
care sufer revers-transcriere i integrare n cromozomul celulei gazd)

SLIDE 51. Concluzii (2)

Retrotranspozomii ne-virali nu posedd LTR i au a regiune bogat n A/T
la unul din capete. Se consider c aceste elemete mobile se deplaseaz printr-un
mecanism ne-viral neobinuit;
Cele mai abundente elemente mobile la vertebrate sunt dou tipuri de
retrotranspozomi ne-virali numite LINE i SINE. Ambele par s cauzeze mutaii
asociate cu bolile genetice umane;
SINE manifest o omologie crescut cu moleculele mici de ARN celular
transcrise de ARN polimeraza III. Cele mai comune secvene SINE, la oameni, conin
un situs de restricie AluI i sunt numite secvene Alu. Acestea sunt secvene de
aproximativ 300 pb dispersate n genomul uman i reprezint 5% din acesta;
Unele secvene de ADN sunt derivate din molecule de ARN celular care au
fost revers-transcrise i inserate n ADN genomic, n timpul evoluiei. Cele derivate
din ARNm se numesc pseudogene procesate i le lipsesc intronii (aceasta fiind o
trastur care le difereniaz de pseudogene care au aprut prin deriva unor secvene
ale genelor duplicate);
Dei elementele mobile par nefuncionale pentru organismul individual, ele
trebuie s fi influenat semnificativ evoluia

SLIDE 52. Rearanjamente funcionale la nivelul ADN cromozomial

n contrast cu transpoziia elementelor mobile n ADN genomic, care par s nu
serveasc direct, funionrii imediate a organismului, exist diferite tipuri de
rearanjamente ale regiunilor ADN care sunt benefice pentru organism. Aceste
rearanjamente funcionale, care au fost identificate att la eucariote ct i la
procariote, apar prin inversii i deleii ale segmentelor de ADN i prin amplificarea
ADN. Aceste aranjamente funcionale joac i un rol important n reglarea unor gene,
cel mai frecvent mecanism de control implicnd reglarea transcripiei.

SLIDE 53. Genele pentru anticorpi sunt asamblate prin re-aranjarea

liniilor ADN germinale
Unul dintre cele mai remarcabile aspecte ale rspunsului imun este vasta
diversitate a anticorpilorcare pot fi orientai ctre multe antigene posibile i particule
individuale. Se estimeaz c un individ poate produce potenial mai multe milioane de
tipuri de anticorpi cu specificiti pentru tot attea tipuri de antigene diferite. Un
milion de molecule de anticorpi diferii nu pot fi codificai direct de genomul uman,
cnd genomul conine numai aproximativ 100 000 de gene. Mecanismul molecular de
generare a unei astfel remarcabile diversiti pornind de la o cantitate limitat de ADN
este acum neles. Inversiile i deaiile regulate au un rol important n proces. Pentru
a nelege cum se realizeaz acest lucru trebuie mai nti s ne amintim structura
anticorpilor.

111

Structura pe domenii a anticorpilor

Anticorpii aparin unei clase de proteine numite imunoglobuline, care
constituie aproximativ 20% din proteinele din snge. Cel mai abundent tip de
anticorpi, imunoglobulinele G (IgG) sunt molecule simetrice compuse din patru
lanuri polipeptidice: dou identice grele H (heavy) de 55 kDa i dou identice uoare
L (light) de 23 kDa. Lanurile uoare sunt compuse din dou domenii, un domeniu
terminal numit VL, deoarece este uor diferit sau variabil ca secven i ca structura
diferitelor molecule de anticorpi, i un domeniu C terminal numit CL, care are o
structur identic sau constant n toate moleculele IgG. Similar, lanurile grele sunt
compuse din patru domenii, un domeniu N-terminal variabil VH i trei domenii
constante denumite CH1, CH2, CH3.
Moleculele de anticorp leag o molecul de antigen prin intermediul
suprafeelor create la intefaa domeniilor VL i VH ale antenelor n Y ale moleculei.
n consecin, specificitatea de legare a unui anticorp este determinat de secvena
dfomeniilor VL i VH.

SLIDE 54. Organizarea lanurilor uoare

Organizarea lanurilor uoare ADN
Anticorpii sunt produi de limfocitele B. Genele care codific anticorpi cu
diferite specificiti de legare nu sunt motenite direct din oul fertilizat. Mai degrab
acestea sunt asamblate dintr-un numr de fragmente separate prezente n ADN-ul
liniei germinative; acest proces apare n timpul dezvoltrii celulelor B din celulele
stem ale mduvei spinrii. De exemplu, un aranjament funcional al genelor care
codific pentru lanul uor k (tipul major de la oarece i la om) conine trei segmente.
La captul 5 este segmentul Lk; acesta codific pentru o peptid semnal sau ledader
care direcioneaz proteinele nou traduse n reticolul endoplasmatic pentru prepararea
secreiei extracelulare a acestora. n timpul procesului post-translaional peptida
semnal este nlturat din structura lanului uor i nu este prezent n molecula de
anticorp matur. Cel de al doilea segment codific pentru domeniul VL al lanului
uor i al treilea segment de la captul 3 codific pentru domeniul CL.
Aa cum vedem n figur, ADN celulelor germinative i a altor celule cu
excepia limfocitelor B mature (de ex. sperm, ou) conin un locus k care posed o
regiune variabil la captul su 5. Aceast regiune const ntr-o banc segmente
leader Lk i variabil Vk coninnd aproximativ 100Lk +Vk uniti la om; aceste
uniti sunt distribuite n tandem de-a lun gul unui fragment de ADN ( Segmentul Lk
corespunde exonului leader din gena final; segmentul Vk prinde majoritatea dar nu
ntreg exonul final VL care codific regiunea variabil a lanului uor). Fiecare dintre
unitile Lk +Vk sunt lungi de aproximativ 400 nucleotide i sunt separate de
aproximativ 7 kb; astfel 100 de uniti Lk+Vk acoper aproximativ 740 kb. Regiunea
variabil a locusului k este urmat de cinci segmemente de mbinare (joining-Jk) i un
segment constant Ck, n ADN germinativ uman. Cele 5 segmente Jk sunt dispuse n
tandem i sunt separate de aproximativ 20 kb de captul 3 al regiunii variabile.
Fiecare dintre segmentele Jk este de aproximativ 30 nucleotide i sunt mprtiate pe
o distan de aprox 1,4 kb. ntre segmentul 3 Jk i segmentul circular Ck exist un
fragment de 2,4 kb. Numrul segmentelor Vk i Jk variaz cu speciile de mamifere,
totui exist ntotdeauna mult mai multe segmente Vk dect Jk.

112

SLIDE 55. Rearanjarea ADN care codific lanurile uoare,

Rearanjarea lanurilor uoare ADN
Cnd ADN se reorganizeaz pentru a face funcional o gen k, un segment
Vk este reunit cu un segment Jk. Aceast reunire este realizat de o recombinaz
situs-specific care recunoate secvenele de la captul 3 al fiecrui segment Vk i
capetele 5 ale segmentului Jk. Recombinarea ntre aceste secvene are ca rezultat o
deleie i o inversiune la nivelul secvenei participante, depinznd dac unitatea Lk +
Vk posed aceeai orientare transcripional sau orientare opus fa de segmentul Jk.
Aceast recombinare formeaz regiunea variabil complet. Mai mult, se cunoate c
orice Vk se poate reuni cu cu oricare Jk alegerea fiind aleatoare. O dat ce segmentele
Vk i Jk sunt reunite, regiunile variabile i constante sunt transcrise mpreun ntr-un
transcript ARN primar. Secvenele care intervin ntre Lk i Vk i ntre Jk i Ck
(icluznd oricare dintre regiunile Jk rmase) sunt apoi nlturate prin splicigul ARN
pentru a obine proteina lanului uor k.
Atta timp ct fiecare segment Vk i Jk are o secven nucleotidic unic,
reunirea Vk-Jk alre celor 100 segmente Vk i 5 segmente Jk n liniile germinative
umane poate produce 500 posibile lanuri diferite. Dar reunirea Vk-Jk genereaz o i
mai mare variabilitate dect pot sugera aceste calcule deoarece un numr mic, variabil
de nucleotide sunt pierdute din segmentele Vk i Jk atunci cnd ele sunt reunite.
Imprecizia procesului de reunire crete mult diversitatea secvenei posibile de
aminoacizi a VL codificat de ctre regiunile Vk-Jk reunite. Semnificativ aceast
regiune codific muli dintre aminoacizii din situsul de legare a antigenului la captul
domeniului VL.
Pierderea aleatoare a nucleotidelor la situsul de reunire genereaz o diversitate
semnificativ n acest punct, dar sistemul pltete pentru aceast diversitate. Costul
este evident dac ne amintim constrngerile unei structuri codante. Trebuie s inem
seam c o secven codant trebuie citit sub form de triplete, i c AUG
(metionin) este codonul care definete o faz de lectur care grupeaz restul regiunii
codante in triplete. Astfel reunirea a dou piese de fragmente de ADN cum sunt Vk i
Jk pot produce o nou faz de lectur corect sau incorect care produce protein nonsens. Deoarece reunirea segmentelor se face aleator, dou din trei reuniuni determin
formarea unei proteinre non-sens.
n concluzie, au fost descrise trei surse de diversitate:
- variabilitatea secvenei multor segmente Vk la nivelul locusului k;
- variabilitatea variabilitatea secvenelor unui mic numr de segmente Jk;
- variabilitatea numrului de nucleotiode deletate la reunirea Vk-Jk.
Exist i alte procese care genereaz o mult mai mare variabilitate prin modificarea
secvenei ADN la nivelul reunii segmentelor.

SLIDE 56. Organizarea i rearanjarea secvenelor ADN ale lanurilor

grele
Organizare i rearanjamentul lanurilor grele ADN
Genele funcionale care codific lanurile grele ale anticorpilor sunt formate
prin procese similare celor deja descrise anterior pentru lanurile uoare. Analiza
situsurilor de legare ale a antigenelor la numeroi anticorpi sugereaz c contribuia
lanurilor grele la contactul cu antigenele este chiar mai mare dect contribuia
lanurilor uoare. n concordan cu necesitatea de diversitate la nivelul lanurilor
grele, trei bnci de segmente genetice contribuie la variabilitatea regiunii funcionale
a lanurilor grele. Primele dou sunt formate din bncile fragmentelor VH i JH ale

113

lanurilor grele iar cea de a treia este format din diversitatea segmentelor D
(diversity) care sunt localizate ntre celelalte dou bnci.
Diversitatea este asigurat de dou procese de reunire, VH cu D i D cu JH.
Cu siguran c reunirea a trei fragmente ofer o diversitate mult mai mare de
combinare. ADN din liniile germinale umane conine aproximativ 100 segmente Vh,
30 segmente D i 6 segmente funcionale JH. Pe lng diversitatea furnizat de
reunirile aleatoare ale segmentelor VH cu D i a D cu JH o anumit diversitate este
furnizat de pierderea nucleotidelor la realizarea jonciunilor care apar la combinarea
segmentelor. ADN pentru lanurile grele din liniile germinale conin i multiple
segmente C care codific pentru domeniile constante ale regiunii claselor de IgG
variabile. O combinare ntre procesrile alternative ale ARN i aranjamentele
adiionale (switching-ul clasei) determin ce clas de IgG este exprimat n anumite
tipuri de celule B.

SLIDE 57. Amplificarea generalizat produce cromozomi

politeni
Toate rearanjamentele ADN discutate anterior att funcionale ct i
nefuncionale implic modificri ale poziiilor secvenelor n cadrul genomului. Alt
tip de rearanjament implic amplificarea generalizat a secvenelor ADN sau
politenizarea.
Este exemplul glandelor salivare de la Drosophila care conin cromozomi
mari n interfaz. Cnd fixm i colorm aceti cromozomi, ei se caracterizeaz
printr-un mare numr de benzi demarcate, care pot fi utilizate pentru a stabili poziia
i ordinea genelor la Drosophila. Mrirea cromozomilor din glanda salivar i din alte
celule de la Drosophila, apare atunci cnd ADN se replic repetitiv i cromozomii
obinui nu sunt separai. Rezultatul este formarea cromozomilor politeni compui din
multe copii paralele . Amplificarea ADN cromozomal crete mult numrul de copii de
gene, probabil pentru a suplini necesitatea de ARNm pentru sinteza proteic care are
loc celulele aceastei glande salivare masive. Totui, la majoritatea cromozomilor care
particip la politenizare, anumite secvene cum sunt secvenele simple ADN de la
nivelul centromerilor i telomerilor nu sunt amplificate. Mai mult genele ribozomale
tind s fie amplificate mai puin dect alte sevene.
Mecanismul molecular al acestor procese este necunoscut, dar se pare c
secvenele simple de ADN contribuie probabil la alinierea ADN amplificat de-a
lungul lungimii cromozomilor politeni.

SLIDE 58. Concluzii
Diversitatea remarcabil a moleculelor de anticorpi este realizat prin
asamblarea genelor funcionale, care codific lanurile grele i uoare ale anticorpilor,
de la mai multe segmente cu secven unic prezente n ADN din liniile germinale.
Segmentele care codific pentru domeniile variabile ale lanurilor uoare i grele din
bnci alternative de regiuni codante scurte;
Numrul mare de combinaii posibile n care segmentele de gene ale lanurilor
grele i uoare pot fi combinate reprezint un mecanism de generare a variaiilor
secvenei de aminoacizi i de cretere a specificitii de legare a anticorpilor produi
de limfocite individuale. Diversitatea crete si datorit pierderilor sau adugirilor
aleatoare care se produc la reunirea capetelor segmentelor genelor care codific
pentru lanurile grele i uoare;

114

n unele organisme, celulele specializate i sporesc numrul i mrimea ADN

cromozomal prin amplificare, producnd cromozomi politeni cum sunt cei din
glandele larvare de la Drosophila. Cromozomii acestor celule gigante rezult din
aproximativ 10 replicri fr diviziune celular i fr replicarea secvenelor simple
de ADN asociate centromerilor i telomerilor

115

NOTE DE CURS BM3

Reglarea Iniierii Transcripiei
SLIDE 2. Controlul genetic la bacterii: modelul Jacob-Monod
Figura: Cnd represorul lac se leag la secvena numit operator (O), care se
leag chiar n amonte de gena lacZ, transcripia operonului de ctre ARN polimeraza
este blocat. Legarea lactozei la represor determin o modificare conformaional a
represorului astfel nct acesta nu se mai leag la operator. ARN polimeraza este
apoi liber s se lege la promotor (P) i iniiaz transcripia genelor lac; ARNm
policistronic rezultat este tradus n proteinele codificate.
O combinaie ntre experimentele genetice i biochimice la bacterii determin
recunoaterea iniial a
i) legarea proteinelor la secvenele reglatoare asociate cu genele; ,
ii) proteinele a cror legare la secvene reglatoare fie activeaz fie represeaz
transcripia.
Aceste componente cheie susin (fundamenteaz) capacitatea att a celulelor
procariote ct i a celor eucariote de a activa sau inhiba (deschide sau nchide) (Turn
on or turn off) cu toate c au fost descoperite diferite variante ale procesului de baz.
Ce urmrim: un rapel al modelelor experimentale timpurii privind controlul
transcripiei bacteriene; un rapel al modului n care ARN polimerazele bacteriene
iniiaz transcrierea i mecanismele prin care acestea au capacitatea de a realiza acest
lucru.
La bacterii, controlul genetic servete n primul rnd pentru a permite celulelor
individuale s se adpteze la schimbrile mediului nutriional astfel nct creterea i
diviziunea s fie optimizate.
Astfel, primele orientri ale cercetrilor s-au ndreptat ctre genele care
codific proteine a cror producere variaz n funcie de statusul nutriional al
celulelor.
Dei controlul genetic al organismelor multicelulare implic adesea rspuns la
modificrile de mediu, este foarte caracteristic i adesea scopul biologic esenial l
reprezint reglarea unui proces genetic care susine dezvoltarea embrionar i
diferenierea tisular. Mai mult, majoritatea principiilor controlului transcripional au
fost mai nti descoperite la bacterii i apoi aplicate/adaptate celulelor eucariote

SLIDE 3. Model experimental pentru evidenierea secvenelor care

acioneaz n cis

Figura: Demonstraie experimental c mutaiile Oc acioneaz n cis

Celulele E. coli care conin dou copii ale operonului lac sunt prezentate n
diagram. Liniile diagonale indic genele i regiunile de control purttoare de
mutaii. n aceste celule, operonul lac al cromozomului bacterian i prezint o
mutaie Oc la nivelul operatorului i o mutaie n gena lacZ (gena lacZ-) care
inactiveaz enzima beta-galactozidaza. Operonul lac din plasmida F este de tip
slbatic. (Top) n absena inductorului IPTG, aceste celule exprim constitutiv o
permeaz funcional dar nu i o beta-galactozidaz. Aceste rezultate indic c
mutaia Oc afecteaz numai genele ale aceluiai ADN. Dac mutaiile Oc ar fi
acionat n trans, transcripia genei lacZ+ din plasmida F ar fi condus la o activitatea
beta-galactozidazic observabil (n partea de jos). n prezena IPTG (Isopropyl -D1-thiogalactopyranoside), sunt observate att activitate galactozidazic ct i

116

permeazic. Aa cum se poate constata din diagram, transcripia genei lacZ

normale (salbatice) din plasmida F conduce la o beta-galactozidaz funcional.

SLIDE 4. Model experimental pentru evidenierea secvenelor care

acioneaz n trans
Figura: demonstraie experimental c gena lacI+ acioneaz n trans.
Celulele care posed o singur gen lacI- produc un represor inactiv, i au ca
rezultat expresia constitutiv a beta-galactozidazei i permeazei. Dac o gen
slbatic lacI+ prezent n plasmidele factor F este introdus n celule lacI-, celulele
transformate produc un represor funcional, care se poate lega la operatorii lac. Ca
rezultat aceste celule nu exprim beta-galactozidaz sau permeaz (lacto-permeaz)
n absena inductorului.

SLIDE 5. Inducerea operonului lac conduce la creterea sintezei

ARNm lac
Figura: demonstraie biochimic c inductorul determin creterea transcripiei
operonului lac.
Eantioane de celule de E. coli crescute pe mediu de glucoz, au fost prelevate
nainte i la scurte intervale dup adugarea IPTG. Uridin marcat cu tritiu a fost
adugat fiecrei probe imediat dup prelevare. Dup 20 de secunde celulele au fost
lizate i a fost izolat ARN. Fiecare prob marcat a fost hibridizat cu un exces de
ADN clonat fixat pe membran. Radioactivitatea rmas pe menbran este o msur
a vitezei de sintez a ARNm n timpul perioadei scurte de marcare. Procentajul total
de ARN marcat cu tritiu care hibridizeaz cu ADN lac n raport cu timpul dup
adugarea IPTG indic c proporia sintezei de ARNm crete rapid dup adugarea
IPTG, ajungnd la o rat maximal dup dou minute.

SLIDE 6: Concluzii
Multe proteine bacteriene sunt inductibile, sinteza lor fiind dependent de
statusul nutriional al celulelor. Expresia diferenial a genelor care codific astfel de
proteine apare cel mai adesea la nivelul iniierii transcripiei;
n concordan cu modelul Jacob i Monod privind controlul transcripiei,
transcripia operonului lac, care codific trei proteine inductibile este represat de
legarea proteinei represoare lac la secvena operator. n absena lactozei sau a altor
inductori represia este nlturat i operonul lac este transcris;
Mutaiile la nivelul promotorului, la care se leag ARN polimeraza, sau la
nivelul operatorului acioneaz n cis; aceasta nseamn c ele afecteaz numai
expresia genelor de pe aceeai molecul de ADN n care apare mutaia;
Mutaiile n secvena unui operator care scad legarea unui represor au drept
rezultat o transcripie constitutiv. Mutaiile n secvena promotorului, care afecteaz
afinitatea de legarea a ARN polimerazei, pot fie s scad (mutaie down) fie s
creasc (mutaie up) transcripia;
Represorii i activatorii acioneaz n trans; ei afecteaz expresia genelor
reglate de ei indifent de poziionarea moleculei de ADN n celul.

SLIDE 7. Inierea transcripiei la bacterii

ARN polimeraza iniiaz transcripia majoritii genelor la nivelul unei poziii
unice situat n amonte de secvena codant;

117

Perechea de baze la nivelul creia se iniiaz transcripia este denumit situs

de iniiere a transcripiei sau Punct START;

Prin convenie, situl de iniiere a transcripiei de pe secvena ADN este

desemnat cu poziia +1, bazele situate n sensul transcripiei (downstream) sunt
desemnate cu numere pozitive iar cele poziionate n sens opus (upstream) sunt
asimilate cu numere negative;

Diferitele proteine (ARN polimeraze, activatori, represori) interacionedaz cu

ADN la nivelul promotorului sau n vecintatea acestuia pentru a regla iniierea
transcripiei

SLIDE 8. Interaciunile proteine-ADN identificate prin tehnica

footprinting
Figura: Technica Footprinting cu DN-aza I comun pentru identificarea situsurilor
de legare a proteinelor la ADN.
Un fragment de ADN care este marcat la unul din capete cu 32P (bilele roii)
ca i n metoda de secveniere Maxam i Gilbert. Poriuni din prob sunt apoi digerate
cu DN-aza I n prezena i n absena unei proteine care se leag la o secven
specific din fragment. DN-aza I hidrolizeaz aleator legturile fosfodiester. La
concentraii sczute DN-aza I este utilizat astfel nct fiecare molecul de ADN este
clivat numai o dat. n absena proteinelor care se leag la ADN, proba este clivat la
toate poziiile posibile ntre captul marcat i nemarcat al moleculei. Cele dou probe
de ADN sunt apoi separate de proteine, denaturate pentru desfacerea catenelor i
supuse electroforezei. Gelul rezultat este supus electroforezei i supus
autoradiografiei pentru a detecta numai catenele marcate i pentru a identifica
fragmentele care se ntind de la captul marcat pn la locul de aciune al DN-azei I.
n dreapta se poate observa o autoradiogram unde sunt analizate dou
fragmente de ADN n absena i n prezena unor proteine de legare la ADN dup
digestia cu DN-aza I. Pentru proba digerat n prezena proteinelor de legare la ADN
se observ lipsa a dou benzi; acestea corespund regiunii protejate de digestie prin
legarea proteinelor (spunem ca am realizat un footprinting privind legarea acestei
proteine). Aceast regiune de protecie poate fi foarte uor aliniat cu secvena ADN
dac se realizeaz o reacie de secveniere a produilor iniiali i a celor care s-au
obinut n urma proteciei furnizate de legarea proteinelor. Reaciile de secveniere i
fragmentele rezultazte n urma aciunii DN-azei sunt trecute pe acelai gel.

SLIDE 9. Identificarea interaciilor proteine-ADN prin tehnica gelshift assays

Figura: Rezultatele unei determinri ale mobilitii eledctroforetice prin tehnica de
ntrziere n gel pentru proteinele care se leag la ADN (EMSA-Electrophoretic
Mobility Shift Assay).
n acest exemplu, fracii ale unei coloane cromatografice de schimb ionic au
fost analizate pentru proteinele care se leag la regiunea promotoare a unei gene
pentru ARNt de la EK. Un eantion al fraciei proteice este ncrcat pe o coloan
(ON) iar fraciile eluate de pe coloan la concentraii saline crescute (numerele
fraciilor) au fost incubate cu o sond (fragment de restricie) radiomarcat care
include regiunea promotoare; fiecare prob a fost apoi supus electroforezei ntr-un
gel de poliacrilamid. Sondele libere care nu se leag la proteine migreaz n fa. O

118

protein prezent n fraciile 7 i 8 eluate de pe coloan se leag la sond, formnd un

complex ADN-protein care migreaz mult mai lent dect sonda liber

SLIDE 10. Evidenierea poziionrii ARN polimerazei la nivelul

regiunii control a represorului lac prin tehnica footprint
Figura: Imagine footprint a legrii ARN polimerazei i a represorului lac la
regiunea control al ADN lac
Deoarece DN-aza I cliveaz unele legturi fosfodiester mai frecvent dect
altele, densitatea benzilor n absena proteinelor (linia 3) nu sunt la fel de uniforme ca
i din figura din slide-ul 8. Parantezele din dreapta indic regiunile ADN protejate de
ctre digestia cu DN-aza I prin legarea ARN polimerazei (linia 4) sau a represorului
lac (linia 5). Liniile 1 i 2 arat produii celor dou reacii de secveniere Maxam i
Gilbert: de pe aceste linii, benzile din gel pot fi corelate cu secvena nucleotidic a
regiunii de control lac. Poziiile n secven sunt notate pe partea stng; capetele
sgeilor indic direcia transcripiei. Experimrentul footprinting a fost realizat ci
marcate la captul 5 al captului din dreapta al catenei superioare ca i n slide-ul 6.

SLIDE 11. Regiunea control a operonului lac conine 3 situri critice

cis-acting
Figura: Diagrama regiunii de control a transcripiei a operonului lac.
Regiunea codant a beta-galactozidazei N terminale este ctre dreapta, i
regiunea codant C-terminal a represorului lac este n stnga. Regiunile protejate de
digestia cu DN-aza I (footprints) de ctre cAMP-CAP, ARN polimeraza i represorul
lac sunt indicate prin barele colorate de deasupra. Analizele mutaionale identific trei
regiuni critice cu aciune n cis: dou n promor (regiunea galben de la 35 la -10) i
una ntre +1 la +20 situat la nivelul operatorului (n maron).
Regiunea footprint represoare se suprapune captului din amonte a regiunii
footprint a ARN polimerazei dar nu este prea mare. Experimente similare de
footprint au demonstrat c o a treia protein, numit CAP care se complexeaz cu
cAMP ( cAMP-CAP) se leag de asemenea la regiunea de control lac. Complexul
cAMP-CAP aciveaz transcripia de la nivelul promotorului lac.

SLIDE 12. ARN polimeraza se fixeaz specific la nivelul secvenelor

promotorului pentru a iniia transcripia
Figura: reprezentarea schematic modului de legare la ADN a formei majore a ARN
polimerazei de la E. Coli.
Prin convenie, situsul de iniiere a transcripiei este numerotat, n general, cu
+1. Perechile de baze care se extind n direcia transcripiei sunt numite
downstream, n aval, fa de situsul de iniiere a transcripiei; cele care sunt extinse
n regiunea invers sunt considerate unstream sau n amonte. Subunitatea sigma70
se leag la secvene specifice situate lng poziiile 10 la 35 ale promotorului.
Subunitile alfa se leag strns la ADN din amonte, iar beta i beta sunt asociate
punctului de start.

SLIDE 13. Diferenele de la nivelul secvenelor promotorului E. coli

afecteaz frecvena iniierii transcripiei
Figura: Promotorii recunoscui de ctre ARN polimeraza (coninnd secvena
sigma70) de la E. coli.

119

a) Secvenele unor promotori puternici cu spaii (puncte) introduse pentru a

maximiza omologia la nivelul regiunii 10 la 35. Aceste secvene corespund catenei
sens (de sus) a promotorului n condiiile n care procesul de transcripie se realizeaz
de la stnga la dreapta. Bazele care corespund secvenei consens din regiunea 35 la
1o sunt colorate n galben. ase dintre secvene corespund secvenelor control ale
genelor care codific pentru ARN. Secvenele din structura regiunilor promotoare ale
Lambda, T7 i fd, care sunt prezente n genoame virale care sunt direct transcrise de
ctre ARN polimeraza celulei gazd.
b) Secvenele consens ale regiunilor 35 la 10, care sunt separate de 15-17 pb.
Sunt descrise mutaiile cunoscute ca descrescnd semnificativ frecvena transcripiei
unui anumit numr de promotori. n secvenele consens, frecvena cu care bazele
indicate apar la fiecare poziie la diferii promotori sigma70 este indicat dup cum
urmeaz: litere n rou: > 70%; litere boldite negre: 50-70%; litere negre: 40-50%.
c) secventele regiunilor /35 la /10 ale promotorului lac care sunt diferite de
secvena consens n patru poziii (n albastru) Mutaiile down determin scderea
expresiei operonului lac. Cele dou mutaii up care cresc gradul de asemnare a
regiunii 10 cu secvena consens, cresc expresia.

SLIDE 14. Majoritatea secvenelor operator sunt scurte repetiii

inversate
Figura: Secvena operatorului lac reprezint o secven repetitiv inversat aproape
perfect centrat n jurul unei secvene GC situat n poziia 11.
Secvena de 17 pb de pe catena sens care ncepe la 7 este identic cu secvena
de 17 pb situat pe catena antisens i ncepe la +28, cu excepia nucleotidelor indicate
n italic. Fiecare din aceste secvene repetitive este denumit jumtate de situs
operator.

SLIDE 15. Majoritatea represorilor bacterieni sunt structuri dimere

care conin elice care se insereaz n fosele majore adiacente ale
ADN
Figura: Modele privind represorul bacteriofagului 434 i interaciunea sa cu ADN
Acesta i muli ali represori bacterieni sunt homodimeri care insereaz un helix
alfa (helixul de recunoatere) al fiecrui monomer ntr-o fos major a operatorului
ADN. Represorii bacteriofagilor se leag la secvenele operator din genomul viral
prevenind astfel transcripia de ctre ARN polimeraza celulei int.
a) Modelul cu bile (space-filling model) al represorului dimer 434 legat la
operatorul su ADN specific
b) Modelul paglic al monomerului superior (de sus) al represorului dimer 434
artnd interacia sa cu ADN. Trei resturi de glutamine (Q), o serin (S) i o treonin
(T) n helixul de recunoatere formeaz legturi de hidrogen cu bazele din fosa major
a ADN operator;
c) Diagrama in fire demonstrnd interaciile dintre ADN i monomerul
inferior i interfaa dimerului n represorul 434. Punctele roii indic legturile de
hidrogen i ionice dintre represor i ADN. Cercurile mici reprezint molecule de ap
legate.

120

SLIDE 16. Modificrile conformaionale induse de liganzi modific

afinitatea multor represori pentru ADN
Figura: Modificri conformaionale n structura apo-represorului cauzate de legarea
triptofanului.
Elicele alfa din proteina dimer, reprezentate ca cilindri, sunt identificate prin
literele majuscule ntr-un monomer i literele minuscule n cellalt. Elicele de
recunoatere (E i e) sunt prea apropiate apropiate pentru a intra n fosele majore
adiacente ale operatorului ADN. Cnd aporepresorul leag triptofanul, capetele N
terminale ale elecelor E i e se deplaseaz cu 8 A. Drept rezultat elecele E i e din
represor mpreun cu triptofanul legat (in portocaliu) se orienteaz (se dispun) n
operatorul ADN.

SLIDE 17. Controlul pozitiv al operonului lac este exercitat de ctre

cAMP-CAP
Figura: Control transcripional pozitiv i negativ al operonului lac de ctre
represorul lac i respectiv cAMP-CAP
a) n absena lactozei, nu se formeaz ARNm lac deoarece represorul se leag la
operatorul lac i mpiedic trancripia;
b) n prezena glucozei i lactozei, represorul lac se leag la lactoz i sufer
modificri conformaionale i astfel nu se mai poate lega la operatorul lac. Totui,
cAMP este sczut, deoarece glucoza este prezent i atunci complexul cAMP-CAP nu
se leag sitului CAP de pe operator. Ca rezultat, ARN polimeraza nu se leag eficient
la promotorul lac i este sintetizat numai puin ARNm lac;
c) n prezena lactozei i n absena glucozei, apare transcripie maxim la
nivelul operonului lac. n aceast situaie, represorul lac nu se leag la operatorul lac,
concentraia cAMP crete i coplexul cAMP-CAP format se leag la situsul CAP,
stimulnd legarea i iniierea de ctre ARN polimeraz.

SLIDE 18. Legarea cooperativ a cAMP-CAP i a ARN polimerazei la

regiunea de control a lac activeaz transcripia
Figura: Legarea cooperativ a ARN polimerazei de la E. Coli i a complexului
cAMP-CAP la promotorul lac.
Prin propria structura, ARN polimeraza i cAMP-CAP posed afiniti relativ
reduse pentru situsurile lor de legare la promotorul lac. Totui, interacia dintre
regiunile CAP i subunitatea alfa a ARN polimerazei formeaz un complex proteinprotein care se leag mult mai stabil la promotorul ADN dect fiecare dintre cele
dou proteine singur.

SLIDE 19. Model de legare a cAMP-CAP la secvena promotoare lac

promoter
Figura: Modelul cu bile de legare a complexului cAMP-CAP la promotorul lac
CAP leag ADN dublu helix n jurul suprafeei sale. Cnd exist resturi de
aminoacizi mutante complexul cAMP-CAP nu mai activeaz transcripia de la nivelul
promotorului lac. Secvena ADN situat la extremitatea complexului reprezint
regiunea din apropierea poziiei 50 unde captul C terminal al unei subuniti alfa se
consider c interacioneaz resturile mai nchise la culoare din structura CAP.

121

SLIDE 20. Transcripia de la nivelul unor promotori este iniiat de

factorii sigma ( ) alternativi

Tabel: Transcripia majoritii promotorilor de la E. Coli este demarat prin interacia

promotorilor cu ARN polimeraza care conine factorul sigma70. Transcripia
anumitor grupe de gene, totui, este realizat de ctre ARN polimeraze care conin
una sau mai multe alternative de factori sigma: sigma28, sigma32, sigma38 i
sigma54-care recunosc secvene promotor consens diferite de sigma70. Att sigma28
i sigma32 prezint regiuni de omologie cu sigma70 i recunosc secvene situate tot n
intervalul 35 la 10.

SLIDE 21. Activarea subunitii 54 a ARN polimerazei la nivelul

promotorului glnA de ctre NtrC
Figura: Activarea subunitii sigma54 a ARN polimerazei la promotorul glnA de
ctre NtrC (Nitrogen regulatory Protein)
glnA este o gen care codific pentru enzima glutamin sintetaza care sintetizeaz
glutamina pornind de la acidul glutamic i amoniac.
Polimeraza se leag la promotorul glnA, formnd un complex unit (strns),
nainte de activare. Ca rspuns la concentraiile mici de aztot organic, o protein kinaz
numit NtrB fosforileaz proteina dimer NtrC (purpurie) care apoi se leag la doi
enhancers (portocaliu) poziionai la 108 i 140 fa de situsul de START al
transcripiei. Dimerii NtrC fosforilai legai interacioneaz cu subunitatea sigma54
legat determinnd formarea unei bucle la nivelul ADN implicat. Activitatea ATPazic A NtrC stimuleaz apoi polimeraz s desfac catenele la situsul de start,
formnd un complex deschis. Transcripia genei glnA poate s nceap.

SLIDE 22. Vizualizarea buclei ADN i a interaciilor legrii NtrC i

subunitii 54 a polimerazei

Figura: Vizualizarea buclei ADN i interaciilor Ntrc i a subunitii sigma54 a

polimerazei
a) Micrografie electronic a fragmentului de restricie ADN cu cei doi dimeri
NtrC fosforilai legai la regiunea enhancer lng unul din capetele subunitii
sigma54 a polimerazei legat la promotorul glnA lng cellat capt.
b) Micrografie electronic a aceluiai fragment demonstrnd legarea dimerilor
NtrC i a subunitii sigma54 a polimerazei unul cu altul cu formarea buclei de ADN
ntre acetia.

SLIDE 23. Multre rspunsuri bacteriene sunt controlate de sisteme

reglatoare bi-componente
Figura: Sistemul bicomponent reglator PhoR/PhoB de la E. Coli
Ca rspuns la concentraiile sczute de fosfai din mediu i spaiul periplasmic,
un ion fosfat disociaz din domeniul periplasmic a proteinei senzor PhoR (portocaliu).
Aceasta determin o modificare conformaional care activeaz un domeniu
transmitor al unei protein kinaze din regiunea citosolic a PhoR. Domeniul
transmitor activat transfer un un gama-fosfat din structura ATP unui rest de
histidin conservat din structura domeniului transmitor. Acest fosfat este apoi
transferat unui acid aspartic din domeniul receptor al regulatorului rspunsului ProB
(purpuriu). Mai multe proteine ProB pot fi fosforilate de ctre una activat ProR.
Proteinele fosforilate ProB activeaz apoi transcripia de la gbenele care codific
122

proteine care ajut celula s rspund la cantitatea mic de fosfat, incluznd phoA,
phoS, phoE i ugpB.

SLIDE 24. Concluzii (I)

ARN polimerazele sunt proteine mari compuse din subuniti beta, beta i
dou subuniti alfa care formeaz core polimeraza i o subunitate sigma, din cteva
alternative, care funcioneaz ca factor de iniiere;
Iniierea ncepe cnd subunitatea sigma a moleculei de polimeraz se leag la
secvena promotor, formnd un complex unit. Polimeraza separ apoi catenele pe o
distan de 12-13 pb la nivelul situsului de start a transcripiei, formnd un complex
deschis. Dup ce aproximativ 10 ribonucleotide au fost polimerizate, subunitatea
sigma este eliberat i core polimeraza continu transcripia matriei;
Puterea unui promotor se refer la ct de frecvent ARN polimeraza iniiaz
transcripia pornind de la acesta. Subunitatea sigma70, factorul major n iniiere la E.
coli, interacioneaz cu secvenele promotor situate n regiunea 10 la 35 fa de
situsul de start;
Represorii se leag la secvenele de ADN numite operatori, care se suprapun
parial cu regiunea promotoare la nivelul creia se leag ARN polimeraza. Legarea
represorului interfer cu legarea ARN polimerazei i cu iniierea transcripiei;
Activatorii subunitii sigma70 a ARN polimerazei se leag, n general, la
ADN pe partea opus a helixului fa de polimeraz, n regiunea 20 la 50, sau chiar
n amonte de polimeraz, n apropierea 60;

SLIDE 25 Concluzii (II)

Activatorul cAMP-CAP stimuleaz transcripia prin formarea unui complex
cu ARN polimeraza care prezint o mai mare afinitate pentru situsuri ADN specifice
dect proteinele individuale. n plus fa de stimularea legrii polimerazei, activatorii
pot stimula i formarea complexului deschis i nceperea transcripiei;
Muli represori bacterieni sunt dimeri. Fiecare monomer conine un alfa-helix
care se insereaz n fosa major a operatorului ADN, astfel nct dimerul se leag la
fose majore succesive. Afinitatea mare de legare este rezultatul formrii multor
legturi de hidrogen, ionice i van der Waals dintre proteine i secvene ADN
specifice;
Secvenele de ADN care leag proteinele reglatoare dimere sunt secvene
repetitive inverse, care reprezint fiecre jumtai de situsuri care leag un monomer;
Operonii transcrii de ctre subunitatea sigma54 sunt reglate prin activatori
care se leag la secvene enhancer de aproximativ 100 pb n amonte de situsul de
iniiere. Secvenele enhancer care leag activatori inetracioneaz tranzitoriu cu
polimeraza echilibrat legat la nivelul promotorului, stimulnd formarea unui
complex deschis i inierea transcripiei;
n sistemele bi-componente reglatoare, o protein acioneaz ca un senzor,
monitoriznd nivelul de nutrieni din mediu. n condiii adecvate, proteina senzor
activeaz o a doua protein, reglatorul rspunsului, care se leag apoi la secvenele
reglatoare, stimulnd sau represnd astfel transcripia genelor specifice.

123

SLIDE 26. Controlul genelor eucariote: scop i principii generale

Spre deosebire de celulele bacteriene i eucariotele unicelulare, celulele
organismelor pluricelulare au relativ puine gene reglate reversibil de condiiile de
mediu;
Controlul genetic al organismelor pluricelulare este important pentru
dezvoltare i difereniere i,
n general, nu este reversibil
n interiorul unei celule bacteriene singulare, genele sunt reversibil induse i
represate prin control transcripional pentru a ajusta mainria enzimatic celular
mediului nconjurtor nutriional i fizic. Eucariotele monocelulare, cum sunt
drojdiile, posed i ele multe gene care controleaz rspunsul la variaia mediului
(cum ar fi statusul nutriional, tensiunea de oxigen i temperatura). Chiar n organele
organismelor superioare, de exemplu, ficatul mamiferelor unele gene pot rspunde
reversibil la stimulii externi cum sunt noxele chimice. Totui, n general celulele
eucariotelor pluricelulare sunt protejate de influenele externe imediate; adic
majoritatea celulelor i desfoar activitatea ntr-un mediu constant. Probabil, din
acest motiv genele care rspund schimbrilor de mediu contrituie o fracie mult mai
mic din numrul celulelor unui organism multicelular dect n organismul unicelular.
Cea mai importanta caracteristic a controlului genetic la organismele
multicelulare este exactitatea execuiei deciziei precise de dezvoltare astfel nct gena
necesar s fie activat ntr-o anumit celul la un anumit moment din dezvoltarea
organismului care conine un numr mare de tipuri celulare. n majoritatea cazurilor o
dat ce etapa de dezvoltare a fost depit de o celul, ea nu este reversibil. Astfel,
aceste decizii sunt fundamental diferite de inducia sau represia bacterian. n
executarea programului lor genetic, multe tipuri celulare diferite (ex. celulele din
piele, celulele rosii din snge, celule productoare de anticorpi, etc) marcheaz o cale
ctre moartea celular final. Profilele determinate ale controlului genetic care conduc
la difereniere servesc necesitile ntregului organism i nu supravieuirii individuale
a celulei.

SLIDE 27 La eucariotele superioare reglarea multor gene se

realizeaz prin controlul transcripiei
Figura: Determinarea ratei de transcripie a lanurilor n formare ale unei gene prin
tehnica run-on
Nucleii izolai au fost incubai cu 32P-ribonucleotid trifosfai pentru o perioad
scurt. n timpul acestei perioade moleculele de ARN polimeraze care transcriu o
gen cnd nucleii sunt izolai adaug 300-500 nucleotide lanurilor de ARN n
formare. Apar foarte puine reacii de iniiere. Prin hibridizarea ARN marcat cu
ADNc pentru o gen specific (A n acest caz), poate fi msurat fracia de ARN total
produs de pe aceast gen (deci transcripia sa relativ).
Msurtorile directe ale ratelor de transcripie ale mai multor gene n diferite
tipuri celulare au artat c reglarea iniierii transcripiei este forma universal a
controlului genetic la eucariote ca i la bacterii. Cea mai simpl i mai direct metod
de a msura ratele de transcripie este aceea de a expune celulele pentru un timp foarte
scurt (de exemplu 5 minute sau mai puin) unui precursor ARN marcat (ribonucleotid)
i apoi s se determine cantitatea de ARN nuclear marcat format prin hibridizarea sa
cu un ADN clonat. Aceast metod poate fi folosit pentru a determina ratele de
transcripie n culturile de celule dar nu i n ntregul organism deoarece cantitatea de
ARN marcat obinut este insuficient pentru msurtori de acuratee. Chiar i n
124

celulele cultivate, o a doua metod numit analiza produsului n formare(nascentchain analysis) sau (run-on analysis) este adesea preferat. n aceast metod,
nucleii sunt izolai din celule i permit incorporarea 32P din ribonucleotid trifosfat n
catenele de ARN n formare. Vitezele relative de transcripie determinate fie prin
marcarea culturilor de celule sau a nucleilor izolai sunt aproximativ aceleai,
inbdicnd c moleculele de polimeraze care sunt active la nivelul nucleilor chiar dac
sunt scoase din mediul celular.

SLIDE 28. Sinteza difereniat a 12 molecule ARNm codificate

specific de gene hepatice
Figura: Demonstracie experimental a sintezei difereniale a 12 moleculele de
ARNm care codific proteine hepatice specifice
Nucleii din ficat, rinichi, celule din creier de oarece au fost expuse la 32PUTP, i ARN marcat rezultat a fost hibridizat cu diferite molecule de ADNc fixate pe
nitroceluloz. Dup ndeprtarea ARN nehibridizat, hibrizii au fost evideniai prin
autoradiografie. Moleculele de ADNc marcate codific pentru 1-12 proteine
sintetizate activ n ficat (de exemplu 4 = albumin, 3 = alfa1-antitripsin, 6 =
transferin) dar nu n majoritatea celorlalte esuturi. Celelalte molecule de ADNc
testate au fost actina (A), alfa- i beta-tubulina (T i T), care sunt proteine ce se
detecteaz n majoritatea tipurilor celulare. ARNt pentru metionin i ADN
plasmidial (pB) n care ADNc au fost clonate au fost folosite drept control.
Intensitatea spoturilor generat prin hibridizarea ARN sintetizat n timpul
transcripiei run-on in vitro izolai dincele trei esuturi indic c genele care se
exprim specific n hepatocite sunt transcrise n ficat dar nu sunt transcrise n
celulele altor esuturi.
Rezultatele analizelor run-on sunt ilustrate n figur i demonstreaz c
transcripia multor gene care care codific proteine exprimate specific n hepatocite
(celulele majore ale ficatului mamiferelor) este ntradevr detectat i n nucleii
preparai din ficat, dar nu i n nucleii izolai din creier i rinichi. Analiznd
msurtorile sintezelor de ARN din timpul dozrilor run-on , aceste rezultate indic
c sintezele difereniale ale proteinelor specifice ficatului sunt reglate de factori de
control a transcripiei genelor corespunztoare n diferite esuturi. Rezultate similare
au fost obinute n experimentele run-on realizate pe alte tipuri celulare i pe o larg
varietate de proteine esut-specifice, indicnd c controlul transcripional este comun
n organismele complexe.

SLIDE 29. Analiza ADN Microarray

Analizele ADN microarray ofer o vedere global asupra modificrilor n procesul
de transcripie, de exemplu, ca urmare a adugrii de SFV (ser fetal) la celulele
umane n cultur.
Serul conine factori de cretere care stimuleaz celulele n faza staionar
ctre cretere i diviziune. Prin analiza ADN microarray se pot detecta factorii de
trasncripie relativi ai genelor n dou populaii celulare n cultur. Aceast analiz
const n spot-uri foarte fine de ADN ataate pe o lam de microscop sau pe alt
suport. Fiecare spot const n mai multe copii de secvene ADN dintr-o singur gen
uman. Se realizeaz dou preparate ARN:
i) un preparat de ARN, care conine toate tipurile de ARN provenind de la
celulele staionare care au fost cultivate n mediu fr ser care este marcat cu
molecule fluorescente verzi;

125

ii) un preparat de ARN care conine toate tipurile de ARN de la celulele n

cretere i diviziune cultivate pe mediu cu SFV i marcate fluorescent n rosu.
Cele doua preparate sunt amestecate i hibridizate pe lam, unde acestea se
vor mperechea cu secvenele genelor lor corespunzatoare. Spoturile verzi (ex. spot 3)
indic genele care sunt transcrise n celulele nedivizate crescute n lips de ser.
Spoturile rosii (ex. spot 4) indic genele care sunt transcrise n celulele n diviziune,
iar spoturile galbene (ex. spot 1 i 2) indic genele care sunt transcrise n cele dou
tipuri celulare (staionare i n diviziune) [From V. R. Iyer et al., 1999, Science
283:83).

SLIDE 30. Elementele reglatoare la eucariote

Reprezint adesea mii de kilobaze n amonte sau n aval de START;
Principiile de baz care controleaz transcripia la bacterii exist i la
eucariote: transcripia este iniiat la nivelul unei regiuni specifice i este controlat
de legarea proteinelor trans-activatoare (factori de transcripie) la secvenele
cis-activatoare din structura ADN;
Elementele cis-activatoare sunt adesea mult mai departe de promotorul pe
care l regleaz, transcripia la nivelul unui singur promotor poate fi reglat prin
legarea mai multor factori de transcripie la elementele de control alternative;
Secvenele care controleaz transcripia pot fi identificate prin analize de
deleie n serie la captul 5.
Genele procariote i eucariote sunt structurate dup aceeai logic de baz, dar
cu diferene importante n detaliile moleculare. O definiie sintetic a unei gene
eucariote poate fi util pentru a rezuma esena acestor diferene. Este general admis c
o singur definiie dat genei eucariote nu poate satisface pe toat lumea sau s
corespund la toate exemplele. Cea pe care am adoptat-o este rezultatul structurii
moleculare a genelor care asigur o gam larg de funciuni n diverse organisme
eucariote. Definiia ine cont de diferenele de localizare i de tipurile de secvene care
influeneaz expresia genelor. Aceasta presupune implicit c mutaiile fenotipice
observabile sunt rezultatul modificrilor la nivelul semnalelor de reglare dar i n
secvenele codante.
Definim gena ca fiind o combinaie de segmente de ADN care, mpreun,
constituie o unitate de expresie, o unitate care determin formarea unui produs
specific i funcional al genei i care poate s fie o molecul de ARN sau un
polipeptid. Segmentele de ADN care definesc gena includ:
1. Unitatea de transcripie care este constituit dintr-un segment ADN
continuu care codific pentru secvena transcriptului primar; acesta include:
a) secvena codant a ARN matur sau a proteinei produse,
b) intronii i
c) secvenele leader 5 i coad 3 prezente la nivelul ARNm matur ca i
secvenele de separare care sunt eliminate n timpul maturrii trannscripilor primari
care codific pentru ARN.
2. Secvenele minimale necesare pentru iniierea corecte a transcripiei
(promotorul) i pentru a da natere extremitii 3 particulare din structura ARN
matur.
3. Elementele secvenei care determin frecvena de iniiere a transcripiei;
acestea cuprind secvenele responsabile de inducerea i represia transcriiei i de
specificitatea celular, tisular i temporal a transcripiei. Aceste regiuni sunt foarte
variate structural, ca poziie i ca funcie pentru a putea purta un singur nume. Dintre
acestea enumerm elementele activatoare (enhancers) i elementele moderatoare
126

(silencers), care sunt secvene ce influeneaz iniierea transcripiei la distan,

independent de localizarea lor n raport cu situsul de iniiere.
n aceast definiie a genei nu sunt incluse secvenele ADN care influeneaz
configuraia unei gene n cromatin i nici cele care codific proteine sau ARN care
moduleaz expresia unei anumite uniti de transcripie.
ntr-o reprezentare grafica, nceputul genei este n stnga i captul n dreapta,
n acord cu convenia general admis de reprezentare a transcripiei. Aceasta
semnific c braul de ADN care are aceeai structur cu ARN transcris, este braul
sens 5-3 orientat de la stnga la dreapta i este n general reprezentat ca braul
superior. Matricea de transcripie, catena antisens este orientat 3-5 de la stnga la
dreapta (braul inferior). Pentru a uura schemele, catena sens este adesea singura
reprezentat. Poziia primei nucleotide n molecula transcript este notat +1, iar
nucleotidele situate n aval n unitatea de transcripie sunt numerotate pozitiv (ex.
+16). Nucleotidele care sunt n amont de +1 (secven netranscris) sunt desemnate
cu numere negative (ex. -25).
O modalitate uoar de a examina relaia care exist ntre noile caracteristici
structurale ale genelor eucariote i expresia i reglarea lor const n a pleca de la
exemple de gene reprezentative n contextul ARN polimerazei care iniiaz expresia
acestora. Astfel, vor fi discutate pe rnd caracteristicile structurale ale genelor de
clas I, clas II i clas III; caracteristicilor ARN polimerazelor respective;
mecanismele de reglare a transcripiei. Maturarea transcripilor primari ARN, n
particular mecanismul procesului de excizie-episaj care determin producerea ARNm,
ARNr i ARNt. ntr-o alt seciune vor fi examinate motivele structurale care permit
factorilor de transcripie proteici s interacioneze cu secvene specifice din structura
ADN i ntre ei. Capitolul se va termina cu examinarea mecanismelor cele mai
generale de reglare, i anime cele care influeneaz rennoirea ARNm, i a modului n
care blocuri mari de gene sunt reglate prin modificarea ADN sau a cromatinei n care
genele sunt mpachetate.

SLIDE 31. Secvenele promotoare ale mai multor gene structurale

eucariote
Figura: Secvenele promotoare ale unor gene eucariote. Segmentul omolog, TATA
box, este colorat n rou i prezint proporiile diferitelor baze precunm i secvena
consens cea mai probabil.
Informatii suplimentare
Fenotipul unui organism sau a unei celule difereniate este, n mare msur,
determinat de cantitatea i de varietatea proteinelor pe care acesta (aceasta) le conine.
Acest lucru reflect, n general, concentraia i natura ARNm sintetizate. Principalul
mecanism responsabil de diferitele fenotipuri este deci expresia difereniat a genelor
din clasa II. Aceast relaie fundamental ntre expresia genelor i fenotip a fost
stabilit prin msurtori comparative ale cantitii proteinelor i ale cantitii ARNm
n diferite stadii ale dezvoltrii unui organism n diverse esuturi difereniate ale
aceluiai organism i chiar n celule identice aflate n stadii fiziologice diferite.
n principiu, dar i n realitate, reglarea expresiei unei gene poate s intervin
n orice etap a biogenezei ARNm sau la traducerea acestuia n protein. O serie de
experimente indic c determinantul esenial al nivelului ARNm este iniierea
transcripiei. Acest proces este reglat n principal prin interacia elementelor secvenei
(elementele cis) prezente la nivelul situsului de iniiere sau la distane variabile de
acesta, cu o colecie de proteine specifice (factori de transcripie care acioneaz n
trans) dintre care cea mai mare parte recunosc secvene particulare de ADN. Astfel,
127

att reglarea temporal a transcripiei ct i reglarea sa specific n funcie de esut

sunt determinate de prezena i cantitatea diferiilor factori care acioneaz n trans.
Viteza i natura procesului de excizie-episaj a pre-ARNm reprezint cel de al doilea
mecanism important care contribuie la reglarea nivelului ARNm. Degradarea
diferenial a moleculelor ARNm influeneaz i ea expresia anumitor gene.
Transportul moleculelor de ARNm din nucleu ctre citoplasm poate s participe i el
la controlul expresiei genelor ce codific pentru proteine, cu toate pn n prezent
exist destul de puine date care s susin aceast ipotez. n plus, chiar traducerea
ARNm poate fi reglat n acest sens existnd multe date probatorii. Degradarea
selectiv a proteinelor contribuie i ea la reglarea nivelului lor, dar importana acestui
proces nu este nc clarificat. Dac proporia de re-nnoire a unei proteine
influeneaz echilibrul concentraiei unui component critic al mainriei de traducere,
de exemplu un factor care acioneaz n trans, influena sa poate fi mare asupra
sintezei moleculelor de ARNm.

SLIDE 32. Construcia i analiza deleiilor seriate n 5

Figura: Construcia i analiza deleiilor 5 seriate pentru a localiza secvenele de
control a transcripiei situate n amonte de genele eucariote
Un fragment de ADN (galben) care conine o regiune start a transcripiei este
clonat ntr-un vector plasmidial (upper-left). Plasmida este linearizat prin digestia
cu o enzim de restricie (A) care scindeaz la captul din amonte a fragmentului
linearizat. ADN linearizat este apoi digerat cu o exonucleaz pentru diferite perioade
de timp, astfel nct lungimi diferite de ADN sunt nlturate de la fiecare capt. Dup
adugarea unui linker oligonucleotidic i digestia cu cu enzimele de restricie B i C,
fragmentele nlturate sunt clonate ntr-un vector plasmidial care conine o gen
raportor slab (albastru deschis). Plasmidele prezentnd fragmente de lungimi diferite
ale regiunii din amonte (regiunea din 5 ale situsul de demarare a transcripiei) sunt
apoi transfectate n culturi de celule (sau folosite la realizarea de animale transgenice)
i este determinat expresia genei raportor. Rezultatele acestui exemplu ipotetic indic
c fragmentele testate conin dou elemente de control. Captul 5 al uneia este
cuprins ntre deleiile 2 i 3; captul 5 al celeilalte este corelat cu deleiile 4 i 5.

SLIDE 33. Sinteza moleculelor de ARN este catalizat de 3 polimeraze

Figura: Separararea i identificarea celor trei ARN polimeraze de la eucariote prin
cromatografie pe coloan.
Un extract proteic din nuclei celulelor de broasc a fost trecut pe o coloan de
DEAE Sephadex pe care proteinele ncrcate se absorb diferit. Proteinele absorbite
sunt eluate (curba albastr) cu o soluie cu concentraie de NaCl crescnd. Fraciile
care conin proteinele eluate sunt testate pentru capacitatea lor de a realiza transcripia
ADN (Curba roie) n prezena a patru ribonucleotid-trifosfai. A fost msurat i
sinteza ARN de ctre fiecare fracie n prezena a 1microgram/ml de alfa-amanitin
(curba bleu). La aceast concentraie alfa-amanitina inhib activitatea polimerazei
Iidar nu afecteaz pe cea a polimerazelor I i III (Polimeraza III este sensibil la 10
micrograme/ml de alfa-amanitin n timp ce polimeraza I este neafectat chiar i la
concentraii mai mari) .
Informaii suplimentare
Transcripia genelor din clasa I este realizat de ARN polimeraza I i
reprezint jumtate din activitatea de transcripie pentru majoritatea celulelor
eucariote. Singurul produs al acestei transcripii este un precursor de ARN ribozomic
128

(pre-ARNr), care este transformat prin clivare secvenial pentru a forma speciile de
ARNr 5,8S, 18S i 28S (cel de al patrule tip de ARNr 5S este codificat de ctre o gen
din clasa III). Numrul de gene care codific pentru ARNr variaz de la o sut la mai
multe mii, n funcie de specie. Acestea sunt localizate pe unul sau pe mai muli
cromozomi specifici, n regiuni morfologice distincte numite organizatori
nucleolari. n timpul interfazei, aceste regiuni sunt ncorporate n nucleol, structur
n care moleculele de ARNr sunt transcrise activ, se transform pre-ARNr i se
asambleaz ribozomii.
ARN polimerazele au fost purificate dintr-o mare varietate de celule utiliznd
metode clasice de separare a proteinelor. Contrar ARN polimerazelor II i III
localizate n nucleoplasm, ARN polimeraza I este asociat nucleolului i poate fi
izolat de nucleosol. Numai ARN polimeraza I catalizeaz transcripia grupului de
gene ARNr. Specificitatea ARN polimerazei I pentru genele ARNr este sugerat de
insensibilitatea sintezei ARNr i de rezistena polimerazei I la -amanitin.
Caracteristicile moleculelor ARN de clas II
Gene din clasa II codific pentru toate moleculele de ARNm citoplasmatic
moleculele ARN U din snRNP (small nuclear ribonucleoproteine), cu excepia U6.
Moleculele transcript ale genelor din clasa II posed modificri caracteristice la
extremitatea 5 (coif): 7-metil guanozin pentru ARNm i 2, 2, 7- trimetil guanozin
pentru ARN U. n ambele cazuri, guanozina metilat a coifului este legat de primul
nucleotid transcris printr-o legtur trifosfat cu nucleotidele din poziiile lor 5.
Aproape toate moleculele de ARNm posed i o coad poliadenilat (poli A)
caracteristic care debuteaz la distane diferite dincolo de sfritul regiunii codante;
coada poli A nu este codificat de gena care a determinat obinerea transcriptului ci
este adugat n urma unei reacii post-transcripionale. La drojdii i alte eucariote
inferioare lungimea cozii poli A este de ordinul a 75 la 185 resturi. Moleculele de
ARNm nuclear de la majoritatea vertebratelor au o coad poli A de 200 la 300
nucleotide, dar extensia poli A a moleculelor ARNm citoplasmatice este mai scurt i
caracteristic fiecrui tip de ARNm n parte. Din contr, multe molecule de ARNm
care codific histone sau ARN U sunt lipsite de aceast coad. Anumite molecule
ARNm conin adenin N6-metilate i toate moleculele ARN U au caracteristic un
numr mare de resturi uracil modificate. Aceste modificri sunt probabil realizate n
timpul sau dup transcripie, funciile lor fiziologice fiind necunoscute.
Cu excepia unor cazuri foarte rare, moleculele ARNm i ARN U deriv din
transcripi primari ale cror secvene sunt colineare pe ntreaga lungime cu ADN de
pe care au fost transcrise. n afar de coif i clivarea extremitii 3 nainte de
poliadenilare, principala etap de maturare necesar formrii unei noi molecule de
ARNm funcional este excizia-episajul (splicing). Cu toate c absena intronilor n
pre-ARN U face aceast operaie inutil, moleculele transcript primar necesit
clivarea endo i exonucleotidic pentru formare extremitilor 3 mature.
Moleculele de ARN transcrise de pe structura genelor din clasa III nu codific
proteine. De fapt, produii acestora sunt molecule mici de ARN implicate n sinteza
proteinelor (ARNt i ARNr 5S), n transportul intercelular al proteinelor (ARN 7 SL)
i n maturarea post-transcripional (ARN U6). Genele din clasa III codific i multe
alte molecule de ARN al cror rol fiziologic este necunoscut (ARN 7SK, ARN Alu).
Genoamele adenovirusurilor posed dou gene de clas III, VA1 i VA2, ai cror
produi de transcripie (de 157 i 140 nucleotide) deturneaz mainria de transcripie
a celulei infectate fcnd-o mai eficace pentru sinteza proteinelor necesare structurii
virale. Dou molecule mici de ARN, EBER I i EBER II (166 i 172 nucleotide) sunt
i ele produse de gene din clasa III ale genomului virusului Epstein-Barr.

129

Genele din clasa III sunt repartizate n dou grupe. n prima, care codific
pentru ARN 5S i ARN 7SL, 7SK, U6 i VA, transcripii primari au aceeai lungime
cu moleculele ARN funcionale; nu exist deci maturare a acestor transcripi.
Trifosfatul din poziia 5 rezultat n urma iniieri transcripiei reprezint extremitatea
5 i ultimul rest care este transcris corespunde extremitii 3 a ARN matur. Genele
clasei III din a doua grup codific pentru moleculele ARNt ale cror forme mature
sunt produse prin eliminarea extremitilor 5 i 3 ale transcripilor primari de ctre
endonucleaze specifice. Secvena -CCA 3 terminal, necesar funcionrii tuturor
ARNt nu este codificat de ctre gen i este adugat de o enzim particular.
Deoarece anumite gene care codific ARNt conin introni este necesar procesul de
maturare (excizie/episaj) pentru producerea moleculelor ARNt mature.

SLIDE 34. Structura ARN polimerazelor eucariote determinat

prin cristalografie electronic
Figura: Structurile ARN polimerazelor eucariote determinate prin cristalografie
electronic.
a) ARN polimeraza II de la drojdii la o rezoluie de aproximativ 16 A. Proteina
are aprox 140x136x110 A.
b) Este ARN polimeraza I de la drojdii la o rezoluie de aprox 30 A. Proteina
are aproximativ 150x110x110 A.

SLIDE 35. Comparaie: subunitile structurale ale ARN

polimerazei de la drojdii i E. coli RNA
Figura: Reprezentare schematic a subunitilor structurale ale ARN polimerazelor
de la drojdii n comparaie cu ARN polimeraza de la E. coli.
Toate trei polimerazele de la drojdii prezint patru subuniti centrale (core)
care exprim aceeai omologie cu subunitile beta, beta i subunitile alfa de la E.
coli. Cea mai mare subunitate (L) de la ARN polimeraza II conine i domeniul C
terminal (CTD). ARN polimeraza I i III conine aceleai dou subuniti like-alfa
neidentice, n timp ce ARN polimeraza II are dou copii a unei subuniti diferite likealfa. Toate trei polimerazele prezint alte cinci subuniti comune (dou copii ale celei
mai mari dintre acestea). n plus, fiecare polimeraz din drojdie conine de la 4 la 7
subuniti mici unice.
Informaii suplimentare
ARN polimeraza II
Genele din clasa II sunt transcrise n nucleu de ctre ARN polimeraza II.
Enzima a fost izolat de la numeroase organisme printre care drojdiile, Physarum,
Aspergilius, Acathamoeba, vegetale superioare insecte, Xenopus i mamifere.
Compoziia n subuniti a enzimelor din diferite organisme este foarte asemntoare
i adesea de ne-departajat pe baza unor criterii fizice. Un numr de nou sau zece
subuniti pare s fie o regul. Toate enzimele analizate conin dou subuniti mari.
Una, de aproximativ 220 kD, este cea mai mare polipeptid pe care o regsim n
structura celor trei tipuri de ARN polimeraze; alta de aproximativ 140 kD. Trei
subuniti mici ale ARN polimeraza II sunt comune cu ARN polimeraza I i II;
celelalte patru sau cinci subuniti sunt specifice enzimei. Existena unei similitudini
structurale i chimice ntre cele dou subuniti mari la cele trei ARN polimeraze
eucariote a fost iniial suspectat datorit reaciilor imunologice ncruciate pe care
acestea le ddeau i datorit existenei unor peptide comune: aceast asemnare este
acum confirmat prin compararea secvenelor genelor clonate. n plus, cele dou

130

subuniti mari ale fiecreia dintre cele trei polimeraze eucariote posed secvene n
aminoacizi cu un nalt grad de asemnare cu secvenele subunitilor mari ale ARN
polimerazei de la E. coli.
Dintre cele trei ARN polimeraze, ARN polimeraza II este cea mai sensibil la
-amanitin. Toxina permite iniierea lanului de ARN dar blocheaz elongarea
acestuia. Situsul de aciune al -amanitinei pare s fie situat la nivelul subunitii
celei mai mari. La Drosophila i la S. cerevisiae mutaiile care confer rezistena la
amanitin sunt localizate n gena care codific pentru subunitatea de 220 kD. Aceast
subunitate mare este i subiectul reaciilor de fosforilare i defosforilare la nivelul mai
multor situsuri. Forma nalt fosforilat, gsit in vivo, atunci cnd activitatea de
transcripie este important, este considerabil mai activ dect enzima defosforilat
din vitro, cel puin n prezena promotorului regiunii tardive din adenovirus.
Domeniul carboxi-terminal al subunitii celei mai mari a ARN polimerazei II
de la drojdii, de la Drosophila i de la mamifere conine multiple repetiii n tandem
ale hexapeptidului Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser. Numrul acestor copii este 26 la
drojdie la 52 la oarece. Aceast secven repetitiv este unic i esenial pentru
activitatea enzimei. Modificarea acestei regiuni n gena de drojdie demonstreaz c
subunitile care conine mai puin de 13 la 13 copii nu sunt funcionale in vivo.
Serinele i treoninele, abundente n aceast regiune, pot fi situsurile de fosforilare
menionate mai sus, dar rolul precis al acestui heptamer nu este deplin elucidat.

SLIDE 36. Cea mai mare subunitate a ARN polimerazei II conine o

repetiie esenial carboxi-terminal care este fosforilat n timpul
transcripiei
Figura: Demonstraia experimental c domeniul carboxi-terminal (CTD) al ARN
polimerazei II este fosforilat n timpul transcripiei n vivo.
Cromozomii politeni de la nivelul glandelor salivare au fost preparati din
larvele de Drosophila chiar nainte de nprlire. Preparatul a fost tratat cu un anticorp
de oarece pentru regiunea CTD fosforilat i cu un anticorp de capr pentru regiunea
CTD nefosforilat. Preparatul a fost apoi colorat cu un anticorp anti-capr marcat
fluorescent cu fluorescein (verde) i cu un anticorp anti-oarece marcat fluorescent
cu rodamin (rou). Moleculele de polimeraze care prezint regiuni CTD nefosforilate
vor fi colorate n verde iar cele care prezint regiuni CTD fosforilate n rou.
Hormonul de nprlire ecdizona induce rate nalte ale transcripiei n regiunile
bufante74EF i 75B; de reinut c n aceaste regiuni sunt prezente numai CTD
fosforilate. Regiunile bufante mici transcrise la rate mari sunt vizibile. Situsurile nebufante care sunt colorate n rou (sgeata n sus) sau verde (sageata orizontal), ca i
siturile colorate att n rou i verde, care produc o culoare galben (sgeata n jos).
Informaii suplimentare
Factorii de transcripie
ARN polimeraza II, ca i celelalte ARN polimeraze necesit o serie de
proteine adiionale pentru a forma un complex de transcripie funcional. Multe sunt
proteine care se fixeaz pe ADN i recunosc una sau mai multe secvene care, par s
constituie promotorul genei. Anumii factori de transcripie reacioneaz prin
intermediul interaciilor protein-protein sau cu ali factori i s modifice astfel
specificitatea i afinitatea acestora. Prin interacii mutuale sau cu diferite secvene de
ADN, diferiii factori de transcripie formeaz ansamble proteice complexe care
regleaz capacitatea ARN polimerazei II de a iniia transcripia. Cea mai mare parte a
complexelor reacioneaz pozitiv crescnd frecvena iniierilor, dar sunt cunoscute i

131

altele care acioneaz negativ fiind deci represori. Exist chiar i factori care
stimuleaz transcripia unei gene dar inhib pe cea a alteia. Muli dintre aceti factori
sunt specifici unui esut sau unor celule i nu reacioneaz dect n anumite stadii de
dezvoltare; acest lucru permite genelor s fie transcrise diferit n funcie de esut sau
de moment (timp). ntr-un anumit sens, ARN polimeraza reprezint mainria de
transcripie, iar interaciile factorilor cu semnalele de reglare de pe ADN sau ntre ei,
determin unde, cnd i cu ce vitez va funciona aceast mainrie.
Numrul de factori proteici care acionnd n trans sunt implicai n sistemele
de transcripie utilizare de ARN polimeraza II este mereu n cretere cu toate c nu
toi au fost foarte bine caracterizai. Rolul unui factor este n funcie de tipurile de
aranjamente ale secvenelor de ADN, elementele cis care constituie regiunea de
reglare a unei gene. Complexitatea lor este att de mare nct anumii factori se leag
la mai mult de o secven de ADN i anumite secvene de ADN reprezint situsuri de
fixare pentru mai multe tipuri de factori. n plus, anumite motive organizate n tandem
se suprapun (se ncalec) crend adesea situsuri de legtur suplimentare absente n
motivele individuale unde favorizeaz fixarea unui factor sau a altuia. Complexitatea
acestor interaciuni, ct i numrul mare de detalii ne-explicate, fac, n momentul de
fa, imposibil o descriere de ansamblu a acestui domeniu important. n plus, exist
nc nomenclaturi diferite i adesea fr raport care au fost folosite pentru a desemna
factorii de transcripie. Acestea sunt, n general, bazate pe originea , tisular sau
celular, pe o caracteristic a situsului de legare sau rezult pur i simplu dintr-o
alegere a aleatoare a autorului.

SLIDE 37. Analiza transcripilor marcai n formare permite cartarea

situsului de iniiere a transcripiei
Figura: Cartarea aproximativ a situsului de iniiere a transcripiei prin analiza
transcripilor n formare sintetizai in vivo.
O seciune de ADN care este n curs de transcriere este evideniat n imagine.
Dup ce celulele sunt marcate pentru timp scurt, producnd molecule de ARN n
formare, celulele sunt rupte i moleculele de ARN izolate sunt separate pe baza
mrimii lanurilor estimat prin centrifugare n gradient de densitate. Fraciile de
diferite mrimi sunt apoi hibridizate cu fragmentele de restricie prezentate n
diagrama de sus (de la A la E). Cei mai scuri ARN marcai vor hibridiza ci
fragmentul de restricie B care conine situsul de iniiere; nucleotidul exact la care
ncepe transcripia nu poate fi determinat. Succesiv moleculele de ARN mai lungi vor
hibridiza cu fragmente din aval fa de situsul de iniiere. Cel mai lung ARN
hibridizeaz cu fragmentul D care conine i situsul de terminare.

SLIDE 38. ARN polimeraza II iniiaz transcripia secvenelor ADN

corespunttoare captului 5 al ARNm

Figura: Cartarea precis a situsului de iniiere a unitii de transcripie trzii a

adenovirusului prin transcripie in vitro
Stnga: Liniile du sus arat situsurile de restricie ale HindIII (cu negru),
XmaIII (albastru) i SmaI (rou) din regiunea genomului adenovirusului unde a fost
localizat situsul de iniiere a transcripiei prin analiza transcripilor n formare
(aproximativ 16 uniti cartate). Fragmentele de restricie HindIII, XmaIII i SmaI
care comin situsurile de iniiere au fost incubate individual cu un extract nuclear
preparat din celule HeLa i ribonucleotid trifosfai marcai cu alfa-32P. Transcripia
fiecrui fragment ncepe la situsul de start: cnd o molecul de ARN polimeraza II

132

care transcrie un fragment ajunge la captul tiat, i prsete matria (run-off

remplate).
Dreapta: Transcriptul rezultat este apoi supus electroforezei n gel i
autoradiografiei. Dac sunt cunoscute poziiile situsurilor de restricie de pe ADN
matri, lungimea transcripilor run-off (n nucleotide, nt) a fragmentelor produse
de SmaI (linia 1). XmaIII (linia 2) i HinIII (linia 3) carteaz precis situsul de start la
16,4 uniti de cartare pe genomul adenovirusului. Secvenele acestei regiuni a
adenovirusului ADN i a captului 5 al ARNm corespunztor i a transcripilor ARN
produi in vitro sunt prezentai n partea stng jos. Astfel punctul de start pentru
transcripia in vitro realizat de ctre ARN polimeraza II corespunde situsului cap
al ARNm. Proba din linia 1a este aceeai cu cea din linia 1, cu excepia prezenei
alfa-amanitinei, ca inhibitor al polimerazei II, care a fost inclus n amestecul de
transcripie. Benzile din partea superioar i inferioar agelului reprezint
moleculele cu mase moleculare ale transcripilor mari i mici care se formeaz n
condiile acestui experiment.

SLIDE 39. Concluzii

Principalul scop al controlului genetic n organismele multicelulare este
realizarea deciziilor precise de dezvoltare astfel nct gene particulare sunt exprimate
n celule particulare n timpul dezvoltrii i diferenierii celulare;
Controlul transcripional este principalul sens al reglrii expresiei genice att
la eucariote ct i la procariote;
n genoamele eucariote, elementele de control care acioneaz n cis i care
regleaz expresia de la nivelul promotorului sunt adesea localizate la multe kb
deprtare de situsul de start. n contrast, elementele de control bacterian sunt dispuse,
n general, pe o distan de 60 pb fa de promotorul pe care acetia l regleaz;
Eucariotele conin trei tipuri de ARN polimeraze nucleare. Toate trei conin
dou subuniti mari i dou subuniti mici care constituie structura central omolog
cu subunitile , i ale ARN polimerazei de la E. Coli, ct i numeroase
subuniti mai mici adiionale. Unele dintre aceste subuniti mici sunt comune iar
altele sunt unice pentru fiecare polimeraz;
ARN polimeraza I sintetizeaz numai pre-ARNr, ARN polimeraza II
sintetizeaz ARNm i unele molecule mici de ARN nuclear care particip la
splicingul ARNm iar ARN polimeraza III sintetizeaz ARNt, ARNr 5S i multe alte
molecule relativ scurte i stabile de ARN.
O secven heptapeptidic, domeniul carboxi-terminal (CTD), din subunitatea
cea mai mare a ARN polimerazei II este fosforilat n timpul iniierii i rmne
fosforilat ct timp enzima transcrie matria;
Similar cu ARN polimerazele bacteriene, ARN polimeraza II iniiaz, de
obicei, transcripia genelor la nivelul unor perechi de baze specifice sau baze vecine
alternative din ADN matri. Nucleotidul din 5 cruia i se adaug capionul la nivelul
ARNm corespunde nucleotidului de pe catena matri la care transcripia este iniiat.

SLIDE 40. TATA box este cel mai bine conservat promotor la eucariote
Figura: Comparaii ale secvenelor nucleotidice situate n amonte de situsul de start
la 60 de gene care codific pentru proteine diferite de la vertebrate
Fiecare secven a fost aliniat pentru a maximiza omologia regiunii 35 la
20. Numerele introduse n tabel reprezint frecvena fiecrei baze la fiecare poziie.
Omologie maxim apare pentru o regiune de 6 baze, care se refer la TATA box i a

133

crei secven este prezentat n partea de jos. Baza iniial cea mai frecvent din
ARNm codificat de genele care conin o TATA box este A.

SLIDE 41. Identificarea elementelor de control transcripional cu

linker mutants
Figura: Analize de scanare mutaional care identific elementele de controltranscripional.
O regiune de ADN eucariot (galben) care susine nivele de expresie crescute
ale unei gene raportor (albastru deschis) este clonat ntr-un vector plasmidial
obinndu-se un numr de clone. Mutaii poziionate la nivelul regiunii de control n
diferite regiuni sunt introduse de la un capt la altul al fragmentului. Aceste mutaii
sunt rezultatul nlturrii aleatroare a unei scurte secvene din ADN. Plasmidele
mutante sunt transfectate separat n celule n cultur i este determinat activitatea
genei raportoare. n exemplul ipotetic muatiile LS (linker scaning) 1,4,6, 7 i 9 nu au
efect sau au efect slab asupra expresiei genei raportor, indicnd c regiunile afectate
n aceti mutani nu conin elemente de control. Exprfesia genei raportor este
semnificativ afectat pentru mutanii 2, 3, 5, i 8 indicnd c elementele control (in
maron) sdunt situate n poziiile indicate n partea inferioar a figurii.

SLIDE 42. Elementele din proximitatea promotorului pot interveni n

reglarea genelor eucariote
Figura: Identificarea elementelor din proximitatea promotorului care controleaz
gena timidin-kinazei (tk) sin virusul herpex simplex (HSV) prin analiza LS (linker
scaning) a mutaiilor.
a) O serie de contrucii ADN a fost preparat, n fiecare construcie o regiune
de aproximativ 10 pb situat n amonte de situsul start al genei tk este mutant prin
nlocuirea cu un linker sintetic care conine un situs de restricie. Fiecare construcie
a fost co-injectat cu o gen tk pseudo-slbatic n ovocitele de Xenopus Laevis n
care gena tk a HSV este transcris cu o frecven ridicat. Dup 24 de ore, a fost
izolat ARN i dozat prin metoda de extincie a primerului folosind un primer ARN
marcat (rou deschis) complementar cu o scurt seciune a ARNm pentru tk. Gena
pseodo-slbatec, care posed o deleie de 10 pb, servete drept control intern a
activitii transcripionale a ovocitelor injectate i a recuperrii ARN.
b) Produii de extindere a primerilor au fost analizai prin gel electroforez i
autoradiografie. Dozarea ARN produs de mutaii LS (linker scaning) conduce la
dou tipuri principale de produi: unul conine 90 de nucleotide corespunttoare
extensiei tuturor ncepnd de la captul 5 al ARN; cel de al doilea este mult mai mic
datorit incompletei extensii. Determinarea ARN transcris de la nivelul genei pseudosalbatice conduce i ea la doi produi: unul lung de 80 de nucleotide i altul mult
mai scurt. Benzile marcate ale fiecrui mutant linker scaning sunt comparate cu
cele ale genei pseudo-salbatice injectate n acelai ovocit (benzile subiri de fond sunt
ignorate). Mutanii LS sunt numii prin intervalul din amonte la nivelul cruia
secvena slbatec din amonte a tk este mutat. De reinut c densitatea
descresctoare a benzilor indic descreterea transcripiei tk, pentru moleculele de
ADN LS mutante marcate n rou.
c) Pe baza rezultatelor au fost cartate elementele din regiunea proximal
promotorului (in maron) genei tk.

134

SLIDE 43. Transcripia catalizat de ARN polimeraza II este adesea

stimulat de secvene enhancer deprtate
Figura: Identificarea regiunii enhancer a SV40.
Au fost construite plasmide coninnd gena beta-globinei cu sau fr prezena
unui fragment de 366 pb provenind de la SV40. Fiecare plasmid a fost transfectat
separat n fibroblaste n cultur, care n mod normal nu exprim beta-globin (etapa
1). Cantitatea de ARNm pentru beta-globin sintetizat de celulele transfectate a fost
determinat prin metoda de protecie cu nucleaz S1. Sonda folosit n aceast
determinare a fost un fragment de restricie, generat din ADNc pentru beta-globin,
complementar cu captul 5 al ARNm pentru beta-globin (etapa 2). Captul 5 al
sondei a fost marcat cu 32P (punctele roii). Cnd ARNm pentru beta-globin a fost
hibridizat cu sonda, un fragment de aproximativ 340 nucleotide din sond a fost
protejat de digestia cu nucleaz S1 (etapa 3). Autoradiografia fragmentelor protejate
de S1 (etapa 4) evideniaz c celulele transfectate cu plasmida 1 (linia 1) produc
mai mult ARNm pentru beta-globin dect cele transfectate cu plasmida 2 (linia 2).
Linia C reprezint controlul ARNm pentru beta-globin izolat din reticulocite care
sintetizeaz activ beta-globin. Aceste rezultate demonstreaz c fragmentul de ADN
pentru SV40 conine un element, numit enhancer (activator) care stimuleaz mult
sinteza ARNm al beta-globinei.

SLIDE 44. Majoritatea genelor eucariote sunt reglate prin mai multe
mecanisme de control
Figura: Comportamentul general al elementelor de control care acioneaz n cis
pentru reglarea expresiei genelor la drojdii i la orgamismele multicelulare
(nevertebrate, vertebrate i plante).
a) Genele organismelor multicelulare conin att elementele proximale
promotorului i enhancerii (activatorii) ct i TATA box sau alte elemente
promotoare. Ultimile poziioneaz ARN polimeraza II pentru a iniia transcripia la
situsul de start i influeneaz rata transcripiei. Activatorii pot fi poziionai fie n
amonte fie n aval i la o distan de aproximativ 50 kb fa de situsul de start al
transcripiei. n unele cazuri, elementele din proximitatea promotorului apar la fel de
bine i n aval de situsul de start al transcripiei.
b) majoritatea genelor de drojdii conin numai o regiune reglatoare, numit
secvena activatoare n amonte (Upstream Activating Sequence-UAS) i o TATA
box, care este de aproximativ 90 pb n amonte de situsul de start.

SLIDE 45. Concluzii

Expresia genelor eucariote care codific pentru proteine este reglat prin
intervenia unor elemente multiple care acioneaz sub forma unor regiuni de control
n cis. Unele elemente de control sunt localizate n apropierea situsului de start
(elemente din proximitatea promotorului), n timp ce altele sunt localizate la distan
(activatori sau enhanceri);
Promotorii determin situsul de iniiere a transcripiei i legarea direct a ARN
polimerazei II. Au fost identificate trei tipuri de secvene promotor pentru ADN de la
eucariote. TATA box, tipul cel mai comun este dominant pentru genele transcrise
rapid. Promotorii de tip iniiator sunt reprezentai cu o frecven sczut n anumite
gene n timp ce insulele CpG sunt caracteristice genelor transcrise;

135

Elementele din proximitatea promotorului sunt localizate ntr-un interval de

200 pb fa de situsul de start. Multe astfel de elemente, coninnd mai puin de 20 pb,
pot fi utile n reglarea unei gene particulare;
Activatorii, care au de obicei o lungime de aproximativ 100-200 pb, conin
mai multe elemente control de 8 la 20 pb. Acestea pot fi localizate de la 200 pb la 10
kb n amonte sau n aval de promoter, n interiorul unui intron, sau n aval de exonul
final al genei;
Elementele din proximitatea promotorului i activatorii sunt adesea specifici
unui tip celular, funcionnd numai tipuri celulare difereniate specific.

SLIDE 46. Factoriii implicai n transcripie sunt identificai prin

tehnici biochimice
Figura: Purificarea factorilor de transcripie
a) Mai multe etape cromatografice sunt folosite pentru purificarea unui factor de
transcripie (protein inrudit, asemntoare, similar) care se leag specific la un
element reglator din structura ADN. Purificarea final este obinut prin
cromatografie de afinitate pe o coloan care este cuplat cu cu catene lungi de ADN
care conin mai multe copii al situsului de legare a factorului proteic. Un preparat
proteic partial-purificat care conine factorul de transcripie este aplicat pe o coloan
cu o trie ionic sczut (100 mM KCl). Proteinele care nu se leag deloc la situsurile
specifice vor fi eluate cu tampoane cu salinitate sczut. Proteinele cu afinitate
sczut pentru situsul de legare sunt splate de pe coloan cu toampoane de salinitate
intermediar (300 mM KCl). In final, factorii proteici inalt purificai sunt eluai cu
soluii saline concentrate (1 M KCl);
b) Proteinele separate prin cromatografie pe coloan sunt testate pentru
capacitatea lor de legare la un element reglator identificat. n acest exemplu, testrile
ADN footprintingpentru proteinele separate prin cromatografie de schimb ionic
indic c fraciile de interes sunt 9-12. Aceste proteine pot fi testate si prin tehnica de
intarziere in gel.
Informaii suplimentare
Ca i la E. coli, diferitele elemente transcripionale de control prezente la
eucariote sunt situsuri de legare a proteinelor reglatoare care acioneaz n trans. Mai
departe o sa discutm despre identificarea, purificarea i structura acestor factori de
transcripie care sunt activatori i represori ai genelor proteice care codific pentru
proteine.
Dup identificarea elementelor reglatoare cu ajutorul analizelor mutaionale
descrise anterior, pasul urmtor l reprezint identificarea proteinelor care recunosc
aceste structuri si se leag specific la ele.
Figura evideniaz modul n care un extract proteic nuclear este supus mai
multor etape cromatografice i apoi unor analize de footprinting cu DN-aza I sau
de intarziere n gel folosint fragmente de ADN care conin elementele reglatoare n
cis deja identificate. Fraciile care conin proteine care se leag la elementele
reglatoare este foarte probabil s conin un posibil putativ factor de transcripie. O
tehnic bun pentru etapa de purificare final a factorilor de transcrpie o constituie un
tip particular de cromatografie de afinitate specific unei secvene de ADN. Ca un test
final, capacitatea proteinelor izolate de a stimula transcripia unei matrici care conine
un situs corespunztor de legare a proteinei, se realizeaz o reacie de transcripie in
vitro.
O dat ce factorul de transcripie a fost izolat, secvena sa parial n
aminoacizi poate fi determinat i folosit pentru pentru clonarea genei sau a ADNc
136

codificat de aceasta. Gena izolat poate fi folosit apoi pentru a testa capacitatea
proteinei codificate de a stimula transcripia ntr-o reacie de transcripie in vitro.

SLIDE 47. Determinarea in vitro a activitii factorilor

de transcripie
Figura: testarea in vitro a activitii de transcripie
Sistemul experimental folosit necesit prezenta a dou plasmide. O plasmid
conine gena care codific pentru un factor posibil (putativ) de transcripie-proteina X.
Cea de a doua plasmismid conine o gen raportor si unul sau mai multe situsuri de
legare a proteinei X. Ambele plasmide sunt simultan introduse n celule gazd crora
le lipsesc gena care codific pentru proteina X i gena raportor. Este msurat
transcripia ARN produs de gena raportor; alternativ, activitatea proteinelor
codificate poate fi determinat. Dac transcripia genei raportor este mai mare in
prezena plasmidei care codific proteina X, nseamn c proteina este un activator;
dac transcripia este mai sczut, atunci este un represor. Prin folosirea unor
plasmide care codific au factor de transcripie mutant sau care conine o rearanjare,
pot fi identificate domeniile importante ale proteinei.

SLIDE 48. Identificarea genetic a genelor care codific pentru factori

de transcripie
Ex: serii de mutani Gal4 purttori de deleii-demonstreaz c factorii de transcripie
sunt compui din domenii separate de legare i de activare
La drojdii, genele care codific pentru factori de transcripie au fost mai nti
identificate prin analize genetice clasice. De ex, una dintre genele de la drojdii
necesare cresterii este numit Gal4. Incubarea unor celule slbatice ntr-un mediu care
conine galactoz are drept rezultat creterea de aproximativ o mie de ori a cantitii
de ARNm pentru enzimele implicate n metabolismul galactozei. Aceast activare nu
se poate observa n cazul mutanilor gal4. Studii de mutagenez dirijat asemntoare
celor prezentate anterior pentru determinarea regiunilor UAS pentru genele
inductibile. S-a determinat c fiecare regiune UAS conine mai mult de o copie a
secvenei de 17 pb nrudite numit UASGAL. Cnd o copie a UASGAL a fost clonat
n amonte de o secvena TATA box urmat de o gen raportor lacZ, expresia lacZ a
fost activat in celulele slbatice cultivate pe mediu cu galactoz, dar nu i n cazul
mutantelor gal4. Aceasta indic c UASGala este un element de control al
transcripiei activat de ctre proteina Gal4 pe mediile cu galactoz.
Gena Gal4 a fost izolat prin complementare mutantului gal4 cu o banc de
ADN de drojdii slbatec. Prin folosirea tehnicilor de recombinare a ADN, proteina
Gal4 a fost exprimat n E. coli i s-a determinat legarea acesteia la UASGAL. Cnd
proteina Gal4 se leag la secvenele UASGAL i activeaz transcripia din apropierea
promotorului cnd celulele sunt plasate pe mediu cu galactoz.
Studii genetice clasice au fost realizate si pe multe alte organisme cum sunt
Drosophila, C. elegans si plantele superioare au dus la descoperirea mai multor gene
care codific pentru factori de transcripie.
Activatorii transcripionali sunt proteine modulare compuse din domenii
funcionale distincte
Un remarcabil set de experimente realizate cu proteina Gal4 de la drojdii au
demonstrat c acest factor de transcripie este compus din domenii funcionale
separabile: un domeniu de legarea a ADN care interacioneaz cu secvene specifice
de ADN i un domeniu de activare, care interacioneaz cu alte proteine pentru a

137

stimula transcripia de la nivelul secvenelor din apropierea promotorului. n aceste

experimente o serie de mutani de deleie gal4 au fost testai pentru capacitatea lor de
a activa transcripia unei gene raportor (lacZ) legat la UASGAL. Msurarea activrii
transcripiei a fost msurat n celulele care gena GAL4 i deci i proteina gal4 nu vor
interfera cu analiza. Legarea proteinei mutante Gal4 la secvena UASGAL poate fi i
aceasta testat. Rezultatele acestor experimente, evideniate n figur demonstreaz c
Gal4 conine un un domeniu N-terminal de legare la ADN de 74 aminoacizi i un
domeniu activator C-terminal. Cnd domeniul N-terminal de legare la ADN a fost
fuzionat cu difrerite fragmente C-terminale, proteinele trunchiate rezultate pstreaz
capacitatea de a stimula expresia genei raportor. Deci regiunea intern a proteinei nu
este necesar pentru funcionarea Gal4 ca factor de transcripie.
Experimente similare au fost realizate i pentru factorul de transcripie de la
drojdii Gcn4, care regleaz genele necesare pentru sinteza multor aminoacizi, indic
existena unui domeniu de legare de aproximativ 60 aa i un domeniu de activare Cterminal de aproximativ 20 aa pozitionat n apropierea mijlocului secvenei.
Studii de acest fel au fost realizate pentru muli factori de transcripie de la
drojdii. Domeniile de activare ale factorilor de transcripie de la mamifere au fost
adesea determinate frecvent prin fuzionarea lor cu domeniul de legarea al Gal4 cnd
celuzlele de mamifere nu conin un factor endogen capabil s se lege la secvena
UASGAL. Modelul structural a activatorilor de la eucariote care a fost emanat din
aceste studii este unul modular n care unul sau mai multe domenii activatoare sunt
conectate unui domeniu de legare capab il s recunoasc secvene specifice de legare
la ADN. n unele cazuri, aminoacizii inclui in domeniul de legare contribuie i el la
activarea transcripional. Aa cum s-a discutat anterior, domeniile de activare se
crede c funcioneaz prin intermediul interaciilor protein-protein cu factorii de
transcripie legai la promotor. Domeniile proteice ale activatorilor, care conecteaz
domeniile de legare la ADN cu domeniile de activare pot explica de ce modificrile n
spaiul dintre elementele de control sunt att de bine tolerate la nivelul regiunilor de
control de la eucariote. Cnd domeniile de legare din apropierea factorilor de
transcripie sunt deplasate de pe poziiile lor relative de pe ADN, domeniile lor de
activare pot inc s interacioneze deoarece ataarea lor la domeniile de legare este
flexibil.

SLIDE 49. Activatorii transcripionali sunt proteine modulare compuse

din domenii funcionale distincte
Figura: Diagrame schematice care ilustreaz structura modular a activatorilor de
transcripie de la eucariote
Aceti factori de transcripie pot conine mai mult de un domeniu de activare
dar arareori conin mai mult de un domeniu de legare la ADN. Receptorul
glucocorticoid (GR), care conine i un domeniu de legare a hormonului activeaz
transcripia genelor int n prezena anumitor hormoni. Sp1 se leag la regiunea
promotoare bogat n elemente GC ntr-un numr mare de gene de mamifere.
Domeniile proteice cu flexibilitate mare din structura activatorilor sunt extrem de
sensibile la digestia cu proteaze.
Informaii suplimentare
Factorii de transcripie se leag la ADN i activeaz transcripia prin
intermediul domeniilor independente
Factorii de transcripie i alte proteine reglatoare sunt necesari pentru dou
tipuri de activiti:

138

- Ei trebuie s recunoasc secvenele int specifice localizate n activatori,

promotori, sau alte elemente reglatoare care afecteaz o anumit gen. (Pentru o
protein represor, legarea la ADN poate fi suficient pentru a-i exercita funcia:
prezena proteinei servete pentru a mpiedica expresia genei).
- Pentru un factor se transcripie sau o protein reglatoare este necesar mai
mult; odat legat la ADN, proteina i exercit funcia prin legarea altor
componente care fac parte din aparatul de transcripie.
Putem caracteriza domeniile factorilor de transcripie care sunt responsabili
pentru aceste activiti? Adesea domeniile care leag ADN i activeaz transcripia
sunt separate, i fiecare funcioneaz independent. De fapt, putem vedea (considera)
funcia domeniului de legare a ADN ca fiind complet odat ce domeniul de activare
a fost adus n vecintatea punctului de start. n principiu, este necesar ca conexiunea
dintre domeniile de legarea a ADN i cel de activare s fie destul de flexibil pentru a
permite domeniului de activare s gseasc intele sale proteice fr a ine seama de
situsul exact coninut de domeniul de legare a ADN la nivelul promotorului. Proteina
int este cel mai probabil un factor de transcripie bazal. Experimentele cu diferite
sisteme sugereaz c principiul domeniilor independente este comun pentru activatorii
transcripiei.
Natura modular a activatorilor transcripiei a fost bine caracterizat pentru
activatorul GAL4 de la drojdie, care controleaz transcripia genelor ai cror produi
sunt responsabili de metabolizarea galactozei. Reglarea se realizeaz la UASG (o
secven de activare din amonte care la drojdii este echivalentul unui activator).
Proteina GAL4 are 4 situsuri de legare n UASG. Fiecare situs este o copie a
palindromului care are o secven consens de 17 pb. Totui, o singur copie a
secvenei consens este adecvat pentru a conferi susceptibilitate (sensibilitate) la
reglarea GAL4.
Proteina GAL4 are trei funcii: ea se leag la ADN; ea activeaz transcripia;
i ea leag o alt protein reglatoare, numit GAL80. Aceste funcii pot fi separate.
Domeniul de legare a GAL4 const n 65 de aminoacizi terminali. Fragmentul
N-terminal poate lega secvena consens obinuit, dar nu activeaz transcripia.
Capacitatea de a activa transcripia poate fi conferit de ctre dou alte regiuni
ale proteinelor: fie secvena 148-196 fie 768-881, dac ataarea la domeniul de legare
a ADN poate activa transcripia.
Regiunea 65-94 permite proteinei s formeze dimeri (dimerizeze). Este destul
de normal pentru factorii de transcripie s posede domenii adiacente pentru legarea
ADN i dimerizare.
Regiunea 851-881, localizat n interiorul unuia dintre domeniile dezactivare,
leag GAL80. DE fapt, aceasta este modalitatea prin care GAL4 rspunde la
galactoz. Expresia genelor GAL este indus de ctre galactoz, care se leag la
proteina GAL80. n absena galactozei, proteina GAL80 leag GAL4 i o mpiedic
s realizeze activarea transcripiei. Galactoza induce transcripia prin eliberarea
GAL80, permind astfel GAL4 s funcioneze efectiv. Aceasta este una dintre
variantele unei teme comune: o protein (sau oricare alt ligand) se leag la un factor
de transcripie pentru a regla (direct sau indirect) domeniul su activare a transcripiei.
Este natural c legarea la ADN este prealabil activrii transcripiei. Depinde
activarea de un anumit domeniu de legare la ADN (DNA-binding domaine).
Represorul bacterian LexA are un capt N-terminal al domeniului de legare la
ADN care recunoate un operator specific; legarea LexA la acest operator reprim
promotorul adiacent. ntr-un experiment de schimbare, aceast secven poate fi

139

nlocuit cu domeniul de legare al GAL4. Gena hibrid poate fi introdus n drojdii

mpreun cu gena int care conine fie operatorul US fie LexA.
O protein GAL4 autentic poate activa o gen int numai dac are un
operator UAS. Represorul LexA singur nu are capacitatea de a activa nici un fel de
int. Hibridul LexA-GAL4 nu mai poate nici el s activeze o gen cu un UAS, dar
acum poate activa o gen care are un operator LexA.
Acest rezultat corespunde punctului de vedere modular asupra activatorilor
transcripiei. Domeniul de legare a ADN servete n aducerea proteinei ntr-o
localizare corect. Cum i unde acesta se leag la ADN nu este relevant, dar, odat
legate, domeniile de activare a transcripiei pot determina iniierea transcripiei. n
acord cu acest punct de vedere, nu mai are importan att de mare dac domeniile de
activare a transcripiei sunt aduse n vecintatea promotorului prin recunoaterea UAS
via domeniului de legare a GAL4 sau prin recunoaterea operatorului LexA via
specificitii modului LexA. Capacitatea celor dou tipuri de module de a funciona n
proteine hibride sugereaz c fiecare domeniu al proteinei se pliaz independent ntr-o
structur activ i nu este influenat de restul proteinei.
Ideea c factorii de transcripie au domenii independente care leag ADN i
care activeaz transcripia este ntrit de capacitatea proteinei tat a virusului HIV de
a stimula iniierea fr a se lega deloc la ADN. Proteina tat se leag la o regiune a
structurii secundare a produsului ARN; partea ARN necesar pentru aciunea tat este
numit secvena tar.
Secvena tar este localizat chiar n aval de punctul de start, astfel nct cnd
tat se leag la tar, este adus n vecintatea complexului de iniiere. Acest lucru este
suficient pentru a asigura ca domeniul su de activare s fie destul de aproape de
complexul de iniiere. Domeniul de activare interacioneaz cu unul sau mai muli
factori de transcripie legai la complex n acelai fel ca i un factor de transcripie
situat n amont (De reinut c cel puin primul transcript trebuie s fie nceput n
absena tat pentru a furniza astfel situsul de legare).
O demonstraie extrem privind independena localizrii i activrii
domeniilor a fost dat de cteva construcii n care tat integrat astfel nct domeniul de
activare a fost conectat la domeniul de legare a ADN n locul secvenei obinuite de
legare tar: cnd un situs int adecvat este plasat n promotor, domeniul de activare tat
poate activa transcripia. Aceasta sugereaz c putem considera domeniul de legare al
ADN (sau n acest caz domeniul de legare al ARN) ca furniznd o funcie de fixare
(de priponire), al crei scop principal este s se asigure c domeniul de activare se afl
n vecintatea complexului de iniiere.
Noiunea de priponire este un exemplu mult mai specific pentru ideea general
c iniierea necesit o concentraie mare de factori de transcripie n vecintatea
promotorului. Acest deziderat poate fi atins cnd factorii se leag de activator care se
afl la o anumit distan pe ADN linear, cnd factorii se leag n amont de
componentele promotorului, sau n caz extrem prin priponirea (fixarea) unui produs
ARN. Cerina comun a tuturor acestor situaii este flexibilitatea exact cele n trei
dimensiuni a aranjamentului format din ADN i proteine.
Exist diferite modaliti prin care factorii de transcripie situai n amont
activeaz transcripia, dar cea mai obinuit modalitate este probabil interacia
protein-protein cu un factor de transcripie bazal. Cele mai comune inte pentru
activare par s fie TFIIID i TFIIIB.
Domeniile de activare ale factorilor de transcripie GAL4 i GCN4 de la
drojdie au multe sarcini negative, de unde descrierea lor drept activatori acizi. Un alt
activator efectiv particular de acest tip este proteina VP16 a virusului Hepex Simplex

140

(VP16 nu are un domeniu de legare la ADN, dar interacioneaz cu aparatul de

transcripie via o protein intermediar. Experimentele realizate pentru a putea
caracteriza funcionarea activatorului acid au fost realizate adesea folosind regiunea
de activare a VP16 legat la cteva motive de legare a ADN.
Nu este clar dac sarcinile negative sunt necesare pentru funcionarea
activatorilor acizi. Pe de o parte, secvenele care au capacitate activatoare cnd se
leag la domeniul de legare a ADN al GAL4 pot exista sub forma unei serii de
secvene polipeptidice scurte care au n comun numai faptul c posed sarcini
negative. Aceasta sugereaz c regiunea de activare este reprezentat de un lob acid
(regiune acid) care interacioneaz ntr-o manier relativ nespecific cu alte proteine
implicate n transcripie. Se consider c mutaiile care determin ndeprtarea
(pierderea) aminoacizilor acizi reduc abilitatea de activare, n timp ce mutaiile care
ndeprteaz aminoacizii bazici genereaz activatori mult mai eficieni. Totui,
mutarea sistematic pentru a ndeprta gruprile ncrcate din GAL4 nu afecteaz
asupra capacitii de activare. Probabil este important lipsa sarcinilor pozitive.
Domeniile de activare ale GAL4 i GCN4 formeaz foi (-sheets, pliere ) care
furnizeaz probabil o interfa pentru contactarea altor proteine.
Activatorii acizi funcioneaz prin schimbarea capacitii TFIIB s lege
complexul bazal de iniiere. Experimentele in vitro arat c legarea TFIIB la
complexul de iniiere pentru un promotor al adenovirusului este stimulat de prezena
activatorilor acizi GAL4 sau VP16; VP16 se poate lega direct la TFIIB. Asamblarea
TFIIB n complex pentru acest promotor (al adenovirusului) reprezint o etap
limitant de vitez care este stimulat de prezena unui activator acid.
Alte tipuri de motive de activare sunt mult mai puin bine caracterizate, dar
includ o regiune bogat n glutamin pentru Sp1 i o regiune bogat n prolin n
CTF. Sp1 pare s necesite proteinele TAF (TAFs= TBP asociated factors) care sunt
asociate cu TBP (TATA binding protein) pentru aceast aciune, astfel nct inta sa
de activare s fie complexul TFIID. Exist date care indic c activatorii pot aciona
cu TFIID.
Elasticitatea promotorului ARN polimerazei II fa de rearanjarea elementelor,
i chiar prezen unor elemente particulare, sugereaz c evenimentele (etapele,
procesele) prin care acesta este activat sunt ntr-o oarecare msur independente
context i relativ generale (destul de generale). De fapt, orice factor situat n amont i
a crui regiune de activare este adus n aceeai orientare (la acelai nivel) cu
complexul bazal de iniiere poate fi capabil s stimuleze formarea acestuia. Cteva din
dovezile izbitoare ale acestei vesatiliti (multiplicitii/elesticitii) au fost furnizate
prin construirea unor promotori care constau n noi combinaii de elemente. De
exemplu, cnd elementul UASG de la drojdie este inserat lng promotorul unei gene
de la un eucariot mai evoluat, aceast gen poate fi activat de GAL4 n culturi
celulare de mamifere.
Deoarece GAL4 activeaz promotorul se pare c aceast protein este bine
conservat evolutiv ncepnd de la drojdii i pn la eucariotele superioare. Proteina
GAL4 trebuie s recunoasc anumite trsturi ale aparatului de transcripie de la
mamifere care se aseamn cu punctele sale normale de contact de la drojdie. O
interpretare este aceea c de fapt exist componente comune, fie ale ARN polimerazei
fie ale altor factori de transcripie, care pot fi recunoscui de ctre unul sau mai muli
factori pentru a activa transcripia. Componentul comun poate fi mai degrab un
motiv dintr-o protein dect o protein ntreag.

141

SLIDE 50. Domeniile de legare la ADN pot fi clasificate n mai multe

tipuri structurale
Proteine care conin homeodomenii
Proteine Zinc-finger
Proteine Winged-helix (forkhead)
Proteined Leucine-zipper
Proteine Helix-loop-helix
Factorii de transcripie de la eucariote conin o varietate de motive structurale
care interacioneaz cu secvene de ADN specifice. Ca i la majoritatea activatorilor i
represorilor bacterieni, elicele alfa ale factorilor de transcripie de la eucariote sunt
orientate astfel nct s fac posibil legarea la fosa major a ADN unde atomii din
structura proteinelor particip la formarea legturilor de hodrogen i a legturilor Van
der Waals cu atomi din structura ADN. Interaciile cu atomii scheletului fosfat, i n
unele cazuri cu atomii din structura ADN de la nivelul fosei minore contribuie i
acestea la legare.
Analizele cristalografice cu raze X ale complexelor dintre situsuri de legare
specifice din structura ADN i factori de transcripie izolai au evideniat un numr de
motive structurale care pot prezenta un alfa-helix in fosa major.
Informaii suplimentare
Exist multe tipuri de domenii de legare a ADN (ADN binding domains)
Comparaiile ntre secvenele mai multor factori transcripionali (implicai n
transcripie) sugereaz c pot fi regsite tipuri comune de motive care sunt
responsabile pentru legarea ADN (pentru legarea la ADN). Motivele sunt ntotdeauna
destul de scurte i cuprind numai o mic parte a structurii proteinei. Motivele au fost
de asemenea identificate ca fiind responsabile de activarea transcripiei via
interaciilor dintre proteinele aparatului de transcripie. Exist informaii detaliate
despre numeroase grupuri de proteine care regleaz transcripia folosind motive
particulare (anumite tipuri de motive) pentru a lega ADN:
- Receptorii steroizi sunt definii ca grup printr-o relaie funcional: fiecare
receptor este activat prin legarea unui anumit steroid (un steroid particular).
Receptorul pentru glucocorticoid este cel mai studiat. mpreun cu ali receptori, cum
sunt receptorul pentru hormonul tiroidian sau receptorul pentru acid retinoic,
receptorii steroizi sunt membrii unei superfamilii de factori de transcripie cu acelai
mod general de operare (modus operandi).
- Motivele degete cu zinc (zinc finger) cuprind un domeniu de legare a ADN
(care leag ADN). Au fost original recunoscute n factorul TFIIA, care este necesar
ARN polimerazei III pentru a transcrie genele care codific ARNr 5S. De atunci au
fost identificate n numeroi ali factori de transcripie (i presupui factori de
transcripie). O form distinct a motivului a fost gsit i n receptorii steroizi.
Motivul Winged-helix (naripat) sau Forkhead (ramificat) este
caracteristic domeniilor de legare la ADN ale histonei 5 i a altor factori de
transcripie care au fost evideniai ca fiind implicai n funcionarea timpurie la
Drosophila i mamifere. Asemeni proteinelor zinc-finger C2H2, proteinele
winged-helix se leag n genmeral la ADN ca monomeri.
Motivul helix-turn-helix (helix-cotitur-helix) a fost original identificat ca un
domeniu de legare a ADN al fagilor represori. Un -helix se leag n fosa mare a
ADN; cellalt helix se leag transversal (de-a curmeziul) peste ADN. O form
nrudit a motivului este prezent n domeniul homeo (homeo domain), secven
care a fost pentru prima dat caracterizat la numeroase proteine codificate de gene

142

implicate n reglarea dezvoltrii la Drosophila. Aceste domenii au fost identificate

acum n gene care codific pentru factorii de transcripie de la mamifere.
- Motivul amfipatic helix-loop-helix (helix-bucl-helix) (HLH) a fost
identificat n cazul ctorva regulatori de dezvoltare i n genele care codific pentru
proteine care leag ADN. Fiecare helix amfipatic prezint o faz format din resturi
hidrofobe i cealalt format din resturi ncrcate (sarcini). Lungimea buclei (loop) de
conectare variaz de la 12 la 28 de aminoacizi. Motivul permite moleculelor s
dimerizeze, i o regiune bazic (ncrcat pozitiv) situat lng acest motiv intr n
contact cu ADN.
- Motivul fermoar de leucine sau agrafe cu leucin (leucine zippers) const
ntr-o regiune (ntindere) format din aminoacizi n care fiecare al aptelea aminoacid
este o leucin. O secven leucine zipper (fermoar leucin) de pe o polipeptid
interacioneaz cu o alt secven de acelai tip de pe o alt polipeptid pentru a forma
un dimer. Adiacent (n apropierea) fiecrui fermoar (zipper) exist o poriune
(ntindere) de resturi ncrcate pozitiv care este implicat n legarea ADN.
Activitatea unui factor de transcripie inductibil poate fi reglat n mai multe
moduri:
a) un factor este specific de esut (esut specific) deoarece el este sintetizat
numai ntr-un anumit tip de celul. Mai muli factori de acest tip sunt cunoscui, muli
dintre ei incluznd domenii homeobox.
b) activitatea unui factor poate fi direct controlat prin modificarea acestuia.
HSTF este transformat n forma activ prin fosforilare. AP1 (un heterodimer
constituit din subunitile Jun i Fos) este transformat n forma activ prin
defosforilarea subunitii Jun.
c) un factor este activat sau inactivat prin cuplarea unui ligand. Receptorii
steroidieni sunt primele exemple. Cuplarea (ataarea) ligandului poate influena att
localizarea proteinei (afectnd transportul din citoplasm n nucleu) ct i direct
abilitatea (capacitatea) sa de a se lega la ADN.
d) disponibilitatea unui factor poate varia; de exemplu, factorul NFkB (care
activeaz genele k ale imunoglobulinelor n limfocitele B) este prezent n multe tipuri
de celule. Acesta poate fi ns reinut n citoplasm de ctre inhibitorul proteic I-kB.
n limfocitele B, NFkB este eliberat de I-kB i se deplaseaz n nucleu, unde activeaz
transcripia.
e) un factor cu structur dimer poate avea comportamente diferite. Exist
posibilitatea ca un partener s l inactiveze; sinteza partenerului activ poate deplasa
partenerul inactiv. Vom putea vedea mai departe c astfel de situaii pot fi amplificate
n reelele n interiorul crora diferii parteneri se mperecheaz alternativ unul cu
altul. Situaie este valabil mai ales n cazul proteinelor HLH (helix-loop-helix)
Totui, trebuie s reinem c mutaii la nivelul factorilor de transcripie din unele din
aceste clase (categorii) d natere unor activai ne-adecvat (incorect) sau inhib
activarea transcripiei; ei pot avea lor n generarea tumorilor. .
n continuare vor fi discutate mai detaliat reaciile de legare a ADN i de
activare, realizate de unele dintre aceste clase de proteine. n multe cazuri, legarea
ADN este realizat de o scurt regiune de -helix care face contact fie cu bazele fie
cu scheletul fosfat de la nivelul fosei majore.

SLIDE 51. Homeodomeniile proteinei engrailed care

interacioneaz cu domeniile specifice din structura ADN
Figura: Homeodomeniul proteinei engrailed care interacioneaz specific cu
situsul su specific ADN
143

Factorul de transcripie engrailed este exprimat n timpul embriogenezei de

la Drosophila. Perechile de baze ale situsului de recunoatere care intr n contact
direct cu proteina sunt evideniate n alb. Regiunile mai deschise din protein conin
resturile care intr n contact cu fosa mare.
Informaii suplimentare
Domeniile Homeo se pot lega la secvene int nrudite de pe ADN
Homeobox este o secven care codific pentru un domeniu de 60
aminoacizi prezent n proteinele multor sau chiar a tuturor eucariotelor. Numele su
deriv de la identificarea iniial la Drosophila a locilor homeotici (acele gene care
determin identitatea structurilor corpului). Homeobox este prezent n multe gene
care regleaz dezvoltarea timpurie la Drosophila, un motiv nrudit fiind determinat n
genele unui mare numr de eucariote superioare. Este foarte atractiv ipoteza c
domeniile homeo identific (sau mcar sunt comune acestora) genele implicate n
reglarea dezvoltrii. Secvene nrudite cu domeniul homeo au fost gsite n multe
tipuri de factori de transcripie de la animale. Extinderea de la domeniile homeo
originale de la Drosophila la mamifere, corelaiile (relaiile) dintre regiunile
conservate scad semnificativ.
La Drosophila genele homeo, adesea domeniul homeo (dar nu ntotdeauna)
sunt localizate n apropierea captului C-terminal. Adesea genele posed o secven
mic conservat situat n afara homeobox. Conservarea secvenelor homeobox
variaz. Un grup major de homeobox care conine i genele de la Drosophila are o
secven bine conservat, cu 80-90% omologie (asemnare) ntre perechile de
secvene comparate. Adesea, n factorii de transcripie animali domeniul homeo este
combinat cu alte motive. Un exemplu este prezentat de ctre proteinele Oct (octamerbinding), care reprezint un grup n care regiunea de 75 aminoacizi conservat este
denumit regiunea Pou i este localizat n imediata vecintate a unei regiuni care se
aseamn cu domeniul homeo. Secvenele corespunztoare prezente n domeniile
homeo ale proteinelor din grupul Pou sunt cele mai ndeprtate rude ale grupului
original, constituind astfel cea mai cea mai ndeprtat ramur a familiei (cea mai
ndeprtat extensie a familiei).
Domeniul homeo este responsabil pentru legarea la ADN, experimentele de
schimbare a domeniilor homeo ntre proteine sugereaz c specificitatea
recunoaterii ADN este nscris n interiorul homeo domeniului. Dar (ca i n cazul
fagilor represori) nu poate fi dedus un cod simplu care leag proteina i secvenele de
ADN. Regiunea C-terminal a domeniului homeo arat o omologie cu motivul
helix-turn-helix al represorilor de la procariote. Aa cum ne amintim represorul
lambda posed un helix de recunoatere (-helix-3) care intr n contact cu fosa
major a ADN, n timp ce cellalt helix (-helix-2) se leag ntr-un anumit unghi
transversal (de-a curmeziul) de-a lungul ADN. Domeniul homeo poate fi organizat
n trei regiuni sub form de helix poteniale; Partea cea mai bine conservat a
secvenei se leag de cel de al treilea helix. Diferenele dintre aceste structuri i
structurile represorului de la procariote sunt legate de lungimea helixului care
recunoate ADN, helixul 3, care este cu 17 aminoacizi mai lung n domeniul homeo,
fa de o lungime de 9 resturi n cazul represorului lambda.
Structura cristalin a domeniului homeo al produsului genei D. melanogaster
engrailed (pictat) este prezentat schematic n figura. Helixul 3 se leag la nivelul
fosei mari a ADN i realizeaz majoritatea contactelor dintre protein i acidul
nucleic. Majoritatea contactelor care orienteaz helixul n fosa major sunt realizate
cu coloana fosfat, deci ele nu sunt specifice pentru secvena ADN. Aceasta se leag
larg pe faa dublului helix, i flancheaz bazele cu care au fost realizate contacte
144

specifice. Celelalte puncte de contact rmase sunt realizate de braul N-terminal al

domeniului homeo, secvena care precede exact primul helix. Ea este proiectat
(orientat/azvrlit) n fosa minor. Astfel, regiunile N- i C-terminale ale
domeniului homeo sunt primele rspunztoare de contactul cu ADN (de intrarea n
contact cu ADN).
O interesant demonstraie a caracterului general al acestui model deriv din
compararea structurii cristaline a domeniului homeo de la D. melanogaster
engrailed cu proteina 2 de mating de la drojdie. Domeniul de legare al acestei
proteine se aseamn cu domeniul homeo, i poate forma trei helixuri similare:
structura sa n fosa ADN poate fi suprapus aproape exact cu cea a domeniului
homeo de la engrailed. Aceste asemnri sugereaz c toate domeniile homeo se
leag la ADN (leag ADN) n acelai mod. Aceasta nseamn c un numr relativ mic
de resturi din helixul 3 i din braul N-terminal sunt responsabile de specificitatea
contactelor.

SLIDE 52. Interacia ADN-Proteine Modelul helix-turn-helix (HTH)

Figura: Modelul helix-turn-helix (HTH) este o structur comun de recunoatere a
ADN i la procariote. n figur avem o imagine obinut prin difracie cu raze X
pentru dimerul cAMP-CAP care formeaz un complex cu aproximativ 30 pb de
duplex ADN.
a) Complexul vzut cu cele dou plieri fa de axa orizontal n planul hrtiei.
Proteina este reprezentat prin structurile sale alfa cu domeniul N-terminal de legare a
cAMP, colorat n albastru i cel C-terminal de legare la ADN n mov/rou;
b) Legarea dimerului CAP prin intermediul motivelor HTH n fosele mojore
succesive ale ADN. Captul N-terminal al motivului HTH este albastru n timp ce
helixul de recunoatere este rou.

SLIDE 53. Interacia ADN-ProteineModelul HTH (represorul 434 al

bacteriofagullui P22)
Figura: Structura obinut cu raze X a represorului 434 al fagului P22 (este
evideniat numai domeniul captului de 69 de resturi amino-terminal) n complex cu
un fragment int de 20 pb cu structura d(TATACAAGAAAGTTTGTACT)
a) Modelul sub form de schelet cu ADN n stnga si cu cele dou subuniti
identice ale proteinei (dou elice alfa) n stnga.
b) Reprezentare schematic a motivului helix-turn-helix, care evideniaz
interacia elicelor alfa2 i alfa3 cu ADN int. Barele scurte din structur sunt
gruprile peptidice NH, legturile de hidrogen sunt reprezentate de linii punctate,
gruprile fosfat ale ADN prin numere ncercuite. Cercurile mici sunt molecule de ap.
c) Modelul cu bile corespunztor reprezentrii din figura a. Proteina este
reprezentat n galben.

SLIDE 54. Interacia ADN-Proteine Modelul HTH (represorul TRp de

la E. Coli)
Figura: Structura cu raze X a complexului represor-operator pentru operonul trp de
la E. Coli.
Cele dou subuniti identice ale proteinei sunt reprezentate sub form de
panglici una verde i cealalt mov. Ambele formeaz motivul HTH (elicele D i E).
Represorul trp se leag la operator numai cnd L-triptofanul (n rou) este legat
simultan

145

SLIDE 55. Interaciile domeniilor C2H2 i C4 zinc-finger cu ADN

Figura:
a) O protein C2H2 cu cinci degete numit GL1. Aceast protein monomer
este codificat de o gen care este amplificat ntr-un numr de tumori umane.
Regiunile helicale sunt reprezentate prin cilindri iar catenele beta prin panglici.
Degetul 1 nu interacioneaz cu ADN, n timp ce celelalte patru degete da. Cercurule
negre indic ionii de Zn2+;
b) regiunile sub form de helix sunt reprezentate ca spirale iar catenele beta sub
form de sgei. Dou elice alfa, una din fiecare monomer, interacioneaz cu ADN.
Ca toi homodimerii Zinc-finger C4, acest factor de transcripie posed o simetrie
de pliere rotaional; centrul de simetrie este avideniat prin elipsa galben. Cercurile
negre indic ionii de Zn2+.
Informaii suplimentare
Motivul zinc finger poate furniza un domeniu de legarea a ADN (poate constitui un
domeniu de legare a ADN)
Zinc fingers (degete cu zinc) i-au luat numele dup structura pe care o
posed. n aceasta, un mic grup de aminoacizi conservai leag ionul de zinc, i
formeaz un domeniu relativ independent n protein. Dou tipuri de proteine care se
leag la ADN (DNA-binding proteins) au structuri de acest tip: proteinele clasice
zinc finger i receptorii steroidieni.
O protein finger tipic are o serie de degete cu zinc, aa cum este prezentat
n figur. Secvena consens a unui singur deget este:
Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X3-His
Motivul i trage numele (i-a luat numele) de la bucla (loop) de aminoacizi
care depete ca o protuberan situsul de legare al zincului, care este descris ca un
deget Cys2/His2. Zincul este prins ntr-o structur tetraedric format prin
conservarea resturilor de Cys i His. Degetul n sine conine aproximativ 23
aminoacizi, iar legtura dintre degete este, n mod normal, de 7-8 aminoacizi.
Factorul de transcripie TFIIIA (necesar ARN polimerazei III s transcrie
genele care codific ARN 5S) conine o serie de 9 degete organizate n repetiii n
tandem (tandem repeats= secvene repetitive n tandem). Trei repetiii ale secvenei
deget sunt prezente i n factorul de transcripie SP1 care este implicat n iniierea
transcripiei la mai muli promotori folosii de ARN polimeraza II. Degetele sunt
necesare pentru legarea ADN (sau legarea la ADN).
Este necesar s se manifeste precauie la interpretarea prezenei (sau
putativelor/posibilelor degete) degetelor cu zinc, mai ales cnd proteina conine numai
un singur motiv deget. Degetele mai pot fi implicate i n legarea la ARN (legarea
ARN) sau chiar fr a fi corelate cu activitatea de reglare la vreun tip de acid nucleic.
Prototipul proteinei cu degete (finger protein) este TFIIIA care se leag att la
gena ADNr 5S ct i la produsul acesteia ARNr 5S. Un factor de iniiere a translaiei
eIF2 are un deget cu zinc; mutaiile la nivelul motivului deget influeneaz
recunoaterea codonului de iniiere. Proteinele capsidei retrovirale au un motiv nrudit
cu motivul deget care poate fi implicat n legarea ARN viral.
Degetele zinc au un motiv comun n proteinele care leag ADN (care se leag
la ADN). De obicei, degetele sunt organizate ca o singur serie de uniti repetitive n
tandem; ocazional exist mai mult dect un singur grup de degete. Regiunea degetelor
variaz ca ntindere de la o lungime de 9 repetiii, care ocup aproape ntreaga
protein (este cazul TFIIIA), la numai un mic domeniu care const n dou degete (ca

146

n cazul proteinei reglatoare ADT1 de la Drosophila) Factorul general de transcripie

Sp1 posed un domeniu de legare a ADN format din trei degete cu zinc.
Partea C-terminal a fiecrui deget formeaz un -helix care leag ADN;
partea N-terminal formeaz o structur -pliat. (Pentru simplificare conformaia pliat i localizarea ionului de zinc nu au mai fort configurate n partea de jos a
figurii). Cele trei regiuni -helix se potrivesc (se fixeaz) ntr-o rsucitur
(ntoarcere/cotitur a fosei majore); fiecare (i astfel fiecare deget realizeaz dou
contacte specifice de secven (secven specifice) cu ADN (indicate prin sgei).
Dac acest tip de structur este tipic degetelor cu zinc, ne putem atepta ca
aminoacizii ne-conservai de la captul C-terminal s fie responsabili de
recunoaterea specific a situsurilor int. (De reinut c ipoteze similare despre
motivul helix-turn-helix prezent la represorii de la procariote au fost dificil de
susinut, acum ezitnd dubii (semne de ntrebare) dac putem dovedi existena unui
cod care coreleaz secvenele n aminoacizi ale elicei cu perechile de baze ale
secvenei ADN int.
Cunoscnd c degetele cu zinc se gsesc n factori de transcripie autentici
care nsoesc (asist) att ARN polimeraza II ct i III, putem privi proteinele cu
motive deget dintr-o perspectiv invers. Cnd se determin c o protein conine mai
multe degete cu zinc, aceasta constituie cel puin prima premis (prima facie) n
sensul investigrii proteinei ca avnd un posibil rol ca factor de transcripie. Astfel s-a
identificat c diferii loci implicai n dezvoltarea embrionar la D. melanogaster sunt
reglatori ai transcripiei.
Receptorii hormonilor steroizi (i alte proteine) au un alt tip de motiv deget.
Structura se bazeaz pe o secven cu (un posibil/putativ) un situs consens de legare a
zincului:
Cys-X2-Cys-X1-3-Cys-X2-Cys
Acestea sunt denumite degete Cys2/Cys2. Proteinele cu degete de acest tip au
adesea degete ne-repetitive, n contrast cu repetiia n tandem a tipului Cy2/His2.
Secvenele de legare de pe ADN sunt scurte i palindromice. Analiza mutaiilor a
artat c regiunile proteinelor reglatoare care se leag la ADN includ motive finger.
Degetele Cys2/Cys2 sunt distincte de degetele Cys2/His2. Studiile pe
receptori steroidieni au artat c mutaiile care transform cea de a doua Cys n His,
schimbnd astfel tipul de deget, determin pierderea capacitii de activare a genelor
int. Deci cele dou tipuri de structuri sub form de deget nu sunt interschimbabile.
Receptorii pentru glucocorticoid i estrogen au fiecare cte dou degete,
fiecare cu un atom de zinc n centrul tetraedrului format de cisteine. Cele dou
structuri deget formeaz -helixuri care se pliaz mpreun pentru a da natere unui
domeniu globular mare. Prile aromatice ale -helixurilor formeaz mpreun un
centru hidrofob unde o structur -pliat conecteaz cele dou helixuri. O parte a
helixului N-terminal vine n contact cu fosa major a ADN. Doi receptori
glucocorticoizi dimerizeaz pentru a se lega la ADN, i fiecare angajeaz o scobitur
(rsucire/turnur) succesiv a fosei majore. Acest aspect este n concordan cu natura
palindromic a elementului rspuns.
Fiecare deget controleaz o proprietate important a receptorului. Dintre
aminoacizii relevani (cu relevan), cei de pe partea dreapt a primului deget
controleaz legarea la ADN iar cei de pe partea stng a celui de al doilea deget
controleaz capacitatea de a forma dimeri.
Dovezi directe privind legarea ADN la degete au fost obinute printr-un
experiment de modificare a specificitii (specificity swap). Motivul deget al
receptorului pentru estrogen a fost nlturat i nlocuit cu cel al unui receptor
147

glucocorticoid. Noua protein recunoate secvena GRE (secvena obinuit pentru un

receptor glucocorticoid) n locul secvenei ERE (secvena obinuit pentru un receptor
estrogen). Aceast recunoatere stabilete specificitatea cu care este recunoscut ADN.
Secvenele GRE i ERE sunt destul de asemntoare (similare), i alte
experiene de modificare a specificitii au artat c diferenierea dintre ele const n
doi aminoacizi care sunt diferii la primul motiv deget. Diferenele dintre secvenele
receptorului glucocorticoid i a celui estrogen sunt determinate n principal pe baza
motivului deget. Substituirea a dou dintre poziiile importante face ca receptorul
glucocorticoid s se lege la o secven ERE n loc de una GRE.

SLIDE 56. Interacia dintre proteina C6 zinc-finger(Gal4) i ADN

Figura: Diagrama interaciei dintre gal4, o protein zinc-finger C6, i ADN
Aceast protein se leag la ADN ca un homodimer care interacioneaz
pentru a forma o structur suprarsucit care se leag perpenticular pe helixul ADN.
Legarea resturilor de cistein la doi ioni Zn2+ (n galben) pe fiecare monomer care
formeaz cte un domeniu globular de legare la ADN.

SLIDE 57. Interacia proteinei homodimere leucine-zipper i ADN

Figura: Dou imagini ale interaciunii factorului Gcn4 de la drojdii, o protein
homodimer leucine-zipper, cu ADN
Regiunile alfa-helix extinse ale monomerului prind ADN la nivelul foselor
majore adiacente. Domeniul suprarsucit de dimerizare al Gcn4 conine resturi de
leucine precis poziionate. Unele proteine de legare la ADN care conin acelai model
general conin ali aminoacizi hidrofobi n aceste poziii; din aceast cauz modelul
prezentat aici se numete modelul fermoar de leucin de baz.
Informaii suplimentare
Motivele leucine zipper pot fi implicate n formarea dimerilor
Interaciile dintre proteine constituie o tem comun n constituirea
complexului transcripional. Un motiv gsit (caracteristic) mai multor factori de
transcripie (i altor proteine) este implicat att n interaciile homo- ct i
heterodimerice. Motivul leucine zipper este o secven (regiune/lungime) de
aminoacizi bogat n resturi de leucin care furnizeaz un motiv dimer. nsi
formarea dimerilor a aprut ca un principiu comun n aciunea proteinelor care
recunosc secvene specifice de ADN. n cazul leucine zipper relaiile acestui motiv
cu legarea ADN sunt clare, deoarece dimerizarea juxtapune regiunile de legare a
ADN de pe fiecare subunitate.
Un -helix amfipatic prezint o structur n care gruprile hidrofobe (inclusiv
leucin) se orienteaz ctre una dintre pri, n timp ce gruprile ncrcate se
orienteaz ctre cealalt parte. Motivul leucine zipper formeaz un helix amfipatic
n care leucinele fermoarului unei proteine se pot intercala printre leucinele altui helix care aparine altei proteine paralele care poart acelai motiv (protuberanele
leucinelor unei pri a fermoarului unei proteine se intercaleaz cu leucinele celeilalte
pri a fermoarului celeilalte proteine dispus paralel). Cele dou elice de mn
stng (rsucite ctre stnga) se rotesc una n jurul celeilalte, cu 3,5 resturi pe tur,
astfel nct motivul se repet integral dup 7 resturi.
Cum se leag aceast structur la ADN? Regiunea adiacent resturilor
repetitive de leucin este foarte bazic n fiecare protein fermoar, i poate cuprinde
situsul de legare a ADN. Cele dou fermoare leucin formeaz de fapt o structur n
form de Y, n care fermoarele constituie stemul (tulpina), iar cele dou regiuni bazice
148

se bifurc simetric pentru a forma braele care leag ADN. Aceast structur este
cunoscut drept motivul structural bZIP. Aceasta explic de ce secvenele int ale
unei astfel de proteine sunt repetiii inverse ne-separate ntre ele (secvene repetitive
inverse care nu sunt distanate ntre ele).
Fermoarele pot fi utilizate pentru a sponsoriza (asigur formarea
homodimerilor i heterodimerilor. Ele sunt motive lungi. Leucina ocup fiecare al
aptelea rest n potenialul motiv fermoar. n proteina C/EBP (factor care se leag sub
form de dimer att la CAAT box ct i la miezul/core activatorului SV40) exist 4
repetiii, iar n factorii Jun i Fos (care formeaz factorul heterodimer de transcripie,
AP1). AP1 a fost original identificat ca o secven care leag ADN prezent n
activatorul (n regiunea activatoare) SV40.
Preparatul activ al AP1 include mai multe polipeptide. Un component major
este Jun, produsul genei c-jun care a fost identificat prin relaia sa cu oncogena v-jun
purtat de virusul sarcomului aviar. Genomul de oarece conine o familie de gene
nrudite, c-jun (izolat original) i junB i junD (identificate datorit omologiei de
secven cu jun). Aceste trei proteine au o considerabil omologie de secven; ele
posed motive leucine zipper care pot interaciona pentru a forma homodimeri i
heterodimeri.
Un alt component major al AP1 este produsul unei alte gene cu o copie
oncogen. Gena c-fos este un omolog celular al oncogenei v-fos purtat de virusul
sarcomului murin (virusul sarcomului de oarece). Expresia c-fos activeaz genele ai
cror promotori posed un situs int pentru AP1. Produsul c-fos este o fosfoprotein
nuclear care face parte din acest grup de proteine. Celelalte au fost descrise ca fiind
antigeni nrudii cu Fos (Fos-related antigenes = FRA); ele constituie familia
proteinelor Fos (Fos-like proteins).
Fos are i ea un motiv leucine zipper, nu poate forma homodimeri dar
formeaz un heterodimer cu Jun. Pentru reacie este necesar un motiv leucine zipper
pentru fiecare protein. Capacitatea de a forma dimeri este partea crucial (cea mai
important) a interaciei acestor factori cu ADN. Fos singur nu poate lega ADN,
probabil datorit incapacitii sale de a forma dimeri. Heterodimerul Jun-Fos se poate
lega la ADN cu aceeai specificitate pentru secvena int ca i dimerul Jun-Jun; acest
heterodimer se leag la situsul AP1 cu o afinitate de aproximativ 10 ori mai mare
dect homodimerul Jun.
Unul dintre modelele imaginate presupune c att n cazul homodimerului
Jun-Jun ct i al heterodimerului Jun-Fos, ambele subuniti intr n contact cu ADN.
Afinitatea crescut a heterodimerului pentru ADN poate reflecta capacitatea
situsurilor de legare ale subunitilor Jun i Fos de a intra mai puternic n contact cu
ADN fa de situsurile celor dou subuniti Jun.

SLIDE 58. Interacia proteinei homodimere helix-loop-helix i ADN

Figura: Interacia domeniului HLH (helix-loop-helix) din proteina homodimer
Max cu ADN
Motivul HLH se extinde i dincolo de elicele de legare la ADN, n stnga
(capetele N-terminale ale monomerilor) pn n apropierea regiunii de rsucire a
catenelor; aceast regiune este urmat imediat de o regiune de rsucire de tip leucine
Zipper n proteina dimer.
Informaii suplimentare
Proteinele helix-loop-helix interacioneaz prin asociere combinat
Cele dou trsturi comune ale proteinelor care se leag la ADN sunt prezen
regiunilor sub form de helix care leag ADN, i capacitatea proteinei de a dimeriza.
149

Ambele trsturi sunt caracteristice i grupului de proteine helix-loop-helix care

conin un tip comun de motiv de secven: o regiune (ntindere) de 40-50 de
aminoacizi conin dou -helixuri amfipatice separate de o regiune de legare (linker
region=the loop), bucla, care are o lungime variabil. Proteinele din acest grup
formeaz att homodimeri ct i heterodimeri prin intermediul interaciunilor care se
stabilesc ntre resturile hidrofobe situate pe feele (prile) corespunztoare celor dou
helixuri. Regiunile sub form de helix au o lungime de 15-16 aminoacizi, fiecare
coninnd mai multe resturi conservate. Capacitatea de a forma dimeri rezid (se afl)
n aceste helixuri amfipatice, i este comun tuturor proteinelor HLH (helix-loophelix). Bucla este probabil important numai pentru a oferi libertate celor dou regiuni
s interacioneze independent una de cealalt.
Majoritatea proteinelor HLH conin o regiune adiacent motivului HLH care
este foarte bazic, i care este necesar pentru legarea ADN. Pe o lungime de 15
aminoacizi aproximativ 6 resturi sunt conservate. Membrii grupului care conin o
astfel de regiune sunt numii proteine bHLH. Se pot lega la ADN att un homodimer
ct i un heterodimer n care ambele subuniti conin o regiune bazic. Se pare c
domeniile HLH au rolul de a orienta corect cele dou regiuni bazice coninute de
subunitile individuale. Nu se cunoate nc mult despre modalitatea n care
proteinele HLH activeaz transcripia.
Membrii grupului bHLH includ: dou proteine E12 i E47 care se leag la un
element prezent ntr-un activator al genei imunoglobulinelor, myoD, miogenina,
factorul de transcripie myf-5 care este implicat n miogenez (formarea muchiului),
genele myc (care sunt copii/dubluri ale oncogenelor implicate n reglarea creterii), i
un grup de gene care specific (sunt responsabile) dezvoltarea sistemului nervos la D.
melanogaster.
Proteinele bHLH se mpart n dou subgrupe (categorii) generale:
- clasa A const n proteinele care sunt exprimate ubicuitar, incluznd proteinele
E12/E47 de la mamifere i musca da (musca domestic);
- clasa B const n proteine care sunt exprimate specific n funcie de esut, care
includ Myo D de la mamifere i AC-S de la musca domestic. Proteinele clasei bHLH
esut specifice pot fi factori de reglare transcripionali (reglatori transcripionali) care
funcioneaz mult mai eficient prin formare de heterodimeri cu un partener cu
distribuie ubicuitar. Nu se cunoate dac acesta este singurul tip de activitate, sau
dac homodimerii formai de proteinele bHLH ubicuitare sunt uneori folosite pentru a
regla transcripia. Proteinele myc formeaz o categorie (clas) separat de proteine
bHLH ai cror parteneri i secvene int sunt diferite.
Dimerii formai de proteinele bHLH difer prin capacitatea lor de a se lega la
ADN. De exemplu, homodimerii E47, heterodimerii E12-E47, i MyoD-E47 se
formeaz eficient i se leag puternic la ADN. E12 homodimerizeaz bine, dar se
leag slab la ADN, n timp ce homodimerii MyoD homodimerizeaz destul de slab.
Astfel, att formarea dimerilor ct i legarea ADN pot reprezenta punte reglatoare
importante. n aceast conjunctur, este posibil definirea unor grupuri de proteine
HLH ai cror membri formeaz diferite tipuri de combinaii (tipuri de
mperecheri/cuplaje), dar nu pentru prezice secvenele cele mai puternic implicate n
formarea dimerilor sau legarea ADN. Toi dimerii acestui grup care leag ADN
recunosc aceeai secven consens. Nu se tie nc dac diferiii homo- sau
heterodimeri manifest preferine pentru situsurile int uor diferite care sunt corelate
cu funciile lor.
Diferenele de legare a ADN sunt determinate de proprietile regiunii situate
n sau din apropierea motivului HLH; de exemplu, E12 difer de E47 prin faptul c

150

posed o regiune inhibitoare chiar dup regiunea bazic i/sau conine resturi de
prolin care par s-i deranjeze funcia. Proteinele de acest tip au aceeai capacitate de
dimerizare ca i proteinele bHLH, dar un dimer care conine o subunitate de acest tip
nu se mai poate lega specific la ADN. Aceasta reprezint o demonstraie eficace
(puternic) a importanei dublrii motivelor de legare a ADN n proteinele care se
leag la ADN (sau care leag ADN).
Importana distinciei dintre proteinele ne-bazice HLH i bHLH este sugerat
de proprietile a dou grupe de proteine HLH: grupul da-AC-S/emc i tipul Myo/Id.
La D. melanogaster, gena emc (extramacrochaetae) este necesar pentru stabilirea
orientrii normale a organelor senzoriale adulte. Ea funcioneaz prin suprimarea
funciilor mai multor gene inclusiv da (daughterless) (care mpiedic formarea de
progenituri) i a complexului AC-S (achaete-scute), care n caz contrar (altfel)
determin celulele adiionale (complementare/suplimentare) s nu urmeze acest
destin. AC-S i da sunt gene care aparin tipului bHLH. Supresorul emc codific
pentru o protein HLH creia i lipsete regiunea bazic. Se presupune c, n absena
funciei emc, proteinele da i AC-S formeaz dimeri care activeaz transcripia unor
gene int adecvate, dar producerea proteinei emc determin formarea heterodimerilor
care nu pot lega ADN. Astfel, producerea proteinei emc n celule adecvate (n
anumite celule) este necesar pentru a suprima funcia AC-S/da.
Formarea celulei musculare este dirijat (orientat/direcionat) de o
modificare n programul transcripional care necesit numeroase proteine bHLH,
inclusiv MyoD. MyoD este produs specific n celulele cu funcie miogenic; s-a
constata c super-exprimarea MyoD n orice alt celul poate induce nceperea unui
program miogenic. Semnalul (declanatorul ,mecanismul responsabil de declanare)
diferenierii celulare este mai probabil un heterodimer care const n MyoD-E12 sau
MyoD-E47 dect un homodimer MyoD/MyoD. nainte de nceperea miogenezei, un
membru al tipului de proteine HLH ne-bazice, proteina Id, se poate lega la MyoD
i/sau E12 i E47 pentru a forma heterodimeri care nu pot lega ADN. Acestea se leag
la E-12/E47 mai bine dect la MyoD, i poate funciona prin sechestrarea partenerului
bHLH ubicuitar. Supraexpresia Id poate mpiedica miogeneza. Astfel, ndeprtarea Id
poate fi semnalul care elibereaz MyoD pentru a iniia miogeneza.
Comportamentul proteinelor HLH este ilustrat n dou principii generale ale
reglrii transcripiei. Un mic numr de proteine formeaz asocieri combinate; este
posibil ca aceste combinaii particulare s aib diferite funcii n ceea ce privete
legarea ADN i reglarea transcripiei, dar pentru moment nu sunt nelese n ntregime
funciile relative ale proteinelor bHLH specifice unui anumit esut i ubicuitare.
Membrii aceleiai clase de proteine pot funciona ca supresori prin participarea la alte
combinaii asociative. Diferenierea poate depinde fie de prezena fie de ndeprtarea
unor proteine supresor particulare (anumitor proteine supresor) aparinnd clasei HLH
de proteine ne-bazice.

SLIDE 59. Factorii transcripionali heterodimeri cresc opiunile

controlului genetic
Figura: Posibiliti de combinare datorate formrii factorilor de transcripie
heterodimeri
a) n modelul ipotetic prezentat, factorii de transcripie A, B i C fiecare
interacioneaz unul cu cellalt, permitnd celor trei factori s se lege la 6 secvene
diferite de ADN (situsurile 1-6) i creaz 6 combinaii ale domeniilor de activare (de
reinut c fiecare situs de legare este mprit n dou jumti de situsuri i c un
singur factor heterodimer conine domeniile de activare al fiecruia dintre monomerii
151

constitueni). Patru factori monomeri diferii se pot combina pentru a forma 10 factori
homo i heterodimeri; cinci monomeri vor duce la formarea a 15 factori dimeri i aa
mai departe;
b) Cnd un factor inhibitor (n verde) se consider c interacioneaz numai cu
factorul A, situsurile de legare 1, 4 i 5 sunt inhibate dar situsurile 2, 3 i 6 nu sunt
afectate
Informaii suplimentare
Trei tipuri de proteine de legare la ADN discutate anterior pot forma
heterodimeri: proteinele Zn finger C4, proteinele bazice zipper i proteinele
helix-loop-helix. Alte clase de factori de transcripie ale cror structuri nu sunt
considerate specific formeaz i ele proteine heterodimere. n unii factori de
transcripie heterodimeri, fiecare monomer posed un domeniu de legare a ADN cu
specificitate de secven echivalent, dar rareori permite domeniilor de activare
asociate cu fiecare monomer s fie adunate mpreun ntr-un singur factor de
transcripie. Totui, dac monomerii posed diferite specificiti de legare la ADN,
formarea heterodimerilor crete numrul de secvene poteniale de ADN pe care
factorii le pot lega.
n plus, exist exemple proteine inhibitoare bazice zipper sau de helixloop-helix care blocheaz legarea ADN cnd dimerizeaz cu un partener polipeptidic
normal capabil s lege ADN. Cnd aceti factori inhibitori sunt exprimai, ei
represeaz activarea transcripional prin intermediul factorilor cu care ei
interacioneaz.
Regulile care guverneaz interaciile membrilor unei clase de factori de
transcripie sunt complexe. Aceast complexitate combinaional poate fi extins i
numrului de situsuri ADN la nivelul crora aceti factori pot activa transcripia dar i
modalitilor prin care aceasta poate fi reglat. Acest lucru nu este posibil pentru
factorii de transcripie care se leag sub form de monomeri sau homodimeri.

SLIDE 60. Domeniile de activare manifest o considerabil diversitate

structural
Figura 1: Structura domeniului fosforilat de activare acid CREB complexat cu
domeniul su de interaciune i co-activatorul su CBP
Structura polipeptidic a domeniului activator fosyforilat acid al CREB este
reprezentat sub forma unei spirale roz. Resturile de aa din CREB care interacioneaz
cu suprafaa CBP sunt indicate prin abrevieri cu o singur liter. Suprafaa domeniuli
de interacie cu CBP accesibil apei este reprezentat n spatele figurii cu regiuni de
potenial pozitiv i negativ prezentate n albastru i rou.
Figura 2: Efectul legrii ligandului asupra conformaiei domeniilor de legare a
liganzilor n cazul a doi receptori nucleari nrudii de la om. Structura determinate
prin cristalografie cu raze X.
a) n absena legrii ligandului (acid 9-cis retinoic), domeniul de legare a domeniului
n receptorul RXRalfa prezint o conformaie deschis. n aceast form, el
funcioneaz ca un domeniu represor;
b) Cnd se leag la all-trans acid retinoic, domeniul de legare a ligandului din
receptorul uman RARgama are o conformaie compact. n aceast form acesta
poate stimula transcripia.
Cilindrii reprezint alfa-helixurile. Regiunile domeniului de legare a
ligandului care nu i schimb semnificativ conformaia datorit legrii ligandului
sunt reprezentate n verde iar regiunile care o fac n galben.
Informaii suplimentare
152

Un domeniu de activare este o secven polipeptidic care activeaz

transcripia cnd fuzioneaz cu un domeniu de legare la ADN. De exemplu, un numr
mare de secvene polipeptidice pot activa transcripia n celule eucariote de la un
promotor care posed n amonte situsuri UASGAL care leag domeniul de legare la
ADN al Gal4. S-a constatat c aprox 1% din proteinele de fuziune compuse din
domeniul Gal4 de legare la ADN i segmente aleatoare ale proteinelor activatoare de
la E. coli, activeaz transcripia la nivelul unui promotor de la drojdii i mamifere care
posed n amonte o secven UASGAL.
Aceste rezultate demonstreaz c un grup divers de secvene peptidice pot
funciona ca domenii de activare, chiar dac aceste au alte funcii n mod obinuit. Cu
toate aceste multe domenii de activare posed un procentaj crescut de aminoacizi
particulari. De exeplu Gal4 i Gcn4 ca i majoritatea factorilor de transcripie de la
drojdii sunt foarte bogai n acid aspartic i acid glutamic. Acestea sunt numite i
domenii acide de activare i sunt capabile s activeze transcripia aproape pentru toate
tipurile de celule animale, fungi, plante.
Studii biofizice recente pe modele de activatori acizi evideniaz c exist ca
structuri polipeptidiced nestructurate, pliate la ntmplare pn n momentul n care
acetia interacioneaz cu o protein co-activator. Aceast interaciune induce plierea
domeniului de activare ntr-o structura alfa-helix amfipatic care intr n contact cu o
suprafa complementar a proteinei co-activatoare.

SLIDE 61. Complexele multiproteice acioneaz la nivelul enhancerilor

Figura: Model de enhanceozome (complex activator) care se formeaz la nivelului
activatorului pentru beta-interferon.
Heterodimerii cJun/AFT2 (Activation Transcription Factor 2), IRF-3, IRF-7
(iron responsive elements/iron binding protein or iron responsive factors) i NF-kB
(un heterodimer format din p50 i p65) se leag la cele 4 elemente de control ale
activatorului de aproximativ 70 pb. Legarea cooperativ a acestor factori de
transcripie este facilitat de HMGI care se leag la fosa minor a ADN. Proteinele cjun, AFT-2, p50 i p65 toate par s interacioneze direct cu o HMGI poziionat n
apropierea lor. Plierea secvenei activatoare determinat de legarea HMGI este critic
pentru formarea enhanceozomului (complexului activator). Alte proteine care se
leag la ADN i determin plierea acioneaz similar la nivelul altor activatori.
Protooncogenele C-jun i c-fos codific proteine care uneori se asociaz
pentru a forma un factor de transcripie heterodimer, numit AP1 care se leag la
secvrene din regiunea promotoare i activatoare a diferitelor gene. Att Fos ct i
Jun pot aciona independent ca factori de transcripie.
NF-kB (factorul nuclear pentru transcripia lanurilor k n celulele B) este un
factor de transcripie heterodimer care a fost descoperit n urma unor experimente
biochimice pornind de la necesitatea acestui factor de ctre celulele B pentru
transcripia lanturilor k ale imunoglobulinelor. NF+kB este un heterodimer format
din dou proteine nrudite p50 i p65. Aceste proteine manifest o regiune de
omologie la capetele lor N-terminale care este necesar pentru legarea ADN i
dimerizare.
Complexele multiproteice se formeaz la nivelul enhancerilor
Enhancerii sau activatorii sunt n general secvene cu o lungime cuprins
ntre 50 i 200 pb i conin numeroase situsuri de legare a factorilor transcripionali.
Factorii transcripionali multipli care se leag la un singur activator se
consider c interacioneaz. Analizele activatorului care regleaz expresia beta153

interferonului, o protein important implicat n aprarea organismului uman fa

de infeciile virale, furnizeaz un bun exemplu privind modul de interaciune al
acestor factori. La nivelul acestui activator de aproximativ 70 pb au fost identificate
patru elemente de control prin analiz mutaional. Studii mai detaliate au evideniat
c factorii care recunosc activatorul se leag simultan. n prezena unei proteine mici
abundente asociat cu cromatina, numit HMGI(high-mobility-group), legarea
factorilor de transcripie este nalt cooperativ, similar cu legarea proteinei CAP de
la E. coli i a ARN polimerazei n regiunea promotorului operatorului lac. Aceast
legare cooperativ duce la formarea unui complex multi-proteic la nivelul
activatorului ADN. Termenul de enhaceozom a fost desemnat pentru a denumi
astfel de complexe nucleoproteice asamblate din factori transcripionali n momentul
n care acetia se leag cooperativ la situsurile multiple de legare din structura
activatorilor.
HMGI se leag la fosa minor a ADN indiferent de secven i are drept
rezultat ndoirea rapid a moleculei de ADN. Aceast pliere a activatorului ADEN
permite factorilor de transcripie s interacioneze adecvat (curat). Interaciile relativ
slabe dintre proteinele legate sunt activate datorit legrii factorilor de transcripie n
zonele vecine, meninnd proteinele la o concentraie relativ foarte ridicat.
Studiile realizate cu activatorii genei receptorului alfa din celulele T, de
asemenea important n rspunsul imun, asamblarea enhaceozomului s-a determinat
a fi dependent de o alt protein (diferit de HGMI) care interacioneaz cu fosa
minor a ADN i induce o curbur. Astfel de proteine implicate n ndoirea ADN au
fost denumite proteine arhitecturale, dearece sunt necesare pentru construcia
acestor complexe nucleoproteice.

SLIDE 62. Muli represori interacioneaz cu activatorii

Transcripia de la eucariote este reglat de represori ct i de activatori ;
Situsurile de legare a represorilor pot fi identificate i represorii purificai
prin aceleai tehnici folosite pentru activatori;
Muli represori din sistemele eucariote posed dou domenii: un domedniu
de legare a ADN i un domeniu represor
Studii genetice i biochimice au demonstrat c transcripia la eucariote este reglat
att prin proteine represoare ct i activatoare. De exemplu, geneticienii au identificat
mutaii la drojdii care au implicaii n exprimarea constitutiv a anumitor gene,
indicnd c aceste gene sunt n mod normal reglate de ctre un represor. n alte studii,
au fost identificate situsuri de legare arepresorilor prin analize mutaionale sistematice
ale regiunilor implicate n procesul de transcripie de la eucariote, similare cu cele
realizate pentru procariote. n timp ce o mutaie la nivelul unui situs de legare a
activatorilor conduce la descresterea expresiei genei raportor corelate, mutaia la
nivelul situsului de legare a represorului conduce la creterea expresiei genei raportor.
Proteinele represoare care se leag la astfel de situsuri au fost purificate i
caracterizate folosind cromatografie de afinitate i secvene specifice, ca i n cazul
proteinelor activatoare.
Absena unei activiti represoare adecvate poate avea consecine
devastatoare. De exemplu, proteina codificat de ctre gena WT1 (tumoarea Wilm)
este un represor care se exprim preferenial n dezvoltatrea rfinichiului. Copii care
motenesc mutaii att la nivelul genei materne ct i paterne a WT1, nu vor produce
o protein funcional WT1 i vor dezvolta invariabil tumori renale de foarte
timpuriu. Proteina WT1 care are un domeniu de legare a ADN de tip C2H2 zinc
finger, se leag la regiunea control a genei care codific un factor de transcripie
154

numit EGR-1. Aceast gena asemeni altor gene de la eucariote este supus att
activrii ct i represrii. Legarea WT1 represeaz transcripia genei EGR-1 fr a
inhiba legarea a doi activatori care n mod normal stimuleaz expresia acestei gene.
Represorii transcripionali eucariotici de tipul WT1 par s fie opuii funcionali ai
activatorilor. Ei pot inhiba transcripia unei gene pe care ei n mod normal nu o
regleaz cnd situsul lor de recunoatere este plasat ntr-un intervalul de cteva sute
de perechi de baze fa de situsul de start al genei respective.
Assemeni activatorilor, muli represori prezint dou domenii funcionale:
domeniul de legare i domeniul de represare. Aa cum se ntmpl i n cazul
domeniilor activatoare, o varietate de secvene de aminoacizi pot funciuona ca
domenii represoare. Multe dintre acestea sunt relativ scurte (de aproximativ 20
aminoacizi) i conin poriuni ntinse de animoacizi hidrofobi. Alte domenii
represoare conin poriuni mari de aminoacizi bazici. n unele cazuri, domeniile
represoare sunt mai mari i bine structurate. De exemplu, n absena ligandului,
domeniul de legare RXRalfa funcioneaz ca un domeniu represiv. Cnd acelai
domeniu leag ligandul su de recunoatere acidul 9-cis retinoic, el este transformat
ntr-un domeniu de activare. Ca i pentru domeniile de activare, diferitele structuri ale
domeniilor represoare sunt probabil a reflectare a mai multor posibile mecanisme de a
reglare a transcripiei la eucariote.

SLIDE 63. Concluzii

Factorii de transcripie, care stimuleaz sau reprim transcripia, se leag la
elemente situate n proximitatea promotorului i la enhancers (activatori) din
structura ADN la eucariote;
Activatorii sunt n general proteine modulare, care conin un singur domeniu
de legare i unul sau mai multe domenii activatoare; diferitele domenii sunt adesea
legate prin regiuni polipeptidice flexibile. Acestea permit domeniilor diferiilor
activatori s interacioneze chiar i cnd domeniile de legare la ADN recunosc situsuri
separate de zeci de perechi de baze;
Activatorii conin, n general, mai multe situsuri de legare pentru factorii de
transcripie grupate sub form de clustere. Legarea cooperativ a mai multor
activatori la situsuri nvecinate din structura unui activator formeaz un complex
multi-proteic numit complex activator. Asamblarea acestuia necesit adesea
proteine mici care se lreag la fosa minor a ADN i determin curbarea rapid a
secventei permitnd proteinelor de pe fiecare parte a curburii s interacioneze mult
mai bine;
Majoritatea represorilor de la eucariote sunt proteine modulare. Similar cu
activatorii, acetia conin de obicei un singur domeniu de legare i unul sau mai multe
domenii represoare, i pot controla transcripia cnd sunt legai la situsuri situate la
sute sau mii de baze fa de situsul de start;
Domeniile de legare la ADN ale factorilor de transcripie de la eucariote
exprim o varietate de structuri. Printre cele mai comune motive structurale sunt
homeodomeniile, domeniile bazice fermoar de leucin (leucine zipper), HLH i
diferite tipuri de degete zinc (zinc finger). n general una sau mai multe alfa-elice din
domeniul de legare la ADN interacioneaz cu fosa major la nivelul unor situsuri de
recunoatere;
Capacitatea anumitor factori de transcripie de a forma heterodimeri crete
numrul de situsuri ADN pe care aceti factori le pot controla i modalitile prin care
le pot controla;

155

Dei anumite domenii de activare i de represare sunt bogate n aminoacizi

particulari, aceste domenii funcionale manifest o varietate de secvene de
aminoacizi i structuri proteice caracteristice diferiilor factori transcripie.

SLIDE 64. Complexul ARN polimerazic II de iniiere a transcripiei

Iniierea de ctre Pol II necesit factori generali de transcripie, care
poziioneaz Pol II la nivelul situsului de iniiere i sunt necesari pentru
transcrierea marii majoriti a genelor transcrise de ctre aceast
polimeraz;
Factorii generali de transcripie sunt structuri multimere i nalt conservate;
Proteinele cuprinse n complexul Pol II de iniiere a transcripiei se
asambleaz ntr-o ordine specific in vitro dar majoritatea proteinelor se
pot combina pentru a forma un complex holoenzimatic in vivo.
Anterior am discutat c ARN polimeraza de la E. coli lipsit de subunitatea
sigma70 nu poate iniia transcripia. Totui, cnd core polimeraza este asociat cu
subunitatea sigma70, holoenzima rezutat poate iniia transcripia in vitro pornind de
la promotori puternici. Astfel, subunitatea sigma70 funcioneaz ca un factor de
iniiere care este absolut necesar pentru nceperea transcripiei i care este eliberat de
pe matri o dat ce s-a produs polimerizarea primilor aproximativ 10
ribonucleotidtrifosfai.
Din contr, transcripia in vitro cu ARN polimeraza II purificat necesit
adugarea unui numr mare de factori de iniiere care sunt separai de complexul
polimerazic n timpul purificrii. Aceti factori de iniiere, care poziioneaz ARN
polimeraza II la nivelul situsurilor de iniiere a transcripiei, sunt numii factori
generali de transcripie, deoarece se consider c ei sunt necesari pentru transcripia
majoritii genelor de ctre acest tip de polimeraz. Un complex de iniiere a
transcripiei conine ARN polimeraza i diferii factori generali implicai n
transcripie care se leag al regiunea promotoare.
Muli dintre factorii generali de transcripie necesari polimerazei II pentru
iniierea transcripiei de la nivelul majoritii promotorilor care conin o TATA box au
fost izolai i caracterizai.
Aceste proteine au fost desemnate cu terminologia TFIIA, TFIIB, etc,
majoritatea fiind proteine multimere. TFIID este unul dintre cei mai mari factori
avnd o mas molecular de aprox 750 kDa. Acesta conine o singur protein de
aprox 38 kDa numita TATA box-binding protein (TBP) i 11 factori asociai TBP
numii TAF (TATA Asociated factors) care nu au fost foarte bine caracterizai. Factori
generali de transcripie cu activiti similare au fost izolai din celule umane n
cultur, ficat de obolan, embrfioni de Drosophila, i drojdii. Genele care codific
aceste proteine la drojdii au fost secvenializate o dat cu secvenializarea complet a
genomului de drojdii ca i n cazul ADNc uman i a celui de la Drosophila. n toate
cazurile, factorii de transcripie echivaleni de la diferitele tipuri de eucariote sunt
foarte bine conservai. Dei factorii generai de transcripie permit polimerazei II s
iniieze transcripia in vitro la nivelul acelorai situsuri prezente in vivo, proteine
adiionale sunt necesare pentru iniierea transcripiei in vivo.

SLIDE 65. Etapele procesului de asamblarea a complexului Pol II de

iniiere a transcripiei in vitro
Figura: Etapele asamblrii complexului de iniiere atranscripiei pornind de la ARN
pol II i factori de transcripie izolai.

156

O dat ce ntreg complexul de iniiere a fost asamblat, se produce separarea

catenelor ADN la situsul de start pentru a forma complexul deschis care necesit
hidroliza ATP. O dat ce transcripia iniiaz i transcripia ncepe s se deruleze de la
nivelul prpmotorului, CTD se fosforileaz i factorii generali de transcripie disociaz
de complexul de legare TBP de la nivelul promotorului. Numeroase alte proteine
particip la iniierea transcripiei in vivo.
n majoritatea studiilor biochimice asupra asanblrii complexului de iniiere al
Pol II, cercettorii au folosit mai degrab TBP (TATA binding protein) dect
complexul TFIID coimplet format din multe subuniti i care este dificil de purificat.
Legarea TBP i a altor factori generali de transcripie la promotorii cu secvene
consens TATA a fost analizat prin tehnica de foot-printing cu DN-aza I i prin
tehnica electroforetic de ntrziere n gel. Aceste studii demonstreaz c complexul
PolII de iniiere este asamblat in vitro n conformitate cu secvena de reacii
determinat i prezentat n imagine.
In vitro, TBP este prima protein care se la promotorul TATA box. Toate
proteinele eucariote TBP analizate prezint domenii C-terminale foarte similare de
aproximativ 180 de aminoacizi. Secvena acestei regiuni prezint o omologie de 80%
de la drojdii la om, majoritatea diferenelor fiind substituii conservative. Acestea
conserv funciile domeniului C-terminal ca i ntreaga lungime a proteinei n urma
transcripiei in vitro. Domeniul N-terminal al TBP, care variaz foarte mult ca
secven i lungime la diferite eucariote, funcioneaz n transcripia genelor care
codific pentru ARNsn.

SLIDE 66. Asamblarea in vitro assembly a complexului de preinitiere a

ARN polimerazei II
Factorii de transcriptie generali se leaga secvential la ARN polimeraza II
purificata (Pol II), la nivelul secventei ADN TATAbox pentru a forma complexul de
preinitiatiere. Hidroliza ATP furnizeaza energia pentru desfacerea moleculelor de
ADN la situsul de start prin legarea subunitatii TFIIH subunit. Initierea transcriptiei
de catre Pol II conduce la formarea complexului deschis, iar polimeraza se deplaseaza
de la nivelul promotorului iar domeniul CTD este fosforilat. In vitro, factorii generali
de transcriptie (cu exceptia TBP) disociaza de complexul TBP si promotor, dar nu se
stie inca care dintre factori raman asociati cu regiunea promotoare pentru fiecare
runda de initiere a transcriptiei, in vivo.

SLIDE 67. Domeniile C-terminale conservate ale TBP de legare la

TATA-box DNA
Figura: Structura domeniului C-terminal al TBP legat la ADN TATA-box.
Dei TBP este un monomer, lanul polipeptidic al acestui domeniu este pliat
ntr-o conformaie care are o simetrie bilateral. Totui, resturile de de suprafa ale
proteinei se disting clar n dou pri. TBP se leag la fosa minor a ADN TATA-box,
distorsionnd structura normal a dublului helix ndoind dramatic ADN.
Figura se bazeaz pe analizele de cristalografie cu raze X i demonstraz
legarea la TATA-box. Asemeni HMGI i altor proteine care produc ndoirea ADN
care particip la formarea enhanceozomului sau complexului de activare.
O dat ce TBP se leag la TATA-box, se poate lega i TFIIB care este o
protein monomer mai mic dect TBP. Domeniul su C-terminal vine n contact att
cu ADN ct i cu TBP. Domeniul N-terminal al al TFIIB se extinde ctre situsul de
start, dar structura sa tridimensional nu este nc cunoscut. Dup plierea TFIIB, un

157

complex pre-format din TFIIF (un tetramer alfa2beta2) i Pol II se leag i

poziioneaz polimeraza peste situsul de start. n complexul de preiniiere, care este
stabil, cele dou subuniti mai mari ale Pol II (L i L) interacioneaz cu promotorul
ADN de-a lungul unui canal de aproximativ 240 A care se extinde n amonte i in
aval de situsul de start. La majoritatea promotorilor, se leag nc doi factori generali
nainte de separarea duplexului ADN i expunerea catemei matri. Primul care se
leag este TFIIE (un tetramer alfa2beta2) care creaz un situs de legare pentru TFIIH,
un alt factor multimer care conine nou subuniti. Legarea TFIIH completeaz
complexul de iniiere a transcripiei in vitro.
n prezenta ATP, se manifest activitatea helicazic a TFIIH care desface
duplexul ADN la nivelul situsului de start, permitnd ADN Pol II formarea
complexului deschis. Dac sunt adugai nucleotidtrifosfai Pol II ncepe transcripia
matriei. n timp ce polimeraza ncepe transcrierea dincolo de regiunea promotoare o
alt subunitate a TFIIH fosforileaz Pol II CTD la multiple situsuri.
Complexele minimale de transcripie in vitro conin numai aceste elemente
generale i Pol II purificat. Dup iniiere TBP rmne legat la TATA-box n timp ce
polimeraza realizeaz transcripia dincolo de promotor n timp ce ceilali factori
disociaz. Asa cum am discutat se pare c in vivo transcripia necesit si ali factori
transcripionali; nu este clar care dintre factori rmn asociai cu regiunea promotoare
dup iniiere.

SLIDE 68. Modelul structural al complexului promotor ADN,

TBP, TFIIB, i Pol II
Figura: Modelul structural al complexului compus din promotorul ADN, TBP, TFIIB
i ARN polimreraza II indicnd mrimile relative ale componentelor.
Cele dou vederi ale complexului cu 180o din fa i din spate.

SLIDE 69. Concluzii

ARN polimeraza II necesit mai muli factori generali de transcripie pentru a
localiza clar punctul de start la nivelul matriei ADN i a iniia transcripia. Acestea
includ TFIID care se leag la TATA-box prin intermediul TBP;
Transcripia genelor care codific pentru proteine este controlat de ctre
ARN polimeraza II care poate fi iniiat in vitro prin legarea secvenial a factorilor:
TBP, care se leag la TATA-box; TFIIB; un complex Pol II i TFIIH; TFIIE; i final
TFIIH;
Activitile helicazice ale celor dou subuniti TFIIH separ catenele la
nivelul situsului de start la majoritatea promotorilor, un proces care necesit hidroliza
ATP. Dup ce pol II ncepe transcrierea dincolo de situsul de start, elementele CTD
sunt fosforilate de ctre o alt subunitate a TFIIH;
Iniierea de ctre Pol II in vivo necesit un complex multimediator
multiproteic, care se asociaz cu elementele CTD nefosforilate ale Pol II, formnd un
mare complex holoenzimatic care include i majoritatea factorilor de transcripie. Se
crede c aceast holoenzim preasamblat se leag la ADN promotor ntr-o singur
etap in vivo;
Complexul de iniiere a transcripiei care se asambleaz la nivelul
promotorilor in vivo poate cuprinde 60-70 polipeptide cu o mas total similar cu
cea a unui ribozom.

158

SLIDE 70. Mecanismele moleculare ale controlului transcripional la

eucariote
Controlul transcripional n celulele eucariote poate fi vizualizat ca implicnd
numeroase nivele de reglare. Concentraiile i activitile activatorilor i represorilor
care controleaz transcripia multor gene care codific pentru proteine sunt reglate n
timpul diferenierii celulare i ca rspuns la hormoni i la semnalele celulelor
nconjurtoare.
Aceti activatori i represori regleaz n schimb i modificrile n structura
cromatinei i n acetilarea i deacitilarea histonelor, influentnd astfel capacitatea
factorilor generali de transcripie s se lege la promotori. n plus, activatorii i
represorii regleaz direct asamblarea complexelor de iniiere a transcripiei.
Reglarea prin controlul structurii cromatinei
Cromatin-Nucleosomi (care conin 146 pb ADN)-fibre de cromatin de 30 nm.
Capetele N-terminale ale fiecrei histone (20-60 aminoacizi n funcie de
fiecare histon) se extind ctre suprafaa nucleosomului. Aceste capete histonice Nterminale sunt bogate n resturi de lizin care pot fi modificate reversibil prin
acetilare, fosforilare i metilare ca i prin adugarea unei molecule singulare de
ubiquitin, o protein nalt conservat de 76 de resturi.
Fosforilarea are un rol important dar este nc puin neleas funcia sa n
condensarea cromozomului n timpul mitozei. Funciile altor modificri sunt de
asemenea puin nelese, cu excepia acetilrii. Acetilarea histonelor N-terminale este
asociat cu controlul genetic n timpul interfazei. Alte proteine mai puin abundente
dect histonele sunt i ele asociate cu cromatina. Acestea includ proteinele HMG care
particip la formarea enhanceozomilor (complexelor activatoare).

SLIDE 71. Aranjament al locilor de conjugare pe cromozomul III de la

drojdie
Figura: Genele de pe cromozomul III implicate n controlul conjugrii (mating) la
drojdii (S. Cerevisiae)
Genele silenioase (ne-exprimate) implicate n conjugare (fie a sau alfa n
funcie de su) sunt localizate pe locusul HML. Genele de tip opus sunt prezente pe
locusul silenios HMR. O dat la fiecare diviziune celular, secvedna ADN de pe
HML este transferat locusului MAT; n diviziunile celulare alternative, secvena
ADN de pe HMR este transferat locusului MAT. Cnd secvenele alfa i a sunt
prezente la locusul MAT, ele pot fi transcrise n ARNm ale cror proteine codificate
sunt factori de transcripie care regleaz expresia genelor specifice implicate n
conjugare. Secvene silenioase de legare a proteinelor situate lng HML i HMR
leag proteinele care sunt critice pentru represia acestor loci silenioi.
Diferite experimente au demonstrat c represia locilor HML i HMR este
rezultatul condensrii structurale a cromatinei care blocheaz steric interacia
factoriilor de transcripie cu ADN. ADN din structura locilor silenioi este inaccesibil
proteinelor in general (nici macar metilazei), inclusiv factorilor de transcripie i ARN
polimerazei. Studii asupra regiunilor N-terminale ale histonelor H3 i H4 au
evideniat c acestea derepreseaz locii silenioi, lasnd de exemplu Dam metilaza s
aiba acces la secvenele GATC din strunctura HML i HMR. Aceste rezultate indic
c interaciile specifice care implic regiunile N-terminale ale histonelor H3 i H4
sunt necesare pentru represia la nivelul locilor silenioi de conjugare.
Informaii suplimentare

159

Activatorii i represorii care se leag specific la situsurile ADN i regleaz

expresia genelor care codific pentru proteine associate, realizeaz acest lucru prin
dou mecanisme generale; aceste gene reglatoare acioneaz concertat cu alte proteine
pentru a modula structura cromatinei, influentnd astfel capacitatea de legare la
promotori a factorilor generali de transcriptie. Trebuie s ne reamintim c ADN din
celulele eucariote nu este liber ci asociat cu o mas aproximativ egal de proteine
pentru a forma cromatina. Unitatea structural de baz a cromatinei este nucleosomul,
care este compus din aproximativ 147pb ADN strns nfurat n jurul unei structuri
n form de disc format din histone. Resturile din regiunile N-terminala i Cterminal a histonelor (ex. H2A), numite cozile histinei (histone tails), depesc
suprafaa nucleosomului i pot fi modificate reversibil. Astfel de modificri, n special
acetilarea cozilor histonelor H3 i H4, influeneaz condensarea relativ a cromatinei
i astfel i accesibilitatea proteinelor necesare pentru iniierea transcriptiei. Pe lng
rolul lor n medierea controlului transcripional, realizat prin intermediul cromatinei,
activatorii i represorii interacioneaz cu un complex multiproteic mare numit
complexul mediator al transcripiei (mediator of transcription complex) sau simplu
mediator. Acest complex se leag la randul lui la Pol II i regleaz direct asamblarea
complexelor de preiniiere a transcripiei. n aceast seciune, reluam nelegerea
curent a modului n care activatorii i represorii sunt controlai, astfel ncat expresia
genelor s fie adaptat la nevoile celulei i ale organismului.
Formarea heterocromatinei sileniaz (atenueaz) expresia genelor la nivelul
telomerilor, n proximitatea centromerilor dar i n alte regiuni.
Ani la rnd a fost clar c inactivarea genelor n celulele eucariote este adesea
asociat cu prezena heterocromatinei, regiuni ale cromatinei care sunt mult mai
condensate i se coloreaz mult mai nchis, cu clorani pentru ADN, dect
eucromatina, la nivelul creia se afla cele mai transcrise gene. Regiunile de la nivelul
cromozomilor situate n proximitatea centromerilor i telomerilor i adesea alte
regiuni adiionale specific care variaz n diferitele tipuri celulare sunt organizate n
heterocromatin. ADN din heterocromatin este mai puin accesibil i n consecin
este adesea numit cromatina nchis. De exemplu, aa cum am vzut n capitolul
anterior, ADN din genele inactive a fost gsit ca fiind mult mai rezistent la digestie cu
DNazaI dect ADN din genele intens transcrise.
Studiul regiunilor de ADN din S. cerevisiae care se comport ca i
heterocromatina de la eucariotele superioare furnizeaz informaii preioase privind
represia transcripiei mediate de cromatin (chromatin-mediated repression of
transcription). Aceasta drojdie are n ciclul su de cretere att forme haploide ct i
diploide. Celulele haploide manifest una din cele dou forme celulare care pot
participa la procesul de conjugare: tipul a i (alfa). Celulele aparinnd la tipuri
diferite de conjugare se pot conjuga sau fuziona pentru a genera celule diploide.
Cnd o celul haploid se divide prin nmugurire, celula mai mare, mam suport
o modificare (switches) a tipului celular de conjugare. Analizele genetice i
moleculare au evideniat existena a trei loci genetici pe cromozomul III de drojdie
care controleaz procesul de conjugare a celulelor de drojdie. Dintre cei trei loci,
numai locusul central MAT este transcris activ. Ceilalti loci adiionali, numii HML i
HMR, situai lng telomerii din stanga i respectiv din dreapta, conin copii
silenioase (silent) netranscrise ale genelor a sau (alfa). Aceste secvene sunt
transferate alternativ de pe HML sau HMRa pe locusul MAT printr-un tip de
recombinare nereciproc ntre cromatidele surori n timpul diviziunii. Cnd locusul
MAT conine secvena ADN din HML, celulele devin (alfa). Cnd locusul MAT
conine secvenele ADN din HMRa, celulele devin a. n acest capitol noi suntem

160

interesai s ntelegem cum se realizeaz represia transcripiei la nivelul locilor

silenioi de conjugare HML i HMR. Dac genele de la nivelul acestor loci sunt
exprimate, aa cum se ntmpl n cazul suselor mutante cu defecte n mecanismele
de represare, att proteinele a i (alfa) sunt exprimate, determinnd celulele sa aib
un fenotip asemanator cu cel al celulelor diploide, care nu se pot conjuga. Promotorii
i UAS (Upstream activating sequences) i regiunile care controleaz transcripia
genelor a i (alfa) se afl n apropierea centrului secvenei care este transferat i
sunt identice indiferent dac secvenele sunt pe locusul MAT sau pe unul dintre locii
silenioi. n consecin, funcia factorilor de transcripie care interacioneaz cu
aceste secvene este ntr-ul fel blocat la nivelul HML i HMR. Aceasta represie la
nivelul locilor sileniosi depinde de secvenele cu rol de sileniere (silencer
sequences) localizate n apropierea regiunii de transfer a secvenelor ADN la nivelul
locusurilor HML i HMR. Se constat c dac sileniatorul este nlturat, locusul
silenios este transcris.
Remarcabil, orice gen situat lng secvena sileniatoare a procesului de
conjugare, prin tehnici de recombinare a ADN, este represat sau sileniat chiar dac
gena ARNt transcris de ctre ARN polimeraza III, care folosete un set diferit de
factori generali de transcripie fa de ARN polimeraza II.
Numeroase studii indic c represia locilor HML i HMR este determinat de o
structur cromatidic condensat care blocheaz steric factorii de transcripie care
interacioneaz cu ADN. ntr-un experiment, gena care codific pentru enzima care
metileaz resturile de Adenina din secvenele GATC, la E. coli, a fost introdus n
celulele de drojdii sub controlul unui promotor de drojdie astfel nct enzima s fie
exprimat. Cercetatorii au evideniat c secvenele GATC din interiorul locusului
MAT i din multe alte regiuni ale genomului acestor celule au fost metilate, dar nu i
cele din structura locilor HML i HMR. Aceste rezulate indic c secvenele ADN de
la nivelul locusurilor silentioase sunt inaccesibile metilazei de la E. coli i n general
tuturor proteinelor, inclusiv factorilor de transcripie i ARN polimerazei.
Experimente similare realizate cu diferite suse mutante de drojdii la nivelul histonelor
au indicat existena unor interacii specifice care implic cozile histonelor H3 i H4
sunt necesare pentru formarea unor structuri cromatinice nalt represate. Alte studii au
artat c telomerii fiecrui cromozom de drojdie devin structuri de tip silenios. De
exemplu, cnd o gen este plasat la cteva kilobaze de orice telomer de drojdie,
expresia sa va fi represat. n plus, aceasta represie este exonerat de aceleai mutaii
n structura cozilor histonelor H3 i H4 care interfer cu represia la nivelul locilor
sileniosi de tip conjugare.
Studiile genetice au condus la identificarea mai multor proteine, RAP1 i 3
proteine SIR, care sunt necesare pentru represarea i silenierea locilor tip conjugare i
a telomerilor de la drojdii. RAP1 a fost identificat ca fiind legat la nivelul
secvenelor ADN de sileniere asociate cu HML i HMR i cu o secven multirepetitiv care se gsete la nivelul fiecrui telomer din cromozomii de drojdie.

SLIDE 72. Numeroase gene codific proteine care leag locii silenioi
specific la nivelul telomerilor de drojdii
Figura: Co-localizarea proteinei Sir3 cu heterocromationa telomeric n nucleii de
drojdii
a) Micrografii confocale pentru trei celule diploide de drojdii, fiecare coninnd
cte 34 telomeri. Telomerii au fost marcai prin hibridizare cu o sond marcat
fluorescent, specific telomerilor (galben). ADN a fost colorat n rou pentru a

161

evidenia nucleii. Cei 34 telomeri se ntreptrund ntr-un numr mult mai mic de
regiuni situate la periferia nucleului.
b) i c) sunt imagini de microscopie confocal ale celulelor de drojdii marcate
prin hibridizare cu o sond specific telomerilor de drojdii (b) i cu anticorp specfic
fa de Sir3 marcat fluorescent (c). De reinut c Sir3 este localizat la nivelul
heterocromatinei represate de la nivelul telomerilor. Experimente similare au fost
realizate i cu Rip1, Sir2 i Sir4 au demonstrat c aceste proteine sunt i ele colocalizate cu heterocromatina telomeric.
Au fost realizate studii genetice cu numeroase gene: RAP1 i 3 SIR (silent
Information regulator) care sunt necesare pentru represia locilor silenioi implicai n
conjugare i prezeni la nivelul telomerilor. De exemplu, RAP1 codific pentru o
protein care se leag n interiorul unor secvene de ADN sileniose asociate cu HML
i HMR i cu o secven care este repetat de mai multe ori la nivelul fiecrui telomer
al cromozomului de drojdie. Studii biochimice mai recente au demonstrat c aceste
proteine se leag ntre ele i c mpreun se leag la capetele terminale ale histonelor
H3 i H4. Microscopia confocal n imunofluorescen asupra celulelor de drojdii
marcate cu anticorpi fa de proteinele Sir i Rap i hibridizate cu o sond ADN care
recunoate regiunea telomeric, evideniaz c aceste proteine formeaz structuri
multiproteice mari cu localizare telomeric asemntoare heterocramatinei evideniate
la eucariotele superioare.

SLIDE 73. Model schematic al silencing la telomerii de drojdii (1)

Figura: Modelul schematic al mecanismului de atenuare (silencing) la nivelul
telomerilor de drojdii
Mai multe copii ale Rap1 se leag la o secven repetitiv simpl situat n
fiecare regiune telomeric, care este lipsit de nucleozomi (sus). Aceasta determin
asamblarea unui complex multiproteic (jos) prin realizarea unor interacii proteinprotein ntre Rap1, Sir2, Sir3 i Sir4 i cozile aminoterminale hipoacetilate ale
histonelor H3 i H4 din structura nucleozomilor nvecinai. Asterixurile marcheaz
prezena cozilor amino-terminale hiperacetilate ale histonelor. Structura
heterocromatinei cuprinde aproximativ 4 kb din secvena ADN situat n vecintatea
situsurilor de legarea ale Rap1 i respectiv a secvenei acesteia.
Structura actual a heterocromatinei nalt organizate nu este nc cunoscut i
neleas.
silencing (amortizare, atenuare) la organismele superioare
Reglarea transcripiei prin intermediul represiei mediate de heterocromatin
este foarte important la eucariotele superioare. De exemplu, expresia factorilor de
transcripie Hox, care regleaz factorii de transcripie, care regleaz dezvoltarea
planul corpului (de exemplu, anatomia normal) la majoritatea animalelor.
Mecanismul acestei represii este nc n curs de studiu dar analizele genetice realizate
la Drosophila au evideniat c multe proteine nucleare sunt implicate n formarea
regiunilor de heterocromatin la nivelul unor situsuri specifice din structura genelor
Hox.

SLIDE 74. Model schematic al silencing la telomerii de drojdii (2)

Mai multe copii ale RAP1 se leag la o secven simpl repetitiv de la nivelul
fiecrei regiuni telomere care este lipsit de nucleozomi (sus). Acestea determin
asamblarea unui complex multiproteic (jos) printr-un mecanism de interacie proteinprotein dintre RAP1, SIR2, SIR3, SIR4 i cozile N-terminale hipoacetilate H3 i H4
ale nucleozomilor nvecinai. SIR2 are rolul de a deacetila cozile histonelor. Structura
162

heterocromatinic pentru fiecare telomer conine aproximativ 4kb ADN din

vecinatatea situsurilor de legare RAP1 indiferent de secven. Asocierea mai multor
telomeri condensai formeaz complexe de cromatin nalt-ordonate care blocheaz
steric alte proteine n interacia cu ADN [Adapted from M. Grunstein, 1997, Curr.
Opin. Cell Biol. 9:383.]
Alte studii biochimice arat c proteinele SIR se leag una la cealalt i c
dou astfel de proteine se leag la cozile N-terminale ale histonelor H3 i H4 care sunt
meninute ntr-o stare neacetilat extins prin activitatea deacetilazic a SIR2. Mai
multe experimente bazate pe microscopia confocal de fluorescen pe celule de
drojdii, fie prin marcare cu anticorpi marcai la oricare dintre proteinele SIR sau
RAP1 sau prin hibridizarea cu o sond marcat specific telomerilor, au evideniat c
aceste proteine formeaz structuri nucleoproteice condensate cu telomerii,
asemntoare heterocromatinei gsite la eucariotele superioare.
Modelul silenierii mediate de ctre cromatin la telomerii de drojdie se
bazeaz i pe alte studii. Formarea heterocromatinei la telomeri este nucleat prin mai
multe proteine RAP1 care se leag la secvene repetitive ntr-o regiune lipsit de
nucleozomi la extremitatea extern a telomerilor. Se formeaz o reea de interacii
proteine-proteine care implic telomerii la care se leag RAP1, trei proteine SIR (2,3
i 4) i histonele H3 i H4 hipoacetilate i care creeaz un complex nucleoproteic
supraorganizat care include mai multi telomeri i n care ADN nu este deloc accesibil
(sau este puin accesibil) proteinelor externe. O alt protein, SIR1, care este necesar
pentru silenierea locilor sileniosi implicai n conjugare. Dei funcia SIR1 nu este
inca bine inteleasa, se stie ca aceasta este asociata cu regiunea de silentiere, unde se
considera ca ar putea determina asocieri ulterioare a complexului de sileniere
multiproteic de la nivelul telomerilor astfel nct procesul de sileniere se rspandete
mai departe pornind de la capetele cromozomilor cuprinznd HML i HMR.
O trasatur importnt a acestui model este dependena silenierii de
hipoacetilarea cozilor histonelor. Aceasta a fost demonstrat n experiene pe drojdii
mutante care exprim histone, n care histonele de la capetele N-terminale sunt
substituite cu arginine sau glutamine. Arginina este pozitiv ncrcat, asemeni lizinei,
dar nu poate fi acetilat. Se consider c aceasta funcioneaz n cozile N-terminale
ale histonelor la fel ca lizina neacetilat. Represarea la nivelul telomerilor i la nivelul
locilor silenioi de conjugare a fost gsit deficient la mutanii cu substituii pentru
glutamin dar nu i la mutanii cu substituii pentru arginin. Hiperacetilarea cozilor
histonelor H3 i H4 ulterior a fost gsit ca interfernd cu legarea SIR3 i SIR4. Dei,
represia transcripiei mediat de cromatin este de asemenea important la eucariotele
multicelulare, mecanismul acestei represii este inactiv n curs de elaborare. Studii
genetice i biochimice la Drosophila au evideniat c mai multe proteine asociate ntrun complex multi-proteic mare particip la acest proces. Acestea se numesc complexe
"Polycomb". Ca i n cazul legrii proteinelor SIR la telomerii de drojdie, aceste
proteine Polycomb de la Drosophila pot fi vizualizate legate la genele pe care le
represeaz n mai multe poziii specifice din genom prin folosirea de anticorpi marcai
fa de cromozomii politeni din glandele salivare.

163

SLIDE 75. Metoda de imunoprecipitare a cromatinei evideniaz starea

de acetilarea a histonelor din structura cromatinei
Histonele pot fi usor cross-legate la ADN, in vivo, dac se folosete un agent
chimic care asigur cros-linkarea reversibil i pentru care celula este permeabil. n
figur, nucleosomii cu cozile histonelor acetilate sunt marcai n verde.
Etape:
1) cromatina cross-linkat este izolat i tiat la o lungime medie care
corespunde la 2-3 nucleozomi;
2) se folosete un anticorp fa de secvena unei cozi histonice pentru
recunoatere;
3) nucleozomii care se leag sunt imunoprecipitai;
4) ADN din fragmentele de cromatin imunoprecipitate este eliberat prin
reversarea cross-linkrii i apoi este cuantificat folosind o metod PCR sensibil.
Metoda poate fi folosit pentru analiza asocierii in vivo a oricrei proteine cu o
secven specific de ADN prin folosirea de anticorpi fa de proteina de interes din
aceea etapa. [See S. E. Rundlett et al., 1998, Nature 392:831.]

SLIDE 76. Analiza strii de acetilare a histonelor n cromatina asociat

cu regiuni specifice ale genomului
Figura: Metod experimental pentru analiza strii de acetilare a histonelor n
cromatina asociat cu o regiune specific a genomului.
Nucleozomii sunt slab nreelai cu ADN in vivo folosind un agent de
nreelare reversibil permeabil la nivel celular. Este izolat apoi cromatina i scindat
pe o lungime medie de trei nucleozomi fiind supui imunoprecipitrii cu un anticorp
specific fa de o secven histonic particular N-terminal specific. ADN din
fragmentul de cromatina imunoprecipitat este eliberat prin reversarea agentului de
nreelare i apoi este cuantificat folodin o tehnic PCR sensibil.

SLIDE 77. Represorii i activatorii pot orienta deacetilarea histonelor

genelor specifice
Figura: Rolul deacetilrii i hiperacetilrii cozilor N-terminale ale histonelor n
controlul transcripiei la drojdii.
a) Deacetilarea dirijat de represor la nivelul cozilor N-terminale ale histonelor.
DNA binding Domain (DBD) al represorului Ume6 interacioneaz cu un element
de control situat n amonte (URS1) ale genelor pe care le regleaz. Domeniul represor
al Ume6 (RD) leag Sin3, o subunitate a unui complex multiproteic care include
Rpd3, o deacetilaz histonic. Deacetilarea capetelor terminale ale histonelor din
structura nucleozimilor din regiunea de legarea a Ume6 inhibnd legarea factorilor
generali la TATA box, represnd mai degrab expresia genelor.
b) Hiperacetilarea dirijat de ctre activatori asupra cozilor N-terminale ale histonelor.
Domeniul ADN de legare a Gcn4 interacioneaz cu secvenele specifice situate n
amonte (UAS) de secvenele activatoare ale genelor pe care le regleaz. Domeniul de
activare al Ggn4 (AD) interacioneaz apoi cu un complex multiproteic de acetilare a
histonelor care include subunitatea catalitic Gcn5. Hiperacetilarea ulterioar a
capetelor N-terminale ale histonelor din structura nucleozomilor aflai n vecintatea
situsului de legare a Gcn4 faciliteaz accesul factorilor generali de transcripie
necesari pentru iniiere. Represia i activarea unor gene din eucariotele superioare
apar prin mecanisme similare.
164

Informaii suplimentare
Rolul deacetilrii histonelor n represia genetic mediat de ctre cromatin
este susinut de descoperirea proteinelor de la drojdii care represeaz transcripia mai
multor gene situate n regiuni interne ale cromozomului. Acum se tie c aceste
proteine acioneaz parial determinnd deacetilarea regiunilor N-terminale ale
histonelor din structura nucleozomilor care sunt legai la TATA box ale genelor pe
care acestea le reprim. Studiile in vitro au demonstrat c dac secvena de ADN
promotor este asamblat ntr-un nucleozom cu histone neacetilate, factorii generali de
transcripie nu se pot lega la TATA box i la regiunea de iniiere. n histonele
neacetilate, lizinele N-terminale sunt ncrcate pozitiv i interacioneaz puternic cu
gruprile fosfat din structura ADN, crescnd afinitatea acestuia fa de suprfa
nucleozomului. Prevenind interacia factorilor generali de transcripie cu regiunea
promotor. Din contra legarea factorilor de transcripie n cazul hiperacetilrii
histonelor este mai puin represat fiind din contr sti,mulat de ctre activatorii
transcripionali.
Legtura dintre deacetilarea histonelor i represarea transcripiei a fost i mai
clar cnd a fost purificat prima deacetilaz histonic din celule umane i ADNc a
fost clonat. Aceste deacetilaze au fost gsite ca fiind asociate cu represorii la
euacriotele superioare. Acestea includ doi represori heterodimeri care particip la
reglarea ciclului celular la mamifere i un grup de receptori nucleari care sunt reglai
de ctre hormoni liposolubili.
Studii recente furnizeaz o explicaie pentru observaiile anterioare c
regiunile inactive transcripional de la vertebrate conin adesea resturi de 5-metilcitidin (mC) urmate imediat de G, n timp regiunile active transcripional sunt lipsite
de mC. S-a determinat c regiunile care conin mC leag specific o protein care la
rndul ei interacioneaz cu mSin3. Aceste descoperiri sugereaz c asocierea mSin3
care conine cxmplexe de deacetilaz histonic cu situsurile metilate din structura
ADN conduce la deacetilarea histonelor din structura nucleozomilor vecini, fcnd
regiunea inaccesibil la factorii de transcripie generali i la Pol II, fcnd-o
transcripional inactiv.

SLIDE 78. Mecanismul propus pentru deacetilarea histonelor i

hiperacetilare n controlul transcripiei la drojdii
a) Deacetilarea cozilor N-terminale ale histonelor controlat de represori. Domeniul
de legare la ADN
(DNA-binding domain - DBD) al represorului UME6
interacioneaz cu elementul specific de control situat n amonte (upstream control
element - URS1) al genelor pe care le regleaz.
Domeniul de represie (RD) al UME6 se leag la SIN3, o subunitate a unui
complex multiproteic care include RPD3, care este o deacetilaz a histonelor.
Deacetilarea cozilor N-terminale ale histonelor din nucleozomi n regiunea de legare
a UME6- (binding site) inhib accesul factorilor generali de transcripie TATA box,
reprimnd astfel expresia genelor.
b) Hiperacetilarea coordonat de activatori a cozilor N-terminale ale histonelor.
Domeniul de legare la ADN al activatorului GCN4 interacioneaz cu secvene
activatoare situate n amonte (upstream activating sequences UAS) ale genelor pe care
le regleaz. Domeniul de activare al GCN4 (AD) interacioneaz ulterior cu un
complex multiproteic cu activitate de acetilare a histonelor care include subunitatea
catalitic GCN5. Hiperacetilarea ulterioar a cozilor N-terminale ale histonelor de la
nivelul nucleosomilor din vecinatatea situsului de legare a GCN4 faciliteaz accesul

165

factorilor generali de transcripie necesari pentru iniiere. Represia i activarea mai

multor gene la eucariotele superioare apar prin mecanisme similare.
Represorii pot directiona deacetilarea histonelor pentru gene specifice
Importana deacetilrii histonelor n represia genic mediat de ctre
cromatin este susinut de studii pe represorii de la eucariote, care regleaz genele
situate pe poziii interne n cromozomi. Aceste proteine sunt cunoscute acum ca
acionnd n parte prin deacetilarea cozilor histonelor din nucleozomii care se leag la
TATA box i la regiunea promotoare proximal a genelor pe care acestia le
represeaz.
Studiile in vitro au artat c atunci cnd un promoter ADN este asamblat ntrun nucleosom cu histone neacetilate, factorii generali de transcripie nu se pot lega la
TATA box i la regiunea de iniere a transcriptiei. n histonele neacetilate, lizinele
terminale sunt ncrcate pozitiv i interacioneaz puternic cu gruparile fosfat din
structura ADN. Cozile neacetilate ale histonelor interacioneaz i cu octamerii vecini
de histone favoriznd plierea cromatinei n structuri condensate i nalt-ordonate a
cror conformaie precis nu este bine cunoscut. Efectul net este acela c factorii
generali de transcripie nu se pot asambla ntr-un complex de preiniiere la nivelul
promotorilor care conin histone hipoacetilate. n contrast, legarea factorilor generali
de transcripie este represat mult mai puin de prezena histonelor care conin cozi
hiperacetilate n care lizinele ncrcate pozitiv sunt neutralizate i intraciile
electrostatice cu moleculele fosfat din ADN sunt eliminate.
Legtura ntre deacetilarea histonelor i represia transcrierii la aproape toi
promotorii drojdiilelor a devenit foarte clar cnd a fost demonstrat homologia ntre
ADNc ce codific pentru deacetilaza histonic uman i gena RPD3, despre care se
cunoate c este necesar pentru represia normal a unui numr ridicat de gene la
drojdie. S-a demonstrat c proteina RPD3 deine activitate histon deacetilazic.
Capacitatea proteinei RPD3 de a deacetila histone la un anumit numr de promotori
depinde de dou alte proteine: UME6, un repressor care se leag la o secven
specific reglatoare (URS1) i SIN3, care este parte a unui complex multiproteic,
mare care conine i RPD3. SIN3 se leag, de asemenea, la un domeniu de represare
al UME6, pozitionnd deacetilaza histonic RPD3 n cadrul complexului, astfel nct
sa poat interaciona cu promotorii asociai nucleosomilor, ndeprtnd gruprile
acetil de la nivelul histonelor n zona N-terminal. Experimente suplimentare,
folosind tehnica de imunoprecipitare a cromatinei, au demonstrat c, la drojdiile de tip
slbatic, unul sau doi nucleosomi din apropierea situsurilor de legare la UME6, sunt
hipoacetilate.
Aceste regiuni din ADN include promotori ale unor gene represate de UME6.
n mutanii cu deleii sin3 i rpd3, promotorii nu erau represai, dar i nucleosomii din
zonele zonele adiacente situsurilor de legare a UME6, erau hiperacetilate.
Aceste descoperiri susin modelul deacetilrii direcionate de repressor. n
cadrul acestui model, este demonstrate faptul c complexul SIN3-RPD3 funcioneaz
ca un co-represor. Complexele co-represor conin deacetilaze histonice, care au fost
associate cu muli represori de la nivelul celulelor mamaliene. Unele dintre aceste
complexe conin omologul mammalian al SIN3 (mSin3), care interacioneaz cu
proteina represor.Alte complexe histonice deacetilazice identificate n celulele
mamaliene conin proteine ce se leag la represori, diferite sau suplimentare.
Aceste combinri represori sau co-represori au ca scop mediarea deacetilrii
histonelor la nivelulul unor promotori specifici, printr-un mechanism similar cu cel de
la drojdii. Totui, ca urmare a observaiei conform creia la un numr ridicat de

166

eucariote, proteinele represor inhib trascripia in vitro, n absena histonelor, se pare

c exist i alte mecanisme de represie, exceptnd deacetilarea histonelor.
Identificarea complexului de deacetilare a histonelor ce conine mSin3, ofer o
explicaie pentru observaiile anterioare conform crora, la vertebrate, regiuni de
ADN inactive din punct de vedere transcripional, conin frecvent resturi de citidin
modificat (5-metilcitidin mC), urmat de G, n timp ce regiuni de ADN active din
punct de vedere transcripional nu prezint resturi de mC. ADN ce contine mC se
leag la o serie de proteine specifice care interacioneaz cu mSin3. Aceste observaii
sugereaz o asociere a corepresorilor ce conin mSin3 cu zone metilate din ADN, ceea
ce duce la deacetilarea histonelor situate n apropierea nucleosomilor. Apar astfel
zone inaccesiblie factorilor de trancripie i Pol II, devenind astfel inactive
transcripional.
Activatorii pot direciona acetilarea histonelor la nivelulul unor gene specifice
Studii genetice i biochimice la drojdii au duc la descoperirea unor complexe
multiproteice mari ce conin GCN5, cu activitate histon acetilazic. O alt subunitate
a complexului histon acetilazic de leag la nivelul domenilor acide de activare a
proteinelor activatoare precum GCN4. Activarea maxim a transcriptiei de ctre
GCN4 depinde de complexul histon-acetilazic, care funcioneaz ca i co-activator.
Modelul prezentat este n concordan cu observaiile conform crora
nucleosomii din apropierea regiunii promotor a unei gene reglate de activatorul
GCN4, sunt hiperacetilate ntr-o maniera specific. Acest proces modific (deschide)
structura cromatinei facilitnd legarea altor proteine necesare iniierii transcripiei.
Un mecanim similar apare i la nivelul eucariotelor superioare. De exemplu,
mamiferele exprima dou proteine cu mai multe domenii (400-kD), denumite CBP
i P300, care se presupune c funcionez n acelai mod. Dup cum s-a menionat
anterior, un domeniu al CBP leag domeniul activator fosforilat acid de la nivelul
factorului de transcripie CREB. Alte domenii din CBP interacionez cu diferite
domenii activatoare de la nivelul factorilor transcripionali. Totui un alt domeniu al
CBP prezint activitate histon-acetilazic, i un altul se asociaz cu un complex
multiproteic histon-acetilazic, care este omologul complexului GCN5 de la drojdii.
CREB i muli ali activatori mamalieni funcioneaz prin dirijarea CBP i ataarea
complexelor histon-acetilazice la nucleosomi specifici, unde acetileaz cozile
histonelor. Astfel este facilitat interacia factorilor transcripionali generali cu
promotrii de la nivelul ADN.
De asemenea, cea mai mare subunitate TFIID prezint activitate histonacetilazic i poate funciona ca i co-activator, prin acetilarea cozii N-terminale a
histonei ce se gsete n vecintatea cutiei TATA.

SLIDE 79. Example ale codului histonelor

Figura: Modificri post-translaionale specifice la nivelul cozilor N-terminale ale
histonelor H3 i H4 au fost evideniate n eucromatina, care este accesibil proteinelor
i care este transcripional activ. Modificri diferite au fost gsite n heterocromatin,
care este condensat i astfel mult mai inaccesibil proteinelor i transcripional
inactiv. Secvenele cozilor de histone sunt prezentate n codul cu o liter al
aminoacizilor. CENP-A este o variant a histonei H3 gsit n nucleosomii asociai cu
centromerii cromozomilor de la mamifere. [Adapted from T. Jenuwein and C. D.
Allis, 2001, Science 293:1074.]
Modificri ale resturilor specifice ale cozilor histonelor controleaz condensarea
cromatinei

167

Pe lng acetilarea reversibil, cozile histonelor pot suferi fosforilarea

reversibil a resturilor de serin i treonin, monoubiquitinarea resturilor de lizin din
coada C-terminal a H2A, metilare ireversibil.
Exist dovezi c nu numai nivelul total de acetilare a histonelor controleaz
condensarea cromatinei i prin urmare accesibilitatea la ADN. Mai degrab anumii
aminoacizi cu poziii precise n cozile histonelor care sunt acelitai si astfel modificai
pot constitui "codul histonelor" care ajut controlul condensrii cromatinei. De
exemplu, lizina din poziia 9 din histona H3 este adesea metilat n heterocromatin.
Codul histonelor este "citit" de proteinele care se leag la aceste modificri specifice
i care la rndul su promoveaz condensarea i decondensarea cromatinei, formnd
structuri cromatinice "nchise" sau "deschise". De exemplu, eucariotele superioare
exprim un numr de proteine asociate cu heterocromatina coninnd aa-numitele
cromodomenii, care se leag la cozile histonelor H3 cnd aceasta este metilat la
lizina 9. Se postuleaz c aceste proteine contribuie la plierea nalt-ordonat
caracteristic heterocromatinei, oarecum, la fel ca proteinele SIR la nivelul
telomerilor de drojdii. Alternativ, bromo-domeniul gsit ntr-un numr de proteine
asociate eucromatinei se leag la cozile acetilate ale histonelor. Cea mai mare
subunitate a factorului TFIID, de exemplu, conine dou bromodomenii apropiate,
care poat ajuta asocierea cu cromatina care conine un cod activ,n timp ce activitatea
histon-acetilazic al aceleiai subunitate menine cromatina ntr-o stare hiperacetilat.
Factorii care remodeleaz cromatina ajut la activarea sau represarea anumitor
gene
Pe lng complexele histon-acetilazei, un alt tip de complex multiproteic,
numit "SWI/SNF chromatinremodeling complex" este necesar pentru activare la
nivelul unor promotori de drojdie. Mai multe subuniti SWI/SNF prezint omologie
cu ADN helicazele, enzime care folosesc energia obinut prin hidroliza ATP pentru a
rupe interaciile dintre perechile de baze din structura acizilor nucleici sau dintre
acetia i proteine. Complexul SWI/SNF se consider c disociaz tranzitoriu ADN
de pe suprafaa nucleozomului, permitnd nucleozomului s alunece de-a lungul ADN
i s promoveze desfacerea structurilor de cromatin condensate i nalt-ordonate.
Rezultatul net al unei astfel de remodelri a cromatinei este facilitarea legrii
factorilor de transcripie la ADN din structura cromatinei. S-a demonstrat legarea
ctorva domenii de activare la complexul SWI/SNF, aceast legare stimulnd
transcripia in vitro de pe matritele de cromatin (de pe ADN legat la nucleosomi).
Astfel complexele SWI/SNF reprezint un alt tip de complex de coordinare. Alte
complexe multi-proteice cu activiti de remodelare a cromatinei similare au fost
identificate la drojdii, crescnd posibilitatea ca diferitele complexe de remodelare a
cromatinei s fie necesare pentru diferite familii de activatori.
Eucariotele superioare conin i ele complexe multi-proteice omologe cu
complexul SWI/SNF. Aceste complexe izolate din extractele nucleare de la mamifere
i celulele de Drosophila, s-a demonstrat c asist legarea factorilor de transcripie la
situsurile lor de recunoaltere din ADN nucleosomal printr-un proces care necesit
consum de ATP. n figur se demonstreaz cum un domeniu de activare poate
determina decondensarea unei regiuni de cromatin. Acest lucru se consider c este
rezultatul interaciei dintre domeniile de activare i complexele care acetileaz
histonele remodelnd cromatina.
n mod surprinztor, complexele SWI/SNF sunt necesare i pentru represia
anumitor gene, probabil deoarece acestea ajut expunerea cozilor de histone la
aciunea deacetilazelor sau deoarece acestea asist legarea activatorului la situsul lui

168

de recunoatere ADN i a PolII la promotor. n plus, una dintre subunitile mediator

au activitate histon-acetilazic i pot funciona n scopul meninerii unei regiuni
promotoare ntr-o stare hiperacetilat.
Experimente cu mutani de drojdii sensibili la temperatura indic c anumite
subuniti mediatoare sunt necesare pentru transcripia aproape a tuturor genelor de la
drojdii. Aceste subuniti ajut, cel mai probabil, la meninerea structurii n ansamblu
a complexului mediator sau la legarea la PolII, i, prin urmare, sunt necesare pentru
activarea realizat de ctre toate tipurile de activatori. n contrast, alte subuniti
mediator sunt necesare pentru activarea unor subseturi specifice de gene.
Analizele ADN microarray pentru expresia genic la mutanii cu defecte la
nivelul acestor subuniti mediator indic c fiecare astfel de subunitate influeneaz
transcripia a aproximativ 3-10% din toate genele. Aceste subuniti mediatoare se
consider c interacioneaz cu domenii specifice de activare; astfel, atunci cnd una
dintre subuniti este defectiv, transcripia genelor reglat de ctre activatorii care se
leag la acea subunitate este sever depresat n timp ce transcripia altor gene nu este
afectat. n concordan cu aceast explicaie sunt studiile de legare care arat c
anumite domenii de activare interacioneaz ntradevar cu subuniti mediatoare
specifice. Complexele mediatoare mari, izolate din culturi celulare de mamifere, sunt
necesare pentru activatorii de mamifere pentru a stimula transcripia realizat de ctre
PolII in vitro. Deoarece genele care codific subuniti omologe ale mediatorului de
mamifere au fost identificate n secvenele genomice de la C. elegans i Drosophila,
se pare c majoritatea animalelor multicelulare (metazoare) au complexe mediatoare
omologe.
Aproximativ 1/3 dintre subunitile mediatoare de la metazoare sunt clar
omologe cu subunitile mediatoare de la drojdie, dar subunitile care rmn, i care
par s fie distincte fa de alte proteine de drojdie, pot interaciona cu domeniile de
activare care nu au fost evideniate n drojdie. Ca i n cazul mediatorilor de la drojdii,
unele dintre subunitile mediatoare de la mamifere au artat c interacioneaz cu
domenii activatoare specifice. De exemplu, subunitatea Sur2 a mediatorului de la
mamifere se leag la domeniul de activare al factorului de transcripie TCF care
controleaz expresia genei EGR-1. Funcia activatorului TCF in vivo este reglat
normal ca rspuns la hormoni proteici specifici prezeni n ser. Celulele stem
embrionare de oarece cu knockout la nivelul genei sur2 eueaz inducerea expresiei
proteinei EGR-1 ca rspuns la ser, ntruct muli ali activatori funcioneaz normal
n celulele mutante.
Aceste constatri demonstreaz implicarea subunitii mediator Sur2 n
activarea funciei TCF. Diferitele rezultate experimentale care indic c subunitile
mediator individuale se leag la domenii de activare specifice sugereaz c mai muli
activatori influeneaz transcripia unui singur promotor prin interacia simultan cu
un complex mediator.
Activatorii care se leag la "enhancer" sau la elemente promotor proximale pot
interaciona cu mediatorii asociai cu un promotor deoarece ADN este flexibil i poate
forma o bucla care poate aduce regiunile reglatoare i promotorii apropiai mpreun.
Astfel de bucle au fost observate n experimentele cu activatorul NtrC de la E. coli i
cu 54 ARN polimeraza. Complexele multiproteice cu nucleoproteine care se formeaz
la nivelul promotorilor de la eucariote pot s conin nu mai puin de 100 polipeptide
cu o mas total de aproximativ 3 megadaltoni (MDa), la fel de mare ca ribozomul.

169

SLIDE 80. Activatorii stimuleaz strnsa cooperare n asamblarea

complexelor de iniiere
Figura: Situsurile de legare ale activatorilor care controleaz transcripia genei
trantiretinei (TTR) din hepatocitele de oarece
HNF= hepatocyte nuclear factor; EBP=enhancer binding protein; AP1=factor
transcripional heterodimer cjun/cfos
Dup participarea la hiperacetilarea cromatinei n vecintatea regiunii
promotoare, activatorii transcripionali se crede c stimuleaz asamblarea unui
complex de iniiere i regleaz frecvena cu care noi molecule de Pol II reiniiaz
transcripia. Aceast funcie a activatorilor care furnizeaz un al doilea nivel de
control transcripional, poate fi demonstrat adesea n reacii in vitro, n lipsa
histonelor.
De exemplu, unii activatori stimuleaz legarea TFIID sau legarea simultan a
TFIID i TFIIH la TATA box in vitro. Ali activatori interacioneaz cu ali factori
generali de transcripie i cu subunitile complexului mediator asociat cu elementele
CTD ale subunitii mari a Pol II.
Asamblarea complexului multiproteic de iniiere la nivelul promotorului se
consider c este rezultatul unor interacii cooperative multiple. La organismele
superioare, cooperativitatea puternic a iniierii asamblrii complexelor este parial
responsabil pentru expresia genic specific tipului celular.
De exemplu, gena TTR codific transtiretina de la mamifere care se exprim
n hepatocite i n celulele plexului coroid. Transcripia genei TTR n hepatocite este
controlat de cel puin 5 factori transcripionali diferii:
- HNF1, o protein hepatic specific homeobox;
- HNF3, o protein hepatic specific winged-helix;
- HNF4, un receptor nuclear care este exprimat i n celulele epiteliale i
celulele tubulilor renali;
- C/EBP, un heterodimer bazic cu elemente Zipper care este exprimat i n
celulele epiteliale, celulele grase i n unii neuroni.
-AP1, o familie mic de proteine bazice zipper care sunt exprimate n toate
tipurile celulare.
Cu toate c trei dintre aceti activatori sunt exprimai i n alte tipuri celulare,
gena TTR nu este transcris n aceste celule. Aceasta deoarece ntregul set de
activatori este prezent numai n hepatocite. Toi activatorii trebuie s fie prezeni
pentru a contribui la asamblarea nalt cooperativ a complexului de iniiere a
promotorului TTR.
Diferite gene care codific proteine hepatice specifice, cum sunt albumina
seric sau alfa1-antitripsina, posed diferite aranjamente ale situsurilor de legare a
proteinelor i folosesc seturi de factori comuni dar nu identice. Cu toate acestea nu
numai factorii activatori sunt cei care dicteaz proportia i tipul proteinelor care vor fi
transcrise (de exemplu albumina este sintetizat in cantitate mult mai mare dect
transtiretina) deci mecanismele de reglare aexpresiei sunt mult mai complexe.

SLIDE 81. Structura complexelor mediator de la drojdii i de la om

(a) Imagine reconstituit a mediatorului de la S. Cerevisiae legat la Pol II. Imaginile
de microscopie electronic prezint structura tridimensional a Pol II n albastru
deschis asociat cu complexul mediator de la drojdie (albastru nchis).
(b) Reprezentarea diagramat a subunitilor mediatoare din celulele umane.
Subunitile reprezentate n aceeiai culoare se pare c formeaz un modul.
Subunitile n portocaliu, galben i verde sunt omoloage cu subunitile din modulul
170

de la drojdie. Studii de genetic, la drojdii au demonstrate c mutaii la nivelul unei

subuniti dintr-un modul inhib asocierea celorlalte subuniti n acelai modul u
restul complexului.
[Part (a) courtesy of Francisco J. Asturias, 2002, Mol. Cell 10:409. Part (b) adapted
from S. Malik and R. G. Roeder, 2000, Trends Biochem. Sci. 25:277.]

SLIDE 82. Modelul asamblrii cooperative a unui complex de iniiere

activat la nivelul promotorului TTR
Figura: Modelul asamblrii cooperative a complexului de iniiere a transcripiei la
nivelul promotorului TTR din hepatocite.
Patru activatori bine reprezentai n hepatocite plus factorul ubiqitar AP1 se
leag la situsurile specifice de la nivelul enhancerului i regiunea proximal
promotorului genei TTR. Domeniile de activare ale activatorilor legai interacioneaz
extensiv cu co-activatorii. Subunitile TAF ale TFIID, proteinele Srb/Mediator i
factorii generali de transcripie determin plierea ADN i formarea unui complex
activat stabil de iniiere. Datorit naturii nalt cooperativ a procesului de asamblare,
complexul de iniiere nu se formeaz la nivelul promotorului TTR din celulele
epiteliulu intestinal, care conin numai dou din cei patru factori transcripionali mai
bogat reprezentai n ficat. Muli dintre factorii generali de transcripie, proteinele
Srb/Mediator i ARN polimeraza II (Pol II) vor fi pre-asamblate ntr-un complex
holoenzimatic.

SLIDE 83. Represorii interfer direct cu iniierea transcripiei n mai

multe feluri
Figura: Diferiii represori de la eucariote pot inhiba transcripia prin mecanisme
care nu implic deacetilarea histonelor.
n cele trei mecanisme exemplificate mai sus, represorul fie inhib activarea
fie interfer direct cu formarea complexului de iniiere. n plus, unii represori
interacioneaz cu proteine co-represoare, care se consider c interacioneaz la
rndul lor cu factorii generali de transcripie pentru a inhiba iniierea.
Un represor este orice protein care interfer cu iniierea transcripiei cnd se
leag la un situs specific din structura ADN. Mai sus am artat c unii represori pot
direciona deacetilarea histonelor prezente n nucleosomii din apropierea situsurilor de
recunoatere a acestora. La rndul ei deacetilarea histonelor inhib interacia factorilor
generali cu situsurile de legare ADN represnd astfel transcripia. Totui, studiile care
demonstreaz c anumii represori sunt capabili s represeze transcripia in vitro, n
absena histonelor indic existena altor mecanisme de represie direct.
Dei mecanismele de represie nu sunt foarte bine nelese, unii dintre represori
acioneaz conform mecanismelor prezentate mai sus.
Dou dintre mecanisme presupun legarea competitiv dintre represor i
activator sau un factor general de transcripie. n ambele cazuri, legarea unei molecule
represoare la un situs ADN specific blocheaz legarea proteinelor necesare iniierii
transcripiei. Totui, n multe cazuri represorii eucariotici inhib transcripia fr a
interfera cu legarea unui activator sau a unui factor general de transcripie. n astfel de
cazuri, represorul legat poate interaciona cu un activator din imediata vecintate,
mpiedicnd funcionarea acestuia, sau cu factorii generali legai la promotor
mpiedicnd asamblarea acestora n complexul de iniiere.

171

SLIDE 84. Hormonii liposolubili controleaz activitile receptorilor

nucleari
Figura: Exemple de hormoni lipo-solubili care se leag la membrii superfamiliei
receptorilor factorilor de transcripie. Cortizolul este un hormon care se leag la
receptorul glucocorticoid (GR).
Asemeni altor hormoni steroizi, acesta este sintetizat din colesterol. Acidul
retinoic este un metabolit, derivat de la vitamina A care are efecte puternice asupra
dezvoltrii mugurelui limbic la embrioni i n rennoirea pielii la mamiferele adulte.
Ligandul pentru acidul retinoic este RAR (receptorul pentru acid retinoic). Tiroxina
este sintetizat din resturi de tirozin n proteina tiroglobulin la nivelul glandei
tiroide. Este un ligand pentru receptorul hormonului tiroidian (TR).
Activitile multor factori de transcripie sunt reglate de ctre hormoni care
funcioneaz ca semnale extracelulare n organismele multi-celulare. Hormonii sunt
secretai de un anumit tip celular i circul prin fluidele extracelulare pentru a aciona
asupra funcionrii celulelor situate n diferite regiuni ale organismului la distan
considerabil de locul sintezei lor. O clas de hormoni cuprinde molecule mici, liposolubile, care pot difuza prin plasm i membranele nucleare. Aa cum am discutat
anterior, aceti hormoni lipodo-solubili, incluznd muli hormoni steroidieni, retinoizi
i hormoni steroidieni, se leag i regleaz factori de transcripie specifici aparinnd
super-familiei de receptori nucleari.
Domeniul structural al receptorilor nucleari.
Clonarea i secvenializarea genelor care codific pentru muli receptori
nucleari au permis compararea secvenei n aminoscizi a acestora. Aceste studii au
evideniat o remarcabil conservare att a secvenei n aminoacizi ct i a diferitelor
regiuni funcionale ale diferiilor receptori nucleari. Toi receptorii nucleari posed o
regiune N-terminal de lungime variabil (100-500 aa) coninnd regiuni care
funcioneaz ca domenii de activare a transcripiei. Domeniul de legare la ADN este
localizat lng centrul secvenei primare i posed 4 motive C4 zinc finger.
Domeniul de legare a hormonului este localizat captul C-terminal al acestor receptori
i conine un domeniu de activare hormon-dependent. n unele cazuri domeniul de
legare a hormonului funcioneaz ca un domeniu represor n absena ligandului.

SLIDE 85. Domeniile structurale ale receptorilor nucleari

Figura: structura general a factorilor de transcripie din super-familia receptorilor
nucleari
Domeniul de legare a ADN localizat central manifest o considerabil
omologie de secven ntre diferiii receptori i are un motiv C4 zinc fingger.
Regiunea C-terminal de legare a hormonului prezint o omologie mult mai redus.
Regiunile N-terminale ale diferiilor receptori variaz ca lungime, au o secven unic
i pot conine unul sau mai multe domenii de activare. Aceast configuraie general a
fost determinat pentru receptorul estrogen (553 aa), receptorul pentru progesteron
(946 aa), receptorul glucocorticoid (777 aa), receptorul pentru hormonii tiroidieni
(408 aa) i receptorul pentru acid retinoic (432 aa).

SLIDE 86. Response elements sunt secvene de ADN care leag mai
muli receptori nucleari majori
Figura: secvene consens ale situsurilor ADN, numite elemente rspuns, care leag
receptorul glucocorticoid (GRE), receptorul estrogen (ERE), receptorul pentru

172

vitamina D (VDRE), receptorul pentru hormonii tiroidieni (TRE) i pentru acid

retinoic (RARE).
Repetiiile inverse din GRE i ERE i repetiiile directe din VDRE, TRE i
RARE sunt indicate prin sgei roii
Secvenele nucleotidice caracteristice ale situsurilor de legare din structura
ADN, numite elemente rspuns, care leag numeroi receptori nucleari majori au fost
determinate. Secvenele consens ale elementelor rspuns la glucorticoizi i estrogeni
sunt secvene repetitive inverse de 6 pb separate de oricare trei perechi de baze.
Aceste descoperiri sugereaz c aceti receptori ai hormonilor steroizi se vor lega la
ADN sub form de dimeri simetrici, aa cum s-a demonstrat deja prin cristalografie
cu raze X asupra receptorului homodimer al hormonului glucocorticoid.
Unele elemente rspuns ale receptorilor nucleari, cum sunt cele pentru
vitamina D3, hormonii tiroidieni i receptorii acidului retinoic, sunt secvene
repetitive directe ale aceleiai secvene recunoscute de ctre receptorul pentru
estrogen, separate de trei la cinci perechi de baze. Receptorii care se leag la astfel de
elemente rspuns direct repetitive ca i heterodimerii care conin un monomer comun
receptorilor nucleari numit RXR. De exemplu, elementul rspuns la vitamina D3 este
legat de ctre heterodimerul RXR-VDR i elementul rspuns la acidul retinoic este
legat de ctre RXR-RAR. Monomerii care compun aceti heterodimeri
interacioneaz unii cu alii ntr-un mod care face ca cele dou domenii de legare la
ADN s se lege la fel dar ntr-o orientare invers, permitnd heterodimerilor RXR s
se lege la repetiiile directe ale situsului de legare pentru fiecare monomer. n contrast,
monomerii receptorilor nucleari homodimeri (ex, GRE i ERE) au o orientare invers.
Informaii suplimentare
Receptorii steroidieni posed domenii pentru legarea ADN, legarea
hormonilor i activarea transcripiei
Hormonii steroizi sunt sintetizai ca rspuns la o varietate de activiti
neuroendocrine i exercit efecte majore asupra creterii, dezvoltrii esuturilor i
homeostaziei corpului n lumea animal.
Glandele adrenale secret peste 30 de steroizi, cele dou grupuri majore fiind
glucocorticoizii i mineralocorticoizii. n categoria steroizilor intr hormonii
reproductori (hormonii de sex masculin i hormonii de sex feminin). Vitamina D este
necesar pentru o bun dezvoltare a oaselor.
Ali hormoni cu structuri i funcii nenrudite pot aciona la nivel molecular n
mod similar hormonilor steroidieni. Hormonii steroizi i tiroidieni pot avea i ei un rol
important n metamorfoz (steroizii insectelor i hormonii tiroidieni de la broate).
Acidul retinoic (vitamina A) este o substan morfogen responsabil de
dezvoltarea axei antero-posterioare n timpul dezvoltrii mugurelui membrelor la pui.
Metabolitul su, acidul-9-cis retinoic se gsete n esuturi care sunt situsuri majore de
stocare i de metabolizare a vitaminei A.
Pe lng aceste diferite aciuni care presupun reglarea dezvoltrii corpului
trebuie s mai adugm i funciile de reglare a cilor de expresie genic. Aceti
compui diferii manifest un mod de aciune comun: fiecare reprezint o molecul
mic care se leag la un receptor specific care activeaz transcripia genelor.
(Receptorul poate s nu fie nominalizat: proteina este un receptor pentru un hormon
steroid sau tiroidian n acelai sens n care represorul lac este receptor pentru galactozid: nu este un receptor n sensul de protein legat de membran
(membranar) care este expus la suprafaa celulelor).
Despre interaciunea glucocorticoizilor cu receptorul lor se cunoate mai mult.
Un hormon steroid poate strbate membrana celular pentru a intra n celul prin

173

simpl difuzie. n interiorul celulei, glucocorticoidul se leag la receptorul

glucocorticoid. (Studiile pe receptorul glucocorticoid au fost realizate cu hormonul
steroid sintetic, dexametazon). Localizarea receptorilor liberi nu este pe deplin
clarificat; ei pot fi n echilibru ntre nucleu i citoplasm. Dar cnd hormonul se
leag la receptor, proteina este transformat ntr-o form activat cu o afinitate de 10x
mai mare pentru ADN ne-specific; complexul hormon-receptor este totdeauna
localizat n nucleu.
Receptorul activat recunoate o secven consens specific care identific
GRE, elementul rspuns la glucocorticoid. GRE este localizat tipic la nivelul unui
activator situat n vecintatea general a unei gene care rspunde la aciunea
glucocoiticoizilor. Secvena GRE poate fi poziionat la mai multe kilobaze n amont
sau n aval de promotor. Cnd complexul steroid-receptor se leag la activator, este
activat promotorul din vecintate (corespunztor) iar transcripia este iniiat.
Activarea activatorului furnizeaz mecanismul general prin care steroizii regleaz
un set larg de gene int. Aciunea corespunde formal modelului bacterian de inducere
a reglrii pozitive de ctre un reglator pozitiv (co-inductorul activeaz inductorul
proteinei).
Prin clonarea ADNc care codific receptorii hormonilor steroizi, au fost
deduse structurile proteinelor corespunztoare. Introducerea ADNc, care codific
pentru un receptor, ntr-o celul confer, n continuare, acelei celule capacitatea de a
rspunde la steroid prin activarea oricrei gene corelat cu unul dintre elementele
rspuns. Acest sistem poate fi folosit pentru a analiza proprietile receptorilor
codificai de ctre ADNc n care au fost introduse mutaii.
Receptorii diferitelor grupe de hormoni steroizi, hormoni tiroidieni, i acid
retinoic reprezint o nou super-familie de gene reglatoare, factori de transcripie
care rspund la liganzi (ligand-responsive transcription factors).
Toi receptorii prezint domenii independente de legare a ADN i a
hormonilor.
Pentru diferiii receptori steroizi domeniile centrale de legare a ADN sunt bine
corelate iar pentru ali receptori rmn identificabile. Anumii liganzi posed receptori
multipli care sunt strns corelai, cum este cazul celor trei receptori ai acidului
retinoic ( , i ) i a celor trei receptori ai acidului 9-cis -retinoic (RXR, , ).
Conversarea secvenei reflect probabil cerinele comune de legare la ADN, n timp
ce variaia este responsabil pentru selecionarea diferitelor secvene int. Actul
(procesul) de legare a ADN nu poate fi deconectat de capacitatea de activare a
transcripiei, deoarece mutaiile prezente n acest domeniu afecteaz ambele activiti.
Regiunile N-terminale ale receptorilor arat secvena minim conservat. Ele
includ alte regiuni necesare activrii transcripiei.
Domeniile C-terminale leag hormonii. Cele din familia receptorilor steroizi
prezint o nrudire de 30 la 57%, reflectnd specificitatea pentru hormonii individuali.
Relaiile cu ali receptori sunt minime, reflectnd specificitatea pentru o varietate de
compui: hormoni tiroidieni, vitamin D, acid retinoic etc.
Regiunea C-terminal regleaz activitatea receptorului, diferit pentru fiecare
tip de receptor individual n parte. Dac domeniul C-terminal al receptorului
glucocorticoid este eliminat, proteina N-terminal rmas este constitutiv activ:
aceasta nu mai necesit steroizi pentru activare (pentru activitate). Aceasta sugereaz
c, n absena steroidului, domeniul de legare a steroidului mpiedic receptorul s
recunoasc secvena GRE; acesta funcioneaz ca reglator negativ intern. Adugarea
hormonului steroid inactiveaz inhibiia, dnd posibilitatea receptorului s se lege la
secvena GRE i s activeze transcripia. Baza represiei poate fi intern, corelat cu

174

interaciunile cu o alt parte a receptorului. O alt ipotez este c represia poate fi i

rezultatul interaciunilor cu alte proteine, care sunt eliberate (deplasate) cnd se leag
steroidul.
Interacia dintre domenii este diferit n cazul receptorului pentru estrogeni.
Dac domeniul de legare a hormonului este nlturat, proteina este incapabil s
activeze transcripia, chiar dac continu s se lege la secvena ERE. Deci, aceast
regiune este mai degrab necesar s activeze dect s reprime activitatea.
Fiecare receptor recunoate elementele rspuns care sunt nrudite cu o
secven consens. Aa cum este prezentat n slide, aceste elemente rspuns au o
trstur caracteristic: fiecare consens const n dou secvene repetitive scurte (or
half sites=jumti de situs). Aceast structur sugereaz imediat c legarea
receptorului se face sub form multimeric, astfel nct fiecare jumtate a secvenei
consens este contactat de ctre o subunitate (reminescene ale interaciei operatorului
i represorului fagului ).
Elementele rspuns ale diferiilor receptori pot fi palindroame sau repetiii
directe n care jumtile de situs sunt separate de 0-4 pb a cror secven este
irelevant (nensemnat). Numai dou dintre aceste jumti de situs sunt folosite de
diferii receptori. Orientarea lor i distana dintre ele determin tipul de receptor
(receptorul) care va recunoate elementul rspuns. Acest comportament permite
elementelor rspuns, care au secvene consens limitate (restrnse) s fie recunoscute
specific de o varietate de receptori. Regulile care guverneaz recunoaterea nu sunt
absolute, dar pot fi modificate de context, i exist i cazuri n care elementele
rspuns palindromice (cu structur de palindrom) sunt recunoscute permisiv de mai
mult dect un receptor.
Receptorii se mpart n dou grupe:
1) Receptorii glucocorticoizi (GR), mineralocorticoizi (MR), androgen (AR) i
progesteron (PR) sunt toi homodimeri. Ei recunosc elementele rspuns ale cror
jumti de situs au o secven consens TGTTCT. Jumtile de situs sunt aranjate
sub form de palindroame, iar distana dintre situsuri determin tipul de element.
Receptorul pentru estrogen (ER) funcioneaz ntr-un mod asemntor dar are ca
jumtate de situs secvena TGACCT.
2) Receptorii tiroidieni (T3R), pentru vitamina D (VDR), pentru acid retinoic (RAR)
i pentru acid -9-cis-retinoic (RXR) formeaz heterodimeri, care recunosc jumti
de elemente a cror secven este TGACCT. Jumtile de situs sunt aranjate ca
uniti repetitive directe, recunoaterea lor fiind influenat de separarea lor dup cum
urmeaz:
1 pb RXR
3 pb VDR
4 pb T3R
5 pb RAR
Acest mod de recunoatere caracteristic celui de al doilea grup este valabil
pentru receptorii dimeri a cror prim subunitate este receptorul de pe list i cea de a
doua este format din RXR (n concluzie prima poziie de pe list este un
homodimer). Necesitile formrii unui heterodimer au fost descoperite deoarece
receptorii pentru acid retinoic i hormoni tiroidieni (RARs i TRs) se leag mult mai
eficient la situsurile int n prezena unui factor adiional, care se pare c este
reprezentat de RXR. Receptorul heterodimer rspunde ligandului prin intermediul
primei subuniti, i aparent nu necesit RXR pentru a cupla (lega) ligandul. Aceti
receptori pot forma i homodimeri care recunosc secvenele palindromice.

175

Acum suntem n situaia de a putea nelege bazele specificitii de

recunoatere. Recunoaterea secvenei unei jumti de situs se realizeaza prin
intermediul secvenei de aminoacizi caracteristic primului deget. Specificitatea de
formare a dimerului este dat de secvena n aminoacizi a celui de al doilea deget. Se
pare c formarea dimerilor determin probabil distana dintre subunitile care sunt
poziionate n curburile succesive ale fosei majore, controlnd astfel rspunsul la
distana dintre jumtile de situs.

SLIDE 87. Translocarea hormon-dependent a receptorilor

homodimeri
Figura: Demonstraie experimental c domeniul de legare a hormonului al
receptorului glucocorticiod (GR) mediaz translocarea ctre nucleu n prezena
hormonului.
Celule animale n cultur au fost transfectate cu vectori de expresie care
codific proteinele prezentate n partea de jos a imaginii. Marcarea imunofluorescent
a fost obinut cu un anticorp specific pentru beta-galactozidaz i folosit pentru a
detecta proteinele exprimate n celulele transfectate.
a) Cnd celulele au fost transfectate numai cu beta-galactozidaz enzima
exprimat a fost localizat n citoplasm n prezena i n absena hormonului
glucocorticoid dexametazon (Dex);
b) Cnd o protein de fuziune constnd din beta-galactozidaz i ntregul
receptor glucocorticoid de oarece de 974 aa (GR) a fost exprimat n celulele n
cultur, a fost prezent n citoplasm n absena hormonului dar a fost transportat n
nucleu n prezena hormonului.
c) O protein de fuziune compus dintr-o regiune de 382 aa a GR incluznd
domeniul de legare a ligandului (portocaliu) i beta-galactozidaz prezint, de
semenea, un transport ctre nucleu dependent de hormon.
Mecanismul de control hormonal al activitii receptorilor nucleari
Legarea hormonilor la receptorul nuclear regleaz activitatea acestuia ca factor
de transcripie. Aceast reglare difer sub unele aspecte ntre receptorii nucleari
heterodimeri i cei homodimeri.
Cnd receptorii nucleari heterodimeri (ex. RXR-VDR, RXR-TR i RXRRAR) sunt legai la situsurile lor de recunoatere din structura ADN, ei acioneaz ca
represori sau activatori ai procesului transcripional depinznd de tipul de hormon
care ocup situsul de legare a ligandului. n absena hormonului, aceti receptori
nucleari direcioneaz deacetilarea histonelor de la nivelul nucleozomilor situai n
vecintate. n prezena hormonului, domeniul de legare a hormonului sufer o
modificare conformaional drastic. Aceti receptori nucleari pot dirija
hiperacetilarea histonelor nucleosomilor vecini, reversnd n felul acesta efectele
represoare ale domeniului de legare fr hormon. Domeniul N-terminal de activare al
acestor receptori nucleari reacioneaz probabil apoi cu factori adiionali, stimulnd
asamblarea cooperativ a complexului de iniiere.
n contrast cu receptorii nucleari heterodimeri, care sunt localizai exclusiv n
nucleu, receptorii homodimeri se gsesc att n citoplasm ct i n nucleu, iar
activitatea lor este reglat prin controlul transportului lor din citoplasm n nucleu.
Translocarea hormon-dependent a receptorului homodimer glucocorticoid (GR) a
fost demonstrat prin experiene de transfecie conform figurii de mai sus. Domeniul
de legare a hormonului glucocorticoid (GR) singur mediaz acest transport.
Studii ulterioare au artat c n absena hormonului, receptorul glucocorticoid
este ancorat n citoplasm ca un agregat proteic mare complexat cu proteine
176

inhibitoare incluznd Hsp90, o protein nrudit cu Hsp70, proteina heat-shoc cea mai
mare. n aceast situaie, receptorul nu poate reaciona cu genele int; deci, nu apare
activare transcripional. Legarea hormonului elibereaz receptorul glucocorticoid de
ancora sa citoplasmatic, permitnd acestuia s intre n nucleu el se va lega la
elementele rspuns asociate genelor int. O dat ce receptorul la care este legat
hormonul interacioneaz cu elementul rspuns, el activeaz transcripia prin
determinarea hiperacetilrii histonelor i facilitarea asamblrii cooperative a
complexului de iniiere.
Receptorii orfelini
Liganzii pentru domeniile de legare a hormonilor ai multor membrii ai superfamiliei de receptori nucleari sunt nc necunoscui. De exemplu, HNF4, care este
implicat n expresia genei transtireninei n hepatocite. Majoritatea acestor proteine de
legare la ADN sunt denumite receptori orfani/orfelini, au fost descoperite prin
screening-ul bncilor de ADNc cu sonde specifice pentru secvenele nucleotidice
nalt conservate ale domeniilor de legare a ADN ale receptorilor nucleari. Rolul precis
al receptorilor orfelini i identificarea hormonilor necunoscui care se presupun c
regleaz activitatea acestora sunt nc subiecte importante de cercetare.

SLIDE 88. Model de activare hormon-dependent a genelor de ctre

receptorul glucocorticoid
Figura: Modelul de activare homon-dependent a genelor activate de ctre
receptorul glucocorticoid (GR).
n absena hormonului, GR este legat ntr-un complex cu Hsp90 n citoplasm
via domeniului su de legare (portocaliu). Cnd hormonul este prezent, el difuzeaz
prin membrana plasmatic i se leag la domeniul de legare GR, determinnd
modificri conformaionale n domeniul de legare a ligandului care elibereaz
receptorul de Hsp90. Receptorul cu ligandul legat este apoi translocat n nucleu unde
domeniul su de legare la ADN (portocaliu deschis) se leag la elementele rspuns,
permitnd domeniului de activare (verde) s stimuleze transcripia genelor int.

Diapozitiv 89. Hormonii polipeptidici semnalizeaz fosforilarea unor

factori de transcripie
Figura: Modelul de activare genic a IFNgama prin fosforilarea i dimerizarea
Stat1alfa.
JAK kinaza este activat cnd receptorul IFNgama dimerizeaz prin legarea la
IFNgama. Kinaza JAK activat fosforileaz un rest specific de tirozin din monomerii
Start1alfa n citoplasm. Stat1alfa fosforilat dimerizeaz, i dimerul fosforilat
transloc apoi n nucleu unde el se leag elementele rspuns corespunztoare,
promovnd transcripia genelor reglate de ctre IFNgama.
Hormonii polipeptidici semnalizeaz fosforilarea unor factori de transcripie
Dei hormonii lipo-solubili pot difuza prin membrana plasmatic i
interacioneaz direct cu factorii de transcripie din citoplasm sau nucleu, cea de a
doua clas major de hormoni, peptidici i proteici, nu poate. n schimb, aceti
hormoni funcioneaz prin legarea la receptori specifici de pe suprafaa celular, care
apoi transmit semnalul c au legat hormonul la proteinele din interiorul celulei, un
proces numit transducerea semnalului.
n multe cazuri, mecanismul prin care un semnal hormonal este transdus ntrun semnal de activare pentru factorii de transcripie implic fosforilarea. Un exemplu

177

simplu este furnizat de ctre interferonul gama (IFNgama), un hormon eliberat de

ctre limfocitele T-helper stimulate antigenic, care sunt critice n rspunsul imun.
Cnd IFNgama se leag la protein receptoare specific care este prezent la suprafaa
majoritii celulelor, acesta induce expresia unui numr de gene, producnd o stare
antiviral care scade susceptibilitatea celulelor la infeciile determinate de o serie de
virusuri. INFgama stimuleaz funcionarea altor celule care particip la rspunsul
imun. Pentru a analiza cum acest hormon determin inducia unui set specific de gene,
cercettorii au identificat mai nti elementul rspuns la la IFNgama i apoi au
purificat o protein din nucleii celulelor tratate cu IFNgama care se leag la aceast
secven. Proteina izolat are aproximativ 91 kDa i este numit Stat1alfa, pentru
signal transductor i activator al transcripiei.
Dup ce celulele n cultur au fost tratate cu IFNgama, activitatea de legare la
ADN a Start1alfa crete rapid, n paralel cu creterea transcripiei genelor inductibile.
Aceast inducere a activitii de legare a Stat1alfa apare chiar i n tratate cu un
inhibitor al sintezei proteice, indicnd c unele tipuri de modificri post-translaionale
ale proteinei pre-existente Stat1alfa activeaz activitatea sa de legare la ADN. Prin
marcarea (colorarea) celulelor cu anticorpi anti-Stat1alfa marcai fluorescent,
cercettorii demonstreaz c Stat1alfa transloc din citosol n nucleu n urma
tratamentului cu IFNalfa, cu cinetici similare cu cele ale inducerii genelor.
Analizele proteinei Stat1alfa din celulele tratate cu IFNgama demonstreaz c
tratamentul hormonal conduce la fosforilarea unui rest specific de tirozin din
structura proteinei. Mai mult, proteina fosforilat Stat1alfa formeaz homodimeri n
timp ce proteina nefosforilat este un monomer. Cnd restul critic de tirozin a fost
schimbat cu o fenilalanin prin mutagenez dirijat situs-dirijat, proteina mutant
Stat1alfa nu mai activeaz genele int ntr-un experiment de transfecie, i oprete
translocarea n nucleu.
Fosforilarea unor resturi specifice de serin i de treonin regleaz de
asemenea activitatea unui numr mare de factori de transcripie. Diferitele ci de
transducere a semnalului care regleaz factorii de transcripie vor fi prezentate mai
trziu (capitolul 20).
n unele cazuri (de exemplu Stat1alfa), fosforilarea factorilor de transcripie
liberi moduleaz activitatea sa de legare la ADN. n alte cazuri, (ex, CREB), factorii
de transcripie inactivi, monofosforilai se leag la secvenele de recunoatere din
structura ADN; fosforilarea modific apoi funcionarea domeniului de activare, astfel
nct proteina poate stimula transcripia.

SLIDE 90. Concluzii

Controlul transcripional la eucariote opereaz pe trei nivele:
i) modularea nivelelor i/sau activitilor activatorilor i represorilor;
ii) modificri n structura cromatinei determinate de activatori i represori;
iii) influena direct a activatorilor i represorilor n asamblarea complexelor
de iniiere;
Heterocromatina se refer la regiunile de cromatin condensat n care ADN
este relativ inaccesibil factorilor de transcripie i altor proteine, astfel nct expresia
genei este represat;
Represarea mediat a heterocromatinei apare la nivelul telomerilor i a locilor
implicai n conjugare la S. cerevisiae. Interaciile diferitelor proteine i hipoacetilarea
regiunilor N-terminale ale histonelor H3 i H4 sunt responsabile pentru represarea
structurii cromatinei n aceste regiuni;

178

Unii represori funcioneaz parial prin interacia cu complexele de deacetilare

a histonelor, avnd drept rezultat deacetilarea histonelor din structura nucleosomilor
situai n vecintate. Aceasta inhib interacia dintre promotorul ADN i factorii
generali de transcripie, represnd astfel iniierea transcripiei;
Unii activatori funcioneaz parial prin interacia cu complexele de
deacetilare a histonelor, avnd drept rezultat deacetilarea histonelor din structura
nucleosomilor situai n vecintate. Aceasta faciliteaz interacia dintre promotorul
ADN i factorii generali de transcripie, activnd iniierea transcripiei;

SLIDE 91. Concluzii

Factorii care remodeleaz cromatina determin disocierea tranzitorie a ADN
de miezul histonic printr-o reacie ATP-dependent i promoveaz astfel legarea
altor proteine necesare procesului de iniiere care se desfoar la nivelul anumitor
promotori ADN;
In vitro, combinarea activatorilor poate stimula asamblarea complexelor de
iniiere din vecinatatea promotorului. Se crede c acest efect direct al activatorilor
apare in vivo n urma acetilrii histonelor;
In vivo, asamblarea nalt cooperativ a complexului de iniiere necesit mai
muli activatori. O celul trebuie s produc un set specific de activatori necesari
pentru transcripia unei anumite gene n scopul reglrii expresiei acesteia;
Unii represori inhib competitiv legarea activatorilor sau factorilor generali de
transcripie. Alii interacioneaz direct cu factorii generali sau cu activatorii;
Activitile super-familiei recptorilor nucleari sunt reglate de hormonii liposolubili. Legarea hormonilor la aceti factori de transcripie induce modificri
conformaionale care modific interaciile lor cu alte proteine;
Activitile unor factori de transcripie sunt reglate prin fosforilare indus de
legarea hormonilor polipeptidici la receptorii lor situai la suprafaa celulelor.

SLIDE 92. Transcripia initiaiat de Pol I i Pol III este analog celei
realizat de Pol II
n continuare vom discuta procesul de iniiera a transcripiei realizat de alte
ARN polimeraze.
Totui, aceste sisteme, n particular reglarea acestora, sunt mult mai puin
cunoscute dect sistemele de transcripie de la E.coli. i cele patronate de ARN
polimeraza II.
Iniierea transcripiei realizat de Pol I i de Poli III este anolog cu cea de la Pol
II.
S ne reamintim c ARN polimeraza I (Pol I) este dedicat sintezei pre-ARNr,
iar ARN polimeraza III (Pol III) transcrie genele ARNt, genele ARNr 5S i genele
care codific multe alte molecule de ARN mici. Formarea complexelor de iniiere a
transcripiei care implic Pol I i Pol III este similar n unele privine cu asamblarea
realizat n cazul Pol II. Totui, fiecare din cele trei ARN polimeraze eucariote
nucleare necesit factori generali de transcripie specifici (sau de iniiere) care
recunosc diferite elemnete de control diferite. Pe de alt parte nici Pol I i nici Pol III
nu necesit hidroliza ATP pentru a iniia transcripia, n timp ce Pol II da.
Iniierea de ctre Pol I. Genele umane pentru pre-ARNr prezint dou
regiuni de control: un element core, care include situsul de start i care este esenial
pentru transcripie, este un UCE (upstream control element) de aproximativ 50 pb,
care ncepe la aproximativ 100 pb fata de situsul de start, i care stimuleaz
transcripia in vitro de aproximativ 10 la 100 ori. Dou proteine de legare la ADN
179

asist Pol I pentru a iniia i transcrie corect genele pre-ARNr. Primul dintre ele este
factorul de legare din amonte UBF (upstream bin ding factor), care se leag att la
UNC ct i la poriunea din amonte a elementului core, chiar dac se consider c
acestea au n aparen o secven puin similar. Factorul de selectivitate I (SL1), o
protein multimer se leag i stabilizeaz astfel complexul. Dup legarea
subunitilor SL1, Pol I se leag i iniiaz transcripia. Una dintre subunitile SL1
este TBP, aceeai protein cu cea care joac rolul central n iniierea Pol II.
Iniierea de ctre Pol III. Spre deosebire de genele care codific pentru
proteine i pre-ARNr, regiunile promotoare ale genelor pentru ARNt i ARNr 5S sunt
n ntregime n interiorul secvenei transcrise. Dou astfel de elemente promotoare
interne, numite box A i box B sunt prezente n toate genele pentru ARNt. Aceste
sevene nalt conservate nu funcioneaz numai ca promotori dar codific i dou
poriuni ale moleculelor de ARNt eucariot care sunt necesare sintezei de proteine. La
nivelul genelor ARNr 5S se afl numai o regiune de control intern numit cutia C,
care acioneaz ca un promotor.
Factorii generali de transcripie necesari lui Pol III pentru a iniia transcripia
genelor pentru ARNt i ARNr 5S au fost bine caracterizate la S. Cerevisiae. Doi
factori multimeri, THIIIC i TFIIIB particip att la iniierea ARNt i ARNr 5S la
drojdii. Asamblarea complexului de iniiere ale genelor ARNt ncep prin legarea
singular a TFIIIC la cutia A i cutia B. Interacia factorului TFIIIC cu TFIIIB l
direcioneaz pe acesta din urm s se lege la secvenele de aproximativ 30 pb situate
n amonte de situsul de start al transcripiei. Asamblarea complexului de iniiere al
genelor pentru ARNr 5S ncepe cu legarea celui de al treilea factor, TFIIIA i cutia C.
Apoi TFIIIC se leag la TFIIIA i este poziionat prin intermediul interaciilor
protein-protein ntr-o poziie similar fa de situsul de start ca i n cazul legrii
TFIIIC la genele pentru ARNt. TFIIIB interacioneaz analog cu TFIIIC i se leag
apoi la o secven ADN situat la aproximativ 30 pb, asemeni legrii la gena ARNt.
Jumtatea N-terminal a uneia dintre subunitile TFIIIB, numit BRF (pentru
TFIIB related factor), este similar cu secvena TFIIB (un factor al Pol II).
Similaritile sugereaz c BRF i TFIIB realizeaz o funcie similar n iniiere, adic
direcionarea polimerazei la situsul corect de start. O dat ce TFIIIB se leag att la
genele pentru ARNt ct i pentru ARNr 5S, Pol III se poate lega i iniia transcripia n
prezena ribonucleotidtrifosfailor Subunitatea BRF a TFIIIB interacioneaz specific
cu una dintre subunitile polimerazice unice pentru Pol III, aceasta fiind elementul
specific important pentru iniierea procesului de transcripie de ctre Pol III. Dup
legarea TFIIIB, TFIIIC poate fi nlturat fr a afecta iniierea realizat de ctre Pol
III. Astfel, TFIIIC se poate considera c ca fiind un factor de asamblare critic legarea
factorului de iniiere TFIIIB.
O alt subunitate din cele trei care compun TFIIIB i TBP, care este o
component a a factorului general de transcripie comun pentru toate cele trei ARN
polimeraze nucleare. Aceste descoperiri c TBP particip n iniierea transcripiei att
cu Pol I ct i cu Pol III au fost surprinztoare, deoarece promotorii recunoscui de
aceast protein nu conin TATA box. Pe de alt parte, studii recente indic c TBP
ca subunitate a TFIIIB interacioneaz cu ADN similar cu interacia cu TATA box.

SLIDE 93. Alte sisteme de transcripie

T7 i ali bacteriofagi nrudii exprim ARN polimeraze monomere
ADN mitocondrial este transcris de ctre ARN polimeraze care prezint
similariti cu enzimele bacteriofagilor sau bacteriene
Transcripia ADN din cloroplaste se aseamn cu transcripia bacterian
180

 Transcripia de la archaea este mai apropiat de transcripia de la eucariote

dect de cea de la bacterii
T7 i ali bacteriofagi nrudii exprim ARN polimeraze monomere
Bacteriofagul T7 domin complet sinteza macromoleculelor n gazdele sale de E.
coli timp de cteva minute dup transfecie. Toi ribozomii celulei realizeaz sinteza
exclusiv a proteinelor codificate de virus. Virusul realizeaz acest lucru prin
direcionarea iniial a sintezei ARN polimerazei codificat de virus, care nu
recunoate promotorii E. coli ci un set de promotori care inactiveaz ARN polimeraza
de la E. coli. n consecin cnd ARN polimeraza gazdei este inactivat, transcripia
genomului gazd se oprete; deoarece ARNm de la E. coli au o durat de via foarte
sczut, sinteza marii majoriti a proteinelor de la E. coli nceteaz curnd. T7 ARN
polimeraza iniiaz transcripia de la promotori care se suprapun cu situsrile de start
din ADN viral. Secvena de 23 pb a promotorului T7 este complet diferit de
promotorii de la E. coli.
T7 ARN polimeraza, un singur lan polipeptidic de 98 kDa, este cea mai
simpl ARN polimeraz cunoscut. Enzima este probabil cea mai simpl posibil
molecul proteic capabil s realizeze funciile unei ARN polimeraze: legarea
specific la promotori, iniierea, elongarea i terminarea. Deoarece virusul este
orientat s sintetizeze proteinele care formeaz capsula virionului la un nivel maxim,
T7 ARN polimeraza nu este reglat semnificativ. O astfel de ARN polimeraz foarte
activ i nereglat cum este T7 ARN polimeraza i cum sunt polimerazele
bacteriofagilor nrudii T3 i SP6 sunt foarte utile sintezei ARN in vitro i expresiei
sistemelor bacteriene.
ADN mitocondrial este transcris de ctre ARN polimeraze care prezint
similariti cu enzimele bacteriofagilor sau bacteriene
Mitocondria conine un genom ADN distinct i un sistem de sintez proteic
n interiorul membranei mitocondriale interne, n compartimentul cunoscut sub
numele de matrixul mitocondrial. Acest ADN codific un subset de proteine esenial
pentru principalelor funcii: sinteza ATP prin fosforilare oxidativ. ADNmt este
transcris de ctre ARN polimeraze care sunt codificate de ctre ADN nuclear. Acestea
sunt mult mai simple dect cele trei ARN polimeraze eucariote care transcriu ADN
nuclear i chiar de ctre polimerazelor sistemelor bacteriene actuale.
ARN polimeraza mitocondrial de la S. cerevisiae const ntr-o subunitate
polipeptidic de 145 kDa cu activitate polimerazic i un factor specific de 43 kDa
esenial pentru iniierea transcripiei la situsurile de start ADNmt. ARN polimeraza
mitocondrial purificat de la Xenopus laevis are o structur similar. Subunitatea
mare a ARN polimerazei mitocondriale de la drojdii este clar nrudit cu ARN
polimeraza monomer din a bacteriofagului T7 i din bacteriofagii similari. Totui,
enzima mitocondrial este distinct funcional de enzima din bacteriofagi n ceea ce
privete dependena sa de subunitatea mic pentru a iniia transcripia de al nivelul
situsului de start. Aceast subunitate mic este nrudit cu factorii sigma ai ARN
polimerazelor bacteriene care interacioneaz cu promotorul ADN. Astfel, ARN
polimerazele mitocondriale se pare c sunt structuri hibride ntre ARN polimeraza
simpl a bacteriofagilor i ARN polimeraza bacteriana posednd o complexitate
intermediar.
Similar cu ARN polimeraza din bacteriofagi, secvenele promotor recunoscute
de ctre ARN polimerazele mitocondriale includ situsul de start, o secven
promotoare bogat n care a fost bine caracterizat la drojdii, plante i animale.
Genomul mitocondrial uman, circular conine dou secvene promotoare nrudite de
15 pb, cte una pentru transcripia fiedcrei catene. Fiecare caten este transcris n

181

integritatea sa; primul transcript primer lungeste apoi procesat la molecule de ARNm,
ARNr i ARNt. O protein bazic de 22 kDa numit mtTF1, care se leag imediat n
amonte de cei doi promotori mitocondriali, stimuleaz foarte mult transcripia. O
protein omolog gsit n mitocondriile de drojdie este necesar pentru meninerea
ADMmt i are probabil o funcie similar.
Transcripia ADN din cloroplaste se aseamn cu transcripia bacterian
ADN circular existent n cloroplaste este considerabil mai mare dect ADNmt,
variind ntre 120 la 160 kpb la diferite plante. ARN polimeraza care transcrie ADN
din cloroplasteeste codificat de ctre acest genom. Enzima prezint subuniti care
au o omologie considerabil cu subunitile alfa, beta i gama ale ARN polimerazei
de la E. coli, dar aparent lipsete subunitatea echivalent factorului sigma de la E.
coli.
Unii promotori de la cloroplaste prezint reminescene ale promotorului
reconoscut de subunitatea sigma de la E. coli, avnd secvene similare n regiunile
10 i 35. Totui, transcripia unor promotori depind de secvene situate n regiunile
20 la +60, foarte diferii de majoritatea promotorilor de la E. coli. Acest promotor
poate fi recunoscut de o a doua ARN polimeraz care este cel mai adesea codificat
de genomul nuclear i important n organit. Analizele transcripiei din cloroplaste sunt
destul de puin dezvoltate, dar n acest moment este clar c cel puin un sistem de
transcripie prezint o omologie ridicat cu transcripia de la E. coli i de la alte
bacterii.
Transcripia de la Archaea este mai apropiat de transcripia de la eucariote
dect de cea de la bacterii
Archeobacterii constituie cea de a treia ramur n evoluia oranismelor, alturi
de bacterii i eucariote. Analize genomice recente sugereaz puternic c evoluia
ramurii bacteriilor din strmul comun nainte de desprirea archeobacteriilor i
eucariotelor dovedete c archeobacteriile sunt mult mai apropiate de eucariote dect
bacteriile.
Ca i bacteriile, archeobacteriile au o singur ARN polimeraz, dar aceasta
conine 13 subuniti distincte (chiar 14 la unele), o complexitate echivalent cu cea a
ARN polimerazelor eucariote. Secvena de aminoacizi dedus pentru 7 subuniti
arat o semnificativ omologie cu subunitpile eucariote, incluznd pe cele dou mai
mari, care sunt comune la toate trei ARN polimerazele nucleare. Totui, unele dintre
subunitile de la archeobacterii manifest o similaritate sczut cu alte secvene ale
subunitilor de la bacterii sau de la eucariote.
Dei archoebacteriile, ca i bacteriile, transcriu operoni n ARNm
policistronic, promotorii archeo sunt similari cu promotorii de la eucariote. O
secven promotoare consens bogat n A/T este poziionat la 26 pb n amonte fa
de situsul de start de la acrheobacterii. Ca i promotorii TATA box de la eucariote,
inseriile i deleiile din apropierea acestei secvene conduc la o pierdere a situsului de
start pentru meninerea spaiului din amonte fa de promotor. n plus,
archeobacteriile conin factori de iniiere cu o omologie nalt cu TBP i TFIIB. n
consecin, mecanismul iniierii transcripiei la archeobacterii este probabil similar cu
cel de la eucariote. n concluzie, se cunoate puin privind modul n care este reglat
transcripia la acest grup fascinant de organisme.

SLIDE 94.Asamblarea in vitro a complexului de iniiere a transcripiei

Pol I la drojdii
UAR si CF, factori transcripionali multimerici, se leag la un element
upstream (UE) i la elemental core, din promotorul ADN. TBP i un factor
182

monomeric (Rnr3p) asociat cu ARN polimeraza I (Pol I) particip i el la formarea

complexului de iniiere.. [Adapted from N. Nomura, 1998, in R. M. Paule,
Transcription of Ribosomal RNA Genes by Eukaryotic RNA Polymerase I, Landes
Bioscience, pp. 157172.]

SLIDE 95. Elemente de control transcripional transcrie de

polimerazele ARN
Att genele pentru ARNt, ct i pentru ARNr-5S, conin elemente promotor
interne (galben) localizate downstream de situsul de start i denumite A-, B- i C-.
Asamblarea complexului de trancripie la nivelul acestor gene ncepe cu legarea
factorilor de transcripie TFIIIA, TFIIIB i TFIIIC la Pol III, i legarea complexului
rezultat la elementele de control. Sgeile verzi indic interacii puternice, secvenaspecifice protein-ADN. Sgeile albastre indic interacii ntre factori de transcripie
generali. Sgeile mov indic interacii ntre factori generali de trascripie i Pol III.
[From L. Schramm and N. Hernandez, 2002, Genes Dev. 16:2593.]

SLIDE 96. Concluzii

Iniierea transcripiei de ctre Pol I este dirijat de ctre un element promotor
core, care se suprapune cu situsul de start, i o regiune de control situat n amonte
(UCE). Aceata necesit doi factori de transcripie generali, SL1 i UBF;
Iniierea transcripiei de ctre ARN polimeraza III este cel mai adesea dirijat
de ctre elemente promotoare interne. Doi factori generali de transcripie sunt
necesari pentru iniierea transcripiei ARNt (TFIIIC i TFIIIB); un factor suplimentar
(TFIIIA) este necesar pentru iniierea transcripiei genelor ARNr 5S;
Iniierea transcripiei de ctre toate cele trei ARN polimeraze nucleare
eucariote necesit un factor de transcripie specific general care conine TBP ca
subunitate;
Iniierea de ctre Pol I i Pol III nu necesit ATP spre deosebire de iniierea
realizat de Pol II care depinde de hidroliza ATP;
Bacteriofagul T7 i bacteriofagii nrudii exprim o ARN polimeraz
monomer simpl. Aceste polimeraze recunosc o regiune promotoare de 23 pb care
include situsul de start;
Mitocondria conine molecule circulare de ADN transcrise de ctre o ARN
polimeraz codificat nuclear compus din dou subuniti. O subunitate este
omolog cu ARN polimeraza simpl din bacteriofagul T7; cealalt se aseamn cu
factorii bacterieni sigma;
Cloroplastele conin ADN care este transcris de ctre o ARN polimeraz
codificat de cloroplast omolog cu ARN polimerazele bacteriane, cu excepia c
aceasta este lipsit de factorul sigma;
Archeobacteriile utilizeaz o ARN polimeraz format din mai multe
subuniti care se aseamn cu ARN polimerazele eucariote nucleare. Iniierea
transcripiei n celulele de archeobacterii necesit o protein, omolog cu factorul
eucariotic TBP, care se leag la un element promotor bogat n A/T situat imediat n
amonte fa de situsul de start i o protein omolog cu TFIIB. Aceste rezultate susin
ipoteza c eucariotele i acheobacteriile actuale au evoluat dintr-un strmo comun.

183

NOTE DE CURS BM4

PROCESAREA ARN, TRANSPORT NUCLEAR I CONTROL POSTTRANSCRIPIONAL


Silde 2.Elongarea ARN de ctre ARN polimeraza
Figura: Elongarea catenei ARN de ctre ARN polimeraz
n regiunea care va fi transcris, dublul helix este deschis (desfcut) cu
aproximativ un tur pentru a permite catenei sens s formeze un scurt segment hibrid
ADN/ARN dublu catenar cu captul 3 ARN. Cu ct ARN polimeraza avanseaz de-a
lungul matriei ADN (n dreapta), ADN este derulat n faa furcii de transcripie n
deplasare i re-rulat n spatele acestuia, elibernd astfel ARN nou sintetizat de catena
matri (antisens).
a) O cale poate s fie urmat este aceea n care ARN polimeraza urmeaz
deplasarea catenei matri astfel nct transcriptul va rmne ataat la nivelul elicei
duplexului;
b) O a doua posibilitate, mult mai plauzibil, este aceea c ARN se deplaseaz n
linie dreapt o dat ce ADN se rotete dedesubtul su. n acest caz ARN nu se va
rsuci n jurul ADN dar ADN va rmne suprarsucit n faa sa (luai n considerare
plasarea degetului ntre catrenele de ADN rsucit n acest model i npingnd ctre
dreapta). Modelul presupune c capetele ADN ca i ARN polimeraza sunt protejate de
ataamente n interiorul celulei.

Silde 3.Transcripia a dou gene ribozomale contigue la E. coli

Figura: O micrografie electronic i o reprezentare schematic care prezint dou
gene supuse transcripiei la E. coli.
Sgeile structurale rezultate o dat cu creterea lungimii lanurilor de ARN n
formare in timp ce moleculele de ARN polimeraza responsabile de sinteza se
deplaseaz de la situsul de iniiere a transcripiei ctre situsul de terminare din
structura ADN.

Silde 4. Micografie electronic a transcripiei i translaiei simultane la

E. coli
Figura: Micrografie electronic i reprezentare schematic a realizrii simultane a
transcripiei i translaiei unei gene de la E. Coli.
Moleculele de ARN polimeraza transcriu ADN de la dreapta la stnga n timp
ce ribozomii traduc moleculele de ARN n formare.

Silde 5. Legarea actinomicinei D la duplexul ADN

Figura: Structura determinat prin analize cu raze X a complexului format de
actinomicina D i duplexul ADN la nivelul unei secvene complementare
d(GAAGCTTC).
Complexul este redat sub forma unui model cu bile n care structura catenei
fosfat este prezentat n galben, bazele n alb i actinomicina D este colorat n funcie
de tipurile de atomi: C n verde, N n albastru i O n rou. Cele dou molecule de
ADN cu simetrie nrudit sunt prezentate vertical pentru a forma un pseudo-continuu
helix. Actinomicina D se leag la nivelu fosei mari a ADN. Actinomicina D este un

184

agent antineoplazic (anticancer) care este produs de ctre Streptomyces antibioticus,

inhib puternic transcripia i replicarea ADN probabil prin interferen cu trecerea
ARN i ADN polimerazei.

Silde 6. Terminarea Transcripiei

Exist mai multe mecanisme care regleaz terminarea transcripiei la
bacterii i celule eucariote
La bacterii principalele mecanisme implic ARN polimeraza, unul dintre
mecanisme necesitnd i factorul de terminare Rho
La eucariote, mecanismele pentru terminarea transcripiei difer pentru
cele trei tipuri de ARN polimeraze
Terminarea transcripiei ADNr
Deoarece transcripii pre-ARNr se termin n apropierea (proximitatea) sau
exact la extremitatea 3 a secvenei ARNr 28S, s-a crezut mai nti c aceast regiune
coninea un teminator recunoscut de ARN polimeraza I. Experienele ulterioare au
demonstrat c transcripia, in vitro, a genelor care codific ARNr continu dincolo de
extremitatea 3 a ARNr 28S matur. La Xenopus, transcripia se realizeaz dincolo de
regiunea care conine separatorul intragenic, i se termin la aproximativ 200 pb n
amont de inima promotorului pre-ARNr 35S urmtor; o clivare endonucleotidic
realizat dincolo de extremitatea ARNr 28S formeaz extremitatea 3. La drojdii,
transcripii care ncep la nivelul inimii promotorului, se termin la nivelul
separatorului intergenic, dincolo de ARNr 5S i la 300 pb n amont de nceperea
secvenei pre-ARNr urmtor.
La ADNr de oarece, terminarea transcripiei are loc ntre 550 i 600 pb
dincolo de extremitatea 3 a ADNr 28S. Semnalul de terminare a acestui sistem este o
secven
foarte
conservat
poziionat
pe
catena
sens
(5AGGTCGACCAATTANTCCG-3numit cutia SalI) i precedat, n general, de unul
sau mai multe grupe de pirimidine bogate n timin (T). Se gsesc 8 grupe de acest tip
ntre perechile de baze 500 i 1 200 plecnd de la extremitatea 3 a ADNr 28S, dar n
general terminarea se realizeaz n grupul T care precede cutia Sal I. Secvena
conservat de 18 pb poate ea nsi s determine terminarea, dar aceasta este mai
eficient i mai precis cnd cele 18 pb sunt precedate i urmate de grupuri
(fragmente) bogate n T. Deleii mici i inserii sau numai schimbarea unor perechi de
baze la nivelul segmentului de 18 pb, la fel ca i inversarea sa, duc la pierderea
activitii sale de terminator. Se consider c un aranjament destul de asemntor de
secvene repetitive conservate (5- GGGTTGACCA-3) furnizeaz probabil semnalul
de terminare a pre-ARNr la om. Secvene repetitive conservate (5-GACTTGC-3
precedate de grupri de T) exist n separatorii intergenici de la Xenopus, terminarea
realizndu-se cel mai adesea la nivelul secvenei repetitive care precede promotorul
situat la extremitatea 3 a regiunii separatoare.
Exist argumente indirecte care sugereaz c terminarea la nivelul acestor
situsuri depinde de fixarea unor proteine pe aceste situsuri specifice. Aceste indicaii
au fost confirmate prin demonstraia c unul sau mai muli factori proteici din
extractul nuclear se fixeaz de secvena de 18 pb. n acest caz, fixarea proteinei la
secvena de terminare a fost evideniat de protecia fa de digestie cu endonucleaz
III a unui fragment marcat la 5 i care coninea acest semnal. Principiul acestei
experiene este c digestia enzimatic a unui segment este oprit de proteina legat.
Trebuie s ne amintim c endonucleaza III diger ADN bicatenar pornind de la
extremitile 3. n aceste condiii vor rezulta fibre marcate n 5, care vor avea
lungimea determinat de locul n care digestia a fost blocat de proteina legat. Cum
185

fiecare caten poate fi marcat independent la captul su 5, se vor putea determina

cele dou limite ale secvenei blocate. n figura 8.18 este redat experimentul realizat
cu dou segmente care conineau secvene de terminare probabile (cutiile Sal I i
secvenele vecine cuprinse ntre 583 i 685 n aval de extremitatea 3 a ADNr 28S).
Se constat c profilul fragmentelor obinute n urma digestiei cu exonucleaza III este
alterat de o incubare prealabil n prezena unui extract nuclear. Alterarea profilului
de digestie indic c o protein (sau proteine) se leag la secvena cutiei Sal I.
Modificri la nivelul secvenei cutiei Sal I sau modificarea distanelor ntre cele dou
secvene mai conservate mpiedic legarea i afecteaz terminarea. n plus, dac un
oligonucleotid corespunztor secvenei consens a cutiei Sal I, este introdus ntr-o
unitate de transcripie a ARN polimerazei I, acesta favorizeaz, in vitro, terminarea
transcripiei. Proteina care se leag la cutia Sal I a fost purificat i mecanismul su de
aciune cunoscut (este n curs de desluire).
Cuplarea terminrii i iniierii transcripiei
O caracteristic original a secvenelor de terminare este c acestea sunt adese
situate imediat n amont de promotorii gene care codific pentru ARNr urmtor.
Astfel de secvene de terminare au fost detectate la aproximativ - 170 pb n raport cu
demararea transcripiei ADNr de la oarece, la - 185 n amont de regiunea control a
ADNr de la om i la - 200 n amont de regiunea control a ADNr de Xenopus. O
curiozitate o reprezint faptul c eliminarea sau modificarea acestor secvene de
terminare provoac o reducere marcant a transcripiei care demareaz la poziia + 1 a
nucleului promotor urmtor. Iniial, s-a presupus c un factor de terminare putea s
reacioneze cu un factor de iniiere sau cu ARN polimeraza I, sau c activarea putea fi
rezultatul localizrii favorabile a enzimei la nivelul unor situsuri de juxtapunere
apropiate promotorului ADNr. O alt explicaie este c terminarea mpiedic
polimerazele ocupate cu transcrierea s se rup complet de complexele de transcripie
care sunt asamblate n imediata vecintate a urmtorului promotor.
Numeroase ntrebri s-au pus privind transcripia genelor de ARNr, n
particular n ceea ce privete coordonarea expresiei acestor gene care codific pentru
ARNr, ARNr 5S i proteinele ribozomale. Implicaiile mecanice i reglatoare ale
prezenei elementelor promotoare, activatoare i de terminare ntr-o regiune
considerat nainte ca silenioas sunt de-a dreptul tulburtoare. Aceste descoperiri
pun de asemenea problema cunoaterii modalitilor de coordonare a terminrii i
iniierii transcripiei i a proprietilor expresiei genelor din clasele II i III. Din punct
de vedere biochimic este important izolarea i caracterizarea factorilor de transcripie
i de terminare astfel nct s fie posibil descifrarea complet a modului de aciune a
acestora pe baze moleculare.
Terminarea transcripiei de ctre ARN polimeraza III
Dac iniierea transcripiei de ctre ARN polimeraza III necesit secvene de
reglare complexe i mai multe proteine, terminarea nu necesit dect enzima i un
grup de resturi dezoxiadenilate la nivelul matricei. Terminarea este realizat perfect in
vitro cu o ARN polimeraz III nalt purificat i cu o matrice de ADN duplex. O
terminare corect i eficace se realizeaz chiar pentru genele din clasa III lipsite de
RCI, eliminnd astfel ipoteza c asocierea matriei cu TFIII A, B sau C pot juca un rol
n procesul de terminare. Au fost utilizate matrie de transcripie formate din ADN
clonat special pentru a ncerca definirea semnalului de terminare. Aceste experiene
au demonstrat c terminarea depinde de existena unui numr de resturi
dezoxiadenilate grupate pe catenele matricei i de secvenele situate de o parte i de
alta a acestui grup. De exemplu, patru dezoxiadenozine nconjurate de dezoxitimidin
nu determin terminarea eficace dar patru dezoxiadenozine flancate de o parte de CG

186

i de cealalt parte de GC (5-GCAAAACG-3), ca n ADNr 5S din celulele somatice

de Xenopus borealis, sunt un semnal de terminare eficace. Mutaiile care modific
numrul de resturi adenilate reduc eficacitatea terminrii. Sinteza ARN se oprete la
nivelul unui rest uridilat complementar unei adenine din grup. n acest caz nu par s
existe influene asupra terminrii nici din partea unor secvene deprtate i nici a unor
secvene secundare. Dac extremitatea 3 a ADNr 5S este eliminat din gena clonat,
transcripia este continuat pn cnd polimeraza III ntlnete un semnal adecvat n
secvena flancant a vectorului. Dac o serie de dezoxiadenozine este inserat la un
situs incorect din structura matricei unei gene din clasa III, terminarea se realizeaz
adesea la acest situs modificat.

Silde 7. Secvena ipotetic de baze care formeaz un terminator

eficient la E. coli
Figura: Secvena de baz a unui element ipotetic puternic (eficient) a terminatorului
de la E. Coli dedus din secvena mai multor transcripi.
a) Secvena ADN mpreun cu ARN-ul su corespunztor. Secvenele bogate n
A-T i G-C sunt prezentate n albastru i rou. Axa de simetria de pliere evideniaz
segmentele care flankeaz segmentele care formeaz o repetiie invers.
b) Structura su form de ac de pr i coada poli A care dirijeaz terminarea
transcripiei.

Silde 8. Terminarea Rho-independent apare la nivelul unor secvene

caracteristice ale ADN din E. coli
Figura: Secvena de terminare a operonului triptofanului trp, un situs independent
Rho.
Operonul triptofan, compus din cinci gene (n albastru), este urmat de o
secven de 36 pb la captul creia apare terminarea. Captul 3 al ARNm
corespunztor la care apare terminarea. Captul 3 al ARNm corespunztor prezint o
structur sub form de bucl bogat n GC care precede ultimile patru resturi U, o
trstur caracteristic a ARNm produs de gene cu situsuri de terminare Rho
independente. n general, situsurile de terminare bacteriene apar ntre operoni dar nu
ntre gene din interiorul unui operon. Din acest motiv, genele din interiorul unui
operon pot fi reglate coordonat, n timp ce cele din diferii operoni sunt reglate
independent

Silde 9. Terminarea prematur prin atenuare ajut la reglarea

expresiei unor operoni bacterieni
Figura: Atenuarea furnizeaz un mecanism secundar de control a expresiei
operonului Trp
Secvena Leader (L), care este localizat ntre operator (O) i prima gen
structural (E). Conine un situs atenuator (banda roie) la care transcripia este
terminat n funcie de concentraia citosolic a triptofanului. Regiunea promotoroperator-leader, care are o lungime de aproximativ 200 pb, nu este reprezentat la
scar cu genele structurale. AUG indic codonii start pentru translocarea secvenei
leader (rou) i aARNm pentru trpE (negru).

Silde 10. Mecanismul de atenuare pentru transcripia operonului trp

Figura: Mecanismul de atenuare a transcripiei operonului trp.

187

a) Diagrama celor 140 nucleotide ale ARN trp leader. Patru regiuni prezentate n
culori pot forma structuri sub form de bucl alternative, numai una dintre
acestea putnd duce la atenuare.
b) Translaia secvenei trp leader ncepe de la captul 5 imediat dup ce acesta
este sintetizat, n timp ce este realizat sinteza restului moleculei ARNm trp.
La concentraii crescute de trp, formarea buclei stem 3-4 urmat de o serie de
resturi U n 3 determin terminarea printr-un mecanism Rho-independent. La
concentraii sczute de Trp, regiunea 3 este sechestrat n bucla stem 2-3 i
nu se poate mperechea cu regiunea 4. n absena structurii sub form de bucl
necesar pentru terminare, transcripia secvenelor care codific trp continu.

Silde 11. Siturile pentru terminarea Rho dependent sunt prezente n

unele gene ale fagului i ale E. coli

Factorul Rho factor este o protein hexamer dispus de-a lungul unui
segment de 70 80 baze al transcriptului ARN n formare
Rho alunec apoi de-a lungul ARN n direcia 3 pn cnd acest desface
hibridul ARN-ADN de la nivelul situsului activ al ARN polimerazei
Dac transcripia este terminat sau dac nu depinde de factorul Rho, acesta se
elibereaz de pe ARN polimeraz
Siturile Rho dependente nu posed secvene consens clare i mecanismul de
terminare Rho dependent este caracteristic numai ctorva operoni

Silde 12. Cele 3 ARN polimerazele folosesc diferite mecanisme de

terminare
ARN polimeraza I realizeaz terminarea printr-un mecanism care necesit
factori specifici de terminare care se leag n aval de unitatea de transcripie
ARN polimeraza II conine semnalul de terminare la nivelul unei regiuni de
0.5-2 kb aparinnd situsului de adugare a cozii poli(A), iar terminarea este
cuplat cu procesul care cliveaz i poliadenileaz captul 3 al transcriptului
Transcripia realizat de ctre ARN polimeraza III este terminat dup
adugarea unei serii de resturi U
Dei se cunoate foarte puin despre terminarea transcripiei la eucariote
comparativ cu bacteriile, cteva trsturi de baz i similitudinile lor cu aceasta dar i
diferenele fa de terminarea de la bacterii este neleas.
Transcripia genelor pre-ARNr de ctre ARN polimeraza I este terminat printr-un
mecanism care necesit un factor de terminare specific polimerazei. Aceast protein
de legare la ADN se poziuioneaz n aval de unitatea de transcripie, diferit de modul
de legare a factorului Rho de la E. coli, care este un factor de terminare care se leag
la ARN.
ARN polimeraza III purificat realizeaz terminarea dup polimerizarea unei
serii de U; spre deosebire de terminarea Rho independent de la bacterii, totui,
terminarea realizat de ARN polimeraza III nu necesit o structur secundar sub
form de bucl stem situat n amonte n structura transcriptului ARN.
La majoritatea genelor de mamifere care codific pentru proteine, ARN
polimeraza II poate termina la situsuri multiple localizate la nivelul unei regiuni de
0,5-2 kb aparinnd situsului de agugare a cozii poli(A). Experimentele cu gene
mutante demonstreaz c terminarea cu procesul care cliveaz i poliadenileaz
transcriptul ARNm n formare la nivelul unor secvene specifice asociate cu domeniul
fosforilat carboxil terminal (elementele/domeniul CTD) ale ARN polimerazei dup

188

iniiere. Acest complex de clivare/poliadenilare poate suprima terminarea ct timp

secvena care semnalizeaz scindarea i poliadenilarea este transcris de ctre
polimeraz. Studii pe mutanii de drojdii indic c scindarea transcriptului n formare,
mai mult dect poliadenilarea, reprezint un eveniment critic care semnaleaz ARN
polimerazei s termine.
Aa cum am discutat anterior terminarea transcripiei la bacterii poate fi
reglat prin atenuare i prin mecanisme de antiterminare. Mecanisme analoge de
control, care implic o decizie ntre elongarea catenei i terminare apar la unele gene
transcrise de ctre ARN polimeraza II

Silde 13. Secvene la nivelul crora ARN polimeraza III termin

transcripia
Silde 14. Transcripia genomului virusului HIV este reglat printr-un
mecanism de antiterminare
Figura: Complexul de antiterminare compus din proteina HIV tat i multe proteine
celulare eucariote
Elementul TAR al transcriptului HIV conine secvene recunoscute de ctre
Tat i proteina celular ciclina T. Ciclina T activeaz i ajut poziionarea Cdk9, o
protein kinaz, lng substratul su, domeniul CTD al ARN polimerazei II.
Transcripia virusului HIV este reglat printr-un mecanism de antiterminare
Curent, transcripia genomului virusului imunodeficienei (HIV) de ctre ARN
polimeraza II furnizeaz cel mai bine neles exemplu de reglare a terminrii
transcripiei la eucariote. Exprimarea eficient a genelor HIV necesit a mic protein
viral codificat de locusul tat. Celulele infectate cu mutani tat- produc transcripi
virali scuri care hibridizeaz cu fragmente de restricie care conin regiuniule
proximale promotorului ADN HIV dar nu i cu fragmentele de restricie poziionate
mai departe n aval fa de promotor. n contrast, celulele infectate cu tipul slbatic
HIV sintetizeaz transcripi lungi care hibridizeaz cu fragmente de restricie
corespunztoare ntregii i singurei uniti de transcripie HIV. Astfel, proteina tat
funcioneaz ca un factor antiterminator, care permite ARN polimerazei II s citeasc
de-a lungul unui bloc transcripional, mai mult dect proteina N a fagului lambda.
Deoarece mecanismul de antiterminare coordonat de proteina tat este necesar pentru
replicarea HIV, nelegerea n viitoar a acestui mecanism de control poate oferi
posibiliti de determinare efectiv a unor terapii pentru rezolvarea sindromului de
imunodeficient dobndit (AIDS, Acquired immunodeficiency sindrom)
Asemeni proteinei N, proteina Tat este o protein care se leag la o secven
specific din structura ARN. Ea se leag la o copie ARN a unei secvene numite TAR,
care este localizat lng captul 5 al transcriptului HIV. Cai secvena mut din
transcripii lambda, TAR conine dou situsuri de legare: unul care interacioneaz cu
Tat i unul care interacioneaz cu o protein celular numit ciclina T. Structurile
secundare ale mut i TAR, inclus amndou o bucl stem, sunt analoge i trebuie s
fie intacte pentru ca s se produc legarea proteinei. Mai mult, domeniul de legare la
ARN al Tat, ca i cel al proteinei N, conine o regiune bogat n arginin.
Asa cum putem vedea n figur, proteina Tat a virusului HIV i ciclina T
celular se leaga cooperativ la ARN TAR. Interacia ciclinei T cu o protein kinaz
numit Cdks9 activeaz kinaza, al crei substrat este domeniul CTD al ARN
polimerazei II.

189

(Ciclinele sunt familii de proteine omologe care se leag i regleaz kinazele

dependente de cicline, sau Cdk. Funcia important a ciclinelor i a moleculelor Cdk
este reglarea diviziunii celulare).
Studiile de transcripie in vitro folosind inhibitori specifici ai Cdk9 sugereaz
c moleculele de ARN polimeraz II care iniiaz transcripia la nivelul promotorului
HIV termin dup transcrierea a aproximativ 50 de baze, numai dac CTD este
hiperfosforilat de Cdk9. Legarea cooperativ a ciclinei T i a Tat la secvena TAR la
captul 5 al transcriptului HIV poziioneaz Cdk9 astfel nct aceasta poate fosforila
domeniul CTD, prevenind astfel terminarea i permitnd polimerazei s coninue
elongarea lanului.
De remarcat c, Spt5 una dintre proteinele complexului ciclinei T-Cdk9,
posed o regiune a sec<venei de aminoacizi omolog cu NusG, una dintre proteinele
implicate n procesul de antiterminare dirijat de proteina N al bacteriofagului lambda.
Aceast omologie sugereaz c aceste similitudini n medcanismul de reglare a
elongrii de la bacterii la animale.

Silde 15. Procesarea ARNm de la eucariote

Figura: Schem general a procesrii ARNm la eucariote
La puin timp dup iniierea transcripiei de ctre ARN polimeraza II la primul
nucleotid al primului exon al unei gene, la captul 5 al moleculei ARN n formare se
adug 7-metilguanin: Transcripia realizat de ctre ARN polimeraza II se termin la
unul sau mai multe situsuri de terminare situate n aval de situsul poli(A), care este
localizat la captul 3 al exonului final. Dup ce transcriptul primar este scindat la
nivelul situsului poli(A), se adaug o prelungire format din A. Coada poli(A) conine
aproximativ 250 resturi la mamifere, 150 la insecte i 100 la drojdii. Pentru
transcripii primari cu puini introni, poliadenilarea, clivarea i splicingul urmeaz de
obicei terminarea. Pentru genele mari, cu un numar mare de introni, intronii sunt
adesea nlturai din pre-ARNm n formare nainte ca transcripia genei s fie
complet. De reinut c capionul rmne n moleculele de ARNm mature.
Informatii suplimentare
Terminarea transcripiei i poliadenilarea
Transcripia a numeroase gene eucariote se continu dincolo de locul n care
ARN este clivat pentru a se forma extremitatea 3 a ARNm matur. Terminarea are loc
la situsuri diferite care se ntind pe sute sau chiar mii de perechi de baze ADN. Astfel,
regiunea n care se oprete transcripia -globinei la vertebrate este situat la mai mult
de 1 kpb de situsul de poliadenilare. La fel, transcripia primelor dou gene n tandem
ale -globulinei de la mamifere se oprete n regiunea de separare de aproximativ 2
kpb care separ cele dou gene. Un exemplu i mai frapant este furnizat de
transcripia regiunii tardive a adenovirusurilor. n acest caz, transcripia continu
dincolo de cele cinci situsuri de poliadenilare nainte de a se termina la captul ADN
viral.
Din contr, anumite gene eucariote par s aib un semnal autentic semnal de
terminare a transcripiei. De exemplu, n gena gastrinei umane, semnalul de terminare
este situat la 193 pb n aval de situsul de poliadenilare. Aceast secven, care
dicteaz terminarea transcripiei, att in vivo ct i in vitro, este un segment bogat n
T, 5-T9A2T5AT4AT4AT5-3. Transcripia unui ADN care posed aceast secven
undeva de-a lungul secvenei sale se termin exact n 5 de acest semnal. O secven
similar, dar cu cteva diferene, este prezent n amont i n aval la mai multe gene
de vertebrate. Acest semnal care se presupune a fi de terminare i anumite secvene
190

bogate n T din genele de drojdii, 5-CAATCTTG-3 i 5- T5ATA-3, amintesc

semnalele de terminare dependente de dependente de la E. coli.
Independent de prezena semnalelor specifice de terminare, transcripia
depete aproape ntotdeauna situsurile de poliadenilare. n consecin, extremitile
3 poliadenilate trebuie s fie create prin clivare endonucleotidic urmat de
polimerizarea de resturi adenilate la nivelul hidroxilului 3 astfel format. Pentru
determinarea situsului de clivare sunt necesare dou secvene situate la distan mic.
Una dintre acestea cvasi-invariant, AATAAA, este localizat ntre 10 i 30 pb n
amont de un nucleotid CA n apropierea situsului de clivare-poliadenilare. nlocuirea
lui T cu G n AATAAA reduce puternic eficacitatea poliadenilrii dar cele cteva
extremiti formate sunt poliadenilate. nlocuirea ultimului A din secven cu G la
captul primei gene din tandemul celor dou care codific pentru -globulinei reduce
producerea normal a -globulinei. Aceast experien, la fel ca i altele, indic
necesitatea absolut a secvenei AATAAA. Totui, deoarece secvena AATAAA
exist i n regiunea codant a numeroase gene, unde nu exist poliadenilare, este
evident necesar o a dou secven pentru a provoca reaciile de clivare i de
poliadenilare. Localizarea acestui semnal a fost studiat examinnd efectul deleiilor
situate n vecintatea situsului de poliadenilare. Experienele demonstreaz c
secvena i poziia precis a acestui semnal variaz de la o gen la alta. n numeroase
gene de vertebrate semnalul cel mai probabil este un segment bogat n GT sau T, 5YGTGTGYY (Y fiind o pirimidin), situat cam la 25 pb n aval de situsul de
poliadenilare i adesea urmat la o distan variabil de o scurt secven de T.
n anumite circumstane situsurile autentice de poliadenilare pot s nu fie
efective. n maturarea ARNm tardiv al adenovirusului de tip 2, un singur situs de
poliadenilare din cinci poteniale este utilizat pentru producerea fiecruia din
transcripii primari. Abundena relativ a celor cinci clase de ARNm tardiv la
adenovirus reflect, n parte, frecvena cu care transcriptul primar este clivat i
poliadenilat la unul din situsurile sale caracteristice. n acest caz, abundena relativ a
moleculelor de ARNm produse plecnd de la transcriptul primar de modific n cursul
infeciei, indicnd c alegerea situsului de poliadenilare este controlat. Un al doilea
exemplu este cel de trecere de la producerea formei membranare la cea a formei
secretate n cazul imunoglobulinelor. Aceste dou forme difer printr-o regiune a
lanurilor lor grele. n acest caz poliadenilarea pre-ARNm la prima pereche de
semnale, cea care este folosit pentru formarea ARNm care codific forma secretat,
este suprimat; molecula de ARNm este tiat la semnalul urmtor producnd un preARNm care poate fi maturat pentru a da natere ARNm care codific forma
membranar. Deci, trecerea de la forma membranar la forma secretat rezult din
utilizarea reglrii difereniale a reaciei de poliadenilare. Fenomenul i modalitile
sale de control nu sunt deplin elucidate.
Secvena AATAAA a fost implicat i n terminarea transcripiei. Aceast
secven situat la extremitatea 3 a secvenei codante a -globinei majore de oarece
este necesar pentru terminarea care se realizeaz la o distan de 1,5 kb. n plus,
aceleai deleii i modificri care blocheaz poliadenilarea corect reduc i
eficacitatea cu care se realizeaz terminarea n aval. Aceasta sugereaz c
recunoaterea situsului de poliadenilare trebuie s se realizeze nainte de terminarea
transcripiei la secvena adecvat situat n aval. Ipoteza prin care consider c
complexul de transcripie nu achiziioneaz capacitatea de a realiza terminarea
transcripiei dect dup cea realizat transcrierea semnalului de poliadenilare constituie
o modalitate interesant de a asocia poliadenilarea i terminarea. Ea poate fi valabil
n cazul n care complexul de transcripie ar conine un factor care ar putea mpiedica
191

terminrile inoportune n timpul transcripiei matricei i l-ar pierde pe acesta la

trecerea peste semnalul de poliadenilare. Dac lucrurile s-ar petrece astfel, complexul
de transcripie lipsit de acest factor s-ar putea desprinde de matrice la nivelul
secvenei bogate n T pe care o ntlnete n continuare. Acest model este urmarea
studiilor realizate in vitro cu ARN polimeraz II purificat, care demonstreaz c
transcripia mai multor tipuri de matrice ADN se termin frecvent la nivelul
secvenelor bogate n T prezente n gen. Este posibil ca clivarea transcriptului la
semnalul de poliadenilare s permit unei ARN nucleaze sau unei proteine de tip s
se fixeze la polimeraz i s induc terminarea la nivelul secvenei bogate n T
prezent n aval.
Clivarea i poliadenilarea se pot realiza n diferite tipuri de extracte celulare
singura condiie fiind ca acestea s posede moleculele ARN substrat purttoare de
semnale adecvate. Studiile realizate in vitro cu astfel de sisteme au clarificat diferite
aspecte ale acestor reacii. Astfel, clivarea i poliadenilarea se pot realiza independent
una de cealalt. n prezena unor analogi ai ATP (ex. cordicepina, care este 3
dezoxiadenozin trifosfat), tierea (ruperea) se realizeaz la situsul exact dar nu este
urmat de poliadenilare. Poliadenilarea se poate realiza la nivelul radicalului oxidril
din 3 terminal care este precedat de o secven AAUAA. Fracionarea unui extract
de celule Hela care au capacitate de clivare i de poliadenilare a unui substrat ARN
furnizeaz multe fracii proteice care, mpreun, catalizeaz aceste dou reacii. Una
dintre componente este o poli A polimeraz, o alt fracie conine una sau mai multe
particule ribonucleoproteice nucleare mici (snRNP) i cea de a treia este o protein
(64 kD) care se leag la o regiune care conine secvena AAUAAA. Aceti trei factori
sunt necesari pentru a asigura cuplarea clivrii cu poliadenilarea, n condiiile n care
singur, poli A polimeraza poate realiza poliadenilarea unei catene de ARN clivat
corect. Cu toate c mecanismul nu este pe deplin elucidat se poate considera c
snRNP U11 mpreun cu proteina 64 kD i probabil cu alte snRNP pot forma un
complex n imediata vecintate a secvenei AAUAAA care asigur clivarea ARN i
permit o poliadenilare corespunztoare. Implicarea snRNP se bazeaz pe descoperirea
unor fragmente care conin secvena AAUAAA n imunoprecipitalelor obinute cu
anticorpi anti snRNP i pe inhibarea poliadenilrii, in vitro, realizat de aceti
anticorpi. Rolul snRNP n poliadenilare este coerent n maturarea ARN: U7 snRNP
este implicat n crearea extremitilor 3 ale ARNm de histone, U3 snRNP n
producerea extremitii corecte a ARNr 28S i U1, U2, U5 I U4/U6 n maturarea
pre-ARNm. Cum genelor de la drojdii i probabil de la celelalte eucariote inferioare le
lipsesc semnalul canonic de poliadenilare, AAUAAA, formarea cozii poli A poate fi
cuplat cu terminarea transcrierii. Secvene ca 5-T5ATAT, care favorizeaz
terminarea, pot fi utile n crearea extremitii 3 necesare poliadenilrii. Formarea
extremitii 3 poate fi i rezultatul clivrii endonucleotidice a unui trancript mai lung
urmat de poliadenilarea realizat de poli A polimeraza. Nu s-a stabilit nc dac la
drojdii intervin snRNP.

Silde 16. *Procesarea post-transcripional. Formarea coifului

ARNm de la eucariote
Figura: Structura capului la ARNm eucariot. Acesta este prezentat drept cap 0, cap
1 sau cap 3 dac nu prezint alte modificri ulterioare n funcie de poziia de
metilare a nucleozidului (n O2), sau dac primele dou nucleozide sunt O2
metilate.

192

Informatii suplimentare
Coiful
n afar de o excepie cunoscut (ARNm de la picornavirus) toate moleculele
de ARNm de la eucariote, celulare i virale, posed un coif la extremitatea 5.
Coifurile transcripilor nucleari i citoplasmatici ai polimerazei II sunt asociate cu
proteine care se leag specific. Pentru moment rolurile acestor proteine i ale coifului
nu sunt deplin clarificate. S-a stabilit totui c coiful interacioneaz specific cu
factorii de iniiere n asamblarea complexului de traducere.
Formarea coifului la extremitatea 5 a transcripilor polimerazei II are loc
imediat dup iniiere; chiar i moleculele de ARN cele mai scurte posed acest coif.
Unul dintre substratele enzimei care realizeaz adugarea coifului (guanil transferaza)
este GTP; cellalt este extremitatea difosfat creat prin eliminarea fosfatului terminal
al trifosfatului primului nucleotid al ARN n formare. n reacia de adugare a
coifului, fosfatul terminal al pre-ARNm este nlocuit cu gruparea guanil a GTP cu
pierderea a doi fosfai terminali din GTP. Nu se poate realiza reacia dac pre-ARNm
nu posed dect un monofosfat 5 terminal. Astfel coifurile marcheaz primul
nucleotid la nivelul cruia ncepe transcripia. Restul de guanidin adugat este
metilat n poziia 7 a ciclului purinei de ctre guanin-7-metil transferaza; radicalii
hidroxil 2 ai primelor dou nucleotide sunt apoi metilai de ctre 2-O-metil
transferaza. Gruparea 7-metil-GTP nu poate constitui substrat pentru reacia de
adugare a coifului. Moleculelor ARN U sunt li se adaug coiful n acelai mod; dar
n aceste caz metilrile ulterioare furnizeaz 2, 2 -7-trimetil guanozina la fel ca i
substituenii 2-O-metil prezeni la primele nucleotide ale transcriptului. Deoarece
moleculelor de pre-ARNm formate n extractul celular, sau cu ARN polimeraz II
purificat li se adaug coiful corect, activitile enzimatice responsabile sunt probabil
asociate polimerazei. Reaciile de iniiere ale procesului de adugare a coifului
realizate de ctre polimeraza II sunt probabil cuplate obligatoriu deoarece transcripii
nucleari formai de ctre ARN polimeraza III, care posed o extremitate trifosfat (ex.
ARN U6, ARNr 5S i pre-ARNt), nu sufer procesul de adugare a coifului. Ne
ntrebm care sunt parametrii care determin diferitele tipuri de coifuri ale pre-ARNm
i pre-ARN U.
Rolul coifurilor n timpul transcripiei i maturrii transcripilor primari n
ARNm nu este clar. De exemplu, rezultatele obinute privind implicarea coifului n
maturare sunt contradictorii. Este posibil ca coiful s aib un rol n formarea
complexelor nucleare de ribonucleoproteine (nRNP) n care moleculele de pre-ARNm
sunt sechestrate n timpul transportului ARNm n afara nucleului sau n asamblarea
particulelor ribonucleoproteice citoplasmatice (cRNP). Exist indicaii care sugereaz
c coifurile i proteinele asociate acestora asigur protecia moleculelor de ARNm de
o degradare care ar putea s demareze la extremitatea 5. Mai bine stabilit este
necesitatea coifului pentru ataarea ARNm de ribozomi nainte de demararea
traducerii. Unul dintre factorii de iniiere, eIF-4 E, este un factor de recunoatere
specific coifului n timpul asocierii subunitii 40S a ribozomului la extremitatea 5 a
ARNm. Se consider c eliminarea coifului unei molecule de ARNm mpiedic
traducerea sa in vivo. In vitro s-a dovedit c moleculele de ARNm care nu posed coif
pot fi totui traduse. Singura excepie cunoscut de la aceast exigen este ARN
genomic de la picornavirus (de ex. virusul polio) care funcioneaz ca ARNm pentru
toate proteinele codificate de virus. n plus, n celulele infectate de ctre virusul polio
se oprete sinteza proteinelor gazdei deoarece o protein viral inactiveaz proteinele
celulare legndu-se la nivelul coifului.

193

Silde 17. Captul 5 -cap este adugat moleculei n formare dup

iniierea transcripiei de ctre ARN polimeraza II
Figura: Adugarea coifului la transcripii ARNm n formare prin adugarea 7metil citozin
Primele dou reacii sunt catalizate de o enzim responsabil de adugarea
coifului care se asociaz cu domeniul CTD al ARN polimerazei II la scurt timp dup
iniierea transcripiei. Dou metil-transferaze diferite catalizeaz reaciile 3 i 4. Sadenozin metionina (S-Ado-Met) este sursa de grupri metil (CH3) pentru cele dou
etape de metilare; restul guanilat (G) este metilat primul, apoi hidroxilul din poziia 2
al primului sau primelor dou nucleotide (N) din transcript.

Silde 18. Pre-ARNm este asociat cu proteine hnRNP care conin

domenii conservate de legare a ARN
Figura: Vizualizarea hnRNP (heterogen nuclear ribonucleoproteine) asociate cu
transcripii n formare ntr-un ovocit de la Nophthalmus viridescens (triton)
O poriune a cromozomului n perie. ADN din axa cromozomului este
colorat n alb cu colorantul specific pentru ADN, DAPI. Filamentele lungi roii sunt
transcripi n formare legai cu hnRNP, care prezint fluorescen roie dup
colorarea cu un anticorp fa de proteine hnRNP.

Silde 19. Interacia unui motiv RNP la nivelul proteinei U1A i a ARN
Figura: Structura complexului format ntre un motiv RNP format din proteina U1A i
ARN
a) Diagrama unui motiv al domeniului RNP. Regiunile conservate RNP1 i
RNP2 sunt localizate n dou catene beta poziionate n mijloc;
b) Reprezentare a suprafeei complexului format din proteina U1a i ARN
determinat prin cristalografie cu raze X. ARN formeaz a bucl stem cu
poriunea monocatenar a buclei legat la suprafaa proteinei. Capetele C i N
terminale sunt orientate ctre dreapt ai stnga. Aminoacizii acizi sunt colorai
n rou i albatru respectiv.

Silde 20. Proteinele hnRNP pot fi implicate n procesarea i

transportul ARNm
Figura: Hibridizarea moleculelor de ARN in vitro accelerat de ctre proteinele
hnRNP.
Prezena structurilor secundare complexe n structura moleculelor de ARN,
hibridizarea ntre secvenele lungi complementare din molecule separate. Asocierea
dintre proteine hnRNP i ARN se consider c previne formarea structurilor ARN
secundare, facilitnd astfel mperecherea diferitelor molecule complemntare. Aceste
molecule pot avea funcii similare in vivo.

Silde 21. Pre-ARNm sunt scindate la situsuri specifice 3 i rapid

poliadenilate
Figura: Model de clivare i poliadenilare a ARNm n celulele de mamifere
Factorul specific de poliadenilare i clivare (CPSF) se leag la o regiune n
amonte AAUAAA de situsul de poliadenilare. CStF interacioneaz cu o secvenp din
aval bogat n GU sau U i cu CPSF legat, formnd o bucl n ARN; legarea CFI i

194

CFII ajut stabilizarea complexului. Legarea poli(A) polimerazei (PAP) stimuleaz

apoi clivarea la nivelul situsului poli(A), care este de obicei poziionat la 10-35
nucleotide n 3 fa de semnalul de poliadenilare din aval. Factorii de clivare sunt
eliberai, cai produsul de clivare din aval care este rapid degradat. Legarea PAP
adaug apoi aproximativ 12 resturi A la o rat sczut la gruparea hidroxil 3 generat
prin reacia de clivare. Legarea proteinei de legare PABII (Poli(A) binding protein la
coada poli(A) iniial scurt accelereaz rata de adugare catalizat de PAP. Dup
adugarea a 200-250 resturi, PABII semnalizeaz oprirea polimerizrii.

Silde 22. Etapa final de maturare: intronii sunt nlturai iar exonii
sunt sudai mpreun
Figura: Demonstraie c intronii sunt nlturai, prin tehnica electronomicroscopica
asupra hibrizilor ADN-ARN formai de adenovirusul ADN i ARNm care codific
hexon, o protein viral major.
Informatii suplimentare
Secvenele codante ale genelor eucariote (exonii) sunt frecvent ntrerupi de
ctre regiuni necodante (intronii). Aceast descoperire curioas a ridicat numeroase
ntrebri fundamentale.
1) Unde, cnd i cum au aprut intronii la nivelul genelor i care este rolul lor
n evoluie?
2) Cum transcripii primari ai acestor gene mozaic sunt transformai n
molecule ARN mature, lipsite de introni?
3) Care este influena procesului de excizie-epissage asupra reglrii expresiei
genelor?
4) Care este funcia, dac exist vreuna, intronilor n multitudinea operaiilor
care afecteaz genoamele contemporane. Sunt intronii vestigii ale evoluiei genelor i
au vreun rol n viaa organismelor contemporane?
Scopul nostru principal este de a expune ceea ce tim despre structura
intronilor, despre mecanismele prin care acetia sunt eliminai i despre influena
procesului de maturare asupra expresiei genelor eucariote.
Roberts i Sharp au obinut premiul Nobel pentru Fiziologie i Medicin n
1993, pentru descoperirea structurii discontinue a genelor.

Silde 23. *Electrono-micrografie care evideniaz formarea hibridului

pre-ARNm/ARNm
Figura: O micografie electronic i reprezentarea sa schematic privind formarea
unui hibrid ntre catena antisens a genei de ovalbumin de la pui (aa cum a fost
obinut prin clonare molecular) i ARNm corespunztor. Segmentele
complementare ale ADN (linia punctat roie) i ARNm (linia roie) au fost anelate
pentru a evidenia poziia exonilor. Segmentele care formeaz bucle externe (I la VII),
care nu au secvene suplimentare cu structura ARNm, sunt intronii.
Informatii suplimentare- Frecvena intronilor
Frecvena genelor n mozaic variaz foarte mult n funcie de speciile
eucariote. Acetia sunt foarte frecveni la vegetale i la animale i la virusurile care le
infecteaz. Intronii sunt mult mai rari n genele nevertebratelor (ex. Drosophila,
nematodele i ariciul de mare). Totui, mai multe gene care guverneaz morfogeneza

195

la Drosophila (ex. grupele Ultrabitorax i Antennapedia) prezint aranjamente

complexe de introni i exoni. Cea mai mare parte a genelor S. cerevisiae sunt lipsite
de introni (genele pentru actin i pentru alte cteva molecule de ARNt sunt excepii)
dar genele mozaic sunt mult mai numeroase la o specie nrudit numit
Schizosaccharomyces pombe. Cu toate c intronii sunt rari n genele nucleare, ei sunt
mult frecveni n genele mitocondriale ale acestei drojdii. La descoperirea lor s-a
crezut c genele mozaic sunt o caracteristic proprie genelor eucariote. Evidenierea
lor n gena timidilat sintetazei bacteriofagului T4 a demonstrat c aceast idee era
fals. De atunci, au mai fost descoperii introni i n gena care codific ARNtSer i n
gena pentru ARNr de la Archeobacterii, etc. Acum nu mai este surprinztor c
cercetri mult mai avansate evideniaz ali introni n genele procariotelor . Au fost
descoperii introni i la anumite bacterii.
Intronii exist n genele nucleare care codific pentru ARNm. ARNr (dar
numai n genele lungi pentru ARNr de la eucariotele inferioare) i pentru un grup de
gene care codific ARNt. De asemenea, intronii sunt frecveni n genele mitocondriale
i din cloroplaste, care codific pentru moleculele ARN mesager, ribozomic i de
transfer din aceste organite. Totui, n genele mamiferelor unde prezena intronilor
este o regul, exist i excepii. Cea mai mare parte a genelor pentru histone nu conin
introni, ca i cele dou familii de gene care codific pentru interferonii i , n timp
ce gena pentru interferon conine foarte muli. Nu se cunosc nc exemple privind
prezena intronilor n genele pentru ARNr 5S i 5,8S i nici pentru ARN U, 7SL i
7SK.
Diferite tipuri de introni
Toi intronii sunt transcrii ca pri integrante ale moleculelor precursoare de
ARN i sunt apoi eliminai printr-un proces de tiere-legare numit excizie-episaj.
Structura i mecanismele de episaj stau la baza clasificrii diferitelor tipuri de introni.
Not: Bazele sunt notate aa cum apar n structura ARN. Y reprezint o pirimidin i
indicele n indic un numr multiplu de pirimidine. R reprezint o purin. Literele
subliniate sunt bazele invariante i sgeile indic situsurile de tiere.

Silde 24. Secvene consens la nivelul a diferite tipuri de situsuri de

splicing
Silde 25. Splicing-ul se produce la nivelul unor secvene conservate,
scurte
Figura: Secvenele consens din jurul situsurilor de splicing 5 i 3 din structura
pre-ARNm de la vertebrate
Cu toate c bazele 5(GU) i 3(AG) sunt aproape invariabile n structura
intronului, totui bazele care le flancheaz pe acestea sunt prezente la frecvene mai
mari dect cele ateptate n cazul unei distribuii aleatoare. O regiune bogat n
pirimidin (albastru deschis) situat n apropierea captului 3 al intronului este
prezent n majoritatea cazurilor. Punctul de ramificare adenozinic, de asemenea
invariant este format de obicei de 20 la 50 baze n direcia 3. Regiunea central a
intronului, care poate fi cuprins ntre 40 pb i 50 kilobaze lungime nu este necesar
procesului de spicing.
Informatii suplimentare
Intronii genelor nucleare pentru ARNm - Intronii genelor nucleare care
codific pentru proteine, primii care au fost descoperii, au o mrime de la 10 pb la

196

10kpb. Intronii genelor omologe de la diferite specii de vertebrate pot s difere prin
lungime i secven asemeni intronilor din genele nenrudite. Mrimea exonilor pare
s se situeze n jurul valorilor de 52, 140, 223 i 229 pb, ultima fiind cea mai
frecvent. Exist i situaii (rare) n care lungimea intronilor este de 15 la 30 pb sau de
mai multe sute sau mii de pb. Caracteristicile cele mai comune ale intronilor sunt
secvenele din 5 (secvene situate n amont sau donatoare) i n 3 (n aval sau
acceptoare) adic jonciunile exon-intron sau situsurile de excizie-episaj.
Secvenele nucleotidice ale fiecrei jonciuni exon-intron sunt conservate
remarcabil n aproape toate genele nucleare pentru ARNm la aproape toate speciile
studiate. Secvena care flancheaz cel mai frecvent situsul de episaj din 5 este CRG
(unde R reprezint o purin), cea care formeaz captul din 3 fiind adesea
reprezentat de un singur G. Cele mai mari variaii se ntlnesc n secvenele care
nconjoar intronii, ns mutaii la nivelul acestor situsuri nu mpiedic niciodat
episajul, chiar dac exist cazuri n care poate fi afectat viteza. Structurile cele mai
puin variabile se gsesc n intron. Primele dou nucleotide ale extremitii 5 ale
intronului n ARN sunt aproape ntotdeauna GU (GC n cazuri excepionale);
urmtoarele cinci nucleotide nu sunt invariabile, cu toate c secvena AGAGU pare s
fie consensus. Modificrile lui nucleotidelor G sau U prezente la nivelul jonciunii
mpiedic, n general, realizarea episajului, n timp ce modificrile poziiilor adiacente
afecteaz diferit episajul. Cele ase nucleotide de la extremitatea 5 a intronului sunt
suficiente pentru situsul de episaj. Chiar i jonciunile criptice (ascunse), care nu sunt
folosite dect rar sau cnd situsurile dominante sunt pierdute sau modificate, posed
secvena GU la extremitatea 5 a fragmentului care trebuie eliminat. Captul 3 al
intronului se termin invariabil prin AG, foarte adesea precedat, n intronii de
mamifere, de o secven bogat n pirimidin (YnNYAG). i n acest caz mutaiile
care nlocuiesc invariabilele A sau G printr-o alt baz mpiedic episajul acestei
jonciuni.
Un rest A apropiat de extremitatea 3 a intronului este un participant esenial
la episajul moleculelor pre-ARNm. n intronii mamiferelor, poziia acestui A nu este
invariabil deoarece poate fi utilizat orice A dintre nucleotidele situate n poziiile 18
la 37 n amont de situsul de episaj. Totui, mutaii la nivelul secvenei vecine acestui
A (cel utilizat) provoac o important diminuare a eficacitii episajului in vitro;
astfel, cu toate c nucleotidul A esenial nu apare ntr-un context invariant, secvena
vecin influeneaz folosirea sa. Din contr, n cazul moleculelor de pre-ARN
nucleare de la drojdie, restul A este furnizat de un heptanucleotid , 5-UACUAAC-3,
situat ntre nucleotidele 6 i 59 n amont de situsul de episaj.
Prezena secvenelor consensus ale situsurilor de excizie-episaj nu semnific
ntotdeauna c intronul poate fi excizat. n anumite cazuri, una sau dou secvene ale
acestui situs sunt situate n exoni i n introni n locuri unde nu se produce n mod
normal excizie-episaj. Totui, astfel de situsuri criptice (ascunse) pot funciona n
anumite circumstane (ex., cnd situsurile autentice sunt modificate sau absente).
Ocazional, intronii posed mai mult de o jonciune 5 sau 3, permind
procese de excizie-episaj alternative. De exemplu, ntr-o regiune precoce a SV40 sunt
doi introni care au amndoi acelai situs 3 dar jonciunile 5 sunt diferite. Rezultatul
acestor procese de episaj alternativ duc la formarea a dou molecule de ARNm
plecnd de la acelai transcript primar. n anumite circumstane, alegerea episajului
este reglat n timp n funcie de esut. Adesea, situsuri de episaj exist dar nu sunt
folosite. Astfel, genoamele retrovirale provin din transcripi de ADN proviral care nu
au suferit excizie-episaj, dar producerea de ARNm care codific pentru anumite
proteine virale necesit excizie. n acest caz acelai transcript poate fi excizat sau nu.

197

Cum s-a menionat anterior, intronii pot conine alte elemente genetice, cum
sunt elementele activatoare (enhancers) ale altor gene, semnale de replicare i de
mpachetare a cromozomului sau secvene necesare asamblrii pre-ARNm n
particulele ribonucleoproteice (RNP).

Silde 26. *Etapele procesului de producere a ARNm matur (gena

ovalbuminei de pui)
Figura: Secvena etapelor de producere a ARNm eucariot aa cum se poate vedea
pentru gena ovalbuminei de la pui.
n urma transcripiei, transcriptului primar i se adaug capul i coada
poliA. Intronii sunt apoi excizai i exonii sudai mpreun pentru a forma structura
ARNm matur.
Informatii suplimentare
Splicingul intronilor moleculelor pre-ANRm nucleare
Studiul mecanismelor de splicing n cazul pre-ARNm nucleari a fost facilitat
de existena genelor mozaic clonate i n particular a formelor modificate natural sau
deliberat ale acestor gene. Substrate special preparate, prin fuziune de exoni i introni,
au ajutat mult la identificarea structurilor necesare pentru un splicing fidel. Cea mai
bun a fost ns abordarea biochimic, graie folosirii de extracte celulare capabile s
realizeze splicing i de asemenea purificarea elementelor mainriei acestei reacii.
Au fost utilizate substrate ARN purttore de coif; acestea au fost obinute prin
transcrierea matrielor ADN special preparate, inserate n aval de promotorul fagului
SP6 i utiliznd ARN polimeraza specific acestuia.
Caracteristici generale
Splicingul pre-ARNm nucleari are loc n nucleu, n acelai timp cu transcripia
pentru anumite gene sau dup transcripie pentru altele. Exist indicaii care sugereaz
c adugarea coifului la extremitatea 5 a transcriptului are implicaii asupra
procesului de maturare. Conceptual i practic, este foarte important s se cunoasc
cum o molecul pre-ARNm care conine mai muli introni poate fi maturat astfel
nct exonii vecini s poat fi asociai corect. Deoarece se tie c situsul 5 al unui
intron poate fi clivat n acelai timp cu situsul 3 al altuia, este foarte important s se
neleag cum, n cursul unei reacii normale, acest lucru poate fi evitat pentru a se
putea realiza un splicing alternativ.

Silde 27. Analiza produilor ARN formai ntr-o reacie de splicing in

vitro
Figura: Analiza produilor ARN formai printr-o reacie de splicin in vitro.
Un extract nuclear de celule Hela a fost incubat cu 497 nucleotide ARN
radiomarcate (n partea de sus) care conin poriuni din doi exoni (rou i roz) din
ARNm pentru beta-globin separai de un intron de 130 nucleotide (albastru). Dup
incubare perioade diferite de timp, ARN a fost purificat i supus electroforezei i
autoradiografiei n prezen de markeri ARN (linia M). Este indicat numrul de
nucleotide din diferite specii. Majoritatea moleculei iniiale de care migreaz mai
ncet (497 b) a fost corect maturat conducnd la un produs de 367 nucleotide.
Intronul excizat (aprox 130 b) migraz mai lent dect ne-am fi ateptat innd cont de
masa sa molecular, indicnd c nu este o molecul linear. De asenmenea, unul din
intermediarii reaciei (339 b) manifest o mobilitate electroforetic anormal de lent.
Analize suplimentare au indicat c n ambele cazuri intronul nu este o molecul

198

linear ci op molecul sub formp de laso. Banda de 252 b, un produa aberant n

reacia in vitro este mult redus n reaciile n care ARN posed structura cap.
Informatii suplimentare
Traseul reaciilor de splicing
n primul rnd vor fi discutate etapele de clivare i de legare care constituie
reaciile de splicing. Etapa iniial o constituie asamblarea unui complex de maturare
(splicing). Primii produi detectai in vitro sunt rezultatul clivrii la nivelul situsului
de splicing 5: unul conine exonul 5, cellalt intronul i exonul 3. Cum pentru nici o
specie de ARN nu s-a evideniat o alterare a produsului clivat la nivelul situsului 3,
nseamn c tierea la nivelul situsului 5 trebuie s precead decuparea situsului 3.
O dat ce reacia progreseaz se acumuleaz doi produi: exonii asociai corect i
intronul complet liber. Att produsul clivrii iniiale i intronul excizat conin o
structur n loso asemntoare celei descrise pentru intronii mitocondriali de tip doi
obinui prin auto-splicing. Structura n laso a fost pentru prima dat sugerat de
mobilitatea electroforetic anormal a intronului eliberat, de incapacitatea sa de a
servi drept matri pentru realizarea unei transcripii inverse pornind de la un punct
apropiat de extremitatea 3 i de rezistena acestuia la digestie complet cu mai multe
ribonucleaze. Structura a fost apoi confirmat prin izolarea ribonucleotidelor
punctului de ramificare (nchidere a lasoului). Acesta conine ntotdeauna, indiferent
de intronul eliberat, fosfatul 5 al guanozinei de la nivelul jonciunii intronului
asociat printr-o legtur diester cu hidroxilul din poziia 2 al unei adenozine. A fost
astfel explicat existena neateptat a unor molecule de ARN nuclear care posedau o
ramificare pornind de la hidroxilul 2 al unui rest adenozil.

Silde 28. Mecanismul de splicing presupune dou reacii de

transesterificare
Figura: splicingul exonilor din molecula pre-ARNm apare prin intermediul a dou
reacii de transesterificare.
n prima reacie, legtura ester dintre griparea 5-fosfat a intronului i oxigenul
din 3 (rou) al exonului 1 este schimbat pentru o legtur ester cu oxigenul 2
(albastru nchis) al restului A de ramificare. n cea de a doua reacie, legtura ester
dintre fosforul din 5 al exenului 2 i oxigenul 3 (albastru deschis) al intronului este
schimbat pentru o legtur cu oxigenul 3 al exonului 1, elibernd intronul sub forma
unei structuri in laso i resudnd cei doi exoni. Sgeile arat unde atomii de oxigen
din gruprile hidroxil activare reacioneaz cu atomii de fosfor.

Silde 29. Secvena reaciilor de transesterificare implicare n unirea

exonilor
Figura: Secvena reaciilor de transesterificare care aduc mpreun exonii
moleculelor de pre-ARNm (exonii i intronii sunt desenai n albastru i portocaliu; R
i Y reprezint purina i pirimidina):
1) Gruparea 2-OH a unui intron specific A atac nucleofil gruparea 5-fosfat de la
captul 5 al captului intronilor pentru a ajunge la o structur sub form de laso;
2) Gruparea 3-OH eliberat formeaz o legtur 3-5-fosfodiester cu restul terminal
5 a exonului 3 , determinnd astfel unirea celor doi exoni i eliberarea intronului sub
form de laso.

199

Silde 30. Moleculele de small nuclear RNAs (snRNAs) asist reacia

de splicing
Figura: Diagrama interaciilor dintre pre-ARNm, U1ARNsn i U2ARNsn n procesul
de splicing-ul timpuriu
Regiunea 5 a U1ARNsn iniial mperecheate cu nucleotide la captul 5 al
intronului (albastru) i captul 3 al exonului din 5 (rou nchis) al pre-ARNm;
U2ARNsn se mperecheaz cu o secven care include punctul de ramificare A, dei
acest rest nu este mperechiat. n figur este prezentat secvena punctului de
ramificare de la drojdii. Structurile secundare ale ARNsn care nu sunt alterate n
timpul splicingului sunt prezentate sunt form de linii diagramate. Dreptunghiurile
roii reprezint secvene care leag proteine snRNP recunoscute de ctre anticorpii
anti-Sm. Din motive necunoscute, antiserurile de la pacieni cu boli autoimune
sistemice cum este lupus eritematos (SLE) conin aceti anticorpi. Aceti anticorpi
au fost utili n caracterizarea componentelor reaciilor de splicing.

Silde 31. Spliceozomul complex ribonucledoproteic compus din multe

molecule de snRNPs
Figura: Micrografia eloectronic a unui spliceozom
Extractele din celulele HeLa au fost amestecate cu pre-ARNm pentru betaglobulin; reacia a fost ntrerupt nainte ca splicingul s fie complet, astfel nct s
poat fi purificat spliceozomul care conine RNPsn i pre-ARNm.
Informatii suplimentare
Asamblarea spliceozomilor
Deoarece splicingul are loc la nivelul spliceozomilor apare necesitatea
cunoaterii structurii, asamblrii i mecanismelor de aciune ale acestora. Particulele
de splicing izolate dintr-un amestec de reacie n care clivarea n 3 a fost inhibat,
sunt de form elipsoidal i cu dimensiuni de 25 x 50 nm. n particular, intronul este
asociat fiecruia dintre snRNP U1, U2, U4/U6 i U5. Spliceozomii funcionali conin
i alte proteine i n particular pe cele care sunt implicate n legarea snRNP la intele
lor care sunt normal fixate pe structura pre-ARNm nuclear.
O secven minimal a exonului este necesar legrii snRNP la intron. Dup
schema actual de asamblare a spliceozomilor, se leag primele particulele snRNP U1
la funciunea 5, chiar dac exist sau nu situsuri funcionale pentru fixarea, n
continuare, a snRNP U2 i U5; dar aceast singur legtur este insuficient pentru a
provoca clivarea situsului 5. Prima legare este apoi urmat de asocierea snRNP U2.
U5 i U4/U6, asociere care necesit ATP. Legarea snRNP U2 la situsul su de pe
intron se bazeaz pe mperecherea de baze; n timp ce ncorporarea complexului
snRNP U4/U6 i U5 n spliceozom depinde de interaciile dintre snRNP. O schem
asemntoare este valabil pentru asamblarea particulelor de splicing pentru preARNm de la drojdii. Dup legarea exonilor evoluia spliceozomului este incert, dar
snRNP sau sub-ansamble ale acestora sunt probabil reciclate atunci cnd ARN
intronic este degradat. Acest mers al reaciilor reprezint a secven posibil dar nu
obligatorie a asamblrii spliceozomilor. Pentru a fi mult mai siguri este necesar
analiza relaiilor precursor-produs. Modelul nu explic cum se realizeaz clivarea
situsului 3', cum se realizeaz legarea exonilor i nici de ce acesta este limitat la
exonii adecvai.

200

Silde 32.Ciclul de aciune la nivelul spliceozomului

Figura: Ciclul de splicing al sliceozomului
RNPsn implicate n splicing (U1, U2, U4, U5 i U6) asociate cu pre-ARNm
i ntre ele ntr-o anumit ordine secvenial n scopul formrii spliceozomului.
Acest complex ribonucleoproteic catalizeaz apoi cele dou reacii de
transesterificare care au ca rezultat splicingul (sudarea) exonilor (rou nchis i
deschis) i eliberarea intronului (albastru) sub forma unei structuri laso. Cu toate c
pentru reaciile de transesterificare nu este necesar hidroliza ATP, se consider c
acesta este necesar pentru a furniza energia necesar rearanjamentele structurii care
apar n timpul ciclului. De reinut c proteinele snRNP din structura spliceozomului
sunt distincte fa de RNPhn discutate anterior. La eucariotele superioare asocierea
U2ARNsn cu pre-ARNm este asistat de o protein RNPhn numit U2AF, care se
leag o regiune baogat n pirimidin situat lng situsul 3 de splicing. De asemenea
U2AF acioneaz probabil i cu alte proteine necesare pentru splicing prin intermediul
uni domeniu care conine repetiii dipeptidice serin-arginin (motivul SR). Punctul
de ramificare A din structura pre-ARNm este indicat cu caracter rou boldit.

Silde 33. Auto-splicing-ul intonilor de grup II furnizeaz indicii

pentru evoluia snRNPs
Figura: Diagrame schematice care compar structurile secundare de auto-splicing
ale intronilor de grup II (a) i UARNsn prezent n spliceozomi (b).
Prima reacie de transesterificare este indicat prin sgei negre; ce a doua
reacie prin sgei albastre. Punctul de ramificare A este prezentat boldit.
Similitudinile acestor structuri sugereaz c structurile ARNsn evolueaz din introni
de grup II, cu aceste ARNsn care acioneaz n trans i este funcional analog cu
domeniile corespunztoare intronilor de grup II.
Informatii suplimentare
Splicing autacatalitic sau catalizat de spliceozomi
Rezultatul final al splicingului intronilor din grupa II i a pre-ARNm este
acelai: intronul eliberat sub form de laso i cei doi exoni vecini unii ntre ei. n
plus, mecanismul reaciilor celor dou procese este asemntor. n cele dou cazuri,
hidroxilul 2 al intronului servete drept centru nucleofil pentru realizarea clivrii
situsului 5 i un hidroxil 5 al exonului situat n amont este centrul nucleofil care
cliveaz situsul 3 pentru a forma legtura exon-exon. Diferena cheie este c anumii
introni din grupa II sunt automaturai in vitro, n timp ce splicingul pre-ARNm
nucleari necesit o mainrie elaborat format din mai multe snRNP i proteine
accesorii. Totui, anumii introni din grupa II necesit maturaze pentru reacia in vitro
cu toate c nucleotidele i centrele catalitice implicate n cele dou procese sunt
aceleai. Presupunnd c splicingul autocatalitic necesit o repliere foarte specific a
ARN, maturazele ar fi necesare pentru stabilirea i stabilizarea unei structuri care
permite transesterificri secveniale adecvate. Astfel, singura diferen ntre cele dou
mecanisme ar fi maniera n care intronul achiziioneaz conformaia sa catalitic
activ.
Aceleai condiii sunt valabile pentru splicingul catalizat de ctre particule.
Este posibil ca snRNP i factorii asociai s creeze un eafodaj pe care intronul s
poat fi corect pliat, astfel nct cele dou jonciuni i punctul de ramificare s fie
juxtapuse i active. n acest sens, implicarea spliceozomilor n splicingul pre-ARNm
nucleari, este analog celei a maturazei pentru intronii din grupa II. Ne putem ntreba
de ce replierea pre-ARNm nucleari necesit un astfel de complex n timp ce numai
201

maturaza este suficient pentru anumii introni din grupa II. Rspunsul se poate gsi
n complexitatea maturrii care trebuie s se realizeze. Intronii mitocondriali din
grupa II se aseamn fiecare posednd mai multe secvene foarte conservate. Una sau
dou proteine sunt probabil suficiente pentru a realiza i a menine conformaia activ
a intronilor. Problema este evident mult mai complex pentru pre-ARNm nucleari
dat fiind diversitatea de mrime i de secven a acestora i deci i numrul de
introni. O singur protein nu ar putea determina adoptarea unei conformaii active
pentru toi intronii. Particulele snRNP, foarte conservate se pot mperechia cu dou
sau trei secvene conservate prezente n toi intronii, pot interaciona ntre ele i pot
impune o conformaie care favorizeaz cele dou transesterificri catalizata de ctre
ARN.
Alt tip de auto-splicing
Intronii din grupa II din structura moleculelor de pre-ARNm mitocondriale de
la drojdii posed i ei secvene conservate i structuri secundare definite dar aceste
sunt distincte de cele caracteristice intronilor grupei I. i intronii din grupa II sunt
supui procesului de auto-splicng dar , din pcate, cunotinele noastre sunt mai
reduse n ceea ce privete structurile secundare i teriare ale acestor substrate, i
privind detaliile moleculare ale reaciei de maturare. Sunt clare dou puncte ale
acestui mecanism: 1) contrar reaciilor de automaturare pe care le suport intronii din
grupa I, maturarea intronilor din grupa II nu necesit un nucleotid iniiator i 2)
produsul de reacie are o structur de laso.
Ca i n cazul intronilor din grupa I, procesul de auto-splicing implic dou
etape de transesterificare, una n urma clivrii la nivelul situsului 5, i cealalt pentru
clivajul situsului 3 i legarea celor doi exoni. Totui, diferena fundamental const
n natura atacului nucleofil: guanozina pentru intronii din grupa I i hidroxilul 2
aparinnd unui nucleotid al intronului n cazul intronilor din grupa II. Structura n
laso rezult din realizarea unei nou legturi 2-5 fosfodiester n mijlocul secvenei
ARN.
Structura tridimensional a intronului, spontan sau facilitat de proteine
asociate, trebuie s aduc hidroxilul 2 al lasoului n apropierea situsului de splicing
5 i s activeze transesterificarea. Alegerea legturii internucleotidice care este
clivat depinde probabil de secvenele, specifice grupei II, GUGCG prezent la
extremitatea 5 i secvena YAU prezen la extremitatea 3 a intronului. Acest
mecanism se aseamn cu cel folosit la maturarea pre-ARNm nucleari. Necesitatea
particulelor ribonucleoproteice care acioneaz n trans pentru realizarea splicingului
intronilor din pre-ARNm este datorat faptului c procesul, n acest caz, este mult mai
complex i specific diferitelor tipuri de pliere a diferitelor specii de pre-ARNm,
necesare asigurrii splicingului corect la nivelul jonciunilor exon-intron.

Silde 34. Secvenele elementelor conservate n mai muli introni din

clasa I
Slide 35. Auto-splicing-ul intronilor de grup 1 - ARN catalitic
Figura: Mecanismele de splicing ale intronilor din grupul I i din grupul II
automatisabili i spiceozomul care catalizeaz splicingul ARNm.
Intronul este marcat n albastru i exonii care urmeaz a fi matisai n rou.
In intronii din grupul I, un cofactor guanozinic (G) care nu face parte din catena ARN
se asociaz cu situl activ. Gruparea hidroxil 3al acestei guanozine particip la o
reacie de transesterificare cu fosfatul de la captul 5 al intronului. Aceast reacie
este analog cu cea care implic gruparea hidroxil 2 a situsului de ramificare A din
intronii de grup I i din intronii pre-ARNm matizai n spliceozomi.
202

Transesterificarea urmtoare care leag capetele 5 i 3 ale celor doi exoni este
similar n toate cele trei mecanisme de splicing . De reinut c intronul de grup I se
elibereaz sub forma unei structuri lineare spre deosebire de produii ramificai din
celelalte dou cazuri.
Autosplicingul intronilor din grupa I.
Splicingul intronului pre-ARNr de la Tetrahymena, care reprezint prototipul
grupei I, se realizeaz printr-o serie de transesterificri concertate n cursul crora
fosfoesterii sunt schimbai fr hidroliz intermediar. Cu excepia etapei de iniiere,
favorizat de prezena guanozinei libere sau a nucleotidelor sale, toate grupele
reactive implicate n transesterificare sunt coninute n secvena intronului. n plus,
specificitatea de schimb a legturilor este o consecin a organizrii tridimensionale a
intronului, rezultat din mperecherea ntre secvene distante dar conservate ale
intronului.
Prima etap a splicingului este legarea guanozinei la o secven a intronului.
Perechea de electroni liberi ai hidroxilului 3 ai guanozinei poate provoca un atac
nucleofil asupra fosfatului jonciunii exon-intron 5 (-UpA-) provocnd clivarea
acestui situs. Hidroxilul 3 creat la situsul de clivare (extremitatea 5 a exonului)
reacioneaz cu fosfatul 3 al jonciunii, provocnd legarea celor doi exoni i
eliberarea intronului linear, de 413 nucleotide. Segmentul de intron linear suport apoi
alte dou transesterificri intramoleculare i hidrolize, cu eliberarea mai nti a 15
nucleotide i apoi formarea intronului final prin eliberarea altor 4 nucleotide. Trebuie
s reinem c reaciei globale nu i este asociat nici o modificare net de energie:
fiecare rupere a unei legturi fosfodiester fiind compensat prin formarea
concomitent a unei alte legturi fosfodiester.
Guanozina sau unul dintre derivaii ei 5 fosforilai, este specific iniierii
reaciei de splicing. Modificarea gruprilor hidroxil 2 sau 3, sau potenialului de
mperechere a guanozinei cu un rest de citozin, modific (altereaz) capacitatea de
iniiere a splicingului. Evident, mperecherea guanozinei cu un rest complementar al
intronului este important pentru poziionarea corect a hidroxilului 3 al guanozinei
i pentru reacia sa cu fosfatul 5 al jonciunii.
Cele dou jonciuni exon-intron sunt probabil apropiate una de alta pentru a
permite legarea celor doi exoni dup clivarea iniial realizat de guanin. Acest
proces este uurat de replierea intronului astfel nct cele dou jonciuni s se poat
suprapune, probabil, n vecintatea situsului de legtur al guanozinei. O posibilitate
este ca, n intron, o anumit secven s fie capabil s se mperecheze cu o secven a
exonului situat la fiecare jonciune. Prezena unei astfel de secvene ghid intern ar
permite reacia gruprii hidroxil 3, creat prin clivarea jonciunii exon-intron 5 de
ctre guanozin, cu fosfatul 3 al situsului de splicing pentru a forma produsul
matisat. Restul G care termin intronul i nucleotidele adiacente acestuia determin
situsul de splicing 3. Modificrile conformaionale n intronul linear eliberat se
presupune c faciliteaz circularizarea i eliberarea de mici oligonucleotide.
Mecanismul de autosplicing evideniat pentru gena ARNr de la Tetrahymena
este aplicabil i altor introni din grupa I. Acetia posed cu toii 4 secvene conservate
(A, B, 9L i 2) i alte dou secvene neconservate 9R i 9R (tabel 8.5 i figura 8.75).
Aceste 6 elemente apar ntotdeauna n aceeai ordine: 5-9R-A-B-9L-9R-2-3. n
plus, cea mai mare parte a intronilor din grupa I posed i o secven care poate servi
drept ghid intern. Mutaii care mpiedic splicingul au fost evideniate i caracterizate
la drojdii i ciuperci. Astfel de mutaii modific n general posibilitatea mperecherii

203

bazelor. Astfel, de exemplu, inactivarea splicingului determinat de modificarea

secvenelor 9R sau 9R este reversibil prin schimbri compensatorii n alt secven.
Splicingul in vitro al anumitor introni din grupa I aparinnd genelor
mitocondriale de drojdie pentru pre-ARNm depinde de aceleai secvene conservate
ca i cele care sunt necesare splicingului pre-ARNr de la Tetrahymena, produii de
reacie fiind analogi. Totui, aceti pre-ARNm nu sufer procesul de auto-splicing in
vitro. Splicingul acestor introni depinde de proteine, care acioneaz n trans,
codificate de aceleai gene sau de gene nrudite, de ctre secvene de lectur deschise
constituite din exoni i introni. Aceste proteine, maturaze, nu sunt prezente dect
pentru o perioad scurt de timp i par s favorizeze replierea intronului din structura
pre-ARNm ntr-o conformaie care permite splicingul. Aceasta explic de ce mutaiile
fr sens (non-sens) sau alunecarea fazei de lectur n secvena intronului care
codific pentru maturaz, mpiedic splicingul acestui intron ca i pe cel al intronilor
din grupa I caracteristici altor gene mitocondriale. Acest model explic i de ce
mutaiile supresoare sau care conin o alunecare de faz, care readuc la normal
producerea maturazei restabilesc i splicingul corect. Plierea corect a anumitor
introni din grupa I este spontan i stabil in vitro n timp alii necesit proteine pentru
formarea i/sau stabilizarea structurii active autocatalitic. Exist i posibilitatea ca
diverse interacii proteine-proteine s aib rol n pliere.
Splicingul n trans
Reaciile de splicing trecute n revist pn n prezent sunt intramoleculare i
sunt deci reacii n cis. Se pune problema existenei unor procese de splicing
intermolecular deci despre care putem considera c se desfoar n trans. Mai
specific, se pune problema dac doi exoni situai pe molecule de ARN separate se pot
asocia cu eliminarea concomitent a intronilor pe care i conin. Existena acestui
proces de splicing intermolecular a fost demonstrat in vitro utiliznd substrate ARN
special preparate. S-a stabilit c splicingul in trans este o etap esenial n producerea
celular a tuturor moleculelor de ARNm la Trypanosoma i a trei din cei patru ARNm
ai genelor actinei de la C. elegans. Primul exemplu de splicing in trans n care erau
implicate uniti transcripionale situate pe cromozomi diferii a fost descris n cazul
proto-oncogenei c-myb (Vellard et al, Oncogene, 1991). n fiecare caz, situsurile de
clivare sunt de tip clasic, GU la jonciunea 5 i AG n poziia 3, produsul fiind i el o
structur ramificat (laso).
Pentru demonstrarea splicingului in trans au fost utilizate dou modele
experimentale. n primul, exonul 5 i intronul care l flancheaz fac parte din aceeai
molecul de ARN, iar exonul 3 i intronul asociat cu acesta pe o a doua caten ARN
(lan ARN). mperecherea bazelor complementare ntre secvenele celor dou
segmente intronice are loc cu o eficacitate de 15% (n extractele celulare) fa de
rezultatele obinute n cazurile n care intronii sunt pe aceeai molecul de ARN.
Deci, nici existena structurilor secundare nici ntreruperea covalent a intronului nu
mpiedic splicingul.
Cea de a doua experien se bazeaz pe prezena secvenelor complementare la
nivelul a doi introni necesare pentru ntlnirea (apropierea) moleculelor de ARN
maturabile (supuse procesului de splicing), n aceast configuraie este posibil
obinerea a patru produi: doi formai prin splicingul n trans i doi prin splicing in
cis. Rezultatul splicingului in vitro al acestui substrat este formarea produilor de
reacie trans 5 adeno-adeno 3 i cis 5 globin-adeno 3. Se obin produii cis 5
adeno-globin 3 i trans 5 globin-globin 3, dar n cantiti reduse probabil din
cauza apropierii bazelor mperechiate de punctul de ramificare.

204

Formarea ARNm al actinei funcionale i a multor alte molecule de ARNm de

la C. elegans se realizeaz prin splicing n trans (trans-splicing). n cazul actinei,
coiful i primele 22 nucleotide ale ARNm provin dintr-un transcript de 100 nucleotide
obinut plecnd de la ADNr 5S situat pe un cromozom diferit. Totui, exemplul cel
mai bine studiat de splicing in trans este cel de formare a ARNm de la Trypanosoma.
Toate moleculele de ARNm de la tryponosoma conin o secven 5 identic de 35
nucleotide, netradus, care preced o secven codant ntrerupt. Aceti mini-exoni
5 provin de la extremitatea 5 a unui ARN de 137 nucleotide transcris plecnd de la
sute de copii n tandem ale unui segment de ADN de 137 pb. Un splicing n trans
asociaz mini-exonul 5 de 35 nucleotide cu un ARN al crui exon codific pentru o
protein cu un alt ARN formnd o molecul de ARN ramificat. n etapa urmtoare,
situsul de maturare 3 este clivat i cei doi exoni sunt reunii. Segmentul ramificat,
coninnd secvenele intronilor de la dou molecule de ARN separate, este apoi
tiat de o enzim care realizeaz deramificarea (debranarea) rezultatul fiind
separarea intronilor care erau asociai celor dou molecule de ARN. n exemplul
analizat mai sus trebuie remarcat: 1) secvena situat imediat n aval de mini-exonul
de la Trypanosoma este conform cu secvena consens 5(GUAUGA), 2) jonciunea
intronului asociat cu exonul codant este analog secvenei 3 a situsurilor de excizie
([C/Un NNAG) 3) un nucleotid al intronului reprezint punctul de ramificare,
sugernd c mecanismele de splicing n trans i n cis sunt analoge. Pentru moment
modul de realizare a complexului de splicing, pentru dou molecule de ARN separate,
nu este pe deplin elucidat.

Slide 36. Auto-splicingul pre-ARNr de la Tetrahymena

Figura: Auto-splicingul pre-ARNr de la Tetrahymena thermophila
Informatii suplimentare
Intronii din grupa I au diferite localizri. Ei apar n gene care codific pentru ARNr n
nucleul eucariotelor inferioare cum sunt Tetrahymena thermophila (un ciliat) i
Physarum polycephalum (viermele de noroi sau rma). Ei sunt comuni n genele
mitocondriale ale fungilor. Prezena lor la nivelul a trei gene din genomul fagului T4
extinde ntinderea lor evolutiv pn la procariote. Intronii au fost pierdui n
ntregime de eubacterii, iar aceste gene prezente la T4 sunt unicul exemplu unde
splicingul este necesar la eubacterii. Intronii din grupul una au comune dou
proprieti:
1) ARN izolat are capacitatea de a se matura singur, reacie numit selfsplicing (auto-maturare sau auto-splicing). Proprietatea nu este unic deoarece se
ntlnete i la intronii din grupa II. n vitro reacia de maturare se realizeaz prin selfsplicing n timp ce in vivo aceasta trebuie asistat de proteine.
2) Un intron din grupa I se poate organiza ntr-o structur secundar distinct,
cu 9 (stem-loop) bucle pe structur (bucle pe tij). Unele dintre aceste bucle sunt
generate prin reacia dintre secvene consensus scurte. Lungimea intronilor din grupa
I variaz larg, secvenele consensus fiind localizate la o distan considerabil de
jonciunile implicate n splicing.
Auto-splicingul a fost descoperit ca o proprietate a transcripilor genelor
ARNr de la T. thermophila. Genele pentru cele dou forme majore de ARNr au
organizarea obinuit, n care ambele sunt exprimate ca o parte a unei uniti comune
de transcripie. Produsul este un precursor ARN 35S care posed secvena pentru

205

molecula mic de ARNr n regiunea 5, i secvena pentru molecula ARNr mare (26S)
ctre captul 3.
La anumite tulpini de T. thermophila, secvena care codific ARNr 26S este
ntrerupt de un singur intron mic. Cnd precursorul 35S este incubat, in vitro,
splicingul apare ca o reacie autonom. Intronul este excizat (eliminat) de pe precursor
i se acumuleaz ca o form linear de 400 pb, care este apoi convertit ntr-o form
circular. Reacia necesit numai un cation monovalent, un cation divalent un
guanidin nucleotid ca cofactor. Nici o alt baz nu poate substitui guanina, fr a fi
neaprat necesar prezent unui trifosfat (se poate utiliza la fel de bine GTP, GDP,
GMP sau chiar guanozin liber). Nucleotidul guanilic trebuie s posede gruparea 3OH liber
Parcursul nucleotidului guanilic poate fi urmrit prin marcare radioactiv.
Radioactivitatea iniial intr i elimin intronul linear. Restul G rmne legat de
captul 5 al intronului printr-o legtur fosfodiester normal. n proces apar trei
reacii de transfer. n primul transfer, nucleotidul guanilic se comport ca un cofactor
care furnizeaz 3-OH liber la captul exonului. Al doilea transfer implic o reacie
chimic similar, n care acest 3-OH atac cel de al doilea exon. Cele dou
transferuri sunt conectate; nu au fost observai exoni liberi, deci legarea lor trebuie s
apar ca o parte a aceleiai reacii n care se elibereaz intronul. Intronul este eliberat
ca o molecul linear, dar cel de al treilea transfer l transform n una circular.
Fiecare stadiu al reaciilor de auto-splicing constau ntr-o transesterificare, n
care un ester fosfat este convertit direct n altul fr hidroliz intermediar. Datorit
legturilor care sunt schimbate direct, energia este conservat, deci reacia nu necesit
energie din hidroliza ATP sau GTP
Dac fiecare dintre reaciile consecutive de transesterificare nu implic o
modificare net de energie, de ce reacia de splicing se realizeaz complet n loc s
apar un echilibru ntre produii maturai i precursor? Concentraia GTP este relativ
mare fa de cea a ARN, i astfel reacia este orientat nainte. Reacia invers este
prevenit de modificrile structurii secundare a ARN.
Sistemele in vitro nu includ proteine care s fie absolut necesare automaturrii ARN. ARN formeaz o structur secundar/teriar specific n care
gruprile relevante sunt juxtapuse astfel nct nucleotidul guanilic se poate lega la un
situs specific, astfel nct s fie apoi posibil reacia de rupere i de reunire. Dei
reacia poate fi realizat numai de ARN, se pare c in vivo acesta este asistat de
proteine, care pot s stabilizeze structura ARN.
Abilitatea de a se angaja n astfel de reacii de transfer rezid n structura
intronului, care continu s fie reactiv i dup eliminarea sa sub forma unei molecule
lineare. Sunt nsumate urmatoarele activiti:
1. Intronul se poate circulariza cnd G situat 3 terminal atac fiecare dintre
cele dou poziii de lng captul 5. Legtura intern este rupt i captul 5 eliberat
este transferat captului 3-OH al intronului. Ciclizarea primar implic de obicei
reacia dintre G414 terminal i A16. Aceasta este cea mai comun reacie. Mai rar G414
reacioneaz cu U20. Fiecare reacie genereaz un intron circular i un fragment linear
care reprezint regiunea 5 original 8lung de 15 baze dac atacul se produce la A16 i
de 19 baze dac atacul se face la U20). Fragmentul terminal conine nucleotidul
guanilic adugat.
2. Fiecare tip de cerc poate genera o molecul linear in vitro prin hidroliza
specific a legturii (G414-A16 sau G414-U20) care au nchis cercul. Acesta se numete
reversul ciclizrii i molecula linear generat prin inversarea ciclizrii la A16 rmne
reactiv i poate realiza o a doua ciclizare prin atacarea U20.

206

3. Produsul final al reaciilor spontane elibereaz intronul ARN L-19, o

molecul linear generat prin reversarea formei circulare scurte. Aceast molecul
are activitate enzimatic, i poate cataliza extinderea oligonucleotidelor scurte.
4. Reactivitatea intronului eliberat se extinde numai prin inversarea reaciei de
ciclizare. Adugarea oligonucleotidului UUU redeschide cercul primar reacionnd cu
legtura G414-A16.
Oligonucleotidul UUU (care se aseamn cu captul 3 de 15 baze eliberat n
prima ciclizare) devine captul 5 al moleculei lineare formate. Aceasta este o reacie
intermolecular, i demonstreaz astfel capacitatea de conectare a dou molecule
diferite de ARN.
Aceste serii de reacii demonstreaz clar c activitatea autocatalitic reflect o
abilitate generalizat a moleculei de ARN pentru a forma un centru activ care poate
lega cofactorii guanilici, recunoate oligonucleotidele, i poate aduce mpreun
grupri reactive ntr-o conformaie care s permite ruperea i reformarea de legturi.
Ali introni din grupa I nu au fost aa investigai n detaliu ca intronul de la
Tetrahymena, dar proprietile lor sunt n general similare.
Reacia de automaturare (auto-splicing) este o proprietate intrinsec a ARN, in
vitro, dar n ce grad sunt implicate proteinele in vivo? Cteva indicaii pentru
implicarea proteinelor au fost furnizate de ctre sistemele mitocondriale, unde
splicingul intronilor din grupa I necesit trans-activare de ctre produi ai altor gene.
Unul dintre cazuri l reprezint mutantul cyt 18 al N. crassa, care este defectiv n
realizarea splicingului mai multor exoni din grupa I. Produsul acestei gene se pare a fi
tirozil-ARNt sintetaza. O posibil implicare este aceea c intronul se poate dispune
ntr-o structur teriar asemntoare cu structura teriar a ARNt i astfel poate fi
recunoscut de sintetaz. Legarea enzimei poate fi implicat direct n splicing sau
poate avea un efect indirect cum ar fi stabilizarea conformaiei ARN.
Relaia dintre sintetaz i splicing este n concordan cu ideea c splicingul
este originar o reacie mediat de ARN, care cu timpul a fost asistat de proteine care
se leag la ARN i care originar au alte funcii. Capacitatea de auto-splicing a ARN in
vitro poate reprezenta interacia biochimic de baz; structura ARN creeaz situsul
activ, dar este capabil s funcioneze eficient in vivo numai cnd este asistat de un
complex proteic.
Conservarea structurii i a mecanismului de splicing printre intronii din grupa
I sugereaz c membrii nucleari i mitocondriali au o origine evolutiv comun. O
migrare trebuie s fi avut loc ntre nucleu i mitocondrie, dar pentru moment nu avem
nici o informaie privind direcia n care aceasta a avut loc.

Slide 37. Secvene consens la nivelul a diferite tipuri

de situsuri de splicing
Slide 38. Mrimea moleculelor ARN U
Slide 39. Proteine din structura snRNP de la mamifere
Slide 40. Majoritatea transcripiei i procesarea ARN apare ntr-un
numr limitat de domenii din nucleul celulelor de mamifere
Figura: Localizarea poliadenilrii ADN i afactorilor de splicing n nucleul
fibroblastelor de mamifere
207

Imagine microscopic digital folosit pentru reconstruirea unei seciuni de groase de

1 micro-metru dintr-un nucleu de fibroblaste colorat.
a) Seciune colorat n urma marcrii cu poli-dT cu rodamin roie pentru a
detecta procesul de poliadenilare a ARN (rou) i cu DAPI pentru a detecta ADN
(albastru). ARN poliadenilat este localizat la un numr limitat de loci discrei
poziionate ntre regiunile de cromatin, dei nu toate regiunile care conin nivele
sczute de ADN conin ARN poliadenilat detectabil (sgeile).
b) Aceeai seciune prezentat n a) colorat pentru a detecta ARN poliadenilat
(rou) i proteina esenial implicat n splicing SC-35, care a fost vizualizat cu un
antcorp monoclonal marcat cu fluorescein verde. Regiunile unde coloranii s-au
suprapus apar n galben. SC-35 este prezentat n centru multor loci (sgei).

Slide 41. Concluzii

Precursorii ARNm de la eucariote sunt procesai prin adugarea structurii cap,
scindare 3 i poliadenilare, sudarea exonilor (splicing) i nlturarea intronilor nainte
de transportul ARNm n citoplasm unde urmeaz a fi tradus de ctre ribozomi;
Structura cap este adugat la captul 5 al pre-ARNm, n formare, de ctre
o enzima specific care este asociat cu domeniul CTD fosforilat al ARN polimerazei
II, la puin timp dup iniierea transcripiei;
Transcripii pre-ARNm, n formare, sunt asociai cu o clas de proteine de
legare a ARN numite hnRNP;
La majoritatea genelor care codific pentru proteine, un semnal de
poliadenilare conservat (AAUAAA) este situat la 10-30 nucleotide n amonte de
situsul poli(A) unde apare clivarea i poliadenilarea.
Un complex multiproteic care include poli(A) polimeraza (PAP) realizeaz
scindarea i poliadenilarea pre-ARNm. O protein nuclear de legare la poli(A),
PABII, stimuleaz adugarea de resturi A de ctre PAP i operete procesul odat ce
coada poli(A) atinge 200-250 resturi;
Splicingul ARN este realizat de ctre un complex ribonucleo-proteic, numit
spliceozom, care este asamblat prin interaciile a cinci particule RNPsn diferite,
ntre ele, i de asemenea cu pre-ARNm. Spliceozomul catalizeaz dou reacii de
transesterificare care sudeaz exonii i inltur intronul sub forma unei structuri in
laso, care este ulterior degradat.
Intronii autocatalitici de grup II, care au fost evideniai n genele
cloroplastelor i mitocondriilor de la plante i fungi, prezint o structur secundar
nalt conservat, care este necesar pentru auto-splicing. Se consider c particulele
RNPsn din spliceozomi c au o structur secundat similar cu cea a intronilor de
grup II;
Majoritatea transcripiei i procesarea ARN din nucleii celulelor eucariote se
realizeaz la nivelul unui numr limitat de domenii. O reea proteic fibroas din
interiotul nulcleului formeaz o matrice nuclear. Aceasta poate servi la organizarea
unor centre de transcripie i procesare a ARN

Slide 42. Reglarea procesrii ARNm: proteina U1A inhib

poliadenilarea propriului pre-ARNm
Figura: Diagrama captului 3 al pre-ARNm care codific proteina U1A, o secven
specific a unei proteine de legare la ARN care este parte component a complexului
U1RNPsn.

208

Legarea proteinei U1A la ambele situsuri situate n amonte de blocurile situsului

poli(A) de poliadenilare, dar nu de clivare, a pre-ARNm. De reinut c secvena
semnalului de poliadenilare din amonte difer uor de semnalul singular uzual
AAUAAA. Aceast secven neobinuit se gsete n puine molecule pre-ARNm.

Silde 43. Splicing-ul esut specific controleaz expresia

fibronectinelor alternative
Figura: Splicingul pre-ARNm al fibronectinei specific fibroblastelor i
hepatocitelor (splicing specific tipului celular).
Gena fibronectinei (sus) conine mai muli exoni care se pare c provin dintr-o
gen ancestral care a suferit un numr de duplicri ale exonilor. Exonii cu secvene
omologe sunt prezentai cu aceeai culoare. n aceast diagram, intronii (liniile
subiri albastre) nu sunt desenai la scal; majoritatea lor sunt mult mai lungi dect
orice ali exoni. ARNm pentru fibronectin produs de ctre fibroblaste include exonii
EIIIA i EIIIB, n timp ce acetia sunt eliminai din structura ARNm pentru
fibronectin prezent n hapatocite.
Informatii suplimentare
Splicingul alternativ: mai multe proteine codificate de o singur gen
Cea mai mare parte a genelor pre-ARNm sunt maturate dup un mecanism
care exclude fiecare intron decupndu-l la nivelul situsurilor de clivare 5 i 3. Astfel,
diferiii exoni ai unui transcript sunt conservai n ordinea iniial sub forma unei
secvene continue n molecula de ARN matur (splicing constitutiv). Totui, anumite
molecule de pre-ARNm pot fi maturate n mai multe moduri determinnd formarea
unei familii de ARNm nrudite structural, fiecare posednd o niruire diferit de
exoni diferii, i putnd codifica o familie de proteine izoforme. Acest tip de maturare
a ARN este numit splicing alternativ. Un numr mare de gene de la Drosophila, om
i virusuri sunt transcrise ntr-o molecul pre-ARNm care sufer maturare (splicing)
alternativ. Aceste gene codific pentru un numr mare de proteine dintre care unele
sunt implicate n constituirea citoscheletului, n contacia muscular, sunt receptori
membranari, hormoni polipeptidici, sunt implicate n metabolismul intermediar i n
transpoziia ADN.
Splicingul alternativ furnizeaz o modalitate de diversificare a informaiei
purtate de o gen fr a modifica organizarea sa genomic. Acest mod de maturare
reprezint o manier eficace de a produce o varietate de ARNm care codific pentru
proteine nrudite n care secvenele comune sunt specificate de exoni comuni n timp
ce secvenele distincte deriv din exoni maturai diferit. n anumite cazuri, moleculele
de ARNm maturate diferit sunt produse n acelai timp, i diferitele molecule proteice
izoforme pot asigura funcii identice sau diferite. Cele patru proteine izoforme care
stau la baza constituirii mielinei sunt toate componente ale anvelopei mielinice ale
celulelor sistemului nervos central; cele dou izoforme de imunoglobuline sunt
respectiv membranar i secretat. Anumite molecule transcript sunt maturate diferit
n funcie de esut. Astfel, o gen unic exprim calcitonina n tiroid i izoforma sa, o
protein nrudit prezent n creier, fiecare fiind format de la acelai pre-ARNm
maturat distinct. n anumite sisteme genetice (ex. gena troponinei T de la mamifere i
din complexul Ultrabitorax de la Drosophila), cantitile relative i tipul de splicing
al moleculelor pre-ARNm sunt reglate n cursul dezvoltrii. Splicingul alternativ are
un rol important n determinarea sexului n cursul embriogenezei la Drosophila.
Diferenele de activitate ale genelor de reglare la masculi i femele sunt datorate, n
principal, diferitelor tipuri de splicing, specific pentru sex, care conduce la producerea
209

de molecule transcript cu funcii distincte la cele dou sexe. n plus, activitatea

genelor individuale n aceast ierarhie de reglare nu este controlat numai la nivel de
splicing, dar determin o schem de splicing care acioneaz ca urmare a rezultatului
acestei ierarhii.
Schema de splicing alternativ
Au fost evideniate trei clase generale de splicing. Tipul I este rezultatul
utilizrii de promotori diferii pentru a da natere la molecule de pre-ARNm nrudite
formate din regiuni 5 proximal distincte i de lungimi variabile. Genele amilazei de
la oarece i a lanului uor al miozinei (CLM) de la vertebrate sunt exemple
caracteristice acestei clase. Gena CLM este transcris plecnd de la doi promotori
situai la aproximativ 10 kpb unul de cellalt. Molecula de pre-ARNm cea mai lung
conine toi exonii n timp ce celei mai scurte i lipsete primul. Splicingul alternativ
produce dou molecule de ARNm aproape egale coninnd fiecare cinci exoni
constitutivi n regiunea 3 proximal dar difer prin exonii poziionai n 5. Maturarea
celui mai lungi molecule de pre-ARNm, exonul 1 este legat de exonul 4, fiind
ignorate situsurile de clivare 3 ale exonilor 2 i 3. Din contr, la maturarea preARNm mai scurt sunt asociai exonii 2, 3 i 5 i nu se produce asocierea exonilor 3 i
4. Analiza secvenei a demonstrat c situsul 3 care flancheaz exonul 2 este defectiv,
ceea ce explic defectul de asociere a exonilor 1 i 2. Absena jonciunii exonilor 1 i
3, 3 i 4 este atribuit altor cauze distincte pe care le vom discuta mai trziu.
Cel de al doilea tip de splicing implic moleculele pre-ARNm care posed
secvene 3 proximal de lungimi variabile, n general deoarece poliadenilarea
transcriptului se face plecnd de la situsuri diferite. Cele cinci grupe diferite de
ARNm tardiv de la adenovirusul 2 sunt rezultatul splicingului alternativ posibil numai
datorit folosirii a cinci situsuri de poliadenilare diferite. Aceeai explicaie ine cont
de originea celor dou specii de ARNm ale lanurilor grele ale imunoglobulinei. Gena
unic a calcitoninei de la mamifere produce dou molecule de ARNm; una provine
dintr-un pre-ARNm scurt, cealalt codific pentru o peptid nrudit cu calcitonina.
Cei patru exoni ai pre-ARNm scurt ai calcitoninei sunt reinui. Molecula pre-ARNm
lung conine doi exoni suplimentari, 5 i 6; acetia sunt prezeni n ARNm al peptidei
nrudite, dar exonul 4 este absent. Situsul de jonciune 3 al intronului 4 este
partenerul preferat al situsului 5 al celui de al treilea intron. n acest caz, maturrile
realizate sunt determinate de utilizarea de semnale de poliadenilare diferite i
specifice de (pentru) esut.
n al treilea tip de splicing alternativ, care este cel mai variat i cel mai
neateptat, o molecul de pre-ARNm d natere la diferite molecule de ARNm
funcionale. Sunt prezeni toi exonii poteniali n pre-ARNm i alegerea posibilitilor
de maturarea se realizeaz folosind exonii existeni. Schema jonciunilor i este
realizat n numeroase gene. Un bun exemplu l constituie gena pentru troponina T
din muchii scheletici rapizi. Grupele i de ARNm ale troponinei T conin
respectiv exonul 16 sau exonul 17. Acesta este rezultatul asocierilor exonilor 15, 16 i
18 sau 15, 17 i 18. Alegerea exonului utilizat este reglat n cursul dezvoltrii.
Astfel, exonul 16 este specific ARNm pentru troponina din muchiul adult i exonul
17 este folosit n moleculele ARNm adulte i embrionare. Cele 32 de combinaii
posibile care implic exonii 4 la 8 sunt reprezentate n grupele i ; eantionul de
molecule ARNm mature merge de la excluderea complet la reinerea tuturor celor
cinci exoni.
Pot exista i procese de maturare care implic situsurile de clivare 5 i 3
interne ale exonilor sau ale intronilor. Astfel, clivarea la nivelul unui situs 5 autentic
210

este de obicei nsoit de clivarea la nivelul situsului 3 normal de la extremitatea

intronului, dar exist posibilitatea clivrii unui alt situs 3 situat n intron, avnd ca
rezultat lungirea exonului urmtor. Un rezultat similar se obine dac are loc o clivare
alternativ n intron sau n exon. Existena i folosirea, unor astfel de situsuri de
jonciune, criptice presupune c splicingul alternativ determin formarea unor faze
de lectur reale. Un astfel de splicing alternativ este folosit de ctre SV40 i de ctre
virusul polioma pentru a exprima mai multe molecule de ARNm plecnd de la un
singur transcript al regiunii precoce. Aceast modalitate de splicing atenueaz
distincia ntre proprietile codante ale exonilor i intronilor.
Un exemplu interesant de splicing alternativ specific pentru esut este cel al
genei care codific pentru elementul transpozabil P de la Drosophila. n acest caz,
conservarea intronului care conine un codon fr sens (STOP), mpiedic expresia
transpozazei (proteinei responsabile de transpoziie) n esuturile somatice. Expresia
acesteia n esuturile liniei germinale este rezultatul eliminrii intronului n aceste
esuturi, permind extinderea secvenei fazei deschise de lectur la un exon necesar
activitii acestei enzime (transpozazei).
Un exemplu extrem de splicing diferenial exist n expresia genelor pentru
retrovirus. Provirusul integrat este transcris ntr-o copie complet de ARN genomic
viral care este n final mpachetat n virion: nu are loc nici o clivare n molecula de
ARN destinat virionilor. Dar acelai transcript reprezint i ARN, care codific
pentru transcriptaza invers i proteina core. n plus, acelai transcript este un preARNm care n urma maturrii produce ARNm pentru proteinele anvelopei. n cazul
leucemiei umane a celulelor T i a imunodeficienei umane, diferitele moduri de
splicing al transcriptului primar produc diferite molecule de ARNm care produc
fiecare o protein particular necesar multiplicrii virale sau patogenitii.
Selecionarea situsului de clivare
Principala enigm relativ la splicingul constitutiv sau alternativ al pre-ARNm,
este modul n care sunt alese perechile de jonciune corect a exonilor. Pentru acest
fenomen exist dou mari categorii de explicaii posibile. Una presupune existena
unor structuri intrinseci ale pre-ARNm sau a unor intermediari care apar n cursul
formri ARNm: acetia sunt factorii cis. O alt explicaie presupune implicarea unor
factori care sunt poziionai n trans, proteine sau alte molecule de ARN care pot
influena alegerea intronului care trebuie eliminat. Este foarte probabil s existe o
ierarhie de eficien a situsurilor de clivare, care ar putea reflectarea avantajului
relativ al formrii spliceozomilor la situsurile 5 i 3 cele mai favorizate. n cazul
moleculelor de ARNm pentru dou antigene T ale SV40, cele dou reacii de clivare
alternativ sunt determinate prin alegerea punctului branare a intronului. Exist
numeroase exemple care demonstreaz c prezena unei mutaii la nivelul unui situs
de jonciune determin folosirea altui situs care de obicei nu era utiliza. Exist
numeroase argumente n favoarea idei c factorii care acioneaz n trans determin
rezultatul reaciilor de splicing. Acest lucru este adevrat cnd molecule de preARNm, presupuse identice, sunt maturate diferit, n funcie de condiiile fiziologice
sau n esuturi particulare. Este posibil ca particulele snRNP sau proteine de tipul
maturazelor s poat fi exprimate, i s funcioneze, ntr-un mod programat n timpul
dezvoltrii specifice a anumitor esuturi, influennd astfel schema de splicing. Multe
dintre aceste puncte vor fi clarificate cu certitudine n anii urmtori.

211

Silde 44. Expresia proteinei Sxl 11.3 (Sex-lethal) n timpul

embriogenezei la Drosophila
Figura: Expresia proteinei Sex-lethal (Sxl) n timpul embriogenezei la Drosophila.
n moleculele de pre-ARNm, exonii sunt prezentai sub forma unor cutii roii i
intronii ca nite linii albastre; splicingul este indicat prin linii punctate. O sgeat
vertical roie indic codonul de start AUG de la care ncepe translaia ARNm.
a) Timpuriu, n dezvoltare, pre-ARNm sxl este sintetizat din PE, care este activ
numai la embrionii femeli. Acest pre-ARNm este ntotdeauna maturat aa cum este
prezentat n figur.
b) Mai trziu, n timpul dezvoltrii, este sintetizat un pre-ARNm pentru sxl este
sintetizat din PL att la femele ct i la masculi. La masculi, acest transcript este
maturat (spilice) pentru a da natere unui ARNm format din patru exoni. Deoarece
exonul 3 conine n structur un codon stop (banda rou nchis), la masculi nu se
produce o molecul funcional. La femele, fixarea proteinel Sxl timpurii la preARNm pentru Slx, mpiedic splicingul exonilor 2 i 3. ARNm rezultat, care conine
trei exoni, este tradus ntr-o protein funcional Sxl, care i aceasta se leag la preARN pentru Sxl sintetizat mai trziu, asigurnd producerea sa continu la femele. De
reinut c exonul 2 al transcriptului timpuriu prezentat n a) este identic cu exonul 4 al
transcriptului tardiv; b) Acest exon codific domeniul RNP care mediaz legarea
proteinei Sxl la ARN.

Silde 45. Cascada splicing-uluiadaptativ care controleaz

diferenierea sexual la Drosophila
Figura: Cascada splicingului adaptativ (regulated = de reglare) care controleaz
expresia genelor sxl (sex-lethal), tra (transformer) , i dsx (doule-sex) din embrionii
de Drosophila.
Pentru claritate, numai exonii (dreptunghiurile rou deschis) i intronii (liniile
albastre) supui splicingului reglator sunt prezentai. Splicingul este indicat prin linii
punctate n fa (femele) sau n spate (mascul) fa de pre-ARNm. Benzile rou nchis
semnific prezena unor codoni stop n fazele de lectur, care mpiedic sinteza unei
proteine funcionale. Numai embrionii femeli produc proteine funcionale Sxl, care
mpiedic splicingul ntre exonii 2 i 3 din pre-ARNm Sxl i dintre exonii 1 i 2 din
pre-ARNm pentru tra. n contrast, legarea complexului Tra-Tra2 la pre-ARNm pentru
dsx activeaz splicingul ntre exonii 3 i 4. Ca un rezultat al acestei cascade de reglare
a splicingului, proteine Dsx distincte sunt produse n embrionii femeli i masculi.
Acetia represeaz transcripia genelor necesare pentru diferenierea sexual a sexelor
opuse.

Silde 46. Mai multe izoforme proteice sunt comune sistemului nervos al
vertebratelor
Figura: Splicingul alternativ al ARNm pentru slo care codific canalul pompei de
Ca2+/K+, n celulele perilor auditivi care contribuie la percepia sunetelor de
diferite frecvene. (splice=matisare, mbinare)
a) Cohlea de pui, un tun de 5 mm, conine un epiteliu cu celule ale periorilor
auditivi care sunt adaptate unui gradient de frecvene vibraionale de la 50 Hz la
captul apical (stnga) la 5000 Hz la captul bazal (dreapta).

212

b) Proteina Slo conine 7 alfa elice transmembranare (S0 la S6), care se asociaz
pentru a forma canalul de K+. Domeniul citosolic, care include 4 regiuni hidrofobe
(S7 la S10), regleaz deschiderea canalului ca rspuns la Ca2+. Izoformele canalului
Slo, codificate de izoforme ARNm obinute prin de splicing alternativ pornind de la
acelai transcript primar, se deschid la concentraii diferite de calciu. Numerele roii
se rtefer la regiunile n care splicingul alternativ produce diferite secvene
aminoacide n diferitele izoforme Slo. De exemplu, dou secvene aminoacide
(prezentate n codul cu o liter) obinute prin splicing alternativ n regiunea 3 sunt
prezentate n partea de jos a figurii. Liniile de unire indic jonciunile exonice.
Splicingul la unul dintre situsurile de mbinare i de reunire...AVS codific n unul
din exoni la GRK.... Celulele periorilor de la captul apical al cohleei realizeaz
numai splicing de secvene scurte, n timp ce celulele periorilor de la captul bazal
realizeaz ambele tipuri de splicing alternativ. Alte forme de splicing alternativ sunt
mbogite n celulelor periorilor auditivi n diferite localizri specifice de-a lungul
lungimii cohleei.

Silde 47. Concluzii

Expresia anumitor proteine este reglat prin controlarea procesrii
transcriptului primar al genei care codific pentru aceasta. Acest tip de reglarea genic
este n special comun pentru genele care codific proteine importante pentru
funcionarea sistemului nervos la vertebrate;
Poliadenilarea pre-ARNmcare codific proteina U1A este inhibat prin chiar
legarea proteinei U1A la dou situsuri identice situate foarte aproape n amonte fa
de situsul poli(A) al pre-ARNm pentru U1A. Drept rezultat, nu se produce ARNm
funcional, expresia proteinei U1A fiind represat. Reglarea de acest fel nu este foarte
comun;
Splicingul alternativ al transcripilor primari produi din uniti complexe
este adesea reglat. Ca rezultat, pot fi exprimate diferite tipuri de ARNm pentru aceeai
gen n diferite tipuri celulare sau n diferite stadii de dezvoltare;
Splicingul alternativ poate fi reglat de ctre proteinele care se leag la diferite
situsuri specifice din apropierea situsului reglare a matisrii din structura ARN. Se
consider c inhibitorii de splicing acioneaz pentru a bloca steric accesul acestor
factori la secvena ARN. Activatorii procesului pot determina splicingul prin
asocierea lor cu situsurile dfe reglarea a mbinrii (matisrii).

Silde 48. Porii nucleari asigur transportul activ al macromoleculelor

ntre nucleu i citoplasm
Figura: Complexul porului nuclear (NPC)
a) Anvelopa nuclear a ovocitelor de Xenopus vizualizat prin microscopie
electronic
Sus: faa citoplasmatic a complexului porului nuclear (NPC);
Mijloc: faa nucleoplasmic a anvelopei nucleare dup ndeprtarea membranei
nucleare a NPC, artnd structura sub form de co;
Jos: Faa nucleoplasmatic a anvelopei nucleare dup ndeprtarea membranei
nucleare prin tratament blnd cu detergent. Reteaua laminar, care se insereaz n
inelul nuclear al NPC, este expus dup acest tratament.
b) Modelul schematic al NPC

213

Silde 49. Model pentru trecerea moleculelor de mRNP prin

complexele porului nuclear
Figura: Modelul trecerii moleculelor RNPm prin complexul porului nuclear (NPC)
bazat pe studiile de microscopie electronic la Chironomous tentans
Dup curbare RNPm se deplaseaz prin inelul terminal, se extinde si trece prin
regiunea central a NPC cu captul 5 nainte asociindu-se cu ribozomii din
citoplasm. Se crede c NPC sufer o modificare conformaional n timpul
transportului.

Silde 50. Determinarea heterocarionului evideniaz diferenele dintre

proteina A1 i proteina C din hnRNP de la om privind trecerea prin
porii nucleari
Figura: Utilizarea heterocarionilor demonstreaz c proteina A1hnRPN poate cicliza
n i n afara citoplasmei, n timp ce proteina umana C hnRNP nu poate
Heterocarionii au fost separai prin tratamentul celulelor Hela i a celulelor de
Xenopus n cultur cu polietilen glicol. Celulele au fost tratate cu cicloheximid
imediat dup fuziunea lor pentru a mpiedica sinteza proteic. Dup 2 ore, celulele au
fost fixate i colorate anticorpi specifici pentru proteinele C i A1 hnRNP marcai cu
fluorescein. Aceti anticorpi nu se leag la proteinele de Xenopous omologe.
a) Un preparat fixat vizualizat prin microscopie n contrast de faz conine celule
HeLa (captul sgeii) i de Xenopous nefuzionate (sgeata punctat) ca i
heterocarioni fuzionai (sgeata solid). n heterocarionul din figur, nucleul rotund
HeLa este n dreapta nucleului oval de Xenopous.
b) i c) Cnd acelai preparat este vizualizat prin microscopie de fluorescen ,
proteinele colorate ChnRNP sunt colorate n verde i A1 hnRNP n rou. De reinut c
celulele nefuzionate de Xenopous sunt necolorate confirmnd c anticorpii sunt
specifici pentru proteinele umane. n heterocarion, hnRNP C apare n ambii buclei
HeLa c);
b) Cu toate c sinteza proteic a fost blocat dup fuziunea celular, o parte din
hnRPN A1 trebuie s fi prsit nucleul celulelor HeLa s se deplaseze prin citoplasm
i s intre n nucleul de Xenopous di heterocarion.

Silde 51. Model privind exportul proteinelor nucleare cargo purttoarea

a unui semnal de export nuclear bogat n leucin
Figura: Mecanismul propus pentru transportul proteinelor cargo coninnd un
semnal de export nuclear bogat n leucin (NES nuclear export signal)
n nucleoplasm, proteina exportina 1 se leag cooperativ la NES din structura
proteinei cargo pentru a fi transportat i la Ran-GTP. Dup formarea complexului
cargo, acesta trece prin complexul porului nuclear NPC i RanGAP, localizat n
citoplasm, stimuleaz transformarea ran-GTP n Ran-GDP. Modificrile
conformaionale la nivelul Ran care nsoesc acest proces conduce la disocierea
complexului. Proteina cargo care conine semnalul de export nuclear NES este
eliberat singur n citosol, n timp ce exportina 1 i Ran-GDP sunt transportate
napoi n nucleu prin intermediul prin complexele porului nuclear. RCC1 localizat n
nucleu stimuleaz transformarea Ran-GDP n Ran-GTP. Repetarea acestui ciclu duce
la exportul mai multor molecule de protein cargo.

214

Silde 52. Model de export nuclear al moleculelor de ARNm mediat de

hnRNP
Figura: Mecanismul propus pentru exportul nuclear al ARNm prin intermediul
hnRNP
a) Captul 5 al complexului format din ARNm-hnPNP (RNPm) se asociaz cu
CBC (Cap Binding Complex), care trece mai nti prin Complexul Porului Nuclear
(NPC).
b) hnRNP care trebuie s rmn n nucleu (potocaliu si albastru) sunt
ndeprtate n timpul trecerii RNPm prin NPC, aceste proteine crora le lipsete
secvenele NES (Nuclear Export Signal) vor rmne n nucleu n timp ce hnRNP
purttoare de NES, cum este A1 hnRNP , sunt transportate pri NPC mpreun cu
ARNm pe care l transport n citoplasm.
c) Complexul RanGAP stimuleaz hidroliza GTP de ctre Ran. Proteinele
navet hnRNP disociaz apoi de pe proteinele receptoare (exporetina 1 pentru
semnale de export nujclear bogate n leucin) care sunt transportate napoi n nucleu.
Apoi ARNm este disponibil s interacioneze cu prpteinele citosolice RNPm, inclusiv
cu poli(A) binding protein (PABP), care se leag n 3 la coada poli(A) a ARNm.

Silde 53. Proteinele purttoare de semnale nucleare de localizare sunt

recunoscute de receptori i transportate n nucleu
Figura: Demonstraie c Semnalul de Localizare Nuclear (NLS Nuclear
Localization Signal) al antigenului T al SV40 poate direciona o protein
citoplasmatic n nucleul celular.
a) Piruvat kinaza normal, vizualizat prin imunofluorescen dup tratarea
celulelor n cultur cu un anticorp specific, este localizat n citoplasm.
b) O piruvat kinaz himer, care conine un semnal NLS al SV40 la captul su
N-terminal, este direcionat ctre nucleu. Proteina himer a fost exprimat n urma
transfeciei unei gene modificate produs prin fuziunea unui fragment al unei gene
virale care codific NLS al SV40 cu gena piruvat kinazei.

Silde 54. Model de import a proteinelor citosolice purttoare de semnale

NLS
Figura: Mecanismul propus pentru proteinele de transport cargocare conin un
semnal de localizare nuclear (NLS) din citoplasm n nucleu.
n citoplasm, importinele alfa i beta interacioneaz cooperativ cu proteina
cargo pentru a fi transportate, cu NLS care se leag la importina alfa. Subunitatea beta
a importinei beta al complexului cargo trimeric rezultat cu componentele NPC,
translocnd complexul n nucleoplasm prin mecanisme slab nelese, mecanisme care
necesit hidroliza ATP. n nucleoplasm, Ran-GTP interacioneaz cu importina beta,
determinnd disocierea complexului cargo, elibernd proteina cargo liber n
nucleoplasm.
Pentru a susine un alt ciclu de import, importina alfa monomer i complexul
importin beta-Ran-GTP sunt transportate napoi n citoplasm. Proteina de activare
RanGAP (Ran GTP activating protein) din citoplasm stimuleaz transformarea ranGTP la Ran-GDP avnd drept rezultat o transformare conformaional la nivelul Ran
care determin disicierea de importina beta. Importina beta liber interacioneaz apoi
cu importina alfa i se formeaz un nou complex cargo purttor al unui semnal bazic
NLS, care iniiaz un alt ciclu de import nuclear. Se presupune c Ran-GDP este de

215

asemenea translocat prin porii nucleari din citoplasm n nucleoplasm, unde factorul
nucleotidic de schimb Ran (RCC1) determin eliberarea GDP i relegarea GTP.

Silde 55. Proteina Rev a HIV Rev regleaz transportul moleculelor de

ARNm viral ne-maturate
Figura: Rolul proteinei Rev n transportul moleculelor de ARNm ale HIV din nucleu
ctre citoplasm
Genomul HIV, care conine regiuni codante suprapuse, este transcris ntr-un
singur transcript primar de 9 kb. n urma splicingului se obin mai multe molecule
ARNm de aproximativ 4 kb n urma splicingului unuia dintre introni (linia albastra n
unghi), i mai multe molecule de ARNm de aproximativ 2 kb n urma splicingului a
doi sau mai multi introni. Dup transportul n citoplasm, fiecare specie de ARNm
este tradus n citoplasm n diferite proteine virale. Proteina Rev, codificat de ctre
ARNm de 2 kb, interacioneaz cu RRE (rec Reponse Element) de la nivelul
moleculelor supuse i nesupuse procesului de splicing, stimulnd transportul lor n
citoplasm.

Silde 56. Concluzii

Anvelopa nuclear conine numeroase complexe ale porilor nucleari (NPC), sub
forma unor structuri complicate, mari, compuse din multe copii a aproximativ 50-100
proteine numite nucleoporine;
Ionii, metaboliii i proteinele mici difuzeaz liber prin porii nucleari, dar
macromoleculele mai mari de 60 kDa trebuie transportate activ prin procese care
necesit ATP i presupun probabil modificri conformaionale la nivelul complexului
porului nuclear;
Att n importul ct i n exportul nuclear, proteinele care trebuie transportate
conin o secven de aminoacizi specific care funcioneaz ca semnal de export
nuclear (NES) sau ca semnal de localizare nuclear (NLS). Proteinele prezente numai
n nucleu conin un semnal NLS dar nu i unul NES, n timp ce proteinele care fac
transferul ntre nucleu i citosol conin ambele semnale;
n concordan cu modelele actuale, semnalele NES i NLS din structura unei
proteine cargo interacioneaz cu proteine receptor specifice implicate n transportul
nuclear localizate n nucleu n cazul exportului n citosol sau n citosol n cazul
importului. Ambele procese de transport necesit i participarea proteinei Ran o
GTP-az care exist n diferite conformaii cnd leag GTP sau GDP;
O dat ce este asamblat un complex cargo se consider c proteina receptor
din complex are contacte multiple cu nucleoporinele, transportnd astfel complexul
prin porul nuclear. Dup ce un complex cargo ajunge la destinaie (citoplasm n
timpul exportului i nucleu n timpul importului), disociaz, elibernd proteina
cargo i celelalte proteine. Ultimele sunt transportate prin porii nucleari n direcie
invers pentru a participa la transportul altor molecule.

Silde 57. Concluzii

Dimensiunea unidirecional att a exportului ct i a importului se consider c
deriv din localizarea factorului RCC1 (Ran nucleotide-exchange factor) n nucleu i
a RanGAP (Ran GTP-ase-activating protein) n citoplasm;
n timpul exportului unei RNPm nucleare, compus dintr-o molecul de
ARNm matur, funcional i proteine hnRNP, sunt nlturate moleculele hnRNP cu
localizare nuclear, n timp ce moleculele hnRNP purttoare de semnale NES leag

216

molecula de ARNm i o transport prin complexul porului nuclear. Dup trecerea n

citosol, aceste molecule hnRNP navet care posed i semnale NLS sunt eliberate de
ARNm i transportate napoi n nucleu pentru a participa la alt etap de export
nuclear;
Au fost identificate multe tipuri diferite de semnale NES i NLS. Se consider
c fiecare clas de semnale nucleare de transport interacioneaz cu receptori proteici
specifici. Receptorii implicai n transportul nuclear se caracterizeaz prin prezena
unor regiuni omologe care interacioneaz cu Ran i cu anumite nucleoporine;
Moleculele pre-ARNm din structura unui spliceozom nu sunt exportate din
nucleu. Nu se cunoate mecanismul acestei inhibiii de transport care acioneaz pn
n momentul procesrii corecte. Sunt exportate numai moleculele de ARNm
funcionale care pot fi traduse n citoplasm;
Proteina Rev a virusului HIV, care conine un semnal NES, poate anula
restriciile privind transportul moleculelor pre-ARNm cu situsuri specifice.

Silde 58. Editarea ARN modific secvenele moleculelor pre-ARNm

Figura: Editarea pre-ARNm pentru apo-B
ARNm pentru apo-B produs n ficat are aceeai secven ca i exonii din
transcriptul primar. Acest ARNm este tradus n Apo-B 100, care prezint dou
domenii funcionale: unul N terminal (verde) care se asociaz cu lipidele i un
domeniu C-terminal (portocaliu) care se leag la receptorii LDL de pe membrana
celular. n cazul ARNm pentru apo-B din intestin, codonul CAA din exonul 26 este
editat la codonul UAA stop. Ca rezultat celulele intestinale produc Apo-B48, care
corespunde domeniului N-terminal al Apo-B100.
Informatii suplimentare
Editarea ARN (RNA editing) utilizeaz informaii din diferite surse. O prim
axiom a biologiei moleculare este aceea c secvena ARNm poate reprezenta numai
ceea ce este codificat n ADN. Dogma central propune o relaie linear n care o
secven de ADN este transcris ntr-o secven ARNm care este direct transformat
ntr-o protein. Existena genelor ntrerupte i ndeprtarea intronilor prin splicingul
ARN introduce un pas n plus n procesul de expresie al genelor: secvenele codante
(exonii) din ADN trebuie s reconstituii n ARN. Procesul rmne astfel unu transfer
al informaiei n care codul purtat de secvena ADN nu este modificat.
Modificri ale informaiei codificate de ADN apar n circumstane
excepionale, cel mai reprezentativ exemplu fiind generarea de noi secvene care
codific pentru imunoglobuline la mamifere i psri. Aceste modificri apar specific
n celulele somatice (limfocitele B) n care imunoglobulinele sunt sintetizate. Noua
informaie este generat n ADN-ul unui individ n timpul procesului de reconstrucie
a genei imunoglobulinei; informaia codificat n structura ADN este modificat
printr-o mutaie somatic. Informaia din ADN continu s fie transcris cu exactitate
n ARN.
Editarea ARN (RNA editing-prelucrarea ADN) este un proces n care
informaia este modificat la nivelul ARN. S-au evideniat situaii n care secvena
codant din ARN difer de secvena ADN dup care a fost transcris. Prelucrarea
ARN apare n dou situaii diferite, determinate de diferite cauze. n celulele de
mamifere sunt situaii n care substituia (modificarea) apare la o singur baz din
structura ARNm, determinnd o modificare a secvenei proteinei codificate. n

217

mitocondriile de la Trypanosoma, modificri mai extinse apar n transcripii multor

gene, cnd bazele sunt sistematic adugate sau nlturate.
n figur sunt prezentate secvenele genei pentru apolipoproteina-B (apo-B)
din intestinul i ficatul mamiferelor. Genomul conine o singur (ntrerupt) gen a
crei secven este identic n toate esuturile, cu o regiune codant de 4563 codoni.
Gena este transcris ntr-un ARNm care este tradus ntr-o protein de 512 000 Da
reprezentnd ntreaga secven codant n ficat.
O form mai scurt a proteinei, aproximativ 250 000 Da, este sintetizat n
intestin. Aceast protein const n regiunea A-terminal a proteinei ntregi. Ea este
tradus de pe o molecul de ARNm a crei secven este identic cu cea din ficat cu
excepia unei modificri a lui C n U la codonul 2153. Aceast substituie modific
codonul CAA pentru glutamin n UAA codon Stop (ocru).
Cine poart responsabilitatea acestei substituii (ce realizeaz aceast
modificare)? Nu a fost evideniat n genom o gen alternativ sau un exon care s
codifice pentru noua secven, i nici nu a fost descoperit o modificare a modului de
splicing (de maturare). n aceste mprejurri se impune concluzia c modificarea s-a
realizat direct n secvena transcriptului. Exist o enzim care recunoate specific
transcriptul apo-B i modific C2153 n T? O astfel de enzim trebuie s recunoasc o
anumit regiune a structurii secundare n mod analog enzimelor capabile s modifice
structura ARNt. Conceperea unui sistem in vitro pentru acest cercetarea acestui
proces de prelucrare sugereaz c o secven relativ mic (aprox. 50 baze) situat n
vecintatea situsului de editare este o int suficient.
Prelucrarea n acest mode este rar, dar apo-B nu este unic. Un alt exemplu
este furnizat de receptorul pentru glutamat din creierul de oarece. Prelucrarea unei
singure poziii modific codonul pentru glutamin, de pe ADN, ntr-un codon pentru
arginin pe ARN; arginina joac un rol important n controlul fluxului ionic prin
neurotransmitor, astfel nct prelucrarea (editarea) este n mod clar necesar pentru
funcionarea fiziologic.
Modificri dramatice ale secvenei au fost detectate la numeroase gene
mitocondriale de la Trypanosoma. n primul rnd s-a descoperit c n secvena
subunitii II a citocrom oxidazei proteina are -1 frameshift (o modificare de cadru)
fa de secvena genei coxII. Secvenele genei i proteinei, sunt conservate la mai
multe specii de Trypanosoma. Cum funcioneaz aceast gen?
ARNm al coxII prezint un insert de patru nucleotide (toate uridine) lng
situsul de frameshift. Inseria restaureaz faza de lectur corespunztoare; aceasta
insereaz un aminoacid n plus i modific aminoacizii pe fiecare parte pentru a crea
faza de lectur corect. Nu a mai fost descoperit o a doua gen pentru aceast
secven, i oamenii de tiin sunt forai s conchid, pentru moment, c aceste baze
n plus au fost inserate n timpul sau dup realizarea transcripiei. O discrepan
asemntoare ntre ARNm i secvenele genomice a fost gsit pentru genele SV5 i
n cazul para-mixovirusului care provoac pojarul. n aceste cazuri este vorba de
adugarea unui rest G n structura ARNm.
Au fost evideniate secvene ARN prelucrate similar i pentru alte gene.
Aceste includ deleii sau adiii de uridin. Este interesant cazul extraordinar al coxIII.
Mai mult de jumtate din resturile din structura ARNm constau n uridine care nu
sunt codificate de gen. Compararea ADN genomic i a ARNm demonstreaz c nu
exist structur mai mare de 7 nucleotide care s nu fie modificat; inseriile sunt
formate din fragmente care conin mai mult de 7 uridine.
De unde provine informaia pentru inserarea specific a uridinelor? O molecul de
ARN ghid conine secvena care este complementar cu ARNm corect prelucrat

218

(editat). n figura este redat un model pentru aceast aciune n gena citocromului b de
la Leishmania.
Secvena de sus arat transcriptul original, sau ARN pre-editat. Golurile
reprezint bazele care urmeaz a fi inserate n urma procesului de prelucrare (editare).
Pentru a crea o secven ARNm valid, n aceast regiune, trebuiesc inserate 8
uridine.
ARN ghid este complementar cu ARNm pe o distan semnificativ care
includ regiunile din jurul regiunii care urmeaz a fi prelucrat (edited region). Tipic,
complementaritatea este mai extins n regiunea 3 a regiunii de prelucrare i adesea
mai redus n regiunea 5. mperecherea dintre ARNm ghid i ARN pre-editat (preedited RNA) las spaii (locuri) unde resturi nemperechiate din ARN ghid nu gsesc
complementaritate n ARN pre-editat. Cnd reacia este complet, ARN ghid se
separ de ARNm, care devine disponibil pentru translaie (traducere).
Specificarea secvenei finale editate poate fi complex; n acest exemplu n
acest exemplu o secven mai lung este editat prin inserarea mpreun a 39 de
resturi U, dar acest proces pare s necesite dou molecule ARNs ghid, care acioneaz
la situsuri adiacente, fie simultan fie succesiv. Ne putem imagina situaii mult mai
complicate n care, de exemplu, dup ce o molecul ARN ghid ajut la crearea
secvenei prelucrate, aceasta este preluat de o alt molecul ghid pentru continuarea
editrii.
Moleculele ARNs ghid sunt codificate ca uniti de transcripie independente,
exemplu la harta regiunii mitocondriale la Leishmania Aceasta include gena pentru
citocromul b, care codific pentru secvenele pre-editate i dou regiuni care specific
moleculele ARNs ghid. Genele pentru regiunile codante majore i pentru moleculele
lor ARNs ghid sunt rspndite (separate)
n principiu, o mutaie fie n gen sau n structurile care codific ARNs ghid
pot schimba secvena primar a ARNm, i astfel pe cea a proteinei. Pe criterii
genetice, fiecare dintre aceste uniti pot fi considerate c conin o regiune gen.
Dac unitile sunt exprimate independent, ele pot complementa desigur in trans.
Dac mutaiile sunt valabile, putem gsi prin urmare c sunt necesare 3 grupe de
complementare pentru a codifica pentru secvena primar a unei singure proteine.
Analiza i caracterizarea intermediarilor parial editai (prelucrai) sugereaz
c reacia se desfoar de-a lungul ARN pre-editat n direcia 3-5. Molecula ARN
ghid are nu numai rolul de a dicta specificitatea inserrii uridinelor prin mperecherea
sa cu ARN pre-editat dar i de a furniza concret resturile U care sunt inserate.
Molecula ARN ghid se termin n cu regiuni de 3-5 resturi de uridin, dup
care urmtoarele uridine sunt adugate pentru a genera cozile 3-oligo U. Cozile au o
lungime eterogen, variind de la 5 la 24 resturi U. Aceste uridine sunt inserate n
ARN prelucrat printr-o reacie care se aseamn cu splicingul intronilor din grupa I.
mperecherea dintre ARN ghid i ARN pre-editat se aseamn cu mperecherea dintre
regiunea IGS a intronului i exonul 5. Reacia se realizeaz prin dou
transesterificri.
n primul transfer, regiunea care urmeaz a fi prelucrat este atacat de 3-OH
al ultimului rest de uridin din coada ARN ghid cu care este mperechiat. Aceasta
realizeaz ruperea ARN pre-editat n dou pri. O parte o reprezint regiunea 5,
terminat printr-o grupare 3-OH. Cealalt parte este o molecul hibrid n care coada
3 a ARN ghid este legat covalent la ARN care urmeaz a fi prelucrat. Acest
intermediar este o molecul linear a crei structur este meninut prin mperecherea
bazelor.

219

n cel de al doilea transfer, gruparea 3-OH generat n urma primului transfer

atac legtura dintre cele dou resturi U din regiunea cozii ARN ghid. Se reface astfel
integritatea moleculei ARN pre-editat, care a ctigat un rest U i se reface structura
ARN ghid, care a pierdut un rest uridin din coad. Ciclul se repet pn la terminarea
procesului.
Structurile moleculelor parial prelucrate sugereaz c resturile de uridin sunt
adugate una cte una i nu n grup. Este posibil ca reacia s se realizeze prin mai
multe cicluri n care resturi de uridin sunt adugate, testate pentru
complementaritatea lor cu molecula ATN ghid, reinute dac sunt acceptate i dac nu
nlturate. Astfel ia natere gradat o molecul de ARN corect prelucrat. Nu se tie
nc dac acelai tip de reacii se desfoar i n cazul n care prelucrarea moleculelor
presupune nlturarea de resturi U sau adugarea de C.

Silde 59. Editarea ARN la protozoare

Figura: Mecanismele de editare a moleculelor de ARNm din kinetoplastul de la
Tripanosoma.
O secven ancor (albastru) din molecul de pre-ARNm ne-editat
hibridizeaz cu o secven ancor (galben) situat n poziia 5 a unei secvene ARN
ghid (ARNg), care direcioneaz apoi adugarea sau ndeprtarea de resturi U. Este
prezentat numai o mic regiune a pre-ARNM. Resturile U adugate sunt prezentate
n rou iar cele ndeprtate prin delta. Numerele ncercuite identific situsurile la
nivelul crora apare editarea.

Silde 60. Durata de via a moleculelor de ARNm

Silde 61. Efectul stabilizator al secvenelor AUUUA asupra timpului de
njumtire al ARNm (t1/2)
Figura: Demonstraia experimental a efectului de destabilizare a secvenelor
AUUUA asupra jumtii de via (T1/2) a ARNm
Celulele n cultur au fost transfectate separat cu vectori de expresie care
conin secvenele beta-globinelor prezentate n diagram i au fost determinate
jumtile de via ale ARNm exprimai . Secvenele AUUUA (rou) au fost ale genei
care codific pentru o citokin numit factor care stimuleaz coloniile granulocitemacrofage (GMCSF), al cror ARNm are o durat de via de aproximativ o or.
Inserarea lor n genele beta-globinei, care n mod normal exprim o molecul de
ARNm stabil, avnd drept rezultat scurtarea vieii ARNm recombinant pentru betaglobin.

Silde 62. Viteza de degradare a moleculelor de ARNm de la eucariote

este reglat
Figura: Reglarea Fe-dependent a stabilitii ARNm pentru receptorul pentru
transferin
Elementele de rspuns la Fe (IRE) poziionate n 3 n structura ARNm
prezint o structur stem sub form de bucl bogat n secvene AU (galben) care
promoveaz degradarea ARNm. La concentraii intracelulare sczute n Fe,
conformaia IRE-BP (verde nchis) este aceea care se leag la IRE, inhibnd astfel
degradarea. Drept rezultat, nivelul receptorului pentru transferin crete, astfel nct
mai mult Fe poate fi adus n celul.

220

Silde 63. Translaia unor molecule de ARNm este reglat specific de

proteine de legare
Figura: Reglarea dependent de Fe a translaiei ARNm pentru feritin.
La concentraii sczute n Fe legarea IRE-BP blocheaz iniierea translaiei.
Acelai mecanism controleaz translaia ARNm care codific ALA sintaza.
Elementele IRE ale acestor dou molecule de ARNm sunt localizate la captul 5 i
nu conin secvene bogate n AU care s promoveze degradarea i sunt prezente n
regiunea 3 a ARNm al receptorului pentru transferin.

Silde 64. ARN antisens regleaz translaia ARNm al transpozazei la

bacterii
Figura: Controlul antisens al translaiei ARNm al transpozazei codificat de
elementul bacterian mobil IS10
Captul 5 al ARNm al transpozazei (rou) produs de pe catena mai mic care
ncepe la PIN, este complementar cu captul 5 al moleculei ARN antisens (negru),
produs de catena de deasupra care ncepe la POUT. Deoarece POUT posed un
promotor mai puternic dect PIN, se va produce mai mult ARN antisens dect
transpozaz, astfel nct tot ARNm pentru transpozaz hibridizeaz cu ARN antisens
mai abundent. Att timp ct codomul de start AUG (verde) i secvena de legare la
ribozom Shine-Dalgarno (galben) sunt n regiunea hibridizat, iniierea translaiei
ARNm al transpozazei este blocat. Foarte rar translaia ARNm pentru transpozaz
este iniiat naintea hibridizrii cu ARN antisens, conducnd la o rat redus a
transpoziiei IS10

Silde 65. Concluzii

Editarea ARN reprezint modificarea secvenei nucleotidice a pre-ARNm n nucleu.
Cele cteva exemple de editare descoperite la vertebrate implic dezaminarea unei
singure baze din secvena ARNm, avnd drept rezultat modificarea aminoacidului
specificat de codonul corespunztor i producerea unei proteine funcionale diferite.
Procese de editare mult mai ample sunt prezente la ARNm mitocondrial de la
protozoare;
Anumite molecule de ARNm sunt direcionate ctre localizri subcelulare de
ctre secvene poziionate, de obicei, n regiunea 3 netradus. Se consider c aceste
secvene sunt inte pentru proteine care se leag specific la ARNm i care sunt
asociate cu proteinele motoare. Proteinele motoare transport apoi ARNm n poziii
specifice prin deplasarea de-a lungul filamentelor de actin ale citoscheletului sau
microtubulilor;
Stabilitatea diferitelor molecule de ARNm n citoplasm variaz foarte mult.
Totui, multe molecule de ARNm de la eucariote sunt destul de stabile iar altele au
durate de via foarte scurte. Acestea din urm, codific adesea pentru proteine si, n
general, posed copiii repetitive ale secvenei AUUUA la captul 3 netradus. Printrun mecanism necunoscut aceste secvene bogate n AU stimuleaz degradarea
ARNm;
Celulele eucariote pot regla rata de degradare sau traducere a unor molecule
de ARNm. De exemplu, interacia unei proteine specifice de legare la ARN cu
situsurile regiunii 3 netraduse din structura ARNm pentru receptorul transferinei
protejeaz ARNm de degradarea mediat de secvenele bogate n AU. Aceeai
protein, a crei activitate este reglat de concentraia intracelular de Fe, blocheaz

221

translaia mai multor tipuri de ARNm legndu-se la secvene specifice din regiunea
5 netradus;
La bacterii, translaia anumitor molecule de ARNm este represat de molecule
ARN antisens, care hibridizeaz la captul 5 al ARNm, prevenind astfel translaia
prin blocarea accesului subunitii ribozomale mici la codonul de iniiere.

Silde 66. Genele pre-ARNr sunt similare la toate eucariotele

Figura: Structura general a unitilor transcripionale pre-ARNr
Cele trei regiuni codante (albastru) codific pentru ARNr 18S, 5,8S i 28 S
prezente n ribozomii eucariotelor superioare sau a echivalenilor lor de la alte specii.
Ordinea acestor trei regiuni codante n genom este ntotdeauna 5-3. Variaiile de
lungime ale regiunilor spacer transcrise (tan) sunt responsabile de diferena major de
lungime a unitilor de transcripie de la diferite organisme.

Silde 67. Genele pre-ARNr funcioneaz ca organizatori nucleolari

Figura: Micrografie a cromozomilor politeni preparai de la musc i care conin o
singur transgen pre-ARNr

Silde 68. snoRNAs (small nucleolar RNAs) asist procesarea ARNr i

asamblarea subunitilor ribozomale
Figura: Procesarea pre-ARNr i asamblarea ribozomilor la eucariote
a) Intermediarii majori i timpul necesar pentru diferitelor etape de procesare a
pre-ARNr la eucariotele superioare. Proteinele ribozomale i nucleolare asociate cu
pre-ARNr 45S imediat dup sinteza sa, formeaz o molecul pre-RNP de 80S. Sinteza
ARNr 5S apare n afara nucleolului. Secvena secundar extins a ARNr nu este
reprezentat. De reinut c acest ARN constituie aprope 2/3 din masa subunitilor
ribozomale i proteina numai 1/3.
b)
Calea de procesare a transcriptului primarpre-ARNr de 6,6 kb (35
S) la Sacharomices cerevisiae. Regiunile spacer transcrise (tan) care sunt nlturate
n timpul procesrii, separ regiunile corespunztoare formelor mature 18S, 5,8 S i
25 S ARNr. Au fost identificai toi intermediarii trecui n diagram.

Silde 69. Moleculele de pre-ARNt sufer scindare i modificarea

bazelor
Figura: Procesarea pre-ARNt pentru tirozin implic patru tipuri de modificri
Un intron de 14 nucleotide (albastru) din bucla anticodon este ndeprtat prin
splicing. O secven de 16 nucleotide (verde) de la captul 5 este clivat de ctre RNaza P. Resturile U de la captul 3 sunt nlocuite de ctre secvena CCA (rou) care se
gsete n toate moleculele ARNt mature. Numeroase baze din bucla stem sunt
transfoirmate n baze modificate caracteristice (galben). Nu toi ARNt conin introni
care sunt matisai n timpul procesrii, dar toi sufer alte tipuri de modificri
evideniate n figur.
D=dihidrouridin; =pseudouridin

Silde70. Splicing-ul moleculelor pre-ARNt difer de celelalte

mecanisme de splicing
Figura: Mecanismul splicingului n pre-ARNt

222

pre-ARNt este clivat n dou locuri, de o parte i de alta a intronului, exciznd

astfel intronul. Mecanismul de clivare genereaz un fosfomonoester 2-3 ciclic la
captul 3 al exonului 5. Reacia de jonciune dintre doi exoni este o reacie n multe
etape care necesit doi nucleozid trifosfai: GTP, care contribuie la gruparea fosfat
(galben) pentru jonciunea 3-5 din molecula final ARNt; i o molecul ATP care
formeaz un intermediar ligaz-AMP activat- Gruparea 2 fosfat a exonului 5 este
nlturat n etapa final.
Informatii suplimentare
Splicingul ARNt
Modul n care sunt eliminai intronii ARNt a fost cel mai bine studiat i neles
la drojdie, dar anumite informaii au fost oferite n urma studiului altor eucariote
inferioare i plante. Toate enzimele implicate sunt cunoscute i purificate i toi
intermediarii sunt caracterizai. O endonucleaz specific pentru ARNt taie pre-ARNt
la nivelul jonciunii 5 a intronului, formnd un 2, 3-fosfodiester ciclic la
extremitatea regiunii 5 a ARNt. Aceeai enzim taie jonciunea celuilalt intron
producnd o grupare 5 hidroxil la extremitatea prii 3 a ARNt. Aceste clivri ne
aduc aminte de cele realizate de anumite RN-aze. Fosfodiesterul ciclic este apoi
deschis de ctre o fosfodiesteraz ciclic pentru a forma un 2 fosfomonoester. Dup
fosforilarea extremitii sale 5 hidroxil, exonul 3 este adenilat de ctre o ligaz
specific pentru ARNt; aceast ultim reacie este identic cu cea catalizat de ctre
ADN ligaze. Legarea celor dou jumti de molecule prin intermediul extremitilor
lor activate creeaz o legtur neobinuit 2 fosfat, 3, 5 fosfodiester. Eliminarea
fosfatului din 2, de ctre o fosfataz duce la formarea ARN matur. De reinut c
fosfatul noii legturi diester provine din ATP. Aceasta este o caracteristic care
distinge maturarea ARNt de la drojdii de cea de la vertebrate. n aceast serie de
reacii, clivarea endonucleazic iniial determin formarea de extremiti 5 hidroxil
i 3 fosfomonoester, acesta din urm fiind convertit n 2, 3 fosfodiester de ctre o
ciclaz ATP dependent. O ligaz specific pentru ARNt unete apoi cele dou
jumti fr a necesita activarea extremitilor.
Fracionarea sistemului de splicing de la drojdii a dus la obinerea unor
preparate nalt purificate a dou enzime. Una catalizeaz clivarea endonucleotidic la
nivelul jonciunilor intronului, iar cealalt posed, la nivelul unei singure polipeptide,
activitatea fosfodiesterazic, kinazic, de adenilare i ligazic. Cele dou enzime sunt
foarte specifice pentru reaciile de splicing ale ARNt; ele reacioneaz totui fr a
face distincie asupra tuturor intronilor ARNt i unesc oricare dou fragmente de
ARNt. Astfel au putut fi construite molecule de ARN hibride foarte interesante,
formate din dou jumti de molecule de la ARNt diferii.

Silde 71. *Organizarea transcriptului primar ARNr 45S

Structura cap de ciocan a unei ribozime
Figura: Organizarea transcriptului primar ARNr 45S;
Structura cap de ciocan a unei ribozime
Informatii suplimentare
Capacitatea catalitic a ARN de a schimba coninutul informaional al ARN i
rolul intronilor
Ideea c numai proteinele au activitate enzimatic a fost total rsturnat n
biochimie.

223

Mult vreme identificarea enzimelor cu proteinele a condus la punctul de vedere c

numai proteinele, cu variatele lor structuri tridimensionale i grupri laterale, posed
flexibilitatea s creeze situsuri active care s catalizeze reaciile biochimice.
Caracterizarea sistemelor implicate n procesarea ARN a demonstrat c acest punct de
vedere era deosebit de simplist.
Numeroase tipuri de reacii catalitice sunt acum cunoscute ca fiind catalizate
de ARN. Pentru a desemna un ARN cu proprieti catalitice se folosete termenul de
ribozime i este deja posibil caracterizarea activitii enzimatice ca i n cazul
enzimelor convenionale. Unele activiti catalitice ale ARN sunt direcionate ctre
substrate separate, n timp ce altele sunt intramoleculare i sunt descrise ca automaturare sau auto-splicing, n funcie de tipul de reacie:
- Enzima ribonucleaza P este o ribonucleoprotein care conine o singur
molecul de ARN legat la o protein. ARN posed capacitatea de a cataliza clivarea
substratului ARNt, n timp ce componenta proteic are un rol indirect, probabil n
meninerea structurii ARN catalitic.
- Moleculele mici de ARN din clasa viroizilor au capacitatea de a realiza
reacii de auto-clivare (self-cleavage). Cu toate c aceste reacii sunt intramoleculare,
molecula poate fi mprit ntr-o parte enzimatic i o parte substrat ale cror
funcii sunt independente.
- Intronii din grupa I posed capacitatea de a-i realiza propria maturare din
pre-ARNm n care sunt coninui Reacia poate fi realizat n vitro numai de ctre
ARN, dar in vivo ea este asistat de proteine. Aciunea intronilor din grupa I
genereaz molecule ARN care posed multe alte activiti catalitice corelate cu
activitatea de origine.
Tema comun a acestor reacii este c ARN poate realiza reacii intra i intermoleculare care implic clivarea sau reunirea legturilor fosfodiester in vitro. Cu toate
c specificitatea reaciilor i a activitii catalitice de baz este furnizat de ARN,
proteinele asociate cu acesta sunt necesare pentru realizarea reaciei in vivo.
Splicingul ARN nu reprezint singura modalitate prin care se pot introduce
modificri n coninutul ARN. n procesul de ARN editing, modificrile sunt
introduse la nivelul unor baze individuale, sau prin adugarea de baze particulare n
anumite poziii din interiorul ARNm. Inserarea de baze (de obicei resturi de uridin)
apare pentru transcripii diferitelor gene mitocondriale de la anumite eucariote
inferioare; anumite forme de splicing sunt utilizate pentru ruperea sau refacerea
legturilor dintre nucleotide, dar necesit, n acelai timp, o matri pentru codificarea
informaiei n noua secven.
Intronii au fost prima dat descoperii la eucariotele superioare. Nu au fost
evideniai la eubacterii (E. coli) dar au fost descoperii acum civa ani la anumite
archeobacterii (ceea ce ridic cteva probleme de filogenie). Acum nu se mai admite,
cum se credea n anii 1970-1980, c eucariotele descind din procariote. La ora actual
considerm, n urma diferitelor studii comparative ale secvenelor acizilor nucleici c
nu exist omologie, c archeobacteriile, procariotele i eucariotele sunt linii
independente. n 1981, Woese propune s se considere c cele trei direcii au un
strmo comun progenotele. De aceea Woese propune termenul de archeas n
locul celui de archeobacterii pentru a evita ideea unei filiaii ntre acestea i bacterii.
Intronii din grupa I au o structur secundar caracteristic
Toi intronii din grupa I au o structur secundar caracteristic (i probabil i
secundar). n figur este dat un model pentru structura secundar a intronului de la
Tetrahymena care const n formarea a 9 scurte regiuni de baze perechi (P1-9). Dou
dintre aceste perechi de baze sunt generate ntre elemente de secven conservate care

224

sunt comune intronilor din grupa I. P4 este construit din secvenele P i Q, care au
fiecare o lungime de 10 baze; 6-7 baze fiind implicate n mperechere. P7 este format
din secvenele R i S, care au o lungime de 12 baze, dar numai 5 baze sunt implicate
n mperechere. Celelalte perechi de baze variaz ca secven n fiecare intron
individual. Analize de mutaii au identificat un o regiune core (intron core) care
conine P3, P4, P6 i P7, care furnizeaz a regiune minim care poate realiza reacia
catalitic. P1 include captul 3 al exonului stng. Secvena din interiorul intronului
care se mperecheaz cu exonul este denumit IGS (internal guide sequence). (Acest
nume reflect faptul c iniial regiunea situat imediat n 3 fa de secvena IGS se
considera c se mperechiaz cu jonciunea de splicing 3, aducnd astfel cele dou
jonciuni mpreun). O secven foarte scurt de dou perechi de baze situat ntre P7
i P9 se mperecheaz cu secvena care precede imediat guanina reactiv (G414 la
Tetrahymena) la captul 3 al intronului.
Importana mperecherii bazelor n crearea structurii core n ARN este
demonstrat de proprietile mutaiilor cu aciune n cis (cis-acting) care mpiedic
splicingul intronilor din grupa I. Astfel de mutaii au fost izolate pentru intronii
mitocondriali de la mutani care nu putea ndeprta un intron in vivo, i au fost izolate
pentru intronul de la Tetrahymena prin transferarea reaciei de splicing ntr-un mediu
bacterial.
Construcia artat n figur permite ca reacia de splicing s fie realizat la E.
coli. Intronul auto-maturabil (intronul care sufer auto-splicing) este plasat ntr-o
poziie care ntrerupe cel de al 10-lea codon secvenei codante a -galactozidazei.
Proteina poate fi astfel tradus cu succes dup ARN numai dup nlturarea
intronului.
Sinteza -galactozidazei n acest sistem indic c splicingul poate s apar n
condiii foarte diferite de cele n care s-a realizat pentru Tetrahymena in vitro. O
interpretare a acestor rezultate este c auto-splicingul poate s se realizeze i n
celulele bacteriene. O alt posibilitate este aceea ca enzimele bacteriene s realizeze
aceast reacie.
Folosind aceast ncercare, putem introduce mutaii n intron pentru a vedea
dac acestea mpiedic reacia. Mutaiile n secvenele consens ale intronilor din
grupa I care modific mperecherea bazelor mpiedic splicingul. Mutaiile pot fi
inversate (reversie) prin realizarea unor modificri compensatoare care s restaureze
mperecherea bazelor.
Mutaiile n secvenele consensus corespunztoare intronilor mitocondriali din
grupa I au efecte similare. O mutaie ntr-o secven consens poate fi inversat printro mutaie n secvena consens complementar pentru a restaura mperecherea; de
exemplu, mutaiile n regiunea consens R pot fi compensate prin mutaii n regiunea
consens S.
mpreun aceste rezultate sugereaz c reacia de splicing a intronilor din
grupa I depinde de formarea structurii secundare ntre secvenele consensus pereche
din interiorul intronului. Principiul stabilit n urma acestor cercetri este c secvenele
distante de jonciunile de splicing sunt necesare pentru formarea situsului activ care
este capabil s realizeze auto-splicingul.
Ribozimele pot avea activiti catalitice variate
Activitatea catalitic a intronilor din grupa I a fost descoperit n virtutea
capacitii lor de automaturare, dar acetia pot realiza i alte reacii catalitice in vitro,
care le-a adus numele de ribozime. Toate reaciile pe care ei le realizeaz se bazeaz
pe transesterificri. Noi analizm aceste reacii n termenii relaiilor acestora cu
reacia de auto-splicing.
225

Activitatea catalitic a intronilor din grupa I este conferit de abilitatea

acestora de a genera o structur secundar i teriar particular, care creeaz situsuri
active, echivalente cu situsurile active ale enzimelor convenionale. n figur este
ilustrat reacia de splicing n termenii acestor situsuri (lund n considerare formarea
acestor situsuri)(este vorba de aceeai serie de reacii prezentat anterior.
Helixul P1 reprezint formarea situsului care leag substratul (substratebinding site), n care captul 3 al primului intron se mperecheaz cu IGS ntr-o
reacie intramolecular . Situsul care leag guanozina (guanosin binding site) este
format de secvenele din P7. Acest situs poate fi ocupat fie de un nucleotid guonozilic
liber, fie de un rest de guanozin din poziia 414. n prima reacie de transfer este
folosit nucleotidul guanozilic care apoi este nlocuit cu G414. De reinut c acest fapt
implic modificri ale conformaiei (comparabile probabil cu modificrile
conformaionale care au loc ntr-o enzim). Cel de al doilea transfer realizeaz unirea
exonilor i cel de al treilea creeaz intronul circular.
ARN L-19 este generat prin deschiderea intronului circular. Acesta pstreaz
nc abiliti enzimatice. Acestea sunt asemntoare cu activitile implicate n reacia
original de splicing. considerm c o molecul are funcie de ribozim n condiiile
n care pstreaz capacitatea de a se lega la o secven intramolecular
complementar cu IGS la nivelul situsului de legare a substratului, n timpul legrii
fie a nucleotidului G414 terminal sau a nucleotidului guanilic liber la G-binding site.
n figur este ilustrat mecanismul prin care se realizeaz extensia unui
nucleotid C5 pentru a genera un lan C6. Oligonucleotidul C5se leag la nivelul
substrate binding site, n timp ce G414 ocup G-binding site. Prin reaciile de
transesterificare, un C este transferat de pe C5 pe G situat n poziie 3 terminal i
apoi napoi pe o nou molecul C5. Urmtoarele reacii de transfer conduc la
acumularea unui oligonucleotid citozinic mai lung. Reacia este o adevrat cataliz
deoarece ARN L-19 rmne neschimbat, i este disponibil s catalizeze mai multe
cicluri. Ribozimul se comport astfel ca o nucleotidil-transferaz.
O serie de alte reacii enzimatice sunt prezentate n figur. Ribozima poate
funciona ca o endoribonucleaz specific pentru un anumit tip de secven prin
folosirea capacitii IGS de a se lega la secvene complementare. n acest exemplu,
IGS leag o matri extern care conine secvena CUCU, n loc s lege secvena
analog care se afl de obicei la captul exonului stng. Un nucleotid guanilic este
prezent n G-binding site, i atac secvena CUCU exact n modul n care este
atacat exonul n prima reacie de transfer. Se realizeaz clivarea secvenei int ntr-o
molecul 5 care se aseamn cu exonul stng, i ntr-o molecul 3 care poart la
capt un rest G. Prin introducerea de mutaii la nivelul elementului IGS, este posibil
modificarea specificitii ribozimei, astfel nct acesta s recunoasc secvenele
complementare noii secvene din regiunea IGS.
Reacia de clivare poate fi realizat i cu un substrat dezoxiribonucleotidic
complementar dar legarea moleculei de ADN se realizeaz mult mai slab ier reacia
de clivare are lob mult mai lent. Deoarece unica diferen ntre substratele ADN i
ARN este lipsa gruprii 2-OH din structura ADN, se sugereaz ideea c aceste
grupri sunt importante pentru legarea/sau desfurarea reaciei. Acest lucru
reprezint un argument n sprijinul ipotezei c splicingul este o proprietate a lumii
ARN, n care ARN constituia forma iniial de material genetic.
Odat cu modificarea IGS se schimb i specificitatea substrate binding site
fiind permis utilizarea altor secvene ARN int i generarea unei activiti de tip
ligaz. O molecul ARN care posed un capt 3-OH se poate lega la substrate
binding site, iar ARN care posed un capt 5-G se leag la G-binding site. Atacul

226

gruprii hidroxil asupra gruprii fosfat realizeaz conectarea celor dou molecule de
ARN i eliberarea restului G.
Reacia fosfatazei nu este direct legat de reaciile de transfer ale splicingului
(maturrii). O secven oligonucleotidic care este complementar cu IGS i terminat
n 3-fosfat poate fi atacat de G414, fiind astfel eliberat un oligonucleotid care
posed o extremitate 3-OH. Fosfatul poate fi transferat fie pe un oligonucleotid
terminat n 3-OH (realizarea efectiv a reaciei inverse) fie apei (eliberarea de fosfat
anorganic)
Reaciile catalizate de ARN pot fi caracterizate la fel ca i reaciile enzimatice
clasice, n termenii cineticii Michaelis-Menten. n tabel sunt trecute n revist reaciile
catalizate de ARN. Valorile KM ale reaciilor catalizate de ARN sunt sczute, ceea ce
implic o legare foarte specific a ARN la substratele asupra crora acioneaz.
Numerele de turnover sunt i ele sczute reflectnd o vitez catalitic sczut. De
fapt, moleculele de ARN, definite ca enzime la modul general, nu pot fi comparate cu
catalizatorii proteici unde numrul de turnover tipic este de 103-106.
Cazul intronilor care codific pentru maturaz
Studiul ADN din mitocondriile de om (i bovine) au permis observaia c
ADN din aceste mitocondrii este lipsit n ntregime de introni. Nu se poate spune
acelai lucru despre drojdii care posed introni n ADN mitocondrial. Echipa lui
Slonimski (Gif-sur Yvette) a demonstrat c un anume intron (intronul 2 al genei
citocromului b din mitocondriile de drojdii) codific pentru o protein. Aceast
protein provine nu numai din traducerea intronului 2, ci mai precis a exonului 1 +
exon 2 +ORF a intronului 2 (open reading frame, partea fr codon stop, n faz cu
exonul precedent). Aceast protein posed curioasa proprietate de a exciza intronul 2
(care i d natere). Din acest motiv, pn nu demult, nu se putea pune n eviden
aceast maturaz matricid care nu exist dect n cantiti foarte mici deoarece
imediat format aceasta distruge intronul din care provine (Tradus, trdtoare a
modalitate clar i expeditiv de a spune c proteina tradus este trdtoare
deoarece ea distruge chiar intronul care i-a dat natere).
Din contr, se poate pune n eviden aceast maturaz utiliznd o su de
drojdie mutant pentru care maturaza produs este inactiv fiziologic. n acest caz
intronul nu poate fi eliminat, i deci el poate continua s produc maturaz.
Aceeai echip a pus n eviden i maturaza produs prin expresia intronului
4. Aceast maturaz nu elimin numai propriul su intron, dar i un intron provenind
dintr-o gen vecin (care codific o subunitate a citocrom-oxidazei). Se sper c
aceti introni au alte funcii dect numai s codifice proteinele cu rol de excizie
(eliminare) a intronilor.
Cu toate c astfel s-a demonstrat, ntr-un mod foarte estetic, c un intron poate
fi tradus n protein n aceste cteva cazuri excepionale, nu se cunoate nc bine
rolul intronilor. n plus, nu putem nc generaliza aceste rezultate obinute pentru
genele mitocondriale de la drojdie.
Cazul intronilor care codific pentru endonucleaz
S-a observat, la anumite tulpini de S. cerevisiae, c un intron situat n gena
ARNr codific pentru o endonucleaz care permite ca ADN din alte tulpini s fie
decupat i s primeasc un intron.
Anumii introni att din grupul I ct i din II conin faze de lectur care pot fi
traduse n proteine. Sunt cunoscute mai bine funciile proteinelor codificate de
anumii introni din grupa I. Rolul acestora este s ajute intronul s perpetueze singur
la hibrizi n care alelele genei relevante difer ntre ele prin posesia acestor introni.

227

Polimorfismul prezenei sau absenei intronilor este destul de comun n

mitocondriile fungilor (ciupercilor). Aceasta este n concordan cu ipoteza c aceti
introni sunt la origine inserii la nivelul genelor. Puin lumin n acest proces se
poate face prin analiza recombinrii la hibrizi care privesc gena pentru molecula mare
ARNr de la mitocondriile de drojdie.
Aceast gen are un intron din grupa I care conine o secven codant.
Intronul este prezent la anumite tulpini de drojdie (numite +) dar absent la altele ().
Hibrizii genetici ntre + i - sunt polari: progeniturile sunt de obicei +.
Dac ne gndim c tulpina +. reprezint donorul i tulpina - este privit ca
recipient (primitor), constatm c n hibrizii + x - se genereaz o nou copie a
intronului n genomul -. Drept rezultat toate progeniturile sunt +.
Mutaii pot s apar la oricare din prini i s elimine polaritatea. Mutanii
manifest o segragare normal cu un numr egal de progenituri + sau -. Mutaiile
indic natura acestui proces. Mutaiile n tulpinile - apar lng situsul unde intronul
trebuie s se insereze. Mutaiile n tulpinile + sunt prezente la nivelul fazei de
lectur a intronului i mpiedic producerea proteinei. Aceasta sugereaz modelul din
figur n care proteina codificat de intron n tulpina + recunoate situsul la nivelul
cruia intronul trebuie inserat n tulpina - i face ca acesta s fie motenit
preferenial.
Care este aciunea proteinei? Produsul intronului este o endonucleaz care
recunoate gena - drept int pentru o clivare dublu catenar. Endonucleaza
recunoate o secven int de 18 pb care conine situsul unde intronul va fi inserat.
Secvena int este clivat pe fiecare catena ADN la 2 baze ctre captul 3 al situsului
de inserie. Deci situsul de clivare are 4 pb separate , i genereaz monocatene libere
(care atrn). Acest tip de clivare este asemntor clivrii caracteristice
transpozomilor cnd acetia migreaz la situsuri noi. Ruperea dublei catene iniiaz
probabil un proces de conversie genic n care secvena genei + este copiat pentru a
nlocui secvena genei -. De reinut c inserarea intronului ntrerupe secvena
recunoscut de ctre endonucleaz, asigurnd astfel stabilitatea procesului.
i ali introni care conin faze deschise de lectur sunt i mobili. Seria
exemplelor de introni mitocondriali la fungi poate fi continuat. Un alt caz este al
celor doi introni de la fagul T4 care sunt motenii preferenial asemenea intronului ,
i a unui intron prezent n gena nuclear pentru ADNr de la Physarum care se
insereaz n orice molecul acceptor de la hibrizi adecvai. n general mecanismul
perpeturii unui intron pare s fie acelai: intronul codific pentru o endonucleaz
care taie specific o secven int la nivelul creia va fi inserat. Exist totui diferene
privind detaliile inserrii: de exemplu, endonucleaza codificat intronul fagului T4 td
taie o secven int situat la 24 pb mai sus situsul (n amont) la nivelul cruia
intronul se va insera.
n ciuda mecanismului comun de mobilitate a intronului, nu exist omologie
ntre secvenele situsurilor int sau ale regiunilor codante ale intronului. Putem
considera c intronii au avut o origine evolutiv comun, dar evident ei au suferi o
mare divergen. Secvenele int sunt dintre cele mai lungi i totodat cele mai
specifice cunoscute pentru endonucleaze. Specificitatea asigur perpetuarea intronului
numai prin inserare la un singur situs aparinnd secvenei int i nu oriunde n
genom.
Aceste descoperiri ntresc punctul de vedere c intronii care posed secvene
codante i au originea n elemente independente care codific pentru o funcie
corelat cu capacitatea de splicing a ARN sau de migrare ntre moleculele ADN. n

228

concordan cu aceast idee, modul de utilizare al codonilor este diferit n regiunile

codificate de introni comparativ cu situaia existent n exoni. n acelai timp, intronii
de acest tip difer probabil de intronii nucleari prin originea lor. Se pare c acetia
sunt mai degrab inserai n gene pre-existente, n timp ce intronii nucleari par s
reprezinte structuri remanente ale genelor primare.
ARN poate avea activitate ribonucleazic
Una din primele demonstraii privind capacitatea ARN de a avea activiti
enzimatice a fost analiza ribonucleazei P, o endonucleaz izolat de la E. coli care
este responsabil de procesarea ARNt. Ribonucleaza P poate fi disociat n cele dou
componente ale sale, o molecul de ARN de 375 baze i o polipeptid de 20 000. n
condiiile iniiale folosite pentru a caracteriza activitatea enzimatic in vitro, ambele
componente erau necesare pentru a realiza scindarea substratului.
Modificarea condiiilor ionice, creterea concentraiilor de Mg2+, fac
componenta proteic inutil. n aceste condiii singur ARN poate cataliza reacia.
Analiznd rezultatele considernd c ARN este o enzim, fiecare enzim
catalizeaz clivarea a cel puin patru substrate. De fapt, activitatea ARN nu este mult
mai mic dect activitatea preparatelor crude de ribonucleaz P.
Prin analiza diferitelor mutaii prezente n gena ARN sau n gena care codific
proteina i care determin inactivarea RN-azei P, se cunoate faptul c in vivo ambele
componente sunt necesare pentru activitatea natural a enzimei. Iniial s-a considerat
c enzima asigur activitatea catalitic i c ARN are un rol secundar, de exemplu de
a coopera n legarea substratului (prin intermediul unor secvene scurte
complementare cu regiuni expuse din ARNt). De fapt aceste roluri sunt inverse.
Cum se poate demonstra c ARN conine centrul catalitic? Aceast capacitate
pare rezonabil dac considerm existena unui centru activ ca o regiune (suprafa)
care expune o serie de grupri active ntr-o relaie fix. Pentru protein, gruprile
active sunt furnizate de lanurile laterale ale aminoacizilor, care posed o apreciabil
varietate, incluznd grupri ionice pozitive i negative i grupri hidrofobe. ntr-o
molecul de ARN, prile disponibile sunt mult mai restrnse, constnd n principal n
gruprile expuse ale bazelor. Putem presupune c scurte regiuni sunt dispuse ntr-o
conformaie molecular secundar sau teriar, furniznd o suprafa de grupri active
capabil s menin un mediu n care legturile pot fi rupte i refcute ntr-o alt
molecul. Pare inevitabil ca interaciile ntre ARN cu funcie catalitic i ARN
substrat s se bazeze pe crearea unui micromediu rezultat din mperecherea bazelor.
Implicaiile evolutive ale acestor descoperiri sunt curioase. Personalitatea
debordant a aparatului genetic, n care ARN este prezent la nivelul tuturor
componentelor, dar proteinele realizeaz reaciile catalitice, a fost sfrmat. Pare
puin probabil ca cele mai ndeprtate evolutiv sisteme de replicare s fi avut n
compoziia lor att acizi nucleici ct i proteine.
Se poate considera (emite ipoteza) c primele sisteme conineau numai acizi
nucleici cu capacitate de autoreplicare i cu activiti catalitice primitive, exact cele
care s realizeze ruperea legturilor fosfodiester. Dac presupunem c implicarea
legturilor 2 n reaciile curente de splicing este derivat din aceste reacii catalitice
primitive, putem argumenta c acidul nucleic original (ancestral) a fost ARN, atta
timp ct ADN care nu posed grupri 2-OH nu poate realiza aceste reacii. Proteinele
au putut fi adugate (cooptate) datorit capacitii lor de a stabiliza structura ARN,
care erau precar meninut fr existena unui astfel de suport. Se poate considera c
versatilitatea (capacitatea de a ndeplini mai multe funcii, multilateral) proteinelor
le-a permis s preia (o parte din) cataliza reaciilor chimice, conducnd eventual la un
complex i la un aparat sofisticat al expresiei moderne a genelor.

229

Activitatea catalitic a RN-azei P necesit ARN pentru a funciona drept

catalizator al unui substrat extern. Un alt exemplu pentru capacitatea ARN de a
funciona ca o endonucleaz este furnizat de cteva molecule mici de ARN de la
plante (aprox 350 baze) care realizeaz o reacie de auto-clivare. Ca i n cazul
intronilor din grupa I este posibil realizarea unor construcii care s funcioneaz cu
substrate externe.
Trei tipuri de molecule mici de la plante se ncadreaz n dou grupuri
generale: viroizii i virusoizii.
Viroizii sunt molecule de ARN infecioase care funcioneaz independent fr
ncapsidare cu orice protein.
Virusoizii sunt similari ca organizare, dar sunt ncapsidai de ctre virusurile
plantelor, fiind mpachetai mpreun cu genomul viral. Aceti virusoizi nu se pot
replica independent i necesit asisten de la virus (viral). Virusoizii sunt numii
adesea ARNs satelii.
Att viroizii i virusoizii par s se replice dup modelul cercului rotativ.
Catena ARN care este mpachetat n virus este denumit catena plus. Catena
complementar. generat n timpul replicrii ARN este denumit catena minus. Au
fost detectai multimeri ai celor dou forme. Ambele tipuri de monomeri sunt probabil
generate prin clivarea cozii unui cerc rotitor: catena circular plus este generat prin
legarea capetelor monomerului linear.
Ambele catene plus i minus ale viroizilor sufer auto-clivare in vitro: Reacia
de clivare este promovat de ctre cationi metalici divaleni; acetia genereaz capete
5-OH i 2-3-fosdiester ciclic. Unele dintre moleculele ARNs cliveaz in vitro n
condiii fiziologice. Altele sufer procesul numai dup un ciclu de nclzire i rcire;
aceasta sugereaz c moleculele izolate de ARN au o conformaie inadecvat, dar c
se poate genera o conformaie activ cnd sunt supuse procesului de denaturarerenaturare.
S-a demonstrat c majoritatea viroizilor i virusoizilor care sufer auto-clivare
au, n principiu, o structur secundar sub form de ciocan. Secvena acestei
structuri este suficient pentru clivare. Cnd secvenele nconjurtoare sunt eliberate
nu mai este necesar ciclul de nclzire-rcire, i micile molecule de ARN autocliveaz spontan. Aceasta sugereaz c secvenele aparinnd structurii cap de
ciocan interfer cu formarea sa.
Situsul activ este o secven de numai 58 nucleotide. Capul de ciocan
(hammerhead) conine 3 regiuni stem-loop (bucle) ale cror poziie i mrime sunt
constante, i 13 nucleotide conservate, marea majoritate n regiunile care conecteaz
(leag) centrul structurii. Bazele conservate i duplexul stem genereaz o conformaie
a moleculei de ARN (un ARN) cu o capacitate intrinsec de clivare.
Nu este necesar ca structura s se formeze prin mperechere intramolecular a
bazelor. O structur activ cap de ciocan poate fi generat prin mperecherea unui
ARN care reprezint o parte a structurii cu un ARN care reprezint cealalt parte. n
partea de jos a figurii este dat un exemplu de cap de ciocan generat prin
hibridizarea a 19 baze ale unei molecule cu 24 de baze ale altei molecule. Hibridul
mimeaz structura cap de ciocan, cu omiterea buclelor (loops) I i III. Cnd
mperecherea dintre cele 19 i baze se realizeaz clivarea ntr-o poziie adecvat de la
nivelul structurii.
Putem s privim partea de sus a structurii ca reprezentnd substratul i
partea de jos ca reprezentnd enzima. Cnd moleculele ARN care conin regiunea
de 19 baze sunt puse n contact cu un exces de molecule ARN de 24 baze, mai multe
copii de 24 baze sunt clivate. Aceasta sugereaz c exist un ciclu al mperecherii

230

fragmentelor de 19 i 24 baze, clivare, disocierea fragmentelor clivate de molecula

ARN de 19 baze, i re-mperecherea acesteia cu un nou substrat de 24 baze. Astfel
molecula de ARN de 19 baze este o ribozim cu activitate endonucleazic. Parametrii
reaciei sunt similari cu cei ai altor reacii catalizate de ARN.
S-a demonstrat c este posibil desemnarea unor combinaii emzim-substrat
care s formeze structuri cap de ciocan, i acestea s poat fi folosite pentru a
demonstra c introducerea n mediu a unor molecule adecvate de ARN permite
apariia reaciei de clivare in vivo. O ribozim proiectat astfel furnizeaz o activitate
de restricie specific orientat ctre o int ARN. Prin plasarea ribozimei sub
controlul unui promotor reglator, aceasta poate fi folosit n acelai fel ca (de
exemplu) construciile antisens construite special pentru a modifica expresia unei
gene int n anumite circumstane.

Silde 72. Concluzii

Asemeni moleculelor pre-ARNm, transcripii primari produi din genele preARNr i ARNt sufer procesri extensive;
Sinteza unui precursorului pre-ARNr (45S n eucariotele superioare) de ctre
ARN polimeraza I i procesarea acestuia apare n nucleol;
Clivarea, digestia exonucleotidic, i modificarea bazelor pre-ARNr 45S
conduce la molecule mature 28S, 18S i 5,8S ARNr, care se asociaz cu proteinele
rizozomale n subunitile ribozomale. O serie de snoARN (small nucleolar RNA)
particip la procesarea ARNr;
ARNr 5S, care este sintetizat n nucleoplasm de ctre ARN polimeraza III, nu
este produs extensiv naintea asamblrii cu alte molecule de ARNr i proteine pentru a
forma subunitatea ribozomal;
Primele molecule de ARNr catalitic (ribozime) descoperite au fost intronii de
grup I din ARNr de la Tetrahymena. Auto-splicingul intronilor de grup I i II, i
splicingul pre-ARNm la nivelul spliceozomilor se realizeaz prin intermediul a dou
reacii de transesterificare;
Transcripia genelor ARNt de ctre ARN polimeraza III i procesarea
transcripilor primari apare n nucleoplasm. n toate moleculele de pre-ARNt,
secvena captului 5 este ndeprtat de RN-aza P, o ribonucleoprotein care conin
un ARN catalitic; CCA este adugat la captul 3; o serie de baze interne sunt
modificate;
Unele molecule de pre-ARNt conin un intron scurt n interiorul buclei
anticodon. Acesta este nlturat de enzime printr-un mecanism distinct de mecanismul
de splicing al pre-ARNm i auto-splicingul intronilor;

231

NOTE DE CURS BM5

TRADUCEREA

Produii transcripiei (ARNt, ARNr i ARNm) particip toi la transferul

informaiei genetice n proteine, dar numai ARNm este depozitarul (cel care
depoziteaza informaia) informaiei. Termenul de traducere desemneaz ansamblul
mecanismelor care transforma informaia secvenei ARNm n proteine. Transferul
informaiei de la secvena nucleotidica la secvena proteica presupune existena unui
sistem de codificare ntre cele dou tipuri de secvene, numit cod genetic. Ribozomii
i ARNt sunt celelalte dou componente implicte puternic n masinaria de traducere
(in mecanismul de traducere). Pe langa acestea, intervin mai multe zeci de alte
proteine i molecule diferite (aminoacil-ARNt transferazele, nucleozid trifosfatii
(ATPi GTP), proteinele de iniiere (IF), de alungire (EF)i de oprire (RF).
Codul genetic
Codul genetic gireaz corespondena ntre secvena nucleotidica a unui ARNm
i secvena aminoacizilor unei proteine. Secvenele nucleotidice sunt citite secvenial
sub forma de triplete. Fiecare triplet este numit codon nu exist suprapunere n lectura
codonilor succesivi. Un nucleotid care a servit pentru lectura unui codon nu poate
servi pentru lectura altui codon. Astfel, primul codon al unei secvene este foarte
important deoarece el definete cadrul de lectura pentru restul secvenei. Deoarece
nu exista suprapunere, sunt posibile doar trei cadre de lectura. n funcie de cadrul de
lectura secvena n aminoacizi va fi diferita.
Descifrarea codului genetic a fost realizat (a fost permis) de experienele in
vitro cu polinucleotide de sintez. Nirenberg i Matthaei (1961) au sintetizat
poliribonucleotide cum este poli U i au furnizat (imaginat) condiiile necesare pentru
traducerea lor. Polipeptida obtinuta este o polifenilalanina. Aceeasi experienta,
repetata cu polimeri de A i C au dat polipeptidele poliLys i poliPro. A i CCC
codifica respectiv pentru lizina i prolina.
Ceilali codoni au fost elucidai prin traducerea poliribonucleotidelor cu
secvene dinucleotidice sau trinucleotidice alternative. De exemplu, un poliAC poart
doi codoni posibili ACA i CAC indiferent de cadrul de lectur adoptat. Traducerea
sa furnizeaz un amestec echimolecular de histidin i de treonin. Identificarea
codonilor acestor aminoacizi a fost realizat printr-o alt experien. Este vorba de
sinteza unui polimer format din A i din C n rapoarte molare de 5:1. n acest polimer
codonul AAA va fi cel mai reprezentat statistic iar codonul CCC cel mai puin
reprezentat. Amestecurile codonilor (A2)C (AAC, ACA i CAA) vor fi mult mai
frecvente dect A(C2) (CCA, CAC i ACC). Analiza compoziiei n aminoacizi, a
produilor de traducere, indic c numai histidina poate fi codificat de A(C2).
Rezult c CAC codific histidina i ACA treonina.
n alte experiene, au fost utilizai, ntr-un sistem de traducere, polimeri
formai din trei sau patru nucleotide. Un polimer format din trei nucleotide ([UUG]n
de exemplu) furnizeaz trei tipuri de peptide: poliLeu, poliCys i poliVal, n funcie
de cadrul de lectur utilizat. Un polimer format din patru ([UUAC]n de exemplu)
furnizeaz un tetrapeptid Leu-Leu-Thr-Tyr. n final, aceste experiene i altele au
permis stabilirea n ntregime a codului genetic.
Iniierea traducerii utilizeaz adesea codonul AUG i uneori codonii GUG i
UUG. Aminoacidul ncorporat este n toate cazurile Met (sau formil-Met la bacterii).

232

Aceeai codoni codific pentru Met, Val i Leu cnd nu sunt folosii ca semnal pentru
nceperea traducerii.
ncheierea (terminarea) traducerii se realizeaz cnd ribozomul ntlnete unul
dintre codonii non sense (UAA, UAG, UGA) indicai n tabel prin Stop.
Aminoacizii sunt desemnai prin trei litere i respectiv o liter de cod.
tiind c codonii sunt triplete i c exist patru baze n structura ARN (G, A,
U, C), sunt posibile teoretic 43 adic 64 de triplete diferite. 61 dintre acestea au sens,
adic codific pentru aminoacizi i trei sunt numii non sens (fr sens) (UAA,
UGA, UAG) deoarece nu exist ARNt care s posede anticodoni complementari.
Aceti codoni fr sens sau Stop, sunt codonii care marcheaz terminarea sintezei
proteice. Acelai aminoacid poate s fie codificat de mai muli codoni diferii (tabel
V). Astfel, histidina este codificata de doi codoni, CAU i CAC, iar arginina de
codonii: CGU, CGC, CGA, CGC, AGA i AGG. n medie, unui aminoacid i
corespund trei codoni. Din aceast cauz codul genetic este numit degenerat sau
redundant. Codul genetic este n acelai timp numit universal deoarece aminoacizii
au aceeai codoni indiferent de sistemul biologic care asigur traducerea. Totui
exist cteva excepii ale codului universal, mai ales n cazul sintezei proteice
mitocondriale. Astfel, la nivel mitocondrial, UGA nu are semnificaia de codon non
sens ci codon Trp. Metionina poate fi codificat de AUG i AUA. AGG i AGA nu
mai reprezint codoni pentru Arg ci codoni Stop la fel ca si AUA i UAG.
Moleculele de ARNt izoacceptoare
Aminoacizii nu au afinitate specific pentru ARNm. Ei se ataeaz matricelor
de ARNm prin intermediarul adaptatorilor, moleculele de ARN de transfer (ARNt).
Moleculele de ARNt sunt molecule de mrime mic (masa lor este de
aproximativ 25 000, 75 de baze). Ele prezint particularitatea de a fi modificate dup
sintez. Astfel, anumite baze sunt metilate, altele transformate n baze rare (cum sunt
dihidrouridina, inozina), etc.
Moleculele de ARNt adopt o configuraie spaial compact n form de L
inversat. Din comoditate, structura este frecvent reprezentat depliat sub forma unei
frunze de trefl cu patru tije formate din baze mperecheate prin legturi de hidrogen
i trei regiuni n form de bucl (limburile frunzei) ne-mperecheate. Extremitatea 5 a
ARNt este tot timpul ocupat de ctre G, n timp ce extremitatea 3OH se termin prin
secvena CCA a crei funciune 3OH a adenozinei este esterificat cu gruparea
COOH a aminoacidului.
Bucla anticodonului poart o secven de trei baze, ncadrat n 3de o purin
i n 5 de un U. Aceasta recunoate i hibridizeaz codonul complementar existent pe
ARNm. Astfel, exist o coresponden specific ntre aminoacidul fixat la ARNt i
anticodon. Anumite molecule de ARNt conin nucleotidul inozin (nucleotid a crui
baz azotata este hipoxantina). Inozina poate forma legturi de hidrogen cu U, C i A.
In concluzie, acelai ARNt se poate mperechea cu trei codoni diferii care corespund
aceluiai aminoacid.
nainte de a participa la traducerea ARNm, moleculele de ARNt fixeaz
aminoacidul corespunztor anticodonului lor: Fiecare aminoacid este mai nti activat,
n prezen de ATP, de ctre enzima aminoacil ARNt sintetaza care catalizeaz ntro prim etap formarea aminoacil-AMP:
Aminoacil-ARNt sintetaza
Aminoacid + ATP
[Aminoacil-AMP] - Enzim + PPi
Enzima rmne legat de complexul aminoacil-AMP pn la ntlnirea unui
ARNt specific aminoacidului. n a dou etap, aminoacidul este transferat pe
extremitatea 3OH a ARNt i formeaz un aminoacil-ARNt numit i ARNt ncrcat:

233

[Aminoacil-AMP]-Enzima + ARNt
Aminoacil-ARNt + AMP +
Enzim
Asamblarea proteinelor se realizeaz plecnd de la aceti aminoacil-ARNt. n
funcie de aminoacidul transportat, aminoacil-ARNt va fi numit alanilARNtAla (sau
Ala-ARNtAla), Glicil ARNtGly(sau Gly-ARNtGly), etc.
Evidenierea relaiilor codon: anticodon: aminoacid transportat de ARNt a fost
realizat n urma experienelor lui Nirenberg i Leder (1964). Ribozomii incubai cu
ARNm poliU i Phe-ARNtPhe fixeaz cei doi acizi nucleici. Dac Phe-ARNtPhe este
nlocuit de ctre un alt aminoacil-ARNt, nu are loc fixare de ctre ribozomi. Deci,
Phe-ARNtPhe recunoate specific codonul UUU graie anticodonului su. Prin
modificarea secvenei ARNm, a fost posibil determinarea speciilor (moleculelor) de
ARNt care recunosc diferiii codoni. Deci, ntr-o celul se gsesc douzeci de
aminoacizi diferii care sunt transportai de aproximativ aizeci de molecule de ARNt
la ncrcarea crora particip acelai numr de ARNt sintetaze corespunztoare. n
consecin, anumii codoni pot fi recunoscui de mai muli ARNt care transport
acelai aminoacid, ARNt izoacceptori, n timp ce alii, codonii Stop, nu sunt
recunoscui de nici unul.
Ribozomii
O dat ncrcai, ARNt se combin cu ribozomii pentru a asigura sinteza
proteic. Ribozomii, particulele citoplasmatice constituite dintr-o subunitate mare i o
subunitate mic, ambele formate din ARNr i proteine, au compoziii diferite la
procariote i la eucariote. Ribozomii sunt constitueni majori n celul. Colibacilul
conine aproximativ 15 000 ribozomi reprezentnd aproximativ 25% din masa uscat
a celulei. Comparaia secvenelor proteinelor ribozomale de la mai multe organisme
relev o foarte mare conservare n cursul evoluiei. Moleculele de ARNr sunt i ele la
fel de bine conservate. Cele dou subuniti sunt adesea libere i nu se asociaz dect
n momentul traducerii ARNm. Funcia principal a ribozomilor este de a orienta
corect ansamblul aminoacil-ARNt n raport cu ARNm pentru a crea legturile
peptidice. Mai muli ribozomi pot ncepe traducerea succesiv a aceleiai molecule de
ARNm, ei gsindu-se astfel legai sub forma unui irag de mrgele care constituie un
polizom sau un poliribozom.
Sinteza proteic
Traducerea ARNm n proteine se realizeaz ntotdeauna n sensul 5-3. La
procariote, traducerea ncepe chiar nainte de terminarea transcripiei. La eucariote,
transcripia se realizeaz n nucleu n timp ce traducerea are loc n citoplasm. Deci,
moleculele de ARNm sunt transcrise i apoi maturate n nucleu. Ele migreaz apoi n
citoplasm pentru a fi traduse n proteine.
Traducerea poate fi mprit n trei etape eseniale: demararea sau iniierea,
alungirea sau elongarea i oprirea sau terminarea.
Demararea sau iniierea
Iniierea traducerii corespunde legrii ribozomului la ARNm, cutrii
codonului de iniiere (orientrii dup codonul de iniiere) i fixarea primului
aminoacil-ARNt.
Demararea sintezei proteice la bacterii ncepe deci cu formarea unui complex
ntre subunitatea mic, 30S, primul aminoacil-ARNt i o molecul de ARNm.
Subunitatea mare, 50S, se leag la acest complex pentru a forma ribozomul
70S funcional. n cursul sintezei tuturor peptidelor bacteriene, primul aminoacid
incorporat este N-formil-metionina (metionin modificat care posed o grupare

234

formil fixat de radicalul amino-terminal) al crui codon principal este AUG, adesea
GUG. Datorit faptului c gruparea amino a formil-Met (fMet) este blocat, un astfel
de aminoacid nu poate fi inserat dect la nceputul catenei (lanului).
Factorii denumii de iniiere (IF pentru Initiation Factors) necesari sunt
proteinele IF1, IF2 i IF3 (la eucariote au fost evideniai cinci astfel de factori).
Aceti factori se fixeaz la subunitatea 30S n timpul primei etape de iniiere, iar GTP
legat la IF2 este elementul stabilizator al acestei fixri. n acest stadiu, factorul IF3
mpiedic asocierea subunitilor 30S i 50S. Cea de a dou etap este asocierea fMetARNtfMet i a ARNm la ansamblul IF-30S-GTP. Asocierea presupune intervenia unei
secvene mici din structura ARNm AGGAGGU, numit situs de fixare la ribozom
sau rbs (ribosome binding site) sau secven Shine-Dalgarno complementar unei
secvene prezent n structura ARNr care particip astfel direct la iniiere selecionnd
situsul de demarare a traducerii: codonul AUG iniiator este definit prin hibridizarea
dintre secvena rbs i o secven apropiat de extremitatea 3 a ARNr 16s (fig. 3. 20).
Eliberarea IF3 permite asocierea celor dou subuniti, hidroliza GTP i
eliberarea altor doi factori de iniiere. Complexul obinut este numit complex de
iniiere 70S.
La eucariote, ribozomii recunosc coiful (capionul) metilat graie unor factori
numii proteine de fixare a coifului (cap binding protein). Acetia alunec apoi dea lungul ARNm plecnd de la extremitatea 5 pn la ntlnirea primului codon AUG
iniiator. Factorii adiionali de iniiere favorizeaz, n aceast etap, desfacerea
structurilor secundare susceptibile de oprirea procesului.
Alungire sau elongare
Elongarea implic formarea unei legturi peptidice ntre aminoacizi i
deplasarea ribozomului de-a lungul ARNm.
Lectura ARNm ncepe de la extremitatea 5 i se realizeaz n direcia 5-3.
Fiecare ribozom posed dou situsuri de fixare a ARNt. Acestea sunt situsurile P
(Peptidil) i A (Aminoacil).
Fixarea ribozomului la ARNm se realizeaz astfel nct fMet-ARNfMet s fie
poziionat n situsul P pentru a se putea mperechea cu codonul AUG de pe ARNm.
Situsul A disponibil poate astfel primi aminoacil-ARNt al crui anticodon corespunde
celui de al doilea codon din structura ARNm. O legtur peptidic se stabilete ntre
gruparea COOH al primului aminoacid i gruparea NH2 a celui de al doilea graie
enzimei numit peptidil-transferaz, component a subunitii 50S. Formarea legturii
peptidice transfer gruparea COOH a aminoacidului din situsul P gruprii amino a
aminoacidului care se gsete n situsul A. Astfel, extremitatea COOH a catenei n
formare se termin ntotdeauna cu o molecul de ARNt. Lanul peptidic este sintetizat
ncepnd de la extremitatea NH2 ctre extremitatea COOH. n urma formrii legturii
peptidice ARNtfMet descarc aminoacidul si prsete situsul P. n acest moment
(atunci) dipeptida se gsete legat la ARNt care purta al doilea aminoacid i este
poziionat (plasat) n situsul A. n continuare, acest peptidil-ARNt se deplaseaz n
situsul P prin micarea relativ a ARNm cu o lungime de trei baze. n acest moment
situsul A liber poate primi un nou aminoacil-ARNt. O dat ajuns n situsul A, o alt
legtur peptidic asociaz aminoacidul cu cel care l precede n situsul P. Elongarea
polipeptidului se realizeaz prin repetarea acestor micri.
Alungirea catenei polipeptidice necesit dou molecule de GTP care sunt
hidrolizate pentru fiecare aminoacid adugat. Factorii de elongare (EF pentru
Elongation Factors) sunt i acetia indispensabili. EF-Tu reacioneaz cu GTP i
ARNt ncrcat pentru a forma complexul aminoacil-ARNt-GTP-EF-Tu care plaseaz
aminoacil-ARNt n situsul A de pe ribozom folosind energia eliberat prin hidroliza

235

GTP n GDP. Deplasarea peptidil-ARNt din situsul A n situsul P este dependent de

factorul de elongare G (EF-G) numit i translocaz. EF-G reacioneaz prin asocierea
GTP la ribozom. Acesta permite translocarea i eliberarea ARNt din situsul P.
Reutilizarea acestui factor de elongare necesit de asemenea hidroliza unei molecule
de GTP n GDP i Pi.
Mecanismele de alungire (elongare) a catenei polipeptidice la eucariote s-au
dovedit similare cu participarea factorilor de elongare eEF-1 i EF2 care au roluri
similare cu EF-Tu, EF-Ts i EF-G.
Oprirea sau terminarea
Terminarea cuprinde detectarea codonului de oprire, ruperea legturii ester
dintre ultimul ARNt i catena polipeptidic i eliberarea acesteia.
Sunt necesare dou condiii:
- prezena unui codon care specific (codific) oprirea elongrii;
- intervenia unui factor de disociere (RF sau Release Factor) capabil s
recunoasc semnalul de terminare a catenei i s favorizeze ruperea legturii cu ARNt
i eliberarea catenei.
n componena codului genetic exist trei codoni de oprire recunoscui (citii)
de proteine specifice care la E. coli sunt RF1 (recunoate UAG i U A) i RF2
(recunoate UGA i U A). Acetia favorizeaz interacia catenei n formare cu o
molecul de ap i eliberarea lanului.
Cnd mrimea unei catene polipeptidice atinge douzeci i cinci de
aminoacizi, codonul de iniiere AUG de pe ARNm este complet liber i se poate iniia
o nou demarare. Fenomenul se reproduce de mai multe ori pn cnd ARNm este
acoperit de ribozomi distanai ntre ei prin aproximativ douzeci i cinci de
nucleotide. Aceast unitate de traducere mare, numit poliribozom sau polizom,
permite celulei reproducerea mai multor copii ale unei proteine plecnd de la o
molecul de ARNm.
Dac ARNm este policistronic i dac al doilea codon de iniiere nu este situat
(poziionat) prea departe de primul codon de oprire (de terminare), ribozomul se
deplaseaz alunecnd i se leag la codonul de iniiere al cistronului urmtor.
La eucariote, nu exist reiniiere a sintezei proteice dup ntlnirea codonului
de terminare.
TRADUCEREA INFORMAIEI GENETICE LA EUCARIOTE
Sinteza proteica sau traducerea este activitatea de sintez cea mai complex din
celul. n timp ce sinteza altor molecule celulare este rezultatul unor reacii
enzimatice relativ directe, asamblarea unei proteine necesit prezena tuturor
moleculelor de ARNt i a tuturor aminoacizilor corespunztori ataai la acetia, de
ribozomi, de molecule de ARNm, de mai multe proteine cu funcii diverse, de cationi
i de GTP. Aceast complexitate nu trebuie s ne mire dac inem cont c sinteza
proteic necesit incorporarea a peste 20 aminoacizi n funcie de o secven precis
dictat de un mesaj codificat scris ntr-o limb care folosete simboluri diferite.
Procesul de traducere de la eucariote seamn remarcabil cu cel de la procariote.
Principal diferen este c n celula eucariot traducerea implic un mare numr de
factori proteici solubili (neribozomici).
INITIEREA
Etapele fundamentale de iniiere a traducerii depind de ataarea corect a
ribozomului la o secven bine determinat din structura ARNm pentru ca mesajul s
poat fi citit ntr-un cadru de lectur corect. Aceasta se realizeaz deoarece ribozomul
ncepe traducerea la nivelul unui situs specific de pe structura mesagerului numit
codon de iniiere. ARNm nu se fixeaz la ribozomii constituii (ntregi). Acesta se

236

unete la cele dou subuniti n momente diferite. Prima etap esenial este unirea
subunitii ribozomale mici la prima (sau la una din primele) secvene AUG ale
mesajului care funcioneaz ca un codon de iniiere. Care este modalitatea prin care
subunitatea mic alege codonul AUG iniial i nu un alt codon intern. Aa cum am
artat anterior, procariotele posed o secven specific de nucleotide numit ShineDalgarno care este complementar cu o secven nucleotidic apropiat de
extremitatea 3 a ARN ribozomal 16S din subunitatea mic.
ARNr _ _ACCUCCUUUA3
ARNm _ _ GGAGGA_ _ _5
Recunoaterea codonului de iniiere AUG este consecina unei interacii ntre
aceste secvene complementare de pe ARNm i de pe ARNr cnd subunitatea mic
recunoate mai nti extremitatea 5 a mesajului , care poart un capion de
metilguanozin. Dup aceast subunitatea mic baleiaz secvena ARNm pn cnd
ntlnete o secven de nucleotide (de obicei 5-CCACCAUGC-3) care aproximativ
90% din moleculele de ARNm eucariot, tripletul AUG este codonul de iniiere.
Dac inem cont de atribuirea codonilor putem spune c AUG este mai mult
dect un codon de iniiere: este singurul codon pentru metionin. De fapt metionina
este ntotdeauna primul aminoacid incorporat la extremitatea amino a catenei
polipeptidice n formare (la procariote metionina din poziia 1 poart ntotdeauna o
grupare formil). n cea mai mare parte a cazurilor metionina (sau formil-metionina)
este ulterior nlturat enzimatic, cu toate c metionina rmne aminoacidul terminal
n aproximativ 50% din catenele polipeptidice mature. Celulele posed dou molecule
de ARNt pentru metionin (deux Met-ARNt): una este folosit pentru iniierea
sintezei proteice (ARNiMet) iar cellalt (reprezentat de ARNMet) intervine n
incorporarea resturilor de metionin n interiorul polipeptidului. Trebuie s reinem c
mitocondriile i cloroplastele celulelor eucariote folosesc N-formil-metionin n locul
metioninei pentru a iniia traducerea, ceea ce d cele mai bune argumente n favoarea
originii procariote a acestor organite.
Mai multe dintre etapele de iniiere necesit prezena unor proteine solubile
numite factori de iniiere (reprezentate de IF la procariote i de eIF la eucariote). De
exemplu, la eucariote, se consider c eIF4E se ataeaz coifului la extremitatea 5 a
mesagerului i nltur regiunile bicatenare care interfer cu deplasarea ribozomului
n cutarea codonului de iniiere. n plus, pe lng factorii proteici este necesar i
prezena GTP pentru a realiza o iniiere reuit. O molecul de GTP se unete cu
ARNtiMet nainte de cuplarea sa cu subunitatea ribozomal mic.
Imediat ce ARNt iniiator este ataat, subunitile mari care se anexeaz
complexului, factorii solubili sunt eliberai i GTP este hidrolizat. Hidroliza GTP
poate fi cauza unei modificri a conformaiei ribozomului necesar iniierii traducerii.
Fiecare ribozom posed dou situsuri de asociere a moleculelor de ARNt. Aceste
dou situsuri, situsul A (aminoacil) i a situsului P (peptidil) joaca roluri diferite n
traducere. Aminoacil-ARNt intr n complexul ribozom-ARNm la nivelul situsului A,
n timp ce la nivelul situsului P ARNt livreaz aminoacizi catenei polipeptidice n
cretere. De fapt ARNt de iniiere (ARNtiMet) apare mai nti la nivelul P al
ribozomului.
ELONGAREA
O dat ce ARNt de iniiere este plasat n situsul P, ribozomul este gata pentru
fixarea celui de al doilea aminoacil-ARNt n situsul A vacant, prima etap de elongare
(etapa 1). nainte ca cel de al doilea aminoacil-ARNt sau c urmtorii s se poat uni
efectiv la situsul A de pe ARNm, acesta trebuie s se combine cu unul dintre factorii

237

proteici de elongare (aceti factori de elongare particulari sunt numii Tu la procariote

i eEF1 la eucariote) unii cu GTP.
Cu toate c orice complex aminoacil-ARNt-Tu-GTP poate intra n situsul A,
va fi blocat la nivelul ARNm printr-o specific numai cel al crui anticodon este
complementar codonului de pe ARNm situat n situsul A. Imediat ce complexul
aminoacil-ARNt-Tu-GTP adecvat recunoate codonul de pe ARNm, GTP este
hidrolizat i se elibereaz complexul Tu-GDP. Complexul ARNt-Tu-GTP este
regenerat.
Cea de a doua etap a ciclului de elongare este formarea unei legturi
peptidice ntre aminoacizii ataai la cele dou molecule de ARNt. Reacia se
realizeaz prin transferarea metioninei (sau a N-formil metioninei) de pe ARNt
iniiator din situsul P pe aminoacidul ataat la ARNt care este complementar celui de
al doilea codon prezent n situsul A. Reacia este catalizat de ctre peptidil
transferaz, element au subunitii mari a ribozomului. Mult timp s-a considerat c
peptidil-transferaza era una dintre proteinele ribozomului. Mai trziu, cnd
capacitatea catalitic a ARN a devenit evident, atenia s-a ndreptat ctre ARN
ribozomal ca fiind posibilul catalizator al legturii peptidice. n ultimul s-a demonstrat
c activitatea peptidil-transferazic este efectiv localizat pe molecula mare de ARN
ribozomal din subunitatea mare a ribozomului. Cu alte cuvinte, peptidil transferaza
este o ribozim.
Formarea primei legturi peptidice las o extremitate a moleculei de ARNt n
situsul A nc ataat la codonul su complementar de pe ARNm n timp ce cealalt
extremitate este ataat la o dipeptid. ARNt prezent n situsul P nu mai posed acum
un aminoacid ataat. Cea de a treia etap a ciclului de elongare implic eliberarea
ARNt nencrcat prezent n situsul P i deplasarea ribozomului cu trei nucleotide (un
codon) de-a lungul ARNm n direcia 3. Aceast ultim etap, numit translocare,
este nsoit de deplasarea ARNt-dipeptidei, nc unit prin legturi de hidrogen la al
doilea codon al ARNm, n situsul P al ribozomului. Translocarea necesit un factor de
elongare numit G la procariote i eEF2 la eucariote i hidroliza GTP. Pentru fiecare
ciclu de elongare sunt hidrolizate cel puin dou molecule de GTP, una (sau mai
multe) n timpul seleciei aminoacil-ARNt i una n timpul translocrii.
ndat ce peptidil-ARNt se deplaseaz n situsul P, situsul A este din nou
disponibil unui nou aminoacil-ARNt al crui anticodon este complementar cu al
treilea codon. Cnd cel de al treilea ARNt ncrcat este asociat la ARNm n situsul A,
dipeptida legat de molecula de ARNt prezent n situsul P este transferat
aminoacidului ARNt din situsul A. ARNt din situsul P este din nou eliberat de
aminoacid. Formarea unei noi legturi peptidice este urmat de eliberarea ARNt din
situsul P i de translocarea ribozomului ctre cel de al patrulea codon, i ciclul este
gata s re-nceap.
PRECIZIA TRADUCERII
Interacia ntre tripletele din structura ARNm i ARNt nu este una foarte
puternic pentru a asigura ea nsi precizia bine cunoscut a sintezei proteice (mai
puin de un aminoacid din 10 000 este incorect incorporat). Au fost propuse mai multe
ipoteze care s explice frecvena foarte sczut a erorilor. O ipotez sugereaz c
numai codonii i anticodonii complementari sunt capabili s se insereze la nivelul
fosei formate de ctre ARN ribozomal. Legtura peptidic se poate forma numai n
cazul n care fosa mare este ocupat. O alt ipotez pune accent pe intervalul aparent
care separ unirea complexului ARNt-Tu-GTP la ARNm i momentul n care
aminoacidul este adugat catenei polipeptidice n cretere. Cu ct codonul i
anticodonul neadecvat (necomplementari) sunt mai mult n contact, cu att este mai

238

mare probabilitatea ca sa se produc separarea celor dou molecule de ARN. O alt

ipotez face apel la faptul c hidroliza GTP poate asigura fidelitatea traducerii. Cu
toate c pn n prezent se presupunea c pentru fiecare ciclu de elongare se
realizeaz hidroliza a dou molecule de GTP exist din ce n ce mai multe argumente
n sprijinul ideii c numrul real de molecule de GTP hidrolizate este mult mai mare
(cel puin trei). Este posibil ca energia suplimentar s fie folosit pentru eliberarea
moleculelor de ARNm ce nu sunt bine mperecheate.
Streptomicina, care este unul dintre cele mai prescrise antibiotice acioneaz
unindu-se selectiv la subunitatea ribozomal mic a celulelor bacteriene provocnd o
lectur eronat a anumitor codoni ai ARNm, crescnd sinteza proteinelor aberante.
Acest antibiotic nu acioneaz asupra ribozomilor de la eucariote si deci nu are efect
asupra traducerii din celulele gazd. Se pare c streptomicina se unete cu proteina
ribozomal numit S12 care intervine care intervine ntr-un fel sau n altul n controlul
preciziei interaciei dintre moleculele de ARNt specifice i complexul ribozomARNm. Rezistena bacteriilor la streptomicin se poate explica prin modificri la
nivelul proteinelor ribozomale i n particular la nivelul S12. Multe antibiotice
acioneaz interacionnd cu diferite etape ale sintezei proteice n celulele bacteriene
(tabel).
Eu, Pro: celule eucariote, procariote; G, P: subunitatea mare sau mic; R:
recunoatere; P: transferul polipeptidului; T: translocare; I: iniiere;
TERMINAREA
Cum s-a remarcat anterior trei din cei 64 codoni (de trei nucleotide) poteniali
sunt codoni stop ale cror funcie este semnalizarea opririi asamblrii polipeptidelor.
Deci, nu exist anticodoni n structura ARNt care s fie complementare codonilor
stop. Cnd ribozomul ajunge la unul dintre aceti codoni, UAA; UAG sau UGA ,
semnalul oprete orice nou elongare i elibereaz polipeptidul asociat ultimului
ARNt. Terminarea necesit prezena factorilor de eliberare care reacioneaz direct cu
codonii stop; bacteriile posed doi factori de eliberare (RF1 care recunoate UAA i
UAG i RF2 care recunoate UGA) n timp ce celule eucariote nu au dect un eRF.
Factorul de eliberare poart un GTP legat care este apoi hidrolizat. Imediat ce
traducerea se oprete, legtura polipeptidei la ARNt este scindat i factorul de
eliberare, ca i ARNt dezacilat, sunt eliberai de pe ribozom. Hidroliza legturii ntre
polipeptid i ultimul ARNt poate fi realizat de ctre aceeai regiune a ARNr care este
responsabil de formarea legturii peptidice n timpul elongrii. Imediat ce se
realizeaz terminarea, ribozomul se separ de mesager i se disociaz n subuniti
pn la iniierea unui nou ciclu de traducere.
Cum cei trei codoni de terminare pot fi uor obinui prin modificarea bazelor
plecnd de la ali codoni, ne-am putea atepta la apariia unor mutaii care dau codoni
stop la interiorul unei gene. Aceste mutaii ar putea provoca o terminare prematur a
catenei polipeptidice n cretere. Mutaiile de acest tip sau mutaiile non-sens, au fost
studiate timp de ani de zile i se tie c acestea sunt responsabile de diferite maladii
ereditare la om. Mutaiile non-sens antreneaz de obicei formele de maladii ereditare
cele mai severe deoarece se realizeaz numai sinteza unei poriuni a proteinei i
aceasta este ntotdeauna nefuncional. Terminarea prematur a creterii catenei poate
fi determinat i de adugarea unui antibiotic, cum este puromicina. Aceast molecul
seamn cu extremitatea 3 a unui ARNt ncrcat i poate intra n situsul A al
ribozomului (figura). Cnd aceasta se plaseaz la acest nivel, polipeptida din situsul P
este transferat puromicinei din situsul A cu formarea unei legturi covalente.
Transferul catenei polipeptidice., n formare, pe puromicin determin formarea unui

239

capion la extremitatea carboxil , astfel nct ali aminoacizi nu se mai pot ataa
complexului peptidil-puromicin iar acesta se desprinde de pe ribozom.
FORMAREA DE POLIRIBOZOMI
Dac observm la microscopul electronic o molecul de ARNm n curs de
traducere vedem ntotdeauna un anumit numr de ribozomi ataai de-a lungul
fragmentului de ARNm. Acest complex format din ribozomi i ARNm numit
poliribozomi. Mai nti, toi ribozomii se asambleaz din subunitile lor la nivelul
situsului de iniiere, apoi ei se deplaseaz de la acest punct ctre extremitatea 3 a
ARNm pn cnd ating codonul de terminare. Imediat ce primul ribozomi se afl la o
distan destul de mare de codonul de iniiere, un al doilea ribozom se ataeaz la
ARNm i demareaz o alt activitate de traducere. Traducerea simultan a aceluiai
ARNm de mai muli ribozomi crete puternic viteza de sintez a proteinelor celulare.
Chiar dac procesele se aseamn ele sunt difereniate la eucariote si la procariote
deoarece la eucariote procesul de transcripie i cel de traducere sunt compartimentate
i se desfoar fiind separate n citoplasm i n nucleu. n celulele bacteriene,
sinteza proteic debuteaz la nivelul moleculelor de ARNm chiar nainte de
terminarea transcripiei acestora. Sinteza unei molecule de ARNm progreseaz n
acelai sens ca i deplasarea ribozomilor care traduc mesajul, adic n direcia 5- 3.
n concluzie, o molecul de ARNm la procariote va fi tradus pentru traducere
imediat ce extremitatea sa 5 este disponibil pentru fixarea ribozomilor. n figur este
reprezentat filamentul de ADN pe care transcripia este n curs. Se pot observa
molecule de ARNm din ce n ce mai lungi la nivelul crora sunt ataai ribozomi
pentru a forma poliribozomii. Catenele proteinelor n formare nu sunt vizibile n
micrografiile realizate n cazul traducerii unor proteine normale dar se pot observa la
nivelul singurului poliribozom izolat dintr-o celul a glandelor sericigene de la
viermele de mtase. Proteina de mtase n curs de sintez este vizibil din cauza
mrimi sale i a maturii sale fibroase. Posibilitatea vizualizrii transcripiei i
traducerii, oferit de Oscar Miller de la Ridge National Laboratory, a constituit o
etap n vizualizarea unui proces care pn n acel moment numai n termeni
biochimici.
Pornind de la discuia privind evoluia conceptului de gen care la nceput a
fost considerat o unitate ereditar care controleaz caracteristicile unei plante de
mazre, gena a devenit apoi un locus pe cromozom, un segment de molecul de ADN
i, mai recent, o unitate de transcripie. Este remarcabil c, n ciuda schimbrilor
intervenite n felul nostru de a vedea factorii ereditari, toate conceptele privind gena
au rmas valabile, chiar dac fiecare a fost adaptat pentru a rspunde la noi criterii
citologice i moleculare. Descoperirea secvenelor intermediare a modificat din nou
conceptul de gen, ndeprtndu-l de dogma care domina i care considera c o
secven linear nentrerupt de nucleotide genereaz o secven corespunztoare de
aminoacizi, revelnd i complexitatea transferului informaiei n celula eucariot.
Cum este adesea cazul, descoperirea unei enigme ajut la explicarea altora. n acest
caz, descoperirea n marea majoritate a genelor, a unui ansamblu de introni a cror
lungime depete pe cea a segmentelor codante a permis realizarea unui pas
important i a explicat de ce exist atta ADN n genomul organismelor superioare i
de ce transcripii primari sunt mult mai lungi dect mesagerii produi n final.
(1) Reglarea expresiei genelor
Principii de reglare a activitii genelor
Cantitile de proteine sintetizate de ctre o celul nu sunt neaprat fixe i
variaz n funcie de necesitile celulei. Colibacilul E. coli poate la fel de bine s

240

sintetizeze metabolii ca triptofanul sau histidina sau s le preia din mediul de cultur.
Oricare dintre aceste mecanisme este declanat n funcie de necesitile celulei i n
funcie de prezena sau absena metaboliilor respectivi n mediu. n general bacteria
nu sintetizeaz metabolii dect n cazul n care nu i poate obine (preleva) din mediu.
Ea realizeaz (face) astfel economie de sinteze inutile. (Ea economisete astfel
sintezele inutile). Diferitele niveluri de expresie a genelor sunt dovada (constituie
dovada) acestei ajustri permanente ntre nevoile celulare i mecanismele moleculare
destinate asigurrii acestora. Aceast reglare este rezultatul diferenelor de
recunoatere a diferiilor promotori (a promotorilor) de ctre ARN polimeraz i de
diferenele n nceperea traducerii (demararea traducerii). De asemenea, exist sisteme
de reglare tip care realizeaz (determin) expresia (exprimarea) la comand. Alte
sisteme ajusteaz concentraia unei proteine n celul n funcie de necesitile impuse
de mediu. Toate aceste mecanisme poart numele (au fost denumite) reglarea
expresiei genelor.
Mecanismele de reglare sunt diferite la procariote i la eucariote. Mecanismele
de la bacterii i de la fagi sunt cele mai bine cunoscute. (Sunt mai bine cunoscute
mecanismele de la bacterii i de la fagi); acestea controleaz n primul rnd
transcripia (dac este nevoie de protein, transcripia este activat, dac nu
transcripia este ncetinit dar nu se oprete niciodat). La eucariote, sistemele de
reglare se pot opri complet transcripia unei gene, expresia n acest caz bazndu-se n
esen pe stimulare.
Mecanismele de reglare se pot mpri n dou categorii: reglare pozitiv i
reglare negativ.
ntr-un sistem de reglare negativ, un inhibitor, prezent n celul, blocheaz
transcripia. ntr-un sistem de reglare pozitiv, o molecul efectoare de natur proteic
sau de alt natur (molecul mic, complex molecular) activeaz promotorul. Cele
dou sisteme de reglare nu se exclud i anumite gene sunt n acelai timp reglate
pozitiv i negativ.
ntr-un proces de degradare, reglarea se realizeaz adesea implicnd nsi
molecula de degradat i poate fi negativ sau pozitiv (exemplul operonului lactoz).
Din contr, ntr-un proces de biosintez, produsul final realizeaz reglarea i de cele
mai multe ori n manier negativ (cazul operonului triptofan).
Reglarea se poate realiza fie asupra sintezei enzimelor implicate ntr-o cale de
biosintez sau de degradare fie asupra activitii enzimelor. n acest proces de
biosintez produsul final n activeaz frecvent enzima. Acest tip de reglare se numete
retroinhibiie. n afar de produii de reacie exist i ale molecule numite efectori
alosterici care pot inhiba o enzim.
Reglarea la procariote
Expresia genelor depinde de ARN polimeraz i de un anumit numr de
proteine de reglare (implicate n reglare). La bacterii, anumite molecule acioneaz ca
inductori i drept co-represori determinnd astfel vitez de biosintez a proteinelor
controlnd sinteza ARNm corespunztori. Aceste molecule se combin cu inhibitorul
transcripiei adesea desemnat ca represor, pentru a-l inactiva (molecula este n acest
caz inductoare a expresiei deoarece nltur inhibiia) sau activa (molecula este
inhibitoare deoarece provoac inhibiie). Reglarea expresiei genelor este esenial (n
esen) transcripional i post-transacripional.
Reglarea transcripiei
Modelul operonului lactozei

241

Pentru a tri colibacilul trebuie s dispun de o surs de carbon organic a crei

degradare furnizeaz energie i precursorii (scheletul carbon) necesar propriilor
sinteze. Aceast surs este constituit preferenial din glucoz (biomolecula cea mai
abundent din biosfer) dar i din alte glucide cum sunt galactoza, lactoza i
aminoacizii. Pentru a metaboliza lactoza, E. coli sintetizeaz o permeaz, pentru a
autoriza (pentru a permite) intrarea glucidului n celul, i o -galactozidaz care
degradeaz lactoza n galactoz i glucoz.
permeaz
Lactoza extern
Lactoz intern
-galactozidaz
Lactoza ntern
galactoz + glucoz
Controlul negativ al operonului
Cnd E. coli este cultivat ntr-un mediu de cultur coninnd ca singur surs
de carbon lactoza (deci n absena glucozei), cantitatea intracelular de galactozidaz crete brusc. De fapt, exist un sistem de reglare care nu autorizeaz
sinteza acestei enzime dect n prezena substratului. Acest mecanism de reglare,
evideniat de ctre Jacob i Monod n 1961, a fost dedus din urmtoarele observaii:
- n absena lactozei (sau a unei molecule din familia -galactozidelor),
concentraiile n permeaz i n -galactozidaz sunt foarte reduse n celul. n
prezena lactozei, concentraiile cresc de aproximativ 105.
- Cnd lactoza este adugat n mediu de cultur al unei culturi bacteriene
capabil s o utilizeze, sunt intetizate permeazele i -galactozidaza aproape
simultan. nainte de adugarea lactozei nu exist ARNm care codific pentru cele
dou enzime (ARNm lac), astfel nct lactoza declaneaz sinteza ARNm lac.
Aceste observaii ne permit s afirmm c sistemul de reglare al cii de
degradare a lactozei este inductibil, inductorul fiind lactoza. Cele trei enzime ale
operonului sunt numite inductibile, i n absena lactozei se consider c operonul
este reprimat.
1) Sistemul de utilizare a lactozei presupune gene de structur i gene ale
secvenelor de reglare. Ansamblul formeaz operonul lactoz.
2) Genele lacZ (-galactozidaz) i lacY (permeaz) sunt transcrise ntr-o
singur molecul de ARNm policistronic care conine i transcriptul unei a dou gene
LacA ce codific enzima transacetilaz a crei funcie este necunoscut.
3) Promotorul care niiaz transcripia genelor lacZ, lacY i lacA este situat n
amont de o secven reglatoare numit operator.
4) Gena lacI situat n amonte de promotor produce de manier constitutiv
(ntr-o concentraie aproape constant) o protein, represor care se fixeaz cu foarte
mare afinitate la operator.
5) Fixarea represorului la operator blocheaz promotorul i mpiedic astfel
ARN polimeraza s se ataeze i s iniieze transcripia ARNm lac.
6) Inductorii (lactoz i -galactozide) stimuleaz sinteza ARNm lac
combinndu-se cu represorul ceea ce diminueaz foarte tare afinitatea sa pentru
secvena ADN a operatorului fcndu-l astfel inactiv. Acest proces este numit
derepresie. Astfel inductorul decroeaz represorul i elibereaz promotorul, ceea ce
autorizeaz nceperea transcripiei de ctre ARN polimeraze.
Funcionarea operonului lactoz a fost confirmat prin utilizarea de mutani
lacI-, lacIs i lacOc. Mutanii lacI au pierdut capacitatea de a sintetiza
represorul;sistemul rmne n permanen indus n absena lactozei. Mutanii lacIs
sintetizeaz un represor mutant care nu se mai poate combina cu inductorul. Acesta
242

rmne deci fixat la ADN iar sistemul este reprimat n permanen. Mutanii lacOc au
un operator care a pierdut o parte din secvena sa prin deleie i care nu poate fixa
corect represorul astfel nct sistemul este indus chiar i n absena inductorului.
Controlul pozitiv al operonului
Pentru a funciona normal, chiar n prezena unui inductor care neutralizeaz
represorul, operonul lactoz trebuie s primeasc un semnal de control pozitiv. Acest
sistem de reglare a operonului lactoz a fost descoperit studiind (cercetnd) maniera
(modalitatea) prin care glucoza inhib funcionarea anumitor operoni.
Dac mediul conine glucoz i lactoz, transcripia operonului lactoz nu este
necesar. Glucoza este metabolizat preferenial i ea exercit o represie, numit
catabolic, asupra operonului lactoz. Deci, nu exist sintez de -galactozidaz att
timp ct n mediu exist glucoz. Astfel, n ciuda prezenei inductorului, lactoza, care
inactiveaz precursorul, transcripia genelor operonului lactoz nu se produce.
Transcripia are loc dac operonul este reglat de manier pozitiv (n mod pozitiv).
Reglarea pozitiv implic dou gene, cea a adenilat ciclazei care produce AMP
ciclic (AMPc) i cea a unei proteine receptoare de AMPc (cRP) sau proteina de
activare catabolic (CAP pentru Catabolite gene Activator Protein). Concentraia
AMPc n celul este invers proporional cu cea a glucozei. Cnd concentraia de
glucoz este sczut, AMPc devine abundent, se fixeaz la proteina CAP i activeaz
astfel operonul lactoz. Complexul AMPc-CAP se fixeaz pe un situs particular al
operonului (situs CAP ntre poziiile 72 i 52) i activeaz transcripia genelor
adiacente favoriznd o mai bun ataare a ARN polimerazei la promotor. El
acioneaz ca un stimulator, regulator pozitiv al transcripiei operonului lactoz i al
multor altor operoni.
ROLUL CATALIZATOR AL ARN
Cercetrile realizate n biochimie i biologie molecular n cursul anilor 70 au
ntrit nelegerea rolului proteinelor i acizilor nucleici. Proteinele erau considerate
ca ageni care permiteau funcionarea celular i enzimele ca accelernd reaciile
biochimice. Pe de alt parte, acizii nucleici erau considerate moleculele care
stocheaz informaia celular, coninnd informaiile genetice n structura lor
nucleotidic. Repartiia sarcinilor ntre proteine i enzime prea s fie una dintre
diferenele cele mai bine definite n tiinele biologice. Acest lucru a fost valabil pn
n 1981 cnd a fost publicat un articol care a nceput s umbreasc aceast
difereniere.
Thomas Cech i colaboratorii si de la Universitatea din Colorado studiau
procesul de transformare n ARNr matur a precursorului ARN ribozomal sintetizat de
ctre protozoarul ciliat Tetrahymena thermophila. Contrar moleculelor de pre-ARNr
de la mamifere, cel de la Tetrahymena thermophila coninea o secven intermediar
de aproximativ 400 de nucleotide care trebuiau ndeprtate din transcriptul primar
nainte de reunirea (legarea) segmentelor.
Cech observase nainte c nucleele izolate de celule erau capabile s
sintetizeze precursorul pre-ARNr i s efectueze ntreaga reacie de maturare
(splicing/epissage). Nu se realizase nc izolarea enzimelor de splicing/epissage de la
alte tipuri celulare i Tetrahimena prea s fie un sistem bun pentru studiul acestor
enzime. Prima etap era izolarea precursorului pre-ARNr intact, apoi determinarea
numrului minim de elemente nucleare care trebuiau adugate amestecului de reacie
pentru ajunge la un splicing/epissage corect. Cnd nucleele izolate au fost incubate n
mediu care conine o concentraie sczut de cationi monovaleni (NH4+ 5mM),
molecula de pre-ARNr era sintetizat dar intronul nu era ndeprtat. Acest lucru a

243

permis cercettorilor s purifice precursorul intact pe care doreau s l foloseasc

drept substrat pentru a testa activitatea de maturare a extractelor nucleare. Totui,
acetia au constatat c, dac precursorul purificat era incubat singur la concentraii
mai crescute n ioni de NH4+, n prezen de Mg2+ i a unui derivat de guanozin (cum
este GMP sau GTP), secvena intermediar era obinut plecnd de la precursorul
matur. Analiza secvenelor nucleotidice a confirmat c fragmentul mic de ARN care
era ndeprtat din precursor era intronul care coninea un nucleotid cu guanidin n
plus la extremitatea 5. Nucleotidul adugat provenea din GTP adugat amestecului
de reacie.
Splicingul unui intron este o reacie complicat care cere recunoaterea
secvenelor care l flancheaz, ruperea legturilor fosfodiester de o parte i de alta a
intronului i legarea fragmentelor nvecinate. Toate eforturile au fost fcute pentru a
elimina orice protein care ar putea fi fixat la ARN nainte de a testa capacitatea de
splicing a acesteia. ARN a fost tratat cu un detergent fenolic, centrifugat ntr-un
gradient i tratat cu o enzim proteolitic. n aceast situaie nu existau dect dou
explicaii rezonabile: fie splicingul era datorat unei proteine legat foarte intim la
ARN, fie unei molecule de ARN sau de pre-ARN capabile ea nsi de splicing.
Aceast ultim explicaie nu a fost deloc uor de admis.
Pentru a rezolva problema prezenei unui contaminant proteic, Cech i
colaboratorii au utilizat un sistem artificial care nu putea s conin proteine nucleare
de splicing. ADN care codific precursorul ARNr a fost multiplicat prin clonare n
E. coli, apoi purificare i folosire drept model pentru procesul de transcripie in
vitro realizat de o ARN polimeraz bacterian purificat.
Pre-ARNr sintetizat in vitro a fost apoi purificat i incubat n prezen de ioni
monovaleni i bivaleni i un derivat de la guanozin. ARN folosit nu poate fi
contaminat cu enzime de splicing celulare. Totui, pre-ARN suport aceeai reacie
de splicing care se produce n celula eucariot. Deci, ARN trebuie s fi realizat
singur propriul splicing.
Aceste experiene au demonstrat c ARN este capabil s catalizeze o reacie
complex, format din mai multe etape. Calculele demonstreaz c reacia a fost
accelerat de aproximativ zece milioane de ori n raport cu viteza de reacie necatalizat. Ca o enzim proteic, ARN era activ la concentraii sczute , nu era
modificat n reacie i era capabil s accelereze puternic o reacie chimic. Singura
diferen ntre acest ARN i enzimele clasice era c ARN aciona asupra lui nsi
i nu asupra unui substrat independent. Cech a desemnat acest ARN ca fiind o
ribozim.
n 1983, s-a descoperit un al doilea exemplu de cataliz realizat de ctre un
ARN ne-nrudit. Sidney Altman de la Yale University i Norman Pace, de la National
Jewish Hospital de Denver i colegii lor, studiau n colaborare ribonucleaza P, enzim
implicat n maturarea unui precursor de ARN de transfer la bacterii. Enzima era
neobinuit: ea era compus dintr-o protein i ARN. n urma incubrii cu tampoane
cu concentraii ridicate (60 mM) de Mg2+, subunitatea ARN purificat[ era capabil s
nlture extremitatea 5 a precursorului ARNt exact cum acest proces era realizat de
molecula ntreag de ribonucleaz P n celul. Molecula de ARNt matur,
transformat, se gsea printre produii de reacie in vitro. Din contr, subunitatea
proteic izolat din enzim era lipsit de activitate catalitic.
Pentru a exclude posibilitatea ca un contaminant proteic catalizeaz de fapt
reacia, poriunea de ARN a ribonucleazei P a fost sintetizat in vitro plecnd de la un
model de ADN recombinant. Ca i ARN extras din celulele bacteriene, acest ARN
sintetizat artificial, fr nici o protein suplimentar, era capabil s cliveze corect

244

precursorul ARNt. Contrar enzimei de maturare a ARN studiat de Cech, ARN

ribonucleaza P aciona asupra unei alte molecule de substrat i nu asupra ei nsi.
Deci, s-a dovedit c ribozimele puteau avea ele nsle proprieti catalitice asemeni
enzimelor formate din proteine. n figura este redat un model recent de interacie ntre
subunitatea ARN catalitic a ribonucleazei P i un precursor de ARNt care servete
drept substrat.
Dovada c ARN putea cataliza reacii chimice a creat un mediu propice unor
noi cercetri asupra unei probleme vechi: care este elementul din subunitatea mare
ribozomal cu activitate peptidil-transferazic, i care este cel care catalizeaz
formarea legturii peptidice. n cursul anilor 1970 au fost fcute mai multe descoperiri
independente care au sugerat c ARN ribozomal ar putea avea un rol mult mai
important dect s serveasc de eafodaj pentru meninerea structurii proteinelor
ribozomale individuale ntr-o poziie propice derulrii unor activiti importante.
Printre aceste argumente enumerm:
1. Anumite sue de E. coli posed gene care codific proteine capabile s
omoare bacterii, numite colicine. Se tia c una dintre aceste toxine, colicina E3
inhib sinteza proteic n celulele bacteriene sensibile. Ribozomii izolai din celulele
tratate cu colicin E3 par destul de normali pentru majoritatea criteriilor, dar nu
permit sinteza proteinelor in vitro. Un studiu mult mai aprofundat al acestor ribozomi
demonstreaz c deficienta era prezent la nivelul ARNr i nu n structura proteinelor
ribozomale. ARN 16S din subunitatea mic era clivat de colicin la aproximativ 50
de nucleotide fa de captul 3, ceea ce fcea ntreaga subunitate incapabil s
realizeze sinteza proteic.
2. S-a constatat c tratamentul subunitilor mari ribozomale cu ribonucleaza
T1, enzim care cliveaz legturile dintre nucleotidele continue din ARN i fac
subunitile incapabile s realizeze reacia peptidil-transferazic.
3. Diferite cercetri asupra antibioticelor care inhib formarea legturii
peptidice, cum este cazul cloramfenicolului, carbomicina i eritromicina, au sugerat
c aceste substane acioneaz asupra ARN i nu asupra proprietilor ribozomale. De
exemplu, s-a constatat c ribozomii devin rezisteni la efectele cloramfenicolului ca
urmare a substituirii unor baze n structura ARN ribozomal.
4. S-a demonstrat c moleculele de ARN ribozomal sunt foarte conservate la
nivelul secvenelor de baze, mult mai mult dect n secvenele de aminoacizi ale
proteinelor ribozomale. Anumite regiuni din structura ARN ribozomal sunt practic
identice n ribozomi provenind din bacterii (archeobacterii ca eubacterii), ciuperci,
plante i animale, ca i n ribozomii izolai din mitocondrii i cloroplaste. Cea mai
mare parte a regiunilor foarte conservate sunt situate la suprafaa ribozomului. O
astfel de conservare a secvenelor de ARNr ne las s credem c aceste molecule au
un rol fundamental n funcionarea ribozomului. n 1975, C.R. Woese concluziona:
deoarece nu exist sau exist puine corelaii ntre regiunile conservate i de situsuri
cunoscute de fixare la proteinele ribozomale, exist puternice presupuneri n favoarea
unei implicri directe a regiunilor importante ale ARN n funcionarea ribozomului.
Ca urmare a descoperirii unor proprieti catalitice ale ARN n laboratoarele
conduse de Cech i Altman, cercetrile privind rolul ARN ribozomal au fost
intensificate. Multe cercetri realizate de Harry Noller i colegii si de la
Universitatea din California, Santa Cruz, s-au focalizat pe situsul ARN ribozomic care
se gsete n apropierea centrului peptidil-transferazic. n cursul unui studiu, ei au
sintetizat o versiune modificat a fenilalanil-ARNt care, atunci cnd se afl n situsul
P al unui ribozom, se unete el nsui la molecula de ARNr. Chiar dac el este astfel
fixat, analogul ARNt rmne capabil s participe la formarea legturii peptidice:

245

aceasta demonstreaz c analogul trebuie s fie situat la situsul P i s fie orientat

corect. Analiza ulterioar a ARNr provenind din aceste experiene indic c
nucleotidele din structura ARNr care sunt astfel fixate se gsesc ntr-un situs
conservat care formeaz o bucl central situat n domeniul V al moleculei. Mai
precis aceast regiune a ARNr care a fost nainte considerat ca situsul mutaiilor care
confer rezisten la cloramfenicol sau la eritromicin. Luate mpreun, aceste
descoperiri desemneaz clar aceast bucl a ARN ca fiind unul dintre elementele care
fac parte din centrul peptidil-transferazic. n cursul altor experimente, s-a demonstrat
c moleculele de ARNt fixate de ribozom protejeaz bazele specifice ale ARNr din
subunitatea mare contra unui atac care poate fi realizat de ctre ageni chimici
specifici. Aceast protecie demonstreaz c ARNt trebuie s fie situat foarte aproape
de bazele de ARNr care sunt protejate. n funcie de fixarea ARNt n situsul A sau n
situsul P, sunt protejate loturi diferite de baze, ns n fiecare caz acestea se afl n sau
n apropierea buclei centrale a domeniului V. Protecia dispare dac extremitatea 3 a
ARNt (extremitatea CCA unit la aminoacid) este nlturat. Este vorba de
extremitatea ARNt implicat n formarea legturii peptidice, care trebuie s se
gseasc foarte aproape de situsul peptidil-transferazic.
Tentativele fcute pentru a atribui o funcie particular ARN ribozomal izolat
au euat ntotdeauna. S-a presupus c, dei proteinele ribozomale nu au funcii
specifice, prezena lor este necesar cel puin pentru a pstra o conformaie adecvat a
ARNr. Dac inem cont de faptul c proteinele i ARN ribozomal au co-evoluat timp
de miliarde de ani, puteam s ne ateptm ca cele dou molecule s fie
interdependente. n ciuda acestui raionament, puterea catalitic a ARNr izolat a fost
n sfrit dovedit de ctre Harry Noller i colaboratorii si n 1992. Noller a lucrat pe
ribozomii de la Thermus aquaticus (cu o stabilitate particular), o bacterie care
triete la temperaturi crescute. Noller a tratat preparatele de subuniti ribozomale
mari cu un detergent destinat extraciei proteinelor (SDS), o enzim proteolitic
(proteinaza K) i mai multe treceri n fenol pentru denaturarea proteinelor. Ansamblul
acestor ageni nltur cel puin 95% din proteinele subunitii ribozomale i asigur
pstrarea ARNr. S-a demonstrat c cea mai mare parte din proporia de 5% de
proteine care a rmas asociat la ARNr consta n peptide mici care reprezentau
fragmente de proteine ribozomale. Totui, n ciuda eliminrii aproape totale a
proteinelor, ARNr conserv aproape 80% din activitatea peptidil-transferazic a
subunitii intacte. Activitatea catalitic era blocat de ctre cloramfenicol i prin
tratament cu ribonucleaz. Cnd ARN era supus unor tratamente suplimentare pentru
a elimina restul de proteine (cele 5%), preparatul pierdea activitatea sa catalitic.
Deoarece este puin probabil ca micile fragmente peptidice s fie responsabile pentru
activitatea catalitic, considerm c acest eperiment dovedete c peptidil-transferaza
este o ribozim.
Perspective pentru om
Ribozimele posed dou proprieti care fac din acestea ageni importani n
lupta contra anumitor maladii cronice:
1. ele conin segmente nucleotidice care le permit s se mperecheze cu un
ARN complementar.
2. ele posed un situs catalitic capabil s cliveze scheletul ARN
complementar
Graie acestor proprieti, ribozimele sunt un subiect de manipulare ideal n inginerie
genetic deoarece ele pot fi fabricate la comand pentru a recunoate i distruge
orice int ARN specific.

246

Ribozimele la comand ncep a fi folosite n lupta contra maladiilor virale.

Pentru ca un virus s provoace probleme ntr-o celul infectat, trebuie ca genomul
viral s fie transcris n ARN i apoi tradus n proteine. S ne gndim la ceea ce se
poate ntmpla dac o celul infectat posed o gen care codific o ribozim capabil
s se uneasc specific la moleculele de ARN viral i s le distrug. Ne-am putea
atepta ca celula s fie protejat de virus, chiar dac genomul su este integrat n
ADN-ul celulei gazd. Experiene destul de recente realizate de Flossie Wong-Staal,
Universitatea din California, i Arnold Hempel, de la Northern Illinois University, au
demonstrat c este posibil folosirea ribozimelor n acest mod.
n experiena lor, Wong-Staal i Hempel au izolat limfocite T de la pacienii
suferinzi de SIDA i au transfectat celulele cu o secven de ADN modificat genetic
care codific o ribozim capabil s recunoasc i s scindeze ARNm al virusului
HIV. Gena ribozimei este plasat n aval fa de un promotor puternic, care
garanteaz transcrierea activ genei. Testele indic c ribozima reduce de aproximativ
10. 000 ori cantitatea de virus produs de celulele infectate de HIV n comparaie cu
celulele ne-transfectate. Un punct la fel de important, este c ribozima distruge
moleculele de ARN viral cu o eficacitate manifest, fr a afecta moleculele de ARN
normale din celul. Etapa urmtoare a proiectului o reprezint punerea la punct i n
practic a unor teste clinice la scar mic, constnd n repunerea limfocitelor care
conin o gen pentru ribozim n organismul pacientului din care provin celulele.
Sperana pe care o avem este ca celulele transfectate s fie rezistente la virus i s
protejeze sistemul imunitar al pacientului.
Scopul ultim al acestei terapii genice este introducerea unei ribozime care
distruge ARN n toate celulele organismului infectate de ctre virus, i s nu se mai
limiteze la celulele care circul n fluxul sanguin.
Ribozimele pot fi utile i pentru a lupta contra anumitor tipuri de cancer care
au aprut ca urmare a inducerii unei mutaii ntr-o gen (sau o oncogen) care codific
pentru o protein implicat n reglarea diviziunii celulare. Aceste celule devin
maligne din cauza sintezei unui ARN diferit de cel pe care l produc celulele normale.
Este posibil suprimarea strii maligne a celulei prin distrugerea ARN modificat,
sarcin care poate fi realizat de ctre o ribozim. S-a realizat izolarea celulelor
canceroase de vezic de la om i acestea au fost transfectate cu o gen de aceeai
mrime care codific pentru o ribozim capabil s recunoasc i s distrug
moleculele de ARN transcrise de ctre oncogena modificat. n mod normal, celulele
maligne de vezic sunt capabile s produc tumori cnd ele sunt injectate la oareci de
laborator, dar celulele transfectate cu gena care codific pentru ribozim nu mai sunt
maligne i nici capabile s produc tumori la animalul gazd. Pentru a fi eficiente n
tratamentul cancerului, gena care codific ribozima trebuie introdus n toate celulele
unei tumori, ceea ce, aa cum am artat mai nainte, necesit punerea la punct a
vectorului capabil s elibereze gena n esuturile interne ale organismului.

247