UNIVERSITATEA TEHNIC GHEORGHE ASACHI IAI

Facultatea Inginerie chimic i protecia mediului

Domeniul de licen: Inginerie Chimic
Programul de studii universitare de masterat
METODE DE CARACTERIZARE SI TESTARE II Aplicaiii practice 2012-2013, .L. PUITEL A.C.

L3 Cromatografia n faz lichid la nalt presiune (high pressure liquid chromaorgraphy)

Cromatografie - tehnic folosit pentru separarea componenilor unei probe, prin care aceti
componeni se distribuie ntre dou faze, una staionar i una mobil. Faza staionar poate fi un solid
sau un lichid depus pe suport.

Rezervor
solvent
de eluie
f

Sistem de injecie

Sistem de
detecie

Colector de fraciuni

Componenii unui sistem HPLC

1. Rezervor sau rezervoare care conin faza sau fazele mobile; faz mobil - ansamblul format din
gazul purttor i poriunea din eantionul introdus n coloan (GC); un lichid (solvent) folosit
pentru eluarea componenilor probei prin coloan sau dup coloan. Poate fi monocomponent
sau un amestec de solveni (HPLC); Faza mobil trebuie s conin reactivi chimici puri. nainte
de utilizare, faza mobil trebuie filtrat i degazat, atunci cnd se impune prevenirea formrii
bulelor de aer n sistem. Trebuie s se asigure filtrarea fazei mobile n circuitele sistemului
HPLC pentru ndeprtarea impuritilor mecanice (particule, praf etc).
2. Pomp de nalt presiune. Pompa trebuie s asigure o presiune n domeniul (040) MPa;
Pompa trebuie s asigure un debit cuprins ntre (0,15,0) ml/min; Pulsaiile pompei trebuie s
nu depeasc 2 % vrf la vrf (ca presiune), cnd se monitorizeaz sistemul cu ap, la o
presiune de retur de 14 MPa, la un debit de 1 ml/min, pentru o durat de 10 minute. ntre pomp
i coloan, sistemul HPLC trebuie s dispun de un monitor de presiune i de un releu limitator
de presiune.
3. Dispozitiv de injecie - mijloc tehnic de introducere a probei n coloana cromatografic;
4. Coloan cromatografic - un tub care conine faza staionar prin care trece faza mobil;
faza staionar - solid depus sau nu pe un suport solid care produce separarea constituenilor unei probe
datorit diferenelor de solubilitate i respectiv, de adsorbie; material imobil activ existent n coloan,
1

UNIVERSITATEA TEHNIC GHEORGHE ASACHI IAI

Facultatea Inginerie chimic i protecia mediului
Domeniul de licen: Inginerie Chimic
Programul de studii universitare de masterat
METODE DE CARACTERIZARE SI TESTARE II Aplicaiii practice 2012-2013, .L. PUITEL A.C.

depus pe suportul solid sau fiind nsui suportul solid, care produce o ntrziere n trecerea
componenilor probei, ca urmare a proceselor specifice de separare cromatografic (HPLC). . Materialul
de construcie trebuie s fie inert fa de componenii fazei mobile i a probelor de analizat. n acest
sens materialele din care se realizeaz pot fi materiale metalice, din sticl sau material plastic. Mai mult,
acestea trebuie i s reziste la presiunea generat de pomp.
5. Detector - dispozitiv care permite conversia concentraiilor componenilor probei n semnal
electric proporional; Caracteristicile detectorului includ:

zgomot de fond - msur a variaiei semnalului de ieire al unui detector n situaia n care nu se
nregistreaz prezena unui component al probei;

limit de detecie - concentraia componentului de interes al probei care d un semnal de ieire al

detectorului, egal (de regul) cu de trei ori zgomotul de fond;

selectivitate - caracteristica unui detector de a reaciona ntr-un grad nalt la anumite categorii de
compui fa de altele;

sensibilitatea unui detector - semnalul produs de unitatea masic a compuilor ntr-un gaz
purttor, care se ncadreaz ntr-una din categoriile urmtoare.
pentru un detector dependent de concentraie, ea se exprim n A x ml x g-1 sau V x ml x g prin ecuaia:
PxF
S=
unde
M
S
Sensibilitatea;
P
Aria integrat a picului (A x s sau V x s);
F
Debitul gazului purttor (ml/s);
M
Masa eantionului n faza mobil purttoar (g)

pentru un detector dependent de debitul masic, sensibilitatea se exprim n A x s x g-1 sau V x s x g1

prin ecuaia: S = P/M; unde simbolurile sunt aceleai ca la definiia de mai sus;

domeniu liniar al detectorului - domeniul concentraiilor sau al debitelor masice pentru un

component de interes al probei, pentru care sensibilitatea detectorului rmne constant ntr-o
plaj de 5 %. Valoarea sa este dat de raportul dintre limita superioar a liniaritii i limita de
detecie;

domeniu dinamic al detectorului - domeniul concentraiilor sau al debitelor masice ale unui
component al probei, pentru care o modificare a cantitii de prob produce o modificare
msurabil a semnalului de ieire al detectorului;
Detectori utilizai n HPLC:
Detector UV/vizibil - detector care msoar absorbana luminii prin prob;
Detector cu fluorescen - detector care utilizeaz relaia dintre emisia fluorescent i concentraia
compuilor probei care au fost excitai prin absorbia luminii;
Detector electrochimic - detector care poate fi folosit pentru msurarea componenilor probei care se
pot oxida sau reduce electrochimic la electrozi;
Detector selectiv de mas (MS) - conform descrierii de la punctul.
6. Trebuie s se ia n considerare sistemele de prelucrare automat a datelor cu ajutorul crora se
pot efectua analize complete, att calitative, ct i cantitative, respectiv de integrare sau
calculatoare care achiziioneaz i prelucreaz automat datele sub form digital, livrnd
rezultatele analizei.
7. Sistem automat de colectare a fraciunilor componenilor unei probe. Uneori, mai ales n cazul
cromatografiei preparative este necesar ca o parte din componenii probei s fie colectati n
vederea utilizri sau efecturii de analize suplimentare.
Terminologie utilizat n cromatografie
2

UNIVERSITATEA TEHNIC GHEORGHE ASACHI IAI

Facultatea Inginerie chimic i protecia mediului
Domeniul de licen: Inginerie Chimic
Programul de studii universitare de masterat
METODE DE CARACTERIZARE SI TESTARE II Aplicaiii practice 2012-2013, .L. PUITEL A.C.

eluie - extragerea i deplasarea constituenilor unei probe din faza staionar de ctre faza mobil;
cromatogram - un grafic al rspunsului electric al detectorului funcie de timp. Din cromatogram
se obin urmtorii parametri de reinere: timpul de reinere (tR), precum i nlimea (h) sau aria (A)
picurilor (vrfurilor cromatografice) componenilor separai; pe baza acestor parametri se identific
i se determin cantitativ componenii probei;
analiz calitativ: identificarea unui compus prin cromatografie, cu ajutorul unor etaloane, pe baza
parametrilor de reinere (tR);
analiz cantitativ - calcularea concentraiilor compuilor chimici sau a compoziiei probei din
datele picurilor componenilor (arie, nlime) i ale componenilor de referin;
timp de reinere sau de retenie - intervalul de timp scurs de la injectarea probei pn la nregistrarea
valorii maxime a picului componentului din prob;

repetabilitate - limit de acceptabilitate pentru rezultatele msurrilor succesive efectuate asupra

aceluiai msurand, n aceleai condiii de lucru, de ctre acelai operator i n cursul unei perioade
relativ scurte de timp.
Factor de capacitate
V V0 t R t0 t ' R
k' = R
=
=
V0
t0
t0
Unde
VR = volumul de retentie pentru un anume compus
V0 = volum de retentie faza mobil, solvent sau pentru un compus inert fa de coloan
t R = timp de retenie a compusului R
t 0 = timp de retentie faza mobil, solvent sau pentru un compus inert fa de coloan
t`R = timp de retenie efectiv
Selectivitatea sau factorul de separare

Eficien de separare

UNIVERSITATEA TEHNIC GHEORGHE ASACHI IAI

Facultatea Inginerie chimic i protecia mediului
Domeniul de licen: Inginerie Chimic
Programul de studii universitare de masterat
METODE DE CARACTERIZARE SI TESTARE II Aplicaiii practice 2012-2013, .L. PUITEL A.C.

Cromatografie n faz normal cromatografie n faz invers

Cromatografie n faz normal se refer la faptul c faza stationar este una polar- adsorbant de
tip silicagel/ alte umpluturi pe baza de silice (SiO2); principiul separarii: etape repetate de adsorbtiedesorbtie faz mobil este nepolar (hexan, heptan, THF, amestecuri de alcool izopropilic cu acetat de
etil i o cantitate redus de ap). Componenii nepolari sunt evacuai rapid (eluie rapid); compuii
polari au timpi de retenie ridicai n consecin vor fi evacuai mai greu din sistem. Timpul de retenie
crete i pe msur ce n faza mobil crete cantitatea de solvent nepolar.
Absorption is the incorporation of a substance in one state into another of a different state (e.g., liquids being absorbed by a
solid or gases being absorbed by a liquid). Adsorption is the physical adherence or bonding of ions and molecules onto the
surface of another phase (e.g., reagents adsorbed to solid catalyst surface).

n cazul cromatografiei lichide la nalt presiune n faz invers (reversed phase HPLC), faza
staionar este nepolar lanturi hidrocarbonate hidrofobe legate de silice. Interaciunile dintre
componenii unei probe de analizat i faza staionar sunt hidrofobe (nespecifice). Ordinea de eluie este
invers compuii polari prezint timpi de eluie mici n timp ce compuii nepolari prezint timpi de
eluie mari. n consecin cei din urm sunt evacuai ultimii din coloan. Faza mobil este n general
polar.

Normal-Phase HPLC :

Reversed-Phase HPLC:

Compusul A(galben) este foarte polar; compusul B are o polaritate medie iar C este cel mai puin polar.
4

UNIVERSITATEA TEHNIC GHEORGHE ASACHI IAI

Facultatea Inginerie chimic i protecia mediului
Domeniul de licen: Inginerie Chimic
Programul de studii universitare de masterat
METODE DE CARACTERIZARE SI TESTARE II Aplicaiii practice 2012-2013, .L. PUITEL A.C.

Partea practic

Se realizeaza solutii de concetratie cunoscuta de ftalat de potasiu (0,1....0,5 g/L); guaiacol

(0,05...0,1 g/L) i acid vanilic. Deasemenea se realizeaz i un amestec dintre cele 2 solutii.
Pentru etalonarea calitativ (stabilirea timpilor de retentie a celor 3 compui) se injecteaz
separat cate 200 L n sistemul cromatografic. Se nregistreaz cromatogramele celor 3 compui i se
stabilesc timpii de retenie corespunztori.
Pentru etalonarea cantitativ a sistemului se procedeaz n felul urmtor: se realizeaz injecii
succesive din soluiile compuilor de mai sus, soluii de concentraie diferit i cunoscut. Pentru fiecare
tip de soluie se calculeaz cu ajutorul softului Origin suprafetele corespunztoare picurilor. Se traseaz
dreapta de etalonare i se stabilete corelaia Apic=f(C).
Pentru determinarea concentraiilor dintr-un amestec se injecteaz n coloan 200 L se
determin suprafaa celor 3 picuri i ulterior, prin interpolare concentraia.

Momente de dipol ale unor compui organici