Daniela (NICU) PETRESCU

genetic a persoanelor

Fingerprinting - Amprentarea AND pentru identificarea

FINGERPRINTING - AMPRENTAREA ADN PENTRU IDENTIFICAREA GENETIC A

PERSOANELOR

Primele informaii referitoare la acizii nucleici provin din 1868, cnd studentul elveian
F. MIESCHER, a descoperit n lapii de somon i n sperma altor animale o substan cu un
coninut ridicat n fosfor, format dintr-o protein i un acid organic pe care a numit-o nuclein.
Mai trziu (n 1899) R. ALTMANN, studiind nucleina de drojdii, constat c acest acid organic
este o substan macromolecular, creia i-a dat numele de acid nucleic. Ulterior, n 1909 i
1930, P. LEVENE a observat c acidul nucleic extras de el din drojdii are o constituie chimic
diferit de cel extras din timusul de viel, era deci un alt tip de acid nucleic. Cei doi acizi vor fi
cunoscui sub numele de acidul dezoxiribonucleic (ADN) - prezent n cantitate mare n nucleii
celulelor vegetale i animale, n cromosomul bacterian i n unele virusuri, i acidul ribonucleic
(ARN) - prezent att n nucleu, ct i n citoplasma celulelor, precum i la unele virusuri (ca
material genetic), (CORNEANU M. i CORNEANU G, 2005).
A trecut peste o jumtate de secol de cnd WATSON i CRICK deslueau structura
molecular a acidului dezoxiribonucleic i 25 de ani din momentul n care JEFFREYS et al.
puneau bazele identificrii genetice umane dezvoltnd i promovnd conceptul de amprentare
ADN (DNA fingerprinting). Descoperirea polimorfismului n segmentele repetitive ale ADN, de
ctre JEFFREYS i colaboratorii si, n anul 1985, a avut un impact major asupra medicinii
judiciare, acetia punnd bazele identificrii de persoan, prin amprenta genetic, mai exact prin
testul ADN. n 1985, n timp ce efectua cercetri privind gena mioglobinei umane, echipa de
cercettori condus de JEFFREYS a remarcat o serie de particulariti structurale ale moleculei
ADN. Cercettorul a aprofundat studiile privitoare la aceste trsturi particulare i a demonstrat
c ele sunt unice, irepetabile, proprii fiecrei persoane, exceptnd gemenii monozigoi.
JEFFREYS a reuit astfel s demonstreze justiiei britanice valoarea descoperirii sale: primele
testari ADN au condus la rezolvarea unor cazuri de imigraie, iar n 1986, la rezolvarea primului
caz penal, respectiv a unui caz de omucidere.
Analiza ADN n scop de identificare este cunoscut sub numele de tipare ADN,
genotipare ADN, profil ADN sau test de identificare ADN (BARBARII, 2003). Profilul ADN se
1

Daniela (NICU) PETRESCU

genetic a persoanelor

Fingerprinting - Amprentarea AND pentru identificarea

definete ca fiind totalitatea acelor caracteristici structurale ale materialului genetic care permit
identificarea unui individ. Dei foarte larg utilizat, termenul de amprent genetic nu definete
tocmai corect acest tip de analiz. Aceast sintagma, a fost creat operndu-se o analogie ntre
multitudinea de benzi obinute prin analiza de genotipare i multitudinea desenelor liniare ce
alctuiesc o amprent digital. Dei sugestiv, analogia este forat ntrucat, cei doi termeni,
amprent digital i amprent genetic nu au n comun dect capacitatea de a reflecta una dintre
trsturile fundamentale ale fiinelor vii, i anume unicitatea lor biologic. Termenul de amprent
genetic s-a impus sub aceast form n contiina publicului, nsa n prezent, n literatura
medical de specialitate i n limbajulul juridic se foloseste aproape exclusiv termenul de profil
ADN. Un profil ADN reprezint o combinaie de genotipuri obinute n urma investigrii unui set
de markeri ADN.
Amprentarea ADN a devenit bine implementat n tiinele medico-legale (LANDER i
BUDOWLE, 1994; ROBERTS, 1992; BENECKE, 1995, dup GAVRIL, 2005). n momentul n
care poliia a recunoscut valoarea analizelor ADN, materialul biologic examinat a provenit din
sngele total, din pete de snge, din cantiti minuscule de epiteliu, fire de pr, oase i sperm
uscat. n contrast cu sngele total utilizat n testele de paternitate, petele biologice de la locul
unei crime sunt deseori expuse la radiatii UV, umiditate i degradare. n plus, clinicienii au
nceput s realizeze analize din esuturi care au fost pstrate ani de zile n parafin. O problem n
toate aceste cazuri este aceea c, n funcie de condiiile de conservare, ADN-ul este de obicei
rupt n fragmente mai mici (fragmentarea este singura modalitate relevant de degradare), iar n
laborator pot fi prelucrate doar cantiti mici de ADN.
n ultimii 10 ani, au fost descoperite sisteme de tipizare ADN foarte robuste i cu
un mare potential informativ. Aceasta a crescut la maximum posibilitatea individualizrii
oricrui material biologic de origine uman.
Tipizarea (amprentarea) ADN are mai multe avantaje dect analiza tradiional a
proteinelor, n primul rnd pentru c ofer mai multe informatii, iar sursa de ADN poate
fi reprezentat de materiale biologice degradate i n cantitate foarte mic, deoarece
ADN-ul este mai rezistent la degradare dect proteinele. n plus, acelai genotip ADN
poate fi obinut din orice esut (de ex. snge, saliv, sperm, pr, piele, oase etc), pe cnd
analiza markerilor proteici se limiteaz la celulele care exprim aceste proteine.
2

Daniela (NICU) PETRESCU

genetic a persoanelor

Fingerprinting - Amprentarea AND pentru identificarea

n prezent, analiza ADN a devenit o metod standard n practica medico-legal, fiind

utilizat n majoritatea laboratoarelor, n scopul rezolvrii unor probleme din domeniul penal i
militar (exemplu: identificarea victimelor, a criminalilor, agresorilor, trierea i excluderea
suspecilor n diferite anchete poliienesti, etc.), ori din domeniul social (cercetarea paternitii,
cercetarea maternitii n cazul schimburilor accidentale de copii n materniti, noi-nscui
abandonai sau pierdui, rezolvarea cazurilor de imigraie - rentregirea familiilor, stabilirea unor
relaii de descenden biologic n scopul aflrii adevrului istoric sau din interese politice,
identificarea feilor concepui prin fertilizare in vitro sau a mamelor surogat, etc. ).
Toate genele umane sunt codificate de aproximativ 10-20% din genomul uman.
Astfel, cea mai mare parte (80-90%) a genomului uman conine regiuni noncodificante, care nu conin informaie genetic cu semnificaie direct pentru sinteza
proteinelor (COVIC et al., 2003). Variabilitatea genetic este relativ limitat n ADN-ul
codificant, cu excepia regiunilor HLA. Aceasta se datoreaza faptului c genele care se
exprim sunt supuse presiunii seleciei pe parcursul evoluiei, n sensul c trebuie s-i
menin funciile specifice. Spre deosebire de acestea, prile non-codificante ale
genomului nu pot fi controlate de presiunea seleciei, astfel c mutaiile din aceste
regiuni sunt reinute i transmise la descendeni, provocnd o semnificativ cretere a
variabilitii genetice. De aceea, aceste regiuni fiind foarte diferite de la un individ la
altul, sunt foarte utile pentru investigaiile din genetica medico-legal, avnd o valoare
informativ mare (SCHNEIDER, 1997, citat dup GAVRIL, 2005).
O proporie important din ADN-ul non-codificant (30%) conine secvene
repetitive, care pot fi incluse n dou clase: secvene repetitive n tandem (tandemly
repetitive sequences) i elemente dispersate (interspersed elements), (COVIC et al.,
2003) . Majoritatea sistemelor de tipizare ADN aflate n uz curent se bazeaz pe analiza
locilor cu secvene repetitive n tandem. Asemenea secvene se afla n ADN satelit, iar
din punctul de vedere al geneticii medico-legale, cele mai interesante sunt regiunile de
ADN repetitiv mai scurte decat cele ntalnite n ADN satelit. Aceste regiuni pot fi
clasificate in minisatelii i microsatelii, sau repetiii scurte n tandem (short
tandem repeat - STR) , (GORDUZA, 2007).
Minisateliii, denumii i loci VNTR (variable number of tandem repeats)
(NACAMURA i colab., 1988) sunt formai din 15-50 bp lungime, care se repet n
3

Daniela (NICU) PETRESCU

genetic a persoanelor

Fingerprinting - Amprentarea AND pentru identificarea

tandem pe lungimi de 500 bp - 20 kb. STR sunt mult mai scurte. Unitatea repetitiv
variaz ntre 1 si 6 bp, care se repeat pe o lungime de 50 perechi de baze pn la 500
pb. n plus, minisateliii i STR difer prin distribuia lor n genomul uman i, probabil,
prin funciile lor biologice. Astfel, minisateliii sunt mai frecvent ntalnii n regiunile
subtelomerice, pe cand STR sunt larg rspandii n ntregul genom uman cu o frecven
de 1 locus pentru fiecare 6-10 kb (BECKMAN i WEBER, 1992, dup GAVRIL, 2005).
Originea variabilitii acestor regiuni pare s fie i ea diferit. Variabilitatea
microsateliilor i are originea n crossing-over inegal i uneori n conversia genelor , iar
aceea a STR, n erorile de replicatie (GAVRIL, 2005). Variabilitatea genetic dintre
indivizi, cu privire la VNTR si STR, se bazeaz pe numrul diferit al elementelor
repetitive, ns are la baz i diferenele privind nsi secvena AND, deoarece
repetiiile pot avea mici diferene n secvena lor.
Microsateliii STR, sunt considerai n prezent standardul de aur n
materie de identificare. Funcia ndeplinit de secvenele repetitive de tip STR nu este n
prezent elucidat, dar ceeea ce intereseaza este organizarea lor i faptul c transmiterea
acestui material genetic se face asemeni genelor, cu respectarea legilor ereditatii (Legilor
Mendeliene). Astfel, n cursul diviziunii celulare, secvenele repetitive segreg
independent i se regsesc n succesiunea generaiilor. Dintre miile de microsatelii din
genomul uman, n genetica judiciar sunt utilizate doar sistemele STR formate din tetrai pentarepeii, avnd localizare unic n genom, numr minim de artefacte genetice
(microvariante) sau fenomene mutaionale (BARBARII, 2003).
Analiza unui singur marker STR nu este suficient pentru afirmarea apartenenei unei
probe. Pentru identificarea cu succes a provenienei unei probe ADN este necesar analizarea a
10 pn la 16 markeri STR. Se elimin astfel situaiile n care se raporteaz identificrile eronate,
datorate unor corespondene ntamplatoare ale profilelor ADN. Cu ct numarul markerilor
investigai crete cu att ansa identificrii eronate se reduce.

Analiza minisateliilor prin utilizarea probelor multi-locus i single-locus

Iniial, pentru analizele genetice medico-legale au fost propuse probele multi-locus.
Amprentele ADN multi-locus se bazeaz pe similitudinea secvenelor ADN din interiorul
4

Daniela (NICU) PETRESCU

genetic a persoanelor

Fingerprinting - Amprentarea AND pentru identificarea

secvenelor repetate n tandem, la majoritatea minisateliilor umani. Astfel, probele ADN formate
din repetiii n tandem dintr-o secven a acestor minisatelii, pot detecta multiple fragmente
variabile de ADN uman, prin Southern blot sau hibridizare, pentru a produce amprente ADN
individual specifice. Metoda Southern blot permite evidenierea deleiilor sau inseriilor mai mari
de 50-100 perechi de baze i a mutaiilor punctiforme care afecteaz o singur pereche de baze.
Analiza ADN-ului cromosomic prin hibridarea in situ, se realizeaz cu sonde marcate cu
fluorocromi i detectare prin microscopie de fluorescen. Metoda permite identificarea deleiilor
cromosomice submicroscopice, care sunt evideniate prin prezena unui singur semnal
corespunztor sondei (fa de cromosomii normali - unde apar 2 semnale), (GORDUZA, 2002).
n anul 1985, JEJFREYS i colaboratorii si au descris prima amprenta ADN multi-locus"
i au prezis c aceste modele individual-specifice pot constitui o metoda foarte valoroas pentru
identificarea individual i pentru testele de paternitate. Probele multi-locus au fost, de
asemenea, utilizate n cazuri judiciare dintr-o disput de imigraie, iar ulterior, n cazuri de
paternitate i criminalistic. Totui, aceste probe multi-locus nu au avut succes n domeniul
medico-legal deoarece, dei erau valoroase sub aspect informational, nu fceau posibil
evaluarea statistic a probelor n cazurile n care acestea trebuiau comparate, iar standardizarea
ridica probleme serioase. Din aceste considerente, aceste probe au fost substitute cu analiza
VNTR prin utilizarea probelor specifice de locus, n condiii de stringen ridicat.
Pn la introducerea analizei STR prin PCR, analiza minisateliilor cu probe singlelocus a fost foarte popular n majoritatea laboratoarelor de genetica medico-legal. i astzi,
acestea se utilizeaz nc n unele laboratoare, ele fiind utile pentru diferite scopuri. Probele cele
mai des utilizate n Europa sunt MS43, MS31 i YNH24. n Europa, s-au depus eforturi
considerabile pentru standardizarea analizelor cu probe single-locus. Ca rezultat al acestor
eforturi, s-a obinut o armonizare precis a rezultatelor, dei s-au utilizat metodologii diferite.
Totui, metodele statistice folosite pentru evaluarea informaiei coninute n profilurile ADN, sunt
controversate, cel mai mare avantaj al analizelor cu probe single-locus este enorma
variabilitate a unora dintre minisatelii. Dezavantajul const ns, din timpul prea mare pentru
efectuarea analizei i, mai ales, necesitatea folosirii unei cantiti relativ mari de ADN
nedegradat. Deoarece ADN-ul extras din probele medico-legale este, n cele mai frecvente cazuri,
degradat datorit condiiilor de mediu, aceste tehnici nu pot da rezultate suficient de concludente.
5

Daniela (NICU) PETRESCU

genetic a persoanelor

Fingerprinting - Amprentarea AND pentru identificarea

Analiza STR prin metoda PCR

Reacia de polimerizare n lant (PCR) a depit dificultaile menionate anterior i a
determinat creterea spectaculoas a utilitaii tehnicilor de amprentare ADN n stiinele medicolegale.Majoritatea sistemelor de tipizare ADN bazate pe PCR permit identificarea alelelor ca
entiti discrete, evitndu-se astfel problemele statistice care apar la compararea benzilor
electroforetice, iar standardizarea a devenit mult mai simpl.
Pe lng creterea sensibilitii inerente oricrei tehnici PCR, devine mult mai probabil
succesul analizei materialului vechi i degradat, deoarece mrimea mic a poriunilor polimorfe
de ADN analizat este foarte susceptibil efecturii reaciei PCR. Dup ce prin PCR a devenit
posibil generarea unui numar mare de copii ale segmentului ADN de interes, au aprut o serie de
metode pentru detecia variaiei segmentelor amplificate. Deoarece se pot produce cel putin 106
copii de secven de interes, este posibil s se utilizeze pentru detecie, metode care nu folosesc
izotopii. Pentru aceasta au fost aplicate mai multe metode. Prima dintre acestea a utilizat probe de
oligonucleotide specifice de secven (SSO). Kitul AmpliType PM PCR (Perkin-Elmer, Foster
City) este unul din cele mai folosite n laboratoarele de profil. Cu acest kit se amplific n sistem
multiplex locii HLA DQA1, LDLR, GYPA, HBGG, D7S8 i GC. Sistemul a fost validat pentru
analizele medico-legale i este nc larg utilizat, dei multe laboratoare prefer astzi sistemele
STR mult mai informative, precum i alte strategii pentru analiza variantelor HLA. Analiza
secvenelor cu repetiii scurte n tandem (STR) prin utilizarea reaciei PCR, este astzi metoda
preferat pentru identificarea medico-legal. STR-urile dinucleotidice sunt cele mai comune
STR-uri din genomul uman, ele fiind markerii genetici cei mai utilizai pentru analizele de
linkage. Totui, nu acetia sunt cei utilizati n genetica medico-legal din cauza c aceste STR
uri sunt afectate n cursul amplificrii prin erori de replicare (strand slippage), ceea ce produce
benzi artefactuale n electroforez. Spre deosebire de acestea, repetiiile tetra i pentanucleotidice
sunt mult mai puin supuse acestor artefacte de replicare i de aceea sunt mult mai potrivite
pentru studiile de amprentare ADN (GAVRIL, 2005).
Datorit structurii lor, STR variaz prin faptul c pot fi extrem de complexe, pn la
extrem de simple. STR complexe prezint avantajul hipervariabilitii. STR simple au avantajul
unei foarte simple standardizri i al sczutei rate mutaionale. Evenimentele mutaionale sunt
6

Daniela (NICU) PETRESCU

genetic a persoanelor

Fingerprinting - Amprentarea AND pentru identificarea

mult mai frecvente n linia germinal masculin, aceast rat, pentru diferii loci, putnd varia cu
mai multe ordine de mrime, structura i lungimea fiind factorii care o afecteaza cel mai mult Pe
lng caracteristicile menionate, selectarea STR ideale pentru scopurile medico-legale include
analiza minuioas a bezilor artefactuale pe care le pot genera, precum i robusteea i mrimea
lor. n general, dimensiunile scurte sunt preferabile, deoarece mrimea produsului amplificat este
critic la probele degradate n care fragmentele mici pot fi amplificate, iar cele mai mari, nu.
Un alt avantaj important l constituie posibilitatea amplificrii simultane a mai multor loci
STR printr-o singur reacie de tip multiplex. Acesta, cuplat cu detecia direct a produilor de
amplificare pe gel de poliacrilamid, face posibil automatizarea amprentrii ADN pe baza STR.
STR au fost pentru prima data analizate prin folosirea sistemelor manuale de
electroforez. Pentru standardizare, sunt recomandabile gelurile de poliacrilamid denaturante
pentru c prin folosirea lor pot fi detectai i produi de amplificare generai de erori de replicare.
Domeniul a fost revoluionat prin introducerea tehnicilor bazate pe evidenierea fluorescent i
prin utilizarea secveniatoarelor ADN. Folosirea secveniatoarelor permite realizarea unor reacii
multiplex mari.
Pentru tipizarea STR este esenial utilizarea ladderi-lor alelici cu secven de
referin. In general, acesti ladderi alelici cuprind toate alelele unui sistem, dei, uneori, pot
apare i alele intermediare la STR-urile mai simple. Pentru distingerea acestor alele intermediare
exist ghiduri de interpretare i astfel ele pot fi uor implementate la secveniatoarele automate.
n general, puterea de discriminare combinat a STR este enorm, iar probabilitatea ca doi
indivizi nenrudii s fie identici este mai mic de 10-10, pentru majoritatea multiplexelor
existente.

AND mitocondrial (AND mit)

Transmiterea materialului genetic mitocondrial se face preferenial pe linie matern
fiind vorba de erediatate de tip matern (matroclinie). Datorit faptului c ADNmt al unei persoane
este motenit integral de la genitorul matern, se poate verifica descendena biologic pe linie
feminin a membrilor unei familii. Acest lucru este extrem de util n identificrile de persoane,
mai ales acolo unde una din verigile dintre generaii lipsete: de exemplu, n cazul n care ambii
7

Daniela (NICU) PETRESCU

genetic a persoanelor

Fingerprinting - Amprentarea AND pentru identificarea

prinii sunt decedai, studiul secvenelor de ADNmt al nepoilor i bunicii materne permite
stabilirea filiaiei lor biologice. Modul de transmitere al ADNmt are i dezavantaje legate de
imposibilitatea distingerii ntre descendenii pe linie matern ale aceleai familii. Analiza ADNmt
nu i gsete utilitatea pentru testele de paternitate.
Analiza regiunii de control a ADNmit este o metod eficient pentru studiul i compararea
provenienei oaselor, a ADN vechi i foarte degradat, i mai ales pentru analiza firelor de pr fr
bulb. n aceste cazuri, variaia ADNmit poate fi analizat prin mai multe strategii. Combinarea
amplificarii PCR cu secvenierea direct a ADN este de obicei ultima etap pentru identificare,
demonstrndu-se reproductibilitatea sa n diferite cazuri de medicin legal. Dei analiza
ADNmit este o metod valid pentru genetica medico-legal, problemele cum ar fi rata
mutaional, heteroplasmia i necesitatea pentru prelucrarea statistic, fac uneori dificil
interpretarea rezultatelor.
Variaiile cromosomului Y
n timp ce toti cromozomii se gsesc perechi n genomul uman, cromosomul Y este unic
nepereche i nu particip la aceste procese de schimb de material genetic. Consecina acestui tip
de comportament din cursul diiviziunii celulare este c Y-ul se transmite integral de la tat la
fiu, n succesiunea generaiilor. Aceast modalitate de transmitere a cromozomului Y ar
corespunde n societate trasmiterii numelui de familie de la tat la descendenii de sex masculin.
Un profil ADN specific cromozomului Y, definit printr-un set de 9-11 markeri de tip STR-Y,
poate discrimina peste 95% din indivizii de sex masculin dintr-o populaie. Puterea
discriminatorie a markerilor cromozomiali Y scade n izolatele populaionale. Discriminarea ntre
indivizii care au o filiaie comun pe linie masculin (tat-fiu, nepot-bunic patern, frai, veri
primari cu bunic patern comun, nepot-unchi patern, etc.) nu se poate realiza utiliznd markerii
specifici cromozomului Y.
Polimorfismele specifice cromozomului Y s-au dovedit a fi foarte utile n identificarea
medico-legal. Polimorfismele Y pot fi aplicate n testarea paternitii cnd este investigat
descendentul masculin al unui tat prezumptiv, precum i n diferite cazuri de criminalistic. De
asemenea, analiza polimorfismelor Y este util pentru analiza fraciunii de ADN masculin din
probe amestecate de la ambele sexe, fapt des ntalnit n anumite crime (5-15% dintre cazurile de
medicina legal). Dei variabilitatea cromozomului Y este mic, regiunea non-pseudoautozomal
8

Daniela (NICU) PETRESCU

genetic a persoanelor

Fingerprinting - Amprentarea AND pentru identificarea

conine diferite tipuri de secvene polimorfe, cum ar fi: markeri bialelici, STR i minisatelii. Cele
mai utilizate STR-uri Y sunt formate din repetiii trinucleotidice (DYS392) i tetranucleotidice
(DYSI9, DYS385, DYS389-I, DYS389-II, DYS390, DYS391 i DYS393). Cea mai
cuprinztoare baz de date international cu profile cromozomiale Y este organizat de
cercettorii de la Universitatea Humbold din Berlin (www.yhrd.org) i conine sute de mii de
profile AND-Y, fiind o referin important att pentru interpretarea rezultatelor testrilor de
rutin efectuate n laboratoarele de gentic judiciar. Geneticienii apreciaz c ntr-un viitor nu
foarte ndeprtat, un profil cromozomial Y detaliat va putea indica anchetatorilor populaia de
origine i poate chiar i numele de familie al infractorului care a lsat o urm biologic la locul
unei fapte.
Interpretarea statistic a cazurilor pentru coinciden, aceeai ca i pentru ADNmit, este
mult mai complicat i necesit luarea n considerare a unor corecii adecvate n funcie de
substructura populaiei de unde vin probele.
Nomenclatura arbitrar atribuit secvenelor de ADN se realizeaz prin simboluri
alfanumerice, conform nomenclaturii standardard adoptate la nivel international, pentru a se
facilita schimbul de informaii. Astfel o secventa de ADN uman va fi denumit prin:
Tipul acidului nucleic (D - reprezinta iniiala de la DNA n terminologia anglo-saxon);
Localizarea cromozomial (1,2,3,........22, X sau Y);
Caracteristicile secvenei (ex: S - single copy sequence, etc.);
Poziia secvenei la nivelul regiunii cromozomiale
Exemplificarea nomenclaturii pentru markerul D1S80
D

DNA

localizarea secventei pe cromozomul 1

segment unic

80

al 80-lea locus descris pe cromozomul 1

Daniela (NICU) PETRESCU

genetic a persoanelor

Fingerprinting - Amprentarea AND pentru identificarea

Metodologia identificrii de persoan prin analiza STR cu sistemele MULTIPLEX

Promega (SUA)
Amprentele ADN clasice se pot obine din cel putin 5-10 g de ADN nedegradat. De
aceea, tehnologia clasic nu poate fi utilizat pentru analiza petelor care conin cantiti de ADN
mult mai mici i/sau de ADN degradat. De exemplu, un fir de pr smuls cu tot cu radcin
conine pn la 30 ng de ADN genomic, pe cnd un fir de pr fr bulb conine maximum 0,1 ng
ADN. ADN-ul degradat conine fragmente moleculare scurte. De aceea tipizarea ADN trebuie s
utilizeze tehnici care permit detecia unor loci repetitivi scuri i, n acelai timp, s ofere
informaiile necesare. Aceti loci (STR) au fost descoperii acum 12 ani, deci mai trziu dect
debutul amprentrii ADN.
Genomul fiecrei persoane conine sute de loci STR (numrul exact nu este nc
cunoscut). S-a observat c fiecare locus are un numr limitat de alele posibile, n general de la
cinci, la zece alele. Fiecare individ poate fi heterozigot sau homozigot pentru fiecare locus STR.
Comparaia alelelor unui individ cu alelele obinute dintr-o pat de snge de la locul unei crime
sau cu ale unui copil, permite determinarea identitii sau paternitii.
Locii STR sunt astzi mijlocul primordial de analiz a petelor i de investigaii
criminalistice n lume. n Statele Unite, unde pn n 1997 erau utilizai cu anumite restricii,
cazul O.J. Simpson a demonstrat n mod impresionant utilitatea STR pentru tipizarea unor
cantiti mici de ADN.
Pentru a evidenia STR este necesar ca aceti loci s fie amplificai prin PCR. Astzi
pot fi amplificai simultan pn la 16 loci STR, folosindu-se primeri care detecteaz specific un
anumit locus.
Dup separarea electroforetic a produilor PCR, vizualizarea se face prin coloraie
argentic sau prin detecia fluorescent semiautomatizat.
Sintetiznd, putem spune c etapele tehnologice (metoda manuala de electroforez)
prin care trebuie trecut o prob biologic pentru tipizarea ADN pe baza analizei STR, sunt
urmatoarele:
10

Daniela (NICU) PETRESCU

genetic a persoanelor

Fingerprinting - Amprentarea AND pentru identificarea

extracia ADN din probele biologice;

amplificarea probelor de ADN prin reacia PCR;

relevarea alelelor amplificate prin electroforeza n gel denaturant de poliacrilamid

(evidentierea amprentei ADN);

interpretarea statistic a rezultatelor

Extractia ADN din probele biologice

nainte de efectuarea oricrui tip de testare, ADN-ul trebuie izolat din celule sau
resturi celulare sau chiar din orice material n care se poate afla el. Aceast operaie trebuie
executat cu mare grij i meticulozitate. Procedurile de extracie sau izolare variaz n
funcie de materialul prezent n prob (de exemplu, snge, sperm, saliv, pr etc.), de
cantitatea de material din prob (ceea ce influeneaz tipul de test la care va fi supusa prob).
Alegerea metodei este n funcie de inspecia vizual, examinarea microscopic i testele
disponibile.
Cantitatea de ADN necesar pentru determinarea complet a amprentei ADN cu
sistemele STR nu depete valoarea de 1-5 ng/l. Astzi exist kit-uri special destinate
pentru asemenea extracii, care permit izolarea ADN din cantiti infime de prob biologic.
De exemplu:
-un fir de pr fr bulb, conine aprox. 1 ng ADN
-un l de saliva, conine aprox. 3 ng ADN
-un l de snge, conine aprox. 45 ng ADN
-un fir de pr cu bulb, conine aprox. 10-500 ng ADN.
Datorit lungimii mici a STR, reacia PCR pentru un singur sistem STR necesit doar
50 pg de ADN matri (BENECKE, 1996, dup GAVRIL, 2005). Considernd c o singura
celul uman conine 6 pg de ADN, opt celule sunt suficiente pentru analiza ADN. n situatii
mai rare, poate fi tipizat i o singura celul (mai ales spermatozoidul).
Kitul de purificare de la Promega Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit
permite izolarea rapid i simpl a ADN dublucatenar din snge total, culturi celulare i
11

Daniela (NICU) PETRESCU

genetic a persoanelor

Fingerprinting - Amprentarea AND pentru identificarea

esuturi animale, fr utilizarea solvenilor organici. Procesul cuprinde trei etape:

- In prima etap se efectueaz liza celulelor, respectiv liza nucleilor. Pentru izolarea ADN din
leucocitele sanguine, aceast etap implicit liza eritrocitelor, urmat de liza leucocitelor i a
nucleilor lor.
- A doua etap const din indepartarea proteinelor prin precipitare salin n urma creia ADN
genomic rmne n soluie.
- ADN genomic este splat i concentrat prin precipitare cu izopropanol. Din 300 l de snge
se obine o cantitate de 5-15 g de ADN genomic bicatenar, cu greutate molecular mare,
adic de lungime acceptabil, pentru analize.
Un alt kit, produs tot de Promega, este Promega DNA IQc System". Acest kit este
foarte util pentru izolarea ADN din produsele biologice degradate sau aflate n cantiti mici,
specifice medicinei legale. Extracia cu acest kit presupune dou etape importante. Pentru
materialele importante aflate pe un suport solid, prima etap const dintr-o extracie simpl
rapid i eficient a materialului biologic de pe suport. Etapa a doua utilizeaz o rain
magnetic ce leag specific ADN-ul, fr a fi necesar o splare a probei pentru a se ndeprta
reactivul de liz. n plus, prezint avantajul c particulele nu se agreg n momentul n care
sunt acoperite de ADN. Aceast metod este util pentru purificarea rapid a cantitilor mici
de ADN, aproximativ 100 ng sau chiar mai putin, i devine mult mai eficient n cazurile n
care probele conin mai puin de 50 ng ADN. Cantitatea de ADN extras prin folosirea unui
protocol standard de izolare este limitat la cantitatea necesar unei reactii PCR pentru
amplificarea STR, ceea ce rezolv o problem dificil, n cazul folosirii altor tehnici, i
anume msurarea cantitii de ADN obinut dintr-o prob.
De precizat c ambele proceduri de extracie prezentate mai sus, prezint o serie de
adaptri i alternative pentru extracia ADN din diferite produse specifice, de exemplu,
digestia firelor de pr sau a fragmentelor de esuturi cu proteinaza K.
Amplificarea probelor de ADN (reacia PCR)
Procedura are rolul de a realiza amplificarea n milioane de exemplare a genelor care vor
fi analizate pentru identificare. Deoarece ADN extras din probele biologice se afla ntr-o
12

Daniela (NICU) PETRESCU

genetic a persoanelor

Fingerprinting - Amprentarea AND pentru identificarea

concentraie foarte mic, el nu poate fi analizat. n plus, el conine toat informaia genetic.
Pentru amprentarea ADN, locii STR sunt amplificai prin folosirea primerilor specifici care sunt
astfel concepui nct permit desfurarea reaciei PCR, prin sistemul multiplex. Un sistem
multiplex de analiz a locilor STR folosit aproape standardizat n medicina legal, este
GenePrint STR System" (Promega, SUA) cu ajutorul caruia se poate realiza amplificarea a 9
loci n trei reacii multiplex (cte 3 loci pentru o reacie). Sistemul este format din kiturile:
-CTT Triplex, care amplific locii CSF1PO, TPOX i TH01;
- FFv Triplex, care amplific locii F13A01, FESFPS i vWA;
-SilverSTR III Triplex, care amplific locii D16S539, D7S820 i D13S317.

n tabelul 1 sunt prezentate amnunte privind locii STR inclui n cele trei triplexuri
GenePrint STR Systems (ilver Stain Detection). (Tehnical manual Promega Corporation, 2001).
TABEL 1. Locii STR inclui n GenePrint STR System" (Promega, SUA)
Locusul STR

Localizare
cromozomiala

Denumirea locusului n GeneBank i

definiia locusului

Secvena repetitive
5-3

ilverSTR III Triplex

D16S539

I6q24-qter

Nu este specifieat

AGA'F

D7S820

7ql 1.21-g22

Nu este speeificat

AGAT

D13S317

13q22-q31

Nu este specificat

AGAT

CTT STR Triplex

CSF1PO

5q33.3-q34

TH01

11 p 15.5

TPOX

2p25.1-pter

HUMCSF1PO Proto-oncogena umana

e-fms pentru gena rceeptorului CSF-1
HUMTH01 Gena tirozin hidroxilazei
umane
HUMTPOX Gena droid peroxidazei
umane

AGAT

AATG

AATG

FFv STR Triplex

F13A01

6p24.3-p25.1

HUMF13A01 subunitate a genei factorului

XIII de coagulare, uman

AAAG

13

Daniela (NICU) PETRESCU

genetic a persoanelor

FESFPS

Fingerprinting - Amprentarea AND pentru identificarea

15q25/qter

HUM FESFPS,

AAAT

proto-oncogena umana c-Fes/fps

vWA

12pl2-pter

HUMVWFA31, gena factorului uman von

Willebrand

AGAT

Locii inclui n aceste trei sisteme Triplex conin alele clar separate, care difer n
lungime prin numrul de uniti repetitive. Aceasta a permis construcia de ladderi
alelici care conin fragmente de aceeai lungime ca i alelele cunoscute pentru fiecare locus.
Compararea vizual ntre aceti ladderi alelici i probele amplificate permite
determinarea rapid i precis a alelei prezente n proba (Fig. 1). Fiecare din cele trei
sisteme Triplex din GenePrint STR System conine perechile de primeri pentru
fiecare locus, precum i ladder-ii alelici pentru aceti loci. n reacia de amplificare se
folosete de asemenea, tamponul specific de reacie i Taq polimeraza standard.
Prepararea soluiei de amplificare (PCR Master Mix) se face conform tabelului 2. Se
multiplic volumul per proba (l) cu numrul total al reaciilor, pentru a se obine volumul final
Dup repartizarea cantitilor corespunzatoare de soluie Master Mix n fiecare tub de
amplificare, cantitatea de ADN matrit (proba) care se adaug, este un factor critic. Astfel, pentru
CTT Triplex i pentru SilverSTR III Triplex, se foloseste o cantitate de 1-5 ng ADN matri
pentru un tub de reacie de 25 l, iar pentru FFV triplex, 5-10 ng.
Tabelul 2. Prepararea PCR Master Mix, pentru 12 probe dintr-un STR Triplex
Componenta din PCR Master
Mix
Apu distilata fara nucleaze

Volum per proba

(l)
17,35

Numar de
reactii

Volumul final

12

(l)
208,2

2,50
2,50

12
12

30
30

0,15

12

1,8

12

270

Tampon STR 10X

Amestec de percchi de primeri
Triplex 10X
Taq ADN Polimeraz
(la
5u /l)

(0,75u)

Volumul total

22,50

Protocolul de amplificare depinde n principal de tipul de Termocicler folosit.

Manualele tehnice recomand detaliile condiiilor de amplificare, dar ntotdeauna,
protocolul trebuie optimizat n funcie de specificul fiecrui laborator. De exemplu,
14

Daniela (NICU) PETRESCU

genetic a persoanelor

Fingerprinting - Amprentarea AND pentru identificarea

pentru amplificarea locilor din sistemul CTT Triplex, o variant optim de protocol
poate fi, (GEORGESCU i COSTACHE, 2010):
Treapta 1:

96C, 2 minute

Treapta 2:

94C, 1 minut

Treapta 3:

60C, 1 minut

Treapta 4:

70C, 1,5 minute

-repetarea succeiva a treptelor 2, 3 i 4, n 10 cicluri

Treapta 5:

90C, 1 minut

Treapta 6:

60C, 1 minut

Treapta 7:

70C, 1,5 minute

-repetarea succeiva a treptelor 5, 6 i 7, in 20 cicluri

Treapta 8 (de repaus): 4C
Dup amplificare, se recomand ntotdeauna verificarea succesului reaciei PCR. Aceast
procedur, dei opional, este totui important, pentru c astfel se evit prelucrarea n
continuare a probelor pentru electroforeza pe gel de poliacrilamida dac amplificarea a euat.
Aceast verificare se face prin electroforeza produilor PCR pe gel de agaroza 1-2% i colorare
cu bromur de etidiu. Observarea gelului se face la transiluminator, la 302 nm (fig.1).

15

Daniela (NICU) PETRESCU

genetic a persoanelor

Fingerprinting - Amprentarea AND pentru identificarea

Fig.1. Exemplu de amplificare PCR: linia 1- marker de greutate 100 pb;liniile 2-3ampliconi de 740pb

Electroforeza produilor PCR n gel denaturat de poliacrilamid

Relevarea alelelor amplificate la fiecare locus se poate face prin procedura manual de
electroforez vertical n gel denaturant de poliacrilamid. Dimensiunile optime ale plcilor ntre
care se toarn gelul sunt: 31 cm/38,5 cm, iar groimea gelului este de 0,4 mm. Toat procedura de
electroforez este foarte laborioas i trebuie s respecte ntocmai indicaiile manualelor tehnice
de utilizare. n general, etapele de lucru pentru electroforeza n gel de poliacrilamida a produilor
PCR, sunt urmatoarele:
1. Pregtirea plcilor (spalarea, ungerea cu soluiile de lipire i de detaare, suprapunerea i
etaneizarea plcilor cu spaiatoarele, cletii i banda adeziv);
2. Prepararea solutiei de poliacrilamid i agent denaturant (uree);
3. Testarea timpului de polimerizare;
4. Adugarea agentului de polimerizare (amonium persulfat i TEMED);
5. Turnarea gelului;
6. Polimerizarea (60 minute);
7. Instalarea plcilor pe aparatul de electroforez;
8. Premigrarea (60 minute, pentru atingerea temperaturii de aprox. 50C)
9. Aplicarea probelor (3 l /godeu);
10. Migrarea (90 minute la 1500-2000 V);
11. Dezlipirea plcilor;
12. Colorarea argentic
n prezent, pentru aplicaiile de genetic judiciar, metoda analitic de selecie este
reprezentat de electroforeza capilar cuplat cu detecie fluorescent LASER. Tehnica se
realizeaz automatizat cu ajutorul unor echipamente dedicate, denumite generic analizoare
genetice. Aceste echipamente au un randament de lucru mare, permind prelucrarea unui numar
de zeci - sute de probe intr-un interval de cateva ore. Analiza genetic cu ajutorul echipamentelor
automatizate reduce substanial efortul de lucru n laborator i crete performana testrilor n
scop de identificare. Avantajele utilizarii tehnicilor automate sunt certe, ns cu toate acestea,

16

Daniela (NICU) PETRESCU

genetic a persoanelor

Fingerprinting - Amprentarea AND pentru identificarea

implementarea tehnicilor de analiz se face n laboratoarele de la noi din ar cu destul de mult

greutate datorit costurilor ridicate ale echipamentelor i a consumabilelor.

Fig.2. Electroforegrama obinut prin metoda de secvenializare Dye terminator

(http://en.wikipedia.org/wiki/Sanger_sequencing)

Evaluarea statistic a testelor ADN.

Legile lui Mendel au stabilit probabilitatea distribuiei alelelor la descendeni, de aceea ele
sunt utilizate pentru a genera patru reguli n atestarea paternitii:
1. Copilul nu poate avea un marker genetic care este absent la ambii prini;
2. Copilul trebuie s moteneasc o pereche de marker genetici, cte unul de la fiecare
printe;
3. Copilul nu poate avea o pereche de marker genetici identicidect dac ambii prini
posed markerul respective, cel puin ntr-un singur exemplar;
4. Copilul trebuie s aib markerul genetic care este present independent la ambii prini.
Funcia cea mai importanta a testelor de medicin legal, indiferent dac este vorba de
testarea paternitii sau de identificare, este aceea de a exclude numrul maxim de posibili
indivizi. n testele de paternitate aceasta se realizeaz prin identificarea alelei obligatorii i
determinarea dac tatl posibil posed aceast alel.
Alela obligatorie este alela care n mod obligatoriu vine de la tatal biologic. De exemplu,
daca mama este de tip AA, iar copilul este de tip AB, tatl biologic trebuie s contribuie la copii
cu alela B. Daca nu este aa, este ncalcat legea ereditii mendeliene, mama considerndu-se ca
fiind sigur mama acestui copil. Dac tatal prezumptiv poseda alela B, fie n stare homozigot
17

Daniela (NICU) PETRESCU

genetic a persoanelor

Fingerprinting - Amprentarea AND pentru identificarea

(ambele alele B), fie n stare heterozigot (alela B doar ntr-un singur exemplar), el nu poate fi
exclus.
Daca tatl prezumptiv nu poseda alela B, el nu a avut cum s-o transmit la copii i de
aceea este exclus de la paternitate. Singura excepie a unei asemenea situatii ar fi dac mutaia
alelei A n alela B, ar fi un eveniment relativ frecvent. Dac mama este de tip AB, iar copilul este
AB, atunci alele obligate sunt i A i B, iar tatl poate contribui la descendent atat cu A, ct i cu
B. Orice tat prezumptiv care poseda alelele A i B, nu poate fi exclus. Dac ns tatl prezumptiv
este de tip C sau cu orice alt genotip non-A i non-B, el este exclus a fi tatal biologic. Se observa
n acest caz c exist dou alele obligatorii.
n situaiile n care tatl nu poate fi exclus, se poate calcula gradul de posibilitate pentru
ca el s fie tatl adevrat. Acest grad de posibilitate (weight of the evidence") reprezinta ansa
relativ ca tatl prezumptiv s transmit la copii alela obligatorie, fa de ali indivizi nenrudii
din populaie.
Indicele de Paternitate (PI) reprezint ansa relativ ca tatl prezumptiv s transmit alela
obligatorie, fa de un alt individ nenrudit din populatie. Indicele de paternitate este un raport de
probabilitate", adic raportul dintre ansa tatlui prezumptiv de a transmite alela, versus alt
individ din populaie. ansa ca tatl prezumptiv s transmit alela obligatorie este determinat de
legile lui Mendel. Daca tatl este homozigot pentru alela obligatorie, adic poseda ambele alele
obligatorii, probabilitatea de a transmite alela obligatorie este 1,0 (2/2). Daca tatl prezumptiv
posed doar o copie a alelei obligatorii sau doar una din dou alele obligatorii, probabilitatea de a
transmite aceast alel devine 0,5 (1/2). PI pentru un anuine locus este probabilitatea cu care tatl
prezumptiv poate transmite alela, mprit la frecvena alelei sau alelelor obligatorii. Astfel, PI
poate fi 1/p sau 0,5/p, depinznd de numarul de alele obligatorii pe care le posed tatl
prezumptiv. Dac s-a determinat dup mam i copil c exista dou alele obligatorii, p se
calculeaza dup formula:
p = p1 + p2, i va fi: l/(p1 + p2) sau 0,5/(p1 + p2)
PI se calculeaz pentru fiecare locus care este testat. Legile teoriei probabilitilor
determin cum se combin toate Pl-urile, pentru a se determina probabilitatea combinat a
paternitii. Astfel se obine indicele de paternitate combinat (CPI).
18

Daniela (NICU) PETRESCU

genetic a persoanelor

Fingerprinting - Amprentarea AND pentru identificarea

La noi n ar, peste 80% din activitatea privind expertiza din domeniul stabilirii filiaiei
este realizat n cadrul laboratoarelor INML Mina Minovici (www.legmed.ro). Formularea
concluziilor medico-legale n investigatiile ADN de filiaie se face prin studiul comparativ al
profilelor ADN aparinnd persoanelor testate, n care se urmarete dac au fost respectate legile
clasice ale transmiterii caracterilor ereditare. Rezultatul final al unei testari ADN care valideaz
paternitatea se exprim ntotdeauna n termeni de probabilitate, respectiv prin indicele de
paternitate i probabilitatea de paternitate.
Markerii genetici Short Tandem Repeat (STR), pot fi utilizai i ca instrumente
genetice n individualizarea polimorfic interpopulaional. Un studiu de genetic populaional
presupune anumite preocupri privind "originea, cantitatea i distribuia variaiei genetice
prezent n populaiile de organisme i destinele acestor variaii n timp i spaiu" i pleac de la
trei mari premise: a) ADN-ul se poate replica, b) ADN-ul poate suferii muta ii i se poate
recombina i c) fenotipul este rezultatul interaciunii dintre ADN i mediul nconjurtor. La noi n
ar s-a realizat un studiu n cadrul unei teze de doctorat - Analiza genetic a populaiilor umane
de pe teritoriul Romniei. n lucrare s-a analizat distribuia geostatistic a frecvenelor alelice n
populaiile umane de pe teritoriul Romniei folosind mai multe Sisteme Unitare de Ordonare a
Frecvenei (SUOF): alela cu cea mai mare frecven, genotipul ce cea mai mare frecven ,
profilul genetic homozigot cu cea mai mare frecven i profilul genetic heterozigot cu cea
mai mare frecven.
Autorul tezei de doctorat mai sus amintite afirm c :Analiza genetic a populaiilor
umane de pe teritoriul Romniei este pe departe a fi un domeniu finalizat. Dei este cea mai
complet abordare la ora de fa pentru Romnia, aceast tez de doctorat prezint doar o parte
din markerii STR existeni i doar un anumit tip de organizare popula ional (cel
administrativ).

Rmne

de analizat mai departe dinamismul frecvenelor alelice n timp,

organizarea eantioanelor populaionale dupa etnii, analiza influenei migraiei forei de munc la
nivel genetic n populaii europene precum Frana, Italia i Spania i alte aspecte Determinarea
probabilistic a originii geografice a unui profil genetic (DPOGPG) este la nceputul
dezvoltarii sale. Cum precizia acestui instrument populaional este dependent de mrimea bazei
de date, respectiv a numrului de raportri de date genetice populaionale, este de ateptat ca n
urmatorii ani aceast precizie s se mbunteasc i totodat aplicaiile specifice acestei
abordri s se diversifice i s se mbunteasc i mai mult, prin monitorizarea literaturii de
19

Daniela (NICU) PETRESCU

genetic a persoanelor

Fingerprinting - Amprentarea AND pentru identificarea

specialitate, alimentarea continu i dezvoltarea bazei de date EHSTRAFD. Pentru a completa

imaginea de ansamblu a studiilor markerilor genetici pentru populaiile din Romania,
datele obinute folosind markeri STR autozomali i heterozomali necesit a fi completate cu cele
obinute n urma analizei markerilor SNP, ndeosebi cei mitocondriali pentru populaiile actuale
(STANCIU, 2010).

BIBLIOGRAFIE:
1. BARBARII L., 2003 Investigaia ADN in slujba justiiei. Note de curs.INML Mina
Minovici Bucureti, 16p.
2. CORNEANU M., CORNEANU G., 2005 Genetica general i evoluia genomului. Ed.
Universitaria, Craiova, p:75-100
3. COVIC M., TEFNESCU D., SANDOVICI I., 2003 Genetic medical. Ed. Polirom,
Iai,
4. JEFFREYS AJ, WILSON V, THEIN SL, 1985 - Individual-specific 'fingerprints' of human
DNA. Nature;316:76-79.
5. GAVRIL L., 2005 Genomica. Vol. II, Ed. Enciclopedic, Bucureti, p:1145- 1174.
6. GEORGESCU S.E., COSTACHE M., 2010 Biochimia acizilor nucleici i biologie
molecular. Ed. Univ. Bucureti, p: 49 97.
7. GORDUZA M.,V., TOFAN L., UTEU D., GORDUZA V.E., 2002 Biomateriale,
Biotehnologii, Biocontrol. Ed. Cermi, Iai, p: 543 578.
8. STANCIU FLORIN, 2010 - Analiza genetic a populaiilor umane de pe teritoriul Romniei
folosind markeri STR. Tez de doctorat. Universitatea din Bucureti, catedra de Biologie.
9. ***, 2007 - The ENCODE Project Consortium. Identification and analysis of functional
elements in 1%of the human genome by the ENCODE pilot project. Nature, 447:799-816.
doi:10.1038/nature05874.
10. http://www.watt.ro/ro/Analizor_fragmente_ADN/Analizor-fragmente-ADN---ElectroforezaCapilara.
11. http://en.wikipedia.org/wiki/Sanger_sequencing

20