Sunteți pe pagina 1din 6

LUCRARE PRACTIC NR.

12

6.2. Evidenierea produilor secundari de metabolism ai plantelor


Produii secundari de metabolism ai plantelor constituie un grup foarte eterogen, prin
natura lor chimic, repartiia sistematic, anatomic i rolul presupus. Ei se caracterizeaz prin:
repartiia sistematic negeneralizat i foarte neregulat;repartiia anatomic adesea foarte
localizat;rolul metabolic obscur. Muli produii secundari pot avea un oarecare rol biologic,
ns pe plan fiziologic sunt aparent inutili i considerai, deseori, ca deeuri. Foarte adesea ei
nu sunt eliminai n exterior, ci acumulai n vacuole, n lumenul canalelor i pungilor secretoare
sau ntre cuticul i membrana scheletic; unii metabolii secundari sunt eliminai la exterior.Ei
prezint un foarte mare interes pentru om, avnd ntrebuinri farmacodinamice i industriale.

6.2.1. Evidenierea alcaloizilor


Alcaloizii sunt substane organice azotate, n general cu structuri ciclice, unde azotul
este ncorporat, adesea, ntr-un nucleu heterociclic; alcaloizii cu proprieti bazice foarte
pronunate de unde i numele; sunt precipitai de reactivi caracteristici (taninuri, ap iodat, clorur
mercuric, etc,). Alcaloizii nu sunt sintetizai n organismul animal i nici de ctre alge sau muchi;
ei se gsesc rar n ciuperci, ferigi i gimnosperme. n cantiti mari se gsesc n plantele
superioare; cum ar fi familiile alcaloidifere (Solanaceae, Papaveraceae, Rubiaceae, etc.). Rareori
o specie conine un singur alcaloid; de obicei se ntlnesc mai muli cu o structur asemntoare.
n mod obinuit ei sunt dizolvai n vacuole, unde datorit proprietilor lor bazice, formeaz
sruri cu diveri acizi, dar pot fi prezente n toate organele plantei. Dei alcaloizii apar nainte de
toate ca deeuri li se pot atribui i urmtoarele roluri: stimularea fotosintezei;aciune
hormonal;funcie protectoare contra agenilor patogeni i organismelor fitofage.
6.2.1.1.Evidenierea nicotinei
Nicotina face parte din clasa alcalozilor pirolidinici i este biosintetizat n rdcini i
transportat, mai ales prin xilem, n frunze, unde se acumuleaz sub form de sruri cu acizii citric,
malic, reprezentnd pn la 2 % din greutatea uscat la Nicotiana tabacum i circa 8% la
Nicotiana rustica. Este un lichid uleios, incolor, cu miros ptrunztor i foarte toxic; oxidat capt
culoare brun.
Materiale necesare: frunz de tutun, (tutun dintr-o igar), reactiv Wagner, pahar
Erlenmeyer, plnie, frtie de filtru, pipete, ap distilat, bec de gaz.
Modul de lucru: tutunul dintr-o igar se nclzete cu 10-15 cm ap distilat; se filtreaz.
Peste civa ml de filtrat se adaug 1-2 ml reactiv Wagner (iod n iodur de potasiu) i se
omogenizeaz coninutul vasului. Se formeaz un precipitat brun- rocat, care se dizolv prin
nclzire.
6.2.1.2 Evidenierea solaninei
Solanina face parte din grupa alcalozilor sterolici i se gsete n plantele tinere de
Solanum tuberosum (cartof), n lstari i n tuberculii ncolii (mai ales n vrfurile lstarilor i n
jurul ochiurilor). Molecula prezint scheletul colesterolului, astfel c solanina este nrudit cu
steriodele.
Materiale necesare: tuberculi de cartof ncolii, acid sulfuric concentrat, pipete.
Modul de lucru: Pe o felie de cartof se aeaz cteva picturi de acid sulfuric concentrat.
Apare o coloraie roie, mai ales la periferie (aproape de suber). Dup cteva minute culoarea
devine violet.

6.2.2 Evidenierea heterozidelor (glicozide)


Heterozidele sunt compui alctuii dintr-o component glucidic i o component
neglucidic (aglicon) cu structur chimic foarte diferit.
Agliconul confer glicozidelor proprieti specifice. Se gsesc n frunze, petale,
semine i de multe ori n scoara arborilor. Semnificaia biologic a condensrii glucidelor cu un
43

aglicon nu este elucidat; toi agliconii care prezint nuclee fenolice sunt toxici n stare liber, iar
condensarea lor cu un glucid permite diminuarea toxicitii.
Heterozidele au adesea o toxicitate foarte ridicat pentru speciile care nu le biosintetizeaz.
Cuplul flavon - antocianidin, are un rol n procesele de oxido-reducere; flavonele i
antocianii, filtrnd lumina i oprind unele radiaii, intervin n toate procesele fiziologice sensibile la
radiaiile solare: fotosintez, transpiraie, fototropisme, nclzirea esuturilor, germinaie, cretere.
De asemenea, au rol n atragerea insectelor polenizatoare i a frugivorelor care contribuie la
diseminarea unor semine.
Heterozidele cianogenetice au rol de aprare contra ierbivorelor.
Clasificarea heterozidelor, ca i evidenerea lor, se bazeaz pe gruparea agluconic.
6.2.2.1 Evidenierea heterozidelor cianogenetice
La hidroliz, heterozidele cianogenetice elibereaz acid cianhidric (de unde i numele). Cel
mai rspndit este amigdalozidul, care se gsete n smburii prunoaselor, din care se extrage cu
eter. Prin hidroliz cu acizi diluai se formeaz dou molecule de D- glucoz, una de benzaldehid
i una de acid cianhidric.
Aceeai produi de hidroliz se obin i cu beta - glucozidaz (din complexul proteic
enzimatic numit emulsin, care nsoete ntotdeauna amigdalozidul din smburii de prunoase). La
o aciune blnd, beta glucozidaza scindeaz numai un rest de glucoz i formeaz heterozida
prunasina (identificat n coaja cireului slbatic).
Materiale necesare: smburi de prunoase, mojar, hrtie periodat, Na2 CO3 10%,
eprubete, dop de cauciuc, stativ pentru eprubete.
Modul de lucru: Se sparg ntr-un mojar smburi de prunoase. Se adaug cteva picturi
de ap peste seminele mrunite; se amestec bine, se modeleaz amestecul sub form rotund
i se introduce ntr-o eprubet.
Se introduce apoi n eprubet o hrtie de filtru periiodat (hrtia se mbib cu acid picric
1%, se usuc i se pstreaz ntr-un plic; la ntrebuinare se tamponeaz cu vat mbibat ntr-o
soluie de Na2 CO3 10 % i se introduce umed n eprubet).
Se acoper cu un dop i se las n repaus; emulsina vine n contact cu glucozidul i
anionul cian (CN- ) eliberat fiind volatil, ajunge la hrtie i modific culoarea acidului picric, din
galben n crmiziu.
6.2.2.2 Evidenierea heterozidelor flavonice i antocianice
Sunt heterozidele cele mai importante prin frecvena i abundena lor n plante. Numeroase
plante i datoresc culoarea frunzelor (varieti de Fagus sp. (fag), Coryllus sp. (alun) etc. cu
frunze rou-nchis), a fructelor (bacele de Ligustrum vulgare (lemn cinesc), a rdcinilor (Beta sp.
(sfecla roie) i mai ales a florilor, acestor heterozide, care sunt localizate n vacuolele celulelor
epidermice sau a parenchimurilor; de aceea heterozidele se mai numesc pigmeni flavonici i
pigmeni antocianici. Coloraiile lor nu trebuie confundate cu cele datorate pigmenilor
carotenoizi, insolubili n vacuole i localizai, cel mai adesea n cromoplaste.
A. Evidenierea pigmenilor flavonici din esuturi fr clorofil
Pigmenii flavonici au ca grupare agliconic un compus derivat din flavoni: oxiflavona,
oxiflavonol, etc. Se pot extrage cu ap, ap acidulat, acid tricloracetic, aceton, alcool etilic,
cristaliznd sub form de ace grupate n tufe.
Cu srurile de fier se coloreaz n verde, verde - oliv, verde - brun; cu alcalii n galben
intens, galben - lmie, galben - verde, galben portocaliu. Reduc acidul osmic i azotatul de
argint.Glucidul pe care-l conin este de obicei D - glucoza sau alt hexoz sau pentoz.Pigmenii
flavonici confer culoare galben esutului vegetal.
Materiale necesare: cutie Petri, sticl de ceas, NH4OH conc., HCl conc., flori cu petale
albe.
Modul de lucru: ntr-o cutie Petri se aeaz flori sau petale albe i o sticl de ceas cu
NH4OH conc.; apoi se acoper cu capacul: petalele devin galbene, ca urmare a formrii unor
44

sruri cu flavonozidele din sucurile celulare. Trecnd aceste petale ntr-o atmosfer cu acid ele se
decoloreaz.
B. Evidenierea pigmenilor flavonici din extracte
Materiale necesare: flori albe, petale galbene, rdcini i frunze de Taraxacum officinalis,
mere galbene, frunze verzi de Viola odorata, mojar, aceton, acid tricloracetic 8 %, eprubete, bec
de gaz, plnie, frtie de filtru, pipete, NaOH conc., HCl, FeCl3, FeSO4 1-5%, acetat de plumb 10%,
reactiv Fehling, stativ pentru eprubete.
Modul de lucru: din materialul vegetal se prepar un extract la cald (prin fierbere n ap,
sau acid tricloracetic, timp de 5 -10 minute). Extractul se filtreaz iar filtratul obinut este utilizat
pentru efectuarea unor reacii chimice de evideniere a pigmenilor flavonici.
a) peste 3 - 4 ml extract se adaug cteva picturi de NaOH conc.; apare o coloraie
galben, sau galben - portocalie; neutraliznd cu HCl soluia se decoloreaz.
b) peste 3 - 4 ml extract se adaug cteva picturi de FeCl3 sau FeSO4 1-5 % ; apare o
coloraie verde, verde - oliv, artnd caracterul fenolic al flavonilor;
c) peste 3 - 4 ml extract se adaug cteva picturi de acetat de plumb 10% ; se obine un
precipitat floconos galben sau galben - portocaliu. Aceast reacie este foarte
caracteristic pentru pigmenii flavonici;
d) prin fierbere cu acid clorhidric 5 % se elibereaz glucidul, nct reacia Fehling devine
pozitiv dup neutralizarea soluiei.
C. Evidenierea pigmenilor antocianici din extracte
Pigmenii antocianici sunt pigmeni albatri, roii, violei, abundeni mai ales n flori.
Agliconul este antocianidina, care are o structur foarte apropiat de flavonoli, din care
deriv prin reducere. Exist foarte numeroase antocianidine, cele mai rspndite fiind
pelargonidinele din Pelargonium sp., cianidinele din corolele de Centaurea cyanus i
delfinidinele din corolele de Delphinium sp. Antocianidinele variaz n privina culorii, funcie de
pH-ul sucului vacuolar: albastru la pH alcalin, rou la pH acid i violet la pH neutru.
Schimbarea culorii dup pH-ul mediului:
Materiale necesare: rdcin de Beta sp. (sfecl roie), Brassica sp. (varz roie), flori cu
petale roii, flori cu petale albastre, acid acetic diluat, NH4OH diluat, acetat de plumb 10%,
FeCl310%, eprubete, pipete, plci Petri, bec de gaz.
Modul de lucru:
1. ntr-o atmosfer cu vapori de HCl se introduc cteva petale roii i albastre; cele roii
rmn roii iar cele albastre devin roii;
2. ntr-o atmosfer cu vapori de amoniac petalele roii devin albastre, cele albastre devin
verzi i cu timpul se nglbenesc, datorit pigmenilor flavonici supranumerari;
3. se prepar un extract din sfecl roie i unul din varz roie, prin fierbere n ap: cel din
sfecl este rou, cel din varz este albastru - violet;
4. se iau n dou eprubete civa ml din extractele apoase; se adaug cteva picturi de
acetat de plumb 10 %; se obin precipitate colorate n albastru, verde, rou sau violet;
5. se iau ntr-o eprubet civa ml de extract apos; se adaug 1-2 picturi de FeCl310 %; se
obine o coloraie nchis ca i n cazul taninurilor, fapt ce arat o nrudire cu acestea prin
caracterul fenolic.
6.2.2.3 Evidenierea heterozidelor fenolice
Heterozidele fenolice au ca grupare agliconic un nucleu fenolic. Se ntlnesc n numr
mare n natur, cu excepia glicozidei fenolului simplu.
A. Evidenierea salicinei
Salicina se ntlnete n frunzele i coaja de salcie i este D - glucozida alcoolului salicilic
(saligenina).
Modul de lucru: O ramur de Salix alba (salcie) se taie transversal foarte oblic, iar suprafaa
de seciune, precum i suprafaa intern a suberului se pensuleaz cu H2SO4 70%, cu ajutorul unei
45

baghete. Peste 5-10 minute, suprafaa pensulat se coloreaz n rou - violet, culoare
caracteristic salicinei.
B. Evidenierea coniferinei
Descoperit la conifere i apoi la sparanghel, coniferina a fost identificat ulterior i la alte
specii. Este glicozida alcoolului coniferilic, fiind prezent n toate esuturile lignificate; prezena ei
indic indirect prezena ligninei.
Modul de lucru: Pe o achie de brad se adaug 1- 2 picturi de reactiv Hohnel (fenol +
KClO3) i 1 2 picturi de HCl conc.; apare o coloraie verde - albstruie
C. Evidenierea siringinei
Siringina se gsete n suberul ramurilor de liliac, n tulpina de iasomie, avnd ca grupare
agliconic alcoolul siringenina. Suprafaa intern a suberului de la o ramur de liliac se trateaz cu
1-2 picturi de H2SO4 70%; apare o coloraie verde.
6.2 3. Evidenierea taninurilor
Taninurile sunt substane fenolice de natur variat, cu foarte numeroi hidroxili, ceea ce
le confer proprieti reductoare remarcabile.
Nu conin azot n molecula lor. Sunt formate din glucoz i acid galic.
Cu srurile de fier dau precipitate nchise la culoare (negre, brune, albastru nchis), iar cu
proteinele dau combinaii complexe insolubile, imputrescibile i foarte rezistente.
Taninurile se ntlnesc n majoritatea plantelor (frunze, scoar, fruct) n cantiti variabile.
Se extrag din ritidoma de stejar.
n celule se gsesc n stare coloidal (n sucul vacuolar) sau sub form de granule (n
citoplasm); adesea reprezint agliconul unor heterozide sau se combin cu mucilagiile, gumele
sau celuloza. Uneori sunt localizate n celule speciale (idioblaste, tanifere), prezente n
parenchimuri, cum este cazul la Rosa canina (mce).
Materiale necesare: ritidom de stejar, nuc, castane slbatice, FeCl3 10%, acetat de plumb
10 %, K2Cr2O7 - soluie diluat, eprubete, pipete, stativ pentru eprubete.
Modul de lucru: Se prepar un extract apos (prin fierbere timp de 10 minute) folosind unul
din materialele biologice mai sus enumerate. Cu extractul obinut se efectueaz reacii de culoare
(vezi tabelul 5.1).
Tabelul nr.5.1 Reacii de evideniere a taninurilor
Nr.
eprubet
1.

Volumul de extract

Volumul de reactiv

Coloraia obinut

Civa ml (3-4 ml)

Cteva picturi FeCl3 10 %

Verde - brun,

2.
3.

Civa ml (3-4 ml)


Civa ml (3-4 ml)

Cteva picturi acetat de plumb 10 %


Cteva picturi K2Cr2O7 - soluie diluat

Precipitat alb
Precipitat brun

7. Respiraia plantelor
Respiraia este procesul fiziologic de degradare oxidativ a substanelor organice
sintetizate n fotosintez, n care se elibereaz energia necesar desfurrii proceselor vitale.
Respiraia se realizeaz n fiecare celul la nivelul hialoplasmei i a condriozomilor, iar la
exterior se manifest sub forma unui schimb de gaze: absorbie de oxigen molecular din aer i
eliminare de dioxid de carbon :

7.1. Metode calitative de studiu a respiraiei aerobe


Aceste metode se bazeaz pe evidenierea schimbului de gaze caracteristic respiraiei.
7.1.1.METODA MOLLIARD
Principiul metodei const n crearea unui deficit de presiune ntr-un recipient nchis, ca
urmare a schimbului de gaze implicate n procesul respirator, n care oxigenul este absorbit de
seminele n curs de germinaie iar dioxidul de carbon degajat este captat de un hidroxid.

46

Materiale necesare: tub din sticl alungit i lrgit la un capt ( tip osmometru Dutrochet),
stativ, vas cu mercur, capsul sau fiol de sticl, dop de cauciuc prevzut cu orificiu, tub de
cauciuc cu clem, semine germinate, soluie de KOH 30%.
Modul de lucru. Se introduc ntr-un osmometru Dutrochet semine germinate, se acoper
cu un dop strbtut de un tub de cauciuc prevzut cu o clem.
Se fixeaz osmometrul pe un stativ , astfel ca tubul lui s fie scufundat ntr-un vas cu
mercur. Dup fixare se deschide clema de la captul tubului de cauciuc, se atrn de crligul de
pe partea inferioar a dopului un vas mic n care se afl o soluie de KOH 30 %.
Se acoper osmometrul cu un dop, lsnd clema deschis pentru a uniformiza presiunea
din interior cu cea extern.
Se nchide apoi clema i dup un interval de timp, dependent de intensitatea respiraiei
materialului vegetal de analizat, se va constata c mercurul urc n tubul osmometrului.
Interpretare. Mercurul urc n tub deoarece dioxidul de carbon degajat de semine fiind fixat de ctre
hidroxid, nu mai compenseaz sub raportul presiunii oxigenul absorbit n respiraie, astfel c presiunea intern scade
comparativ cu exteriorul .

7. 2. Evidenierea enzimelor de respiraie


Enzimele de respiraie fac parte din clasa oxidoreductazelor i catalizeaz reaciile de
oxidare i reducere care au loc n celule.
Majoritatea oxidrilor biologice se realizeaz prin dehidrogenare, transportul hidrogenilor de
la substrat (care se oxideaz - AH2 ) la acceptor (care se reduce B) realizndu-se prin
intermediul dehidrogenazelor:
AH2 +

A + BH2

n funcie de natura acceptorului de hidrogen, dehidrogenazele pot fi:


- aerobe, care transport hidrogenul de la substratul care se oxideaz direct la oxigen;
- anaerobe, care transport hidrogenul la ali acceptori, dect oxigen.
7.2 1 Evidenierea dehidrogenazelor anaerobe (reductaze)
7.2.1.1 Dehidrogenazele anaerobe din drojdia de bere
Materiale necesare: eprubete, drojdie de bere, soluie de albastru de metilen 1 %, ulei.
Modul de lucru. Se introduce cte o granul de drojdie de bere, de mrimea unui bob de
mazre, n trei eprubete ce conin o soluie de albastru de metilen 1 %.
Se agit bine coninutul primei eprubete i se constat c albastrul de metilen este redus total
i trece, ntr-un interval de timp scurt, n leucoderivatul incolor.
Eprubeta a doua se aeaz n stativ, fr a fi agitat. Se va constata c soluia se decoloreaz
doar la baza eprubetei i rmne colorat n partea ei superioar, deoarece albastrul de metilen se
oxideaz neenzimatic, spontan, prin reacie cu oxigenul atmosferic.
Coninutul celei de a treia eprubete se izoleaz de aer, turnnd deasupra lui un strat de ulei.
Lsnd eprubeta n stativ, se va constata c albastrul de metilen se decoloreaz total, ns ntr-un
timp mai ndelungat.
7.2.2 Evidenierea oxidazelor directe
Aceste enzime sunt oxidoreductaze transportoare de electroni, care catalizeaz reacii
de tipul:
O2 + 4e 2O 2- +
2H2O
A. Evidenerea peroxidazei
Peroxidaza catalizeaz transferul atomilor de hidrogen de la diferii donatori (fenoli, amine,
aldehide, flavone, tirozin, citocrom c, acid uric, rezorcin, etc.) la apa oxigenat, dup ecuaia:

47

AH2 + H2O2

2H2O + O2

Principiul metodei. Evidenierea peroxidazelor se face cu ajutorul unor substane care,


prin oxidare, dau produi colorai.
1. Materiale necesare: tinctur de guaiac, ap oxigenat 3 %, rdcin de Armoracia
rusticana (hrean), bisturiu, plac Petri, pipete.
Modul de lucru. Se picur pe o rondel extras dintr-o rdcin de hrean, puin tinctur
de guaiac.
Se va constata c nu apare nici o coloraie. Dac se adaug apoi peste ea o pictur de
ap oxigenat 3 %, apare coloraia albastr a formei oxidate a acidului alfa - guaiaconic.
Se poate folosi i un extract preparat la rece din rdcin de hrean triturat, filtrat, peste
care se adaug cteva picturi de tinctur de guaiac i de ap oxigenat.
B. Evidenierea catalazei
Catalaza descompune apa oxigenat rezultat n celulele vii sub aciunea enzimelor
flavinice n ap i oxigen.
Rolul ei este foarte important, deoarece apa oxigenat este un oxidant puternic, duntor
structurilor vii, care trebuie transformat rapid n oxigen gazos mai puin reactiv i molecule de ap.
H2O2 + H2O2 = 2 H2O + O2
Modul de lucru: Pentru evideniere, se plaseaz pe o lam de microscopie dou frunze de
Elodea canadensis, (dintre care una fiart n prealabil). Deasupra se aeaz o pictur de ap
oxigenat 3 %. Se acoper cu lamela.
Se observ preparatul la microscop, cu un obiectiv mic; se constat o degajare energic de
gaz din frunza vie. Acest gaz este oxigenul ce se degaj din apa oxigenat ptruns n frunz i
care a fost descompus de enzim.
C. Evidenierea catecoloxidazei
Cunoscut mai ales sub numele de tirozinaz, catecoloxidaza este o monofenoloxidaz
ce conine cupru i catalizeaz oxidarea aerob a o - difenolilor, trifenolior, a substanelor tanante
i n special a tirozinazei.
Sub aciunea catecoloxidazei are loc convertirea tirozinei n dihidroxifenilalanin (DOPA),
care, la rndul ei, este oxidat cu formare de dopachinon. n continuare reaciile decurg spontan,
n absena enzimelor, ajungndu-se la melanine (pigmeni bruni):
n celulele vegetale catecoloxidaza are i rolul de a oxida, cu ajutorul oxigenului, hidrogenii
scoi de dehidrogenaze din diferite substane i care au fost transferai chinonelor, care trec astfel
n polifenoli. Acetia sunt oxidai de ctre catecoloxidaz i n acest mod se formeaz n plante un
lan respirator secundar, fr citocromi:
Modul de lucru: Se secioneaz un tubercul de cartof sau un mr i se las la aer.
Se constat c dup un timp, suprafaa de seciune se brunific. Dac se adaug pe
suprafaa de seciune puin soluie de tirozin, coloraia apare mai repede i mai intens, deoarece
se formeaz melanine n urma activitii catecoloxidazei.
TEM DE VERIFICARE A CUNOTINELOR
1.Indicai grupele de substane considerate produi secundari de metabolism i precizai rolurile lor biologice.
2.Dai exemple de specii vegetale a cror organe esuturi conin astfel de substane.
3. Selectai rspunsurile corecte:
a. Alcaloizii sunt substane organice cu proprieti bazice foarte pronunate
b. Heterozidele sunt formate dintr-o component glucidic i una neglucidic
c. Heterozidele flavonice i antocianice sunt localizate n vacuole
d. Taninurile sunt substane de natur fenolic conin azot n molecul
e. Taninurile formeaz cu proteinele complexe insolubile, imputrescibile
4. Definii procesul de respiraie.
5. Precizai rolul enzimelor de respiraie.
6. Dai dou exemple de enzime de respiraie studiate n cadrul lucrrilor de laborator.

48