Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Cromatografie - 2009
Cromatografie - 2009
CROMATOGRAFIA
Analiza cromatografica include mai multe metode de separare si totodat de
analiza a componentilor amestecului din proba. Separarea precede analiza si se
realizeaza prin repetarea, de un numar mare de ori, a echilibrului de distributie ntre
doua faze. Una dintre faze este imobila i poarta denumirea de faza stationara (aflata de
regula ntr-un tub numit coloana) iar cealalta faza mobila, denumit i eluent, se
deplaseaza prin golurile primei faze.
Separarea pe cale cromatografic a speciilor chimice dintr-un amestec se petrece
ntr-o coloana cromatografica, piesa cheie a ntregii metode. Faza mobila, - ce se
scurge continuu, cu viteza constanta, prin interstitiile fazei stationare, adeseori
poroase, provoac migrarea, cu viteze diferite, a celor n componente ale amestecului
de-a lungul coloanei. Amestecul supus separarii se introduce sub forma de solutie la
nceputul coloanei, folosindu-se un dispozitiv de introducere a probei (de exemplu o
microseringa la gazcromatografie i pomp de nalt presiune la comatografia de lichide
de tip HPLC), si se afla initial fixat ntr-o zona ngusta de la nceputul coloanei. Antrenai
de eluent, o parte din componentii probei migreaza apoi prin coloana cu viteze diferite.
Acest lucru se datoreaza interactiunilor fizice specifice, dintre moleculele probei si faza
stationara (nu orice molecula poate migra pe orice faza stationara). Efectul, este numit
retenie si aceasta provoaca o asa-numita migrare diferentiata. Adica moleculele
migreaza n grupuri, n fiecare grup existnd doar molecule de acelasi fel. Aceasta face
posibila sesizarea pe rnd a componentilor, la prsirea coloanei cromatografice de
catre un detector care este un analizor fizico-chimic, sensibil la mai multi (n mod ideal
la oricare) dintre speciile moleculare ce traverseaz coloana ceomatografic.
Detectorul d un semnal proportional cu masa sau cu concentratia solutiei de
component n faza mobila. Intr-o exprimare plastic se poate spune c detectorul
"marcheaza" trecerea fiecareia din substantele ce compun initial amestecul analizat n
mod similar cu un sistem Video care nregistreaza trecerea liniei de sosire de ctre
concurenti n atletism.
Gauss. In cazul introducerii unui singur component intr-un eluent inert se obine cea
mai simpl cromatogram posibil de tipul celei din figura II.1. Pe axa absciselor fiind
reprezentat timpul (sau volumul) de eluent scurs, cu debit cunoscut, de la introducerea
(injectarea) probei, iar pe cea a ordonatelor, semnalul detectorului exprimat n unitati
arbitrare.
In cazul unei cromatograme distingem urmatoarele elemente de baz:
1.
Peak- urile cromatografice. n cazul prezentat n fig. 1, cele doua semnale
sau vrfuri sunt denumite peak-uri care sint valorificate n
toate metodele
cromatografice n scopul analizei calitative si cantitative a speciilor prezente in
amestecul analizat. In acest sens inlimea peak-ului sau suprafaa lui reprezint o
msur a concentraiei speciei chimice i timpul de sosire la detector ( denumit timp de
retenie) reprezint o caracteristic a naturii speciei. In sens pur grafic o cromatogram
este asemntoare
cu o spectrogram. Diferenele intervin la faptul c la o
spectrogram identificarea speciilor dintr-un amestec se face prin lungimea de und
care este o constant fizic, iar la o cromatogram identificarea speciilor se face prin
timpul de retenie care este
o mrime caracteristic numai in conditii date de
temperatur, presiune, uzura coloanei etc. La analiza amestecurilor complexe
cromatografia este superioar spectrometriei. La analiza spectrometric a unor
amestecuri complexe, cu lungimi de und specifice apropiate pentru unele specii
chimice,
se poate ajunge la identificri greite. Asemenea erori snt excluse la
cromatografie deoarece componentele amestecurilor analizate trec la timpi diferii prin
dreptul detectoarelor specifice fiind astfel exclus att confuzia acestora ct i
posibilitatea ca acestia s prseasc coloana neidentificai .
Primul peak din cromatogram, de nlime mai redus, corespunde unui
component inert ( gazul purttor n cromatografia de gaze sau diluantul lichid in
cromatografia de lichide ) - care este retinut n foarte mic msur de coloana
cromatografic. Cel de-al doilea peak , notat cu C, corespunde speciei (unice n cazul
de fata) analizate. Sosirea intirziat a grupului de molecule a acestei specii fa de
eluent se datoreaz staionarii mai ndelungate n coloana cromatografic ca urmare
afinitii mai mari a acestei specii fa de materialul coloanei. Gradul de afinitate este
exprimat prin numrul absorbiilor i desorbiilor repetate de pe umplutura sau pere ii
coloanei i este o caracteritric a naturii speciilor analizate. Cu ct numrul absorbiilor
i desorbiilor este mai mare pe traseul parcurgrerii coloanei de ctre o specie chimic
cu att mai trziu va sosi aceasta la detector la. In cazul unor amestecuri complexe
timpii de sosire se vor distribui pe un anumit interval
Timpul mort, tM - este timpul n care un component, complet neretinut de catre
faza stationara, parcurge coloana si tuburile de legatura pna la detector. Acesta nu
poate fi zero. n cazul gazcromatografiei (GC) timpul mort, de exmplu, este egal cu
timpul de retentie al aerului: tM = tR (R = Retentie). Deci, cu alte cuvinte, reprezinta timpul
scurs de la injectarea (introducerea) probei n coloana si aparitia maximului de
concentratie n detector, pentru componentul neretinut.
Timpul de retentie, tR - o marime caracteristica pentru fiecare component al
amestecului separat de coloana - reprezinta timpul scurs de la injectarea probei si
aparitia maximului de concentratie n detector. De exemplu, n cazul prezentat anterior n
fig. 1, acesta este distanta de la axa ordonatelor (nceputul cromatogramei) pna la
verticala prin vrful picului C. Acest timp, pentru un component si o coloana (plus conditii
experimentale) date este constant, indiferent daca componentul respectiv este singur
sau n amestec.
t r t0
t0
k 2 t r2 t 0
k1 t r1 t 0
(talere) lipite unul de altul , pe fiecare din aceste talere realizndu-se echilibrul ntre faza
mobil i cea staionar . n acest concept se ia in considerare situaia n care un taler
realizeaz singur separarea cromatografic a componentelor, este evident c pentru
aceasta viteza fazei mobile ar trebui s fie infinit de mic iar timpul de efectuare a unei
cromatograme extrem de mare. ntr-o coloan cromatografic cu umplutur pentru
lichide un taler este asimilat cu o particulele de umplere a coloanei, astfel colanele
comerciale conin cca 50.000 talere pe metru dac este vorba de particule cu diametrul
de 5 m sau cca 25.000 talere pe metru liniar dac este vorba de particule de umplere
cu diametrul de 10 m. In general eficiena unei coloane cromatografice de separare
crete atunci cnd dimensiunea particulelor de umplere scade. Numrul teoretic de talere
necesar ntr-o coloan cromatografic de lungime L este dat de relaia:
L
H
unde: L - lungimea coloanei msurat de la sistemul de injecie pn la detector
H- nlimea teoretic a talerului
N
L
N
Una din problemele de baz ale cromatografiei n general este aceea a lirii benzii
Peak-urilor ca urmare a cltoriei speciilor chimice prin coloana cromatografic. In
condiii ideale o specie chimic ar trebui s se deplaseze prin coloan fr ca banda
ei s se leasc la baz. n realitate ns are loc o lire destul de pronunat la
traversarea coloanei cauzat de
difuzie molecular longitudinal,
de curgeri
neuniforme prin coloan, de variaii necontrolate ale sorbiei i resorbiei. Eficiena unei
coloane cromatografice este cu att mai ridicat cu ct lirile W1 i W2 n condiii date
ale timpilor de retenie tr1 i tr2 snt mai mici, numrul de talere teoretice N fiind dat de
relaia:
t
N 16 r
W
Din relaia de mai sus rezult c numrul de talere respectiv eficiena unei coloane
poate fi calculat din dou msurtori de timpi: tr i W.
O alt metod pentru determinarea eficienei, considerat de muli cercettori
ca fiind de ncredere mai mare [Skoog] o reprezint determinare llimii peak-ului la
jumtatea nlimii lui, figura , numrul de talere teoretice rezultate fiind :
tr
N 5,54
W1/2
Fig. Definirea limii unui Peak la jumtatea nlimii lui ( VARIAN p1-18)
Rs
t r2 t r1
0,5 (w1 w 2 )
unde : w1, w2 reprezint limea bazei picurilor celor dou componente. Exprimarea
pentru t i w poate fi n uniti de timp, de volum, sau de lungime. Atta timp ct pentru
cele dou mrimi se folosesc aceleai uniti se consider c dou peak-uri snt
complet separate la baz dac Rs = 1,5. In figura 2 snt prezentate dou Peak-uri
neseparate complet.
Dac cele dou peak- uri snt apropiate i au ariile egale , figura 3, ecuaia () devine
Rs
t r2 t r1
4
t r t0
t0
k 2 t r2 t 0
k1 t r1 t 0
L
H
L
N
Una din problemele de baz ale cromatografiei n general este aceea a lirii benzii
Peak-urilor ca urmare a cltoriei speciilor chimice prin coloana cromatografic. In
condiii ideale o specie chimic ar trebui s se deplaseze prin coloan fr ca banda
ei s se leasc la baz. n realitate ns are loc o lire destul de pronunat la
traversarea coloanei cauzat de
difuzie molecular longitudinal,
de curgeri
neuniforme prin coloan, de variaii necontrolate ale sorbiei i resorbiei. Eficiena unei
coloane cromatografice este cu att mai ridicat cu ct lirile W1 i W2 n condiii date
ale timpilor de retenie tr1 i tr2 snt mai mici, numrul de talere teoretice N fiind dat de
relaia:
tr
N 16
Din relaia de mai sus rezult c numrul de talere respectiv eficiena unei coloane
poate fi calculat din dou msurtori de timpi: tr i W.
Factori ce influeneaz lirea de band
n cltoria ei prin coloan lirea de band a unei probe este influenat de patru
factori:
1. difuzia radial
2. difuzia longitudinal
3. efectele transportului de mas
4. efectele exterioare
Difuzia radial se bazeaz pe faptul c o prob datorit drumului de curgere
distribuit radial parcurge ntr-o coloan lungimi diferite fcnd ca ea s soseasc pe
un interval mai mare de timp (band lit). Diferenele de lungime iau natere ca
urmare
a diferitelor forme i dimensiuni ale umpluturii coloanei precum i datorit
golurilor neuniforme din umplutur, reprezentarea schematic este dat n figura
Fig. Efectul curgerii cu vitez diferit i a difuziei asupra lirii de band . i- la curgere a
unui lichid printr-o conduct viteza liniar se schimb de-a lungul seciunii n sensul c
moleculele din centru se deplasez mai rapid dect cele din imediata vecintater a peretelui, iii difuzia multidirecional a probelor lichide duce la lirea de band
coeficientului de difuzie mai mic cu ordine de mrime de cca 10 3-104 la lichide dect la
gaze difuzia longitudinal este minor n cazul cromatografiei de lichide n schimb la
cromatografia de gaze ea joac un rol hotrtor. Influena efectului difuziei longitudinale
asupra lirii de band este reprezentat n figura
Efectele transportului de mas se manifest asupra lirii de band datorit faptului
c cinetica de absorbie- desorbie a moleculelor probei ntre faza staionar i cea
mobil este mai lent dect viteza moleculelor n faza mobil. Atunci cnd o molecul
a fazei mobile intr n interaciune cu faza staionar petrece pe i n aceasta un un
anumit timp pn cnd intr din nou n fluxul de curgere i este transportat mai departe
de faza mobil. In tot acest timp molecula pierde timp fa de moleculele care nu au
interacionat cu faza staionar. Un rol important la retenia moleculelor o joac i
structura poroas (atunci cnd este cazul) a fazei staionare. Fenomenele de transport
de mas devin cu att mai pronunate cu ct viteza de curgere liniar este mai mare, ca
atare lirea de band datorit efectului de transport de mas poate fi redus prin
scderea vitezei de curgere a fazei mobile . De asemenea ea poate fi redus prin
folosirea , (la coloanele cu umplutur) a unor particule cu diametru ct mai mic i
neporoase pentru umplutur, precum i folosirea de solveni de vscozitate mic (la
cromatografia de lichide) .
Fig.
Efectul curgerii cu vitez diferit i a difuziei asupra lirii de band
10
tr
N 5,54
W1/2
11
Fig. Definirea limii unui Peak la jumtatea nlimii lui ( VARIAN p1-18)
Rs
t r2 t r1
0,5 (w1 w 2 )
unde : w1, w2 reprezint limea bazei picurilor celor dou componente. Exprimarea
pentru t i w poate fi n uniti de timp, de volum, sau de lungime. Atta timp ct pentru
cele dou mrimi se folosesc aceleai uniti se consider c dou peak-uri snt
complet separate la baz dac Rs = 1,5. In figura 2 snt prezentate dou Peak-uri
neseparate complet.
12
Dac cele dou peak- uri snt apropiate i au ariile egale , figura 3, ecuaia () devine
Rs
t r2 t r1
4
13
14
Fig.
Efectele exterioare ale lirii de band se manifest n exteriorul coloanei i snt
cauzate de volume moarte n injector , n detector, precum i n conductele de transport.
Suma efectelor enunate mai sus se numesc Efecte extracolumnare un experiment [1]
simplu poate demonstra efectul diferitelor volume moarte intercalate n circuitul de lichid
iar n figura este exemplificat acest lucru pentru trei situa\ii concrete :
15
16
Analiza calitativ
17
Analiza cantitativ
Metoda normrii suprafeei (nlimii)
La analiza cantitativ se are n vedere faptul c suprafaa respectiv inlimea
unui peak este proportional cu concentraia componentului reprezentat de acel peak.
Pentru a exprima concentraia procentual a unui component trebuie avut n vedere
nlimea total sau suprafaa total a tuturor componentelor din amestec care este
considerat ca avnd o compoziie de 100% . Concentraia fiecrui component din
amestec se determin pe urm prin regula de trei simple. La acest mod de abordare a
analizei cantitative se accept urmtoarele:
1. se presupune c pe cromatogram snt evideniate toate componentele i c
fiecare component apare sub forma unui peak individual bine definit. Aceast
presupunere nu ine cont de faptul c dou sau mai multe componente pot parsi
n acelai timp coloana fiind identificate ca o singur specie, sau unele specii
pot fi reinute total pe coloan i iar altele eventual nici nu snt detectate
2. se presupune c sensibilitatea detectorului este aceeai pentru toate
componentele amestecului ceea ce n cele mai multe cazuri nu se adeverete
bazat pe aceste presupuneri i efectele generate de ele se procedeaz la calibrarea
sensibilitii detectorului prin diferite metode care vor fi descrise n continuare.
Metoda standardului extern
La folosirea acestei metode se prepar un standard extern care conine specia
(speciile) urmrit , dac se bnuiete ordinul de mrime al concentraiei componentei
18
Ai
h
Ai
S
calibrarea
multipl
cu
concentraii
cresctoare a componentului urmrit
urmrit oarecare
19
cS
cs Ss
c's
A's
20
21
22
23
24
25
26
vr
v ma
v mp
27
trebuie depit ns temperatura care duce la valorii mai mari de 1 a vitezei relative
de migrare vr
La detectoarele
sensibile la variaie de concentraie semnalul electric al
detectorului este proporional cu concentraia momentan a substanei (i) din volumul
din imediata vecintate a detectorului. La un detector sensibil la variaie de debit masic
semnalul electric al detectorului este proporional cu debitul masic (Mi), adic cu masa
de substan ce trece n unitatea de timp prin dreptul detectorului. Detectoare sensibile
la variaia de concentraie snt influenate de debitul de gaz purttor motiv pentru care
debitul de gaz purttor trebuie reglat automat n vederea meninerii constante a valorii
lui. Influena debitului de gaz purttor nu se manifest la detectoarele sensibile la
variaie de debit masic.
Sensibilitatea S a detectorului reprezint nivelul de conversie a mrimii
fizice neelectrice ntr-o mrime electric proporional. La detectoarele sensibile la
28
29
30
Fig.II.8. Domeniul liniar (a) i domeniul dinamic (b) al unui detector folosit n cromatografie
de detectabilitate Ld. n partea de sus prin o abatere tolerat de 5% de la dreapta ideal
de liniaritate. Pentru exemplificare grafic a domeniului liniar se reprezint n
coordonate dublu logaritmice suprafaa peak-ului Ai sau a semnalului detectorului
Ei n funcie de cantitatea m i a probei, concentraia Ci , respectiv fa de debitul
masic Qmii, figura II.8.a, Intr-un alt tip de reprezentare folosit se reprezint
sensibilitatea Si n funcie de cantitatea de prob folosit mi, n funcie de
concentraia Ci sau n funcie de debitul masic Qmii, figura II.8.b. Valoric domeniul
liniar se exprim prin raportul dintre limita superioar a domeniului liniar i limita de
detectabilitate, este obligatorie i indicarea naturii substanei analizate i. Domeniul
dinamic al detectorului este plasat n continuarea domeniului liniar i reprezint
domeniul n care o modificare a concentraiei sau a debitului masic mai provoac
o modificare sensibil i posibil de calibrat a semnalului detectorului, figura II.8.a,b.
31
N2, NO2 , CO, CO2 , H2O , CS2 , NH3 , 02 , CCl4 sau alte legturi de halogen ,
halogenuri de siliciu
32
Fig.II.10. Sistem combinat cromatospectrometric. 1-gazcromatograf, 2- detector de ionizare, 3sistem de adaptare pentru sonda optic, 4-flacr de hidrogen, 5-lentil colimatoare din
sticl de cuar, 6- fibr optic de transmisie, 7-spectrometru cu reea de difracie i
detector Diode- Array, 8- sistem de procesare afiare i tiprire spectre
33
a)
b)
Fig. II.11. Schema de principiu a detectorului pentru: a- fosfor (P), b- azot i fosfor (N-P). 1arztor, 2- flacr de hidrogen, 3,4 electrozi colectori de electroni, 5-perl alcalin, 6plasm, 7- amplificator electronic, 8-sistem electronic de prelucrare i afiare
34
Fig.II.12.
Detectorul de conductivitate termic , figura II.12, este format dintr-un bloc metalic
compact bine termostatat n care se gsesc patru celule de gaz identice prevzute
cu filamente de platin sau de wolfram , sub form de srm, legate electric ntr-o
punte de tip Wheatstone. n detector se realizeaz o msurare comparativ de
compensaie. n acest scop prin dou celule, situate pe dou laturi opuse ale
braelor punii, trece gazul purttor pur, iar prin celelalte dou brae ale punii trece
gazul purttor n amestec cu gazele pentru analizat. Toate filamentele snt
parcurse de un curent electric care provoac nclzirea acestora prin efect JouleLenz. Temperatura srmelor i prin aceasta i rezistena lor electric depinde de
conductivitatea termic a gazelor ce trec prin celule. Modificri ale compoziiei
gazelor
provoac prin conductivitile lor termice specifice modificri
corespunztoare de temperatur i prin aceast modificri ale rezistenei electrice
a filamentelor de srm. Diferenele de temperatur a filamentelor n celulele de
msurare i n celulele de referin duc la un dezechilibru electric msurabil al punii
Wheatstone. Timpul la care se produce acest dezechilibru este proporional cu
natura substanei care traverseaz la acel moment dou brae opuse ale punii , iar
valoarea dezechilibrului este proporional cu concentraia acelei substane din
amestecul de gaze analizat. Detectorul de conductivitate termic este un detector
universal, utilizabil la aproape toate substanele, singurele ngrdiri snt la
substane puternic corozive care distrug filamentele, dar are o sensibilitate destul
de sczut.
35
baz snt n analiza urmelor i n chimia mediului. Detectorul este format dintr-o camer
de ionizare ce conine un catod i un anod i un flux continuu de gaz. Pentru ionizare
snt folosite radiaii () emise de o surs radioactiv sub forma unei folii foarte subiri al
izotopului Ni63,
sursa de radiaii constituie totodat i catodul, figura II.13.
Descompunerea radiaiei () duce la emisia de electroni primari care se ciocnesc cu
moleculele (N2) ale gazului purttor i ca urmare iau natere ioni N2 ncrcai pozitiv i
electroni secundari liberi. Prin aplicarea unei tensiuni ntre cei doi electrozi apare un
cmp electric prin care electronii secundari liberi se deplaseaz spre anod unde produc
un curent electric de civa nanoamperi numit curent de ionizare de baz. Dac n
amestecul de gaze este un gaz cu afinitate mare fa de electroni atunci aceast
substan colecteaz o mare parte din electronii liberi ceea ce duce la micorarea
curentului de ionizare de baz. Aceast micorare afecteaz proporional curentul de
baz i reprezint semnalul util al detectorului. Detectorul cu capcan de electroni
reacioneaz la substane cu afinitate de electroni cum snt de exemplu substane
halogenate precum i anumite pesticide. Sistemul clasic cu msurarea curentului de
ionizare de baz, descris mai sus, are dezavantajul unui domeniu liniar redus, motiv
pentru care n aparate moderne se folosete alt sistem de lucru. Astfel se aplic un
impuls de tensiune cu frecven variabil . n momentul n care exist semnalul de
tensiune (0,5 pn la 1s), electronii care nu au reacionat cu substanele amestecului
de gaze din gazul purttor snt colectai de anod. Timpii de pulsare a semnalului electric
se aleg aa de scuri pentru ca ionii grei, rezultai ca urmare a absorbiei de electroni,
s nu poat ajunge la anod. Frecvena semnalelor electrice aplicate nu este constant ci
modificat continuu n sensul asigurrii unei intensiti de curent constante. Dac n
detector intr prin amestecul de gaze un numr mare de molecule electrofile pentru
compensarea scderii sub limit a curentului (ca urmare a scderii numrului de
electroni) se mrete frecvena curentului. La acest mod de lucru semnalul util al
detectorului nu-l mai reprezint micorarea curentului de ionizare de baz ci modificarea
frecvenei tensiunii aplicate n scopul meninerii constante a intensitii curentului ,
frecvena semnalului fiind proporional cu concentraia moleculelor captoare de
electroni. Prin timpul de pauz ntre semnale se asigur n limite largi un numr de
electroni liberi constant , ceea ce nsemn c i la concentraii mari ale substanei de
analizat snt suficieni electroni la dispoziie pentru ionizare. Numrul de electoni se
adapteaz concentraiei substanei de analizat prin acesta extinzndu-se sensibil i
domeniul liniar.
36
Sensibilitatea relativ
Hidrocarburi
eteri, esteri
10
100
104
105
106
Valorile din tabel 1 snt valori aproximative dar corecte din punct de vedere al ierarhizrii.
Sensibilitatea variaz destul de mult chiar n cadrul aceleiai grupri chimice deoarece
ea depinde de structura legturilor .
37
termic
dat de microunde, 2- plasm termic, 3-oglind plan de reflexie, 4retea de difracie, 5-detector Diode-Array, 6-amplificator electronic, 7- sistem
electronic de achiziie , prelucrare i afiare
II.2.1.5.7. Detectorul cu fotoionizare
Folosirea detectorului cu fotoionizare, figura II.15, n cromatografia de gaze se
datoreaz att selectivitii ct i sensibilitii sale ridicate la detectarea hidrocarburilor
38
CROMATOGRAFIA DE LICHIDE
n cadrul cromatografiei in lichide (LC) se disting mai multe variante, n functie de
mecanismele de separare, astfel exist :
- cromatografia de lichide pe coloana inchisa;
- cromatografia de lichide pe coloana deschisa;
In cadrul cromatografiei de lichide pe coloana inchis snt cunoscute metodele:
1. Cromatografia de adsorbtie utilizata pentru separarea substantelor organice cu
molecule de dimensiuni mici si medii pe adsorbanti, ca silicagel si alumina, folosinduse, ca faze mobile, diferite amestecuri de solventi organici.
2. Cromatografia ionica (de schimb ionic), care se petrece pe o faza stationara solida,
poroasa, formata din materiale specifice - schimbatorii de ioni - substante cu o retea
solida afnata, de natura organica sau anorganica. Cele mai raspndite sunt rasinile
schimbatoare de ioni.
3. Cromatografia de excluziune sterica se desfasoara pe faze stationare poroase dar
cu porozitatea selectionata astfel nct sa corespunda dimensiunilor moleculelor
supuse separarii. O parte dintre molecule intra prin pori, iar altele sunt excluse
deplasndu-se practic neretinute odata cu faza mobila. Tehnica se mai ntlneste si
sub denumirea de filtrare prin geluri sau permeatie prin geluri n functie de natura
apoasa sau organica a fazei mobile.
4. Cromatografia lichid-lichid (LLC), n care faza stationara este o faza lichida,
nemiscibila cu cea mobila si imobilizata pe un suport solid, ntr-o coloana. Aici
suportul solid este inert fata de componentele din proba. Acesta tehnica este cea
mai raspndita devenind aproape sinonima cu cromatografia de lichide.
In cadrul cromatografiei de lichide pe coloana deschisa faza mobila circula printr-un
material poros dispus ntr-un plan si formnd un strat relativ subtire, dar de compozitie
asemanatoare cu cele mentionate la cromatografia pe coloana nchis. Se disting
metodele :
1. Cromatogafia pe hrtie, tehnica n care faza stationara este o hrtie poroasa din
celuloza (initial o hrtie de filtru) care este irigata de solvent prin forte capilare.
2. Cromatografia pe strat subtire (TLC), n care faza stationara pulverulenta
este fixat de suportul plan (sticla, aluminiu, material plastic) cu un liant,
formnd un strat subtire (0.1- 0.5mm) de asemenea irigata prin capilaritate.
3. Cromatografia pe strat subtire de nalta performanta (HPTLC), n care faza
stationara are granulatie extrem de fina ridicndu-se astfel eficienta
separarilor dar si viteza acestora.
Cromatografia HPLC
Cromatografia de lichide de nalt performan ( engl. HPLC - High Performance
Liquid Chromatography ) cunoscut n literatur i sub denumirea de cromatografie de
39
40
mrime i form , la acest tip de cromatografie moleculele mari traverseaz cel mai
rapid sistemul cromatografic.
Cromatografia cu lichide supracritice
Dac n timpul separarii cromatografice compoziia substanei de analizat rmne
constant tehnica de cromatografic este denumit eluie izocratic. Dac compoziia
fazei analizate este schimbat n timpul procesului de separare dup o modalitate
prestabilit, tehnica poart denumirea de eluie de gradient .Cea din urm tehnic este
folosit atunci cnd domeniul timpilor de retenie a moleculelor din prob este att de
mare nct acetes nu pot fi eluate ntr-un timp rezonabil cu un solvent pur sau cu un
amestec de solveni.
Detectorii folosii n HPLC lnt detectori selectivi, ceea ce nseamn c ei nu
rspund la toate moleculele existente nt-un amestec ci numai la anumite molecule sau
clase de compui. In cromatografia de lichide nc nu exist un detector universal i de
inalt sensibilitate aa cum este de exemplu detectorul de ionizare cu flacr FID din
cadrul cromatografiei de lichide, n schimb detectoarele din cromatografia de lichide
acoper un numr mult mai mare de substane dect cele din cromatografia de gaze.
Unele molecule de probe snt greu de detectat n HPLC i trebuiesc aduse dup
prsirea coloanei cromatografice ntr-o form detectabil
tehnic denumit
derivatizare dup coloan. Ca i la alte cromatografii n condiii tehnice date pentru
analiza calitativ este definitoriu timpul necesar unei molecule din prob pentru a
traversa sistemul cromatografic i a ajunge la detector, timp denumit timp de retenie.
Dat fiind numrul extrem de mare de substane organice unele substane au timpi de
retenie identici situaie n care peak-urile se suprapun putnd da natere la erori
importante de interpretare. Pentru nlturarea acestui neajuns cele mai importante
detectoare pentru HPLC snt spectrometrele. Tot mai des ieirile din coloanele
cromatografice se cupleaz la
spectrometre clasice cel mai des folosit fiind
spectrometrul de mas (MS) situaia clasic fiind cea LC-MS sau LC-MS-MS. Aceste
combinaii de aparate au sisteme de performante de prelucrarea datelor ce permit
identificarea automat prin compararea electronic a spectrului oricrei specii
moleculare, n momentul sosirii ei din coloana cromatografic la spectrometru, cu
spectrele etalon din bibliotec electronic de spectre.
41
Fig. 1 Schema de principiu a unui cromatograf de lichide. 1- butelie, 2-ventil nalt presiune, 3manometru nalt presiune, 4-reductor de presiune, 5- manometru de joas presiune, 6- sistem
distribuitor i dozare heliu, 7,8- recipiente cu solvent, 9- filtru, 10-pomp cu sistem de gradient,
11-sistem de msurare a presiunii i a debitului, 12-sistem de introducere prob, 13- xxxx, 14coloan cromatografic,
7- incint de termostatare a coloanei, 8-detector, 9-sistem de achiziie i prelucrare
date, 10-cromatogram.
Trebuie avut n vedere c n HPLC se folosesc solveni organici puternici sau soluii
tampon care pot ataca chimic orice component ce se gsete n traseul lor de la
recipientele de stocare pin la detector , ca atare toate materialele folosite pe acest
traseu trebuie s prezinte o rezisten chimic corespunztoare. O alt recomandare
este aceea ca volumul mort , denumit i volum extracolumnar, ntre introducerea probei
i traversarea detectorului s fie meninut ct mai mic posibil prin aceasta evitndu-se o
lire de band (vezi i cap). Reducerea volumului mort se realizeaz n primul rnd prin
msuri constructive ale furnizorului de cromatograf i prin de alegerea corespunztoare
a coloanei cromatografice. In continuare vor fi descrise pe rnd elementele componente
ale unui cromatograf de tip HPLC
Cromatografia de lichide de nalta performanta (HPLC) acopera azi, n proportie
aproximativ 80%, analiza substantelor moleculare: organice, organo-metalice si
anorganice inclusiv compusii foarte polari sau labili termic precum si compusii cu masa
moleculara ridicata (naturali sau sintetici). De aceea, mpreuna cu cromatografia de
42
43
44
45
10
2
6
7
Fig. II.19. Principiul de funcionare al detectorului de UV. 1- raze UV, 2- substana ce vine de la
coloana cromatografica,3- substana ce pleac, 4- geam de cuar, 5- tub capilar prin
care circula substana de analizat, 6- detector (fotomultiplicator), 7- amplificator,8sistem de achiziie, prelucrare si afiare a datelor, 9- cromatograma,10- cuva
detectorului
M
5
6
C
2
I
10
Fig.II.20. Principiul de functionare al unui detector refractometric. 1- radiatia luminoasa, 2amestec de substante, 3- solvent pur,4- perete sticla, 5- detector refractometric, 6,6 *fotoelement, 7- amplificator, 8- surub reglator, 9- sistem nregistrator, 10cromatograma, C- cuva refractometrica, M- sistem ce regleaza detectorul in funcie de
unghiul sub care cad razele
46
Radiatia luminoasa (1) trece prin solventul pur, apoi prin peretele de sticla ce
separa cele 2 incinte, prin amestecul de substante. Ajunge sub un anumit unghi pe
detector, o parte se reflecta pe fotoelementul 6 iar o parte se refracta pe fotoelementul
6. Semnalul este amplificat. Daca cele doua tensiuni primite de la cei 2 detectori sunt
diferite, motorul primete un semnal de corecie, in scopul egalizrii tensiunilor, astfel are
loc compensarea modificrii indicilor de refracie. In urma deplasarii urubului 8 ,
sistemul nregistrator 9 va nregistra datele sub forma unei cromatograme.Diferenta
dintre indicii de refractie pentru solutiile aflate n cele doua compartimente vor fi practic
nule, atta timp ct din coloana iese doar eluentul pur, dar diferita n momentul n care n
eluent mai apare un component separat - antrenat de catre eluent din coloana. n
momentul iesirii unui component are loc o deplasare a pozitiei fascicolului emergent din
detector - deplasare care este proportionala cu concentratia si sesizata de catre
detector.
n cazul acestui tip de detector sunt posibile si picuri negative, ceea ce face
necesara aducerea liniei de baza la jumatatea scalei lucru care, pe lnga sensibilitatea
relativ coborta (10-5molL-1), constituie un dezavantaj. Acest detector este universal,
dar nu poate fi utilizat n cromatografia cu gradienti deoarece, n acest caz, compozitia
eluentului la intrarea n coloana difera de cea de la iesire si se modifica continuu,
neexistnd o linie de baza. De asemenea fenomenul este foarte sensibil la temperatura
(0.0001C) fiind necesara termostatarea, att a detectorului ct si a coloanei.
47
forma unui pic in cromatograma (8). Astfel se realizeaza analiza cantitativa probei. A
doua substanta va modifica conductivitatea electrolilor dupa un anumit timp cea ce duce
la masurarea timpului de retentie (analiza calitativa) si la aparitia unui nou pic in
cromaograma.
Este necesar un generator de inalta frecventa pentru a nu se instala un transfer de
ioni intre cei doi electrozi ceea ce ar duce la denaturarea analizei. Se alimenteaza cu
5kH.
6
1
4
3
48
i
3
10
4
7
6
2
5
9
8
Fig.II.22.
+i
E6
E5
E4
E3
E0
E1
E2
E(mv)
-i
49
16
15
3
4
t
5
Fig.II.24.
13
14
7
10
11
12
Principiul de funcionare: Radiaia emisa de sursa (1) dup trecerea prin filtru este
focalizata de lentila (4) apoi cade sub un unghi de 90 pe radiaia incidenta. Lumina
fluorescenta emisa este focalizata de lentila (10), trece prin filtrul (11) si ajunge la
detectorul de fluorescenta care ii msoar intensitatea. Semnalul este apoi amplificat si
preluat de sistemul de prelucrare si afiare a datelor(15). Datele obinute sunt afiate
sub forma unei cromatograme (16).
50
10
7
t
8
9
Fig.II.25. Principiul de funcionare al detectorului sir de fotodiode. 1- radiaii ultraviolete, 2substana ce vine de la coloana cromatografica,3- substana ce pleac la tratament
chimic, 4- fereastr cuart, 5- tub capilar prin care circula substana de analizat, 6reea de difracie, 7- dioda Array, 8- amplificator, 9- sistem de preluare,achiziie si
afiare a datelor, 10- cromatograma (in care se preiau concomitent toate lungimile de
unda)
51
Detectori LC
Limita de
detectie
1-10pg
Caracteristici
Electrochimici
(Amperometrici)
10pg = 1ng
Sensibilitate 10-10M
Compusi oxidabili sau reductibili
Da
Bazati pe
Spectrometria
de Masa (MS)
100pg 1ng
Da
FT-IR
1g
Da
Difuzia luminii
Activitate optica
Electrozi ion
selectivi
10g
1ng
10ng
Da
Nu
Nu
Fotoionizare
1pg- 1ng
Nu
Fluorimetrici
Disponibilitateco
merciala
Da
52
electrozi
Solutie
tampon
A
C
C
A+B
B+C
B+C
A+B+C
b
7
8
10
+
I
Fig.II.27.
2
3
1
11
Principiul de functionare , figura II.27, este relativ simplu. La aplicarea tensiunii electrice
U, ionii substantelor din amestec vor incepe sa migreze prin tubul capilar in functie de
potentialele lor specifice. Astfel se realizeaza separarea ompusilor din amestecul de
analizat. Deplasarea lor e bidirectionala (de la stanga la dreapta si de la dreapta la
stanga). In deplasarea lor prin tubul capilar, la un moment dat ionii substantei vor fi
53
54