Curs 3

Factori ce influenteaza extracia

Solubilizarea propriu-zis a unei proteine se realizeaz prin tratarea sursei biologice dezintegrate cu
un volum dintr-un anumit mediu de extracie, n diferite condiii experimentale. Alegerea metodei
optime de extracie a unei enzime dintr-o surs biologic necesit o serie de experimente
preliminare prin care se stabilesc condiiile optime de extracie, respectiv: metoda de dezintegrare,
mediul optim de extracie, raportul optim de extracie (raportul dintre g de esut i ml mediu de
extracie), timpul optim de extracie i temperatura optim de extracie.
Este important ca in timpul procesarii sursei enzimatice si a prelucrarii pana la preparatul enzymatic
dorit sa se retina in acesta maximum de activitate enzimatica.
Problemele majore care apar pe parcursul extraciei, purificrii unei proteine sunt:
Denaturarea termica;
Fortele de forfecare pot distruge pe langa peretii celulari si enzimele de interes;
scderea pH-ului mediului ca urmare a eliberrii de acizi n urma dezintegrrii celulare;
Dilutia;
Schimbarea structurii conformationale datorita prezentei detergentilor sau/si solventi;
Fenomene de oxidare;
prezena ioni metalici;
prezena enzimelor proteolitice n cantiti mari;
contaminarea cu acizi nucleici, bacterii i virusuri;
formarea radicalilor liberi;
formarea de spuma ce poate duce la distrugerea conformatiei enzimei de interes.
Aceste probleme pot fi limitate prin alegerea unui mediu de extracie corespunztor, prin scurtarea
timpului de preparare a extractului proteic i prin desfurarea procedeului de extracie ales la
temperaturi sczute.
Denaturarea termica
Prin cresterea temperaturii ca urmare a consumului de energie care genereaza caldura fenomen ce
caracterizeaza majoritatea metodelor de omogenizare/dezintegrare celulara.
Temperatura de extracie este un parametru important care trebuie optimizat cu grij.
Procesarea la temperaturi scazute este esentiala pentru cele mai multe enzyme. Totusi
1

trebuie subliniat faptul c, temperaturile sczute nu sunt necesare n toate cazurile, pentru anumite
enzime fiind chiar nerecomandate ca de exemplu enzimele alosterice.
Prezenta unor substante cum sunt poliolii de tipul glicerolului, glucozei sau zaharozei ajuta la
stabilizarea enzimelor in conditii termice denaturante. Astfel glicerolul, n concentraie de 50 %
(g/v) determin scderea punctului de topire al soluiilor apoase sub temperatura normal a
congelatoarelor (-200C). Soluiile proteice cu glicerol se preteaz de asemenea conservrilor pentru
perioade mari de timp, ntruct previne nghearea multor enzime.
Fortele de forfecare
Dezintegrarea celulelor prin metode severe (presare, sonicare) supune componentele celulare la
presiuni ridicate care pot conduce la inactivarea unor enzime. Efectele presiunilor ridicate asupra
enzimelor pot fi complexe. Enzimele oligomere, ca de exemplu lactat dehidrogenaza sau
gliceraldehid- 3- fosfat dehidrogenaza, supuse la presiuni moderate (de pn la 2 kbari) sunt
disociate reversibil la monomeri inactivi. La presiuni ridicate monomerii se agreg i formeaz o
structur denaturat, proces care este ireversibil. Pentru a minimaliza efectul duntor pe care
metodele severe de dezintegrare l pot avea asupra enzimelor, presiunile i perioadele de timp de
aplicare ale acestora trebuie controlate.
pH ul
n mod normal, valoarea pH-ului mediului de extracie este valoarea la care enzima de interes are
activitate catalitic maxim. Insa pentru anumite enzime, pH-ul optim de aciune nu este i cel la
care se realizeaz cea mai eficient extracie, fiind necesar o extracie la un pH la care enzima are
o stabilitate maxim.
De exemplu tripsina este mult mai stabil la pH = 3 valoare la care autoliza nu se produce, dect la
valorile de pH cuprinse nttre 8 i 9, valori la care enzima are capacitate catalitic maxim. Extracia
unor enzyme din drojdii este mult mai eficient la valori extreme de pH ale mediului realizate n
prezena unei concentraii de 0,5 M ammoniac, denaturrile suferite n aceste condiii fiind
acceptabile.
Valoarea pH ului ales trebuie s fie ct mai ndeprtat de cea corespunztoare pI ului proteinei.
Valoarea pH ului optim n extracia unei enzyme este realizat i meninut constant cu ajutorul
sistemelor tampon.
Tampoanele utilizate
2

Sistemul tampon ales pentru extracia unei enzyme dintr-o anumit surs biologic poate influena
capacitatea de solubilizare i activitatea catalitic a acesteia prin:
valoarea pH ului su;
tria sa ionic i compoziia sa.
Soluiile tampon sunt acele soluii care i modific pH-ul numai n mic msur la
adugare de acizi i baze tari.
Tampoanele alese trebuie s asigure manifestarea unei activiti catalitice maxime i
stabilitatea enzimei, s nu interfere n metodele de determinare a concentraiilor proteice, s nu fie
volatile, s nu interacioneze cu substraturi, cu cofactori sau cu ioni metalici, s aib solubilitate
mare n ap.
Pentru calcularea pH-ului mediilor de extractie, tampoanelor se utilizeaza relaia Henderson
Hasselbach:
pH pK a log

[Baza]
[Acid]

Aceast relaie stabilete o corelaie direct ntre pH-ul unei soluii de acid, constanta sa de
aciditate i raportul dintre concentraia bazei sale conjugate n condiii de echilibru. Dac ntr-o
soluie apoas sunt prezente dou cupluri acid-baz, se ajunge la relaia :
pH

1
1 [B ]
pK a1 pK a2 lg 2
2
2 [ A1 ]

Soluiile tampon sunt caracterizate prin indicele de tamponare (value buffer) care se definete ca
fiind raportul dintre adaosul de acid tare sau baz tare, exprimat n echivaleni la litru i variaia
corespunztoare a pH-ului si arata capacitatea de tamponare a solutiilor tampon, deci:
i

dn
dpH

unde: dn este numrul de echivaleni de acid sau baz tare adugat dpH variaia de pH la adaosul
de acid sau baz tare.
Maximul capacitii de tamponare apare atunci cnd pH ul mediului este egal cu valoarea pK a si
sistemele tampon au o capacitate bun de tamponare pe un domeniu de pH egal cu pKa 1.
Din ecuaiile de mai sus se observ c valoarea de tamponare este n relaie direct cu concentraia
tamponului i este de ateptat ca aceasta s-i menin pH ul dup diluie dac, att [HA] ct i [A-]
sunt reduse n proporii echivalente. Practic se constat c acest lucru se ntmpl doar atunci cnd
diluia aplicat nu este foarte mare.

n cazul tampoanelor care au ioni monovaleni, modificrile pH urilor cauzate de diluie sunt
minore. De exemplu, diluia unui tampon de concentraie 0,1 M, care conine cantiti egale de HA
i A-, produce o modificare a pH-ului acestuia de 0,024 uniti. Dac tamponul conine ioni
polivaleni (citrate sau fosfat), modificarea pH ului poate fi semnificativ. Pentru astfel de
tampoane insa nu sunt recomandate diluii mari.
Un alt factor care poate afecta pH-ul unei soluii tampon este temperatura, parametru care afecteaz
valorile pKa. Tampoanele cele mai sensibile la modificarea temperaturii sunt cele care conin
grupri amino. De exemplu tamponul Tris HCl adus la pH = 8,0 la 250C, va avea la 00C un pH de
8,78. Tampoanele cele mai puin sensibile la variaiile de temperatur sunt cele care conin acizi
carboxilici. Astfel tamponul acetat are un pH de 4,5 la 25 0C i unul de 4, 495 la 0 0C. Comportarea
diferit fa de temperatur rezid din diferenele care exist ntre valorile H ale proceselor de
ionizare ale acizilor.
Din punctul de vedere al substanelor dizolvate, soluiile tampon sunt soluii de electrolii. O
marime importanta ce caracterizeaza electrolitii este taria lor ionica ce caracterizeaza cmpul
electric dezvoltat de ioni, n soluie. Aceasta depinde de concentraia sa, de valena sa (adic de
sarcina sa), de prezena altor ioni n soluie i este independent (n soluii diluate) de natura chimic
a ionului. Pentru a ine seama de toi aceti factori, a fost introdus o noiune, i anume tria ionic
(G.N.Lewis, 1921). Tria ionic se noteaz cu i este definit ca fiind jumtate din suma
termenilor obinui prin nmulirea concentraiilor, c (molaliti sau molariti), ale fiecrui ion din
soluie, cu ptratul valenei sale, Z. Astfel, pentru o soluie coninnd mai multe specii de ioni, notai
cu indicii 1, 2, 3, n, tria ionic a tuturor ionilor din soluie va fi:

c1 Z 12 c 2 Z 22 c3 Z 32 ...
2

Majoritatea proteinelor au solubilitate maxim la trii ionice moderate, cuprinse nttre 0,05 i 0,1 M,
valori care sunt alese dac capacitatea de tamponare a sistemului tampon este suficient n aceste
condiii.
Cteva tampoane utilizate pentru extracia proteinelor sunt prezentate n tabelul

Utilizarea unor

tampoane cu capacitate slab de tamponare pentru cantiti mari de proteine necesit verificare pH
ului mediului, ntruct proteinele acioneaz ca sisteme tampon. Tampoanele utilizate pentru
extracia proteinelor au n general concentraii cuprinse ntre 20 i 100 mM (concentraia unui
tampon se refer la concentraia tuturor speciilor componente).
Tabel.
4

Sisteme tampon utilizate pentru extracia proteinelor

Tampon
Valori pKa
Acetat de sodiu
4,75;
Bicarbonat de sodiu
6,50; 10,25;
Citrat de sodiu
3,09; 4,75; 5,41;
Acetat de amoniu
4,74; 9,25;
Bicarbonat de amoniu
6,50; 9,25;

Tris - HCl
10,25;
Fosfat de sodiu
8,21;
Tris - fosfat
1,5; 7,5; 12,0; 8,21;

Tris : Tris (hidroximetil) aminometan

Compoziia sistemelor tampon alese pentru extracia enzimelor poate afecta capacitatea catalitic a
acestora. Unele dintre tampoanele clasice prezentate n tabelul prezint unele dezavantaje.
Tampoanele fosfat tind s precipite ionii bivaleni de Mg, Ca, Fe i ali cationi polivaleni. Fosfatul,
un metabolit important, inhib unele enzime ca : kinaze, dehidrogenaze, carboxipeptidaze, ureaza,
aril sulfataza, fosfoglucomutaza. Tampoanele care conin pirofosfat precipit cationii polivaleni i
au tendina de a forma complexe, iar cele pe baz de citrat precipit ionii buvaleni de calciu. Astfel
de tampoane nu trebuie utilizate n extracia enzimelor pentru care prezena cationilor respectivi
este esenial n manifestarea funciei lor catalitice. O alternativ mai bun pentru tampoanele pe
baz de fosfai sunt tampoane de tip Mops sau Bes, tampoane pentru care baza conjugat are sarcina
1.

Mops

Bes

Alegerea unui tampon adecvat este un factor esenial n extracia unei enzime.pH ul din interiorul
unor organite subcelulare poate diferi de cel neutru (pH ul din interiorul vacuolelor i lizozomilor
este de aproximativ 5). Capacitatea de tamponare a tampoanelor utilizate n astfel de situaii trebuie
s in seam de acest lucru atunci cnd astfel de formaiuni sunt supuse dezintegrrii. Procesele
metabolice pot continua n extractele obinute fapt care afecteaz pH ul. Astfel degradarea
glicogenului n extractele musculare poate produce o scdere cu o unitate a pH ului mediului n
timp de o or, scdere datorat acumulrii de acid lactic.
Un factor important care poate afecta/modifica comporatarea enzimei de interes este dilutia ce are
loc la extragerea sa.
Deoarece solutiile tampon sunt in general solutii destul de diluate, in evaluarea celor mai bune
tampoane pentru extractia unei enzime de interes se utilizeaza legea dilutiei sau
legea lui Ostwald. Aceasta arat dependena constantei de disociaie de gradul de disociere i de
5

concentraie.: K

2C
(1 )

Extracia proteinelor din esuturi sau celule poate conduce la obinerea unor soluii de enzime foarte
concentrate. n unele compartimente celulare, cum ar fi de exemplu matricea mitocondrial,
concentraia proteinelor este de peste 500 mg/ml. Pentru a putea determina activitatea enzimelor,
concentraia proteic trebuie redus la 5 mg/ml n extractele celulare i la 5 g/ml n soluia unei
enzime pure.
n practic s-a constatat insa c multe enzime i pierd rapid activitatea dac sunt pstrate n soluii
diluate. Acest efect poate fi contracarat prin introducerea unei proteine inerte, cum este albumina
seric bovin, n concentraie de 1 10 mg/ml. Introducerea acestei proteine poate preveni
pierderea activitii enzimatice datorate adsorbiei pe suprafaa veselei utilizate sau degradrii
prioritare a acesteia de ctre enzimele proteolitice coprezente.
Diluia extractelor proteice poate avea ca efect i disocierea unor cofactori de apoenzim, fenomen
care poate determina pierderea activitii catalitice. Pentru ca acest efect s poat fi compensat, se
recomand introducerea cofactorului n sistemul tampon utilizat pentru extracie.
n concluzie, n alegerea unui tampon pentru extracia unei enzime trebuie avui n vedere urmtorii
factori :
Tria ionic a tamponului trebuie s corespund unei capaciti de tamponare suficiente
i s determine extracia optim a enzimei;
Domeniul pe care tamponul menine pH ul mediului constant s corespund cu cel de
stabilitate al enzimei;
Componentele tamponului nu trebuie s manifeste efecte negative asupra activitilor
enzimatice (tampoanele polianionice de tipul citratului i fosfatului sunt ageni de
chelatare ai unor ioni metalici care pot fi eseniali n aciunea unor enzime);
Concentraia tamponului nu trebuie s interfere n etapele ulterioare extraciei
(concentraii mari de tampoane polivalente pot competiiona cu proteinele n legarea la
situsurile ncrcate ale schimbtorilor de ioni).

Detergenii
n multe cazuri proteinele care trebuie extrase sunt legate de membrane sau se gsesc sub form de
agregate. Pentru solubilizarea unor astfel de proteine interaciile hidrofobe n care acestea sunt
implicate trebuie diminuate prin utilizarea detergenilor sau a agenilor caotropici. Civa dintre
detergenii care se utilizeaz frecvent pentru extracia enzimelor sunt prezentai n tabelul
6

Tabel.
Detergeni utilizai pentru solubilizarea proteinelor
Detergent

Triton X 100
Nonidet P 40
Lubrol PX
Octil glucozid
Tween 80
Deoxicolat de sodiu
Dodecil sulfat de sodiu(SDS)
CHAPS

Caracter

Efect

ionic

proteinelor

micelar

Denaturant slab

% (w/v)
0,020

neionic
neionic
neionic
neionic
neionic
neionic
neionic
Zwiter-ioni

asupra Concentraie critic

Denaturant puternic

0,006
0,730
0,002
0,210
0,230
1,400

Unii detergeni nu denatureaz proteinele globulare sau nu interfer cu activitile biologice ale
acestora, n timp ce alii, cum ar fi SDS, sunt puternic denaturani. n prezena SDS proteinele
globulare sufer modificri conformaionale puternice care le afecteaz funcia biologic, iar
proteinele cu structur oligomer dunt disociate n subuniti.
Detergenii trebuie utilizai cu discernmnt n extracia enzimelor. Pentru unele enzime detergenii
reprezint singura posibilitate de solubilizare din formaiunile celulare n care sunt incluse, iar
pentru altele detergenii sunt agenii denaturani puternici. n cazul unor enzime utilizarea
detergenilor este necesar nu numai la extracie, ci i pe tot parcursul procedeelor de purificare, la
finalul purificrii obinndu-se complexe detergent enzim. Detergenii sunt molecule amfipatice.
Cnd concentraia lor n mediu crete, ei pot forma micele, la aa numita concentraie critic
micelar. Deoarece micelele formate ngreuneaz purificrile prin procedee cromatografice, trebuie
utilizate concentraii sub valoarea celei critice micelare.
Agenii reductori
Gruprile tiol ale resturilor de cistein din structura proteinelor pot suferi modificri pe parcursul
procedeelor folosite pentru extracia acestora. n interiorul celulelor, catenele laterale ale resturilor
de cistein sunt meninute n forma redus (-SH)datorit mediului reductor existent. n urma
dezintegrrii, celulele devin expuse oxigenului i apare tendina ca gruprile SH s formeze puni
disulfurice sau s fie oxidate. Protejarea gruprilor SH contra oxidrii se realizeaz prin includerea
n mediul de extracie a unor ageni reductori ca :acidul ascorbic,

mercaptoetanolul, 1,4-

ditioeritritol (DTE) i 1,4-ditiotreitol (DTT). Structura acestor ageni reductori este prezentat n
tabelul ... . de obicei concentraii cuprinse ntre 10 i 25 mM sunt suficiente n protejarea gruprilor
tiolice din structura proteinelor, fr a produce scindarea punilor disulfurice.

Tabel..
Structura unor ageni reductori
Agent
2 - mercaptoetanol
1,4-ditioeritritol (DTE)
1,4-ditiotreitol (DTT)

Structur
HS-CH2-CH2-OH
HSCH2-HCOH-HCOH-CH2SH (cis)
HSCH2-HCOH-HOCH-CH2SH (trans)

2 mercaptoetanolul este un lichid dens, cu un miros neplcut i toxic. Prezena acestuia n

concentraii de 10 20 mM n mediul de extracie asigur protecia gruprilor tiol din structura
proteinelor pe o perioad de 24 ore. Ditiotreitolul i ditioeritritolul, substane reductoare puternice,
realizeaz protecia gruprilor tiol la concentraii mai sczute ale acestora n mediu (1 mM).
Potenialul redox standard al ditiotreitolului la pH = 7,0 este -0,33 V, cu 0,12 V mai negativ dect
cel al cisteinei. Principalul dezavantaj al ditiotreitolului este preul su de cost ridicat.
Un studiu ntreprins asupra stabilitii soluiilor agenilor reductori a evideniat c acetia sunt
puin stabili la valori ridicate de pH, la temperaturi ridicate i n prezena unor concentraii mici de
ioni de Ca2+. Includerea n soluiile de acid etilendiamino tetraacetic (EDTA) le mrete stabilitatea.
Prezenta ionilor metalici
Prezena ionilor metalelor grele (Cu, Pb, Hg, Ni) n mediu poate deteriora funcia biologic a unor
enzime dar pot fi si activatori pentru unele enzime.
Multe enzime necesit prezena n mediu a ionilor de Ca2+ ( - amilaza), de Zn2+ (alcool
dehidrogenaza) sau a altor ioni bivaleni, ioni care sunt complexai de EDTA. n astfel de situaii, fie
EDTA este introdus n mediu n cantiti mici, fie mediul de extracie se suplimenteaz cu ionul
metalic respectiv. Suplimentul de ion metalic trebuie realizat cu reactivi foarte puri pentru a se evita
o potenial contaminare cu metale grele.
Unii ioni au actiune toxica deoarece reacioneaz cu gruprile tiol din structura proteinelor sau
intensific oxidarea acestora n prezena oxigenului. Metalele grele pot proveni din esutul utilizat
ca surs biologic, din sticlrie sau din reactivi. Protecia contra efectelor induse de metalele grele
se realizeaz prin introducerea n mediul de extracie a unor ageni de chelatare ai acestora. Cel mai
utilizat agent de chelatare este EDTA, care la concentraii 1 mM n mediul de extracie
minimalizeaz efectele metalelor grele, capacitatea de chelatare a acestora crescnd cu creterea pH

ului. Avnd n vedere c EDTA este un tampon, se recomand adiia srii disodice a acestuia
nainte de ajustarea pH ului final al mediului.
Prezenta enzimelor proteolitice
Una dintre cel mai dificile probleme care apare att n timpul extraciei ct i pe parcursul purificrii
enzimelor este controlul degradrii acestora de ctre enzimele proteolitice endogene mai ales in
cazul surselor bogate in enzime proteolitice(de exemplu tesuturile animale ca ficatul, splina sau
rinichii). Degradarea proteolitic a unei enzime este evideniat prin urmtoarele constatri
experimentale :
Enzima este izolat cu un randament sczut;
Pierderea activitii enzimatice la incubarea enzimei;
Obinerea unei rezoluii slabe prin electroforez n gel de poliacrilamid n prezen de
dodecil sulfat de sodiu (SDS PAGE), datorat unei heterogeniti la nivelul masei
moleculare a enzimei;
Discrepane ntre proprietile enzimei raportate n alte cercetri i cele determinate
experimental.
Exist o serie de strategii care minimalizeaz sau suprim proteoliza nedorit. Acestea includ :
manipulri la temperaturi sczute la care aciunea proteazelor este ncetinit; alegerea ca surs
biologic a unor esuturi cu puini lizozomi sau a unor tulpini microbiene deficitare n enzime
proteolitice; extracia rapid a omogenatului proaspt ntr-o soluie apoas a unui polimer n sistem
bifazic; adsorbia proteazelor pe adsorbani prin interacii hidrofobe. Inhibarea proteazelor se poate
realiza i prin ajustarea pH ului mediului la o valoare la care acestea nu acioneaz, cu condiia ca
aceast valoare de pH s nu afecteze stabilitatea proteinei supus purificrii.
Cea mai utilizat metod implic utilizarea, n etapele de extracie i n cele ulterioare, de inhibitori
ai enzimelor proteolitice. Inhibitorii reacioneaz i modific ireversibil unele resturi de aminoacizi
implicate n funcia enzimelor proteolitice. Cteva exemple de astfel de substane sunt :
Diizopropil fluorofosfatul (DIP), inhibitor ireversibil al serin proteinazelor la concentraii
de 1 mM n mediu, substan foarte toxic i instabil n soluii apoase:

E-OH +

+ HF

 Fluorur de fenilmetansulfonil (PMSF), inhib puternic toate serin proteinazele, la

concentraii cuprinse ntre 0,1 i 1 mM, ct i unele tiol proteinaze. PMSF trebuie manipulat
cu atenie pentru c este foarte toxic:

E-OH +

+ HF

EDTA ul, substan solubil n ap, la concentraii cuprinse ntre 1 i 10 mM inhib

proteazele activate de metale;
Acidul monoiod acetic sau moniod acetamida ( IAA, IAN), sunt inhibitori ai cistein
proteinazelor la concentraii mici, cuprinse ntre 10 i 100 M:
E SH + ICH2- CONH2E S CH2- CONH2 + HI
IAN
Cistatinele, inhibitori naturali de natur peptidic, se leag reversibil i inhib unele tiol
proteinaze;
Pepstatina A, o substan natural, cu structur asemntoare unei pentapeptide, secretat de
unele specii de Streptomyces, inhib la concentraii de 1 M unele proteaze acide cu resturi
de acid aspartic n centrul catalitic activ.
Pentru a inhiba toate tipurile de enzime proteolitice prezente ntr-un extract proteic total se
utilizeaz amestecuri de astfel de inhibitori.
Exemple de amestecuri de inhibitori necesar minimalizrii aciunii principalelor tipuri de enzime
proteolitice din diferite esuturi sunt prezentate n tabelul....

Tabelul..
Inhibitori utilizai pentru controlul proceselor de proteoliz
Tip de esut
esuturi
animale

Tipuri de proteinaze
Serin-proteinaze
Metalo-proteinaze
Aspartic- proteinaze

Inhibitori adugai
PMSF (1mM)
EDTA (1mM)
Benzamid (1mM)
Leupeptin (10 g/ml)
Pepstatin A(10 g/ml)

Soluii stoc utilizate

0,2 M n metanol
0,1 M n ap
0,1 M n ap
1 mg/ml n ap
5 mg/ml n metanol
10

0,1 mg/ml n ap
Aprotinin (1 g/ml)
esuturi
ale Serin-proteinaze
PMSF (1mM)
0,2 M n metanol
Cistein-proteinaze
1 mg/ml n DMSO
Chimostatin(20g/ml)
plantelor
0,1 M n ap
EDTA (1mM)
1 mg/ml n ap
E64 (10 g/ml)
Drojdii, fungi
Serin-proteinaze
PMSF (1mM)
0,2 M n metanol
Aspartic- proteinaze
5 mg/ml n metanol
Pepstatin A(15 g/ml)
Metalo-proteinaze
1 M n etanol
Fenantrolin (5 mM)
Bacterii
Serin-proteinaze
PMSF (1mM)
0,1 M n metanol
Metalo-proteinaze
EDTA (1mM)
0,1 M n ap

E64 : L trans epoxisuccinil leucilamino (4-guanidino) butan

Amestecurile de inhibitori prezentate n tabel sunt numai orientative. Pentru fiecare enzim i
pentru fiecare surs biologic sunt necesare experimente prealabile prin care s se stabileasc
tipurile de inhibitori care stopeaz cel mai eficient procesele de proteoliz care pot afecta funcia
catalitic a enzimei supuse studiului.
Cteva aspecte legate de utilizarea inhibitorilor enzimelor proteolitice trebuie cunoscute:
Msuri de protecie. PMSF trebuie manipulat cu atenie pentru c este foarte toxic. O alternativ
mai puin periculoas este nlocuirea lui prin 3,4 dicloroisocumarin (DCI), compus mult mai
puin toxic i mai reactiv fa de serin proteinaze, dar mult mai scump. DCI este greu solubil n
ap (se prepar n dimetilsulfoxid DMSO) i este destul de instabil, timpul de via a acestuia la
pH neutru fiind de 20 30 minute. Concentraia acestuia n mediile de extracie trebuie s fie de
0,1 mM.
Stabilitatea. PMSF este instabil n soluii apoase, avnd la 250C i pH = 7,0 un timp de
njumtire de 30 minute. Acest dezavantaj poate fi nlturat prin adugarea repetitiv de volume
mici din soluiile stoc la extractele proteice.
Solubilitate. Unii inhibitori, prezentai n tabel, sunt puin solubili n ap i de aceea se prepar
soluii stoc n solveni organici. Volumul din soluiile stoc care se adaug n mediul de extracie
trebuie s fie ct mai mic pentru a minimaliza efectul denaturant al solvenilor organici;
Contaminarea cu microorganisme(mai ales bacterii i virusuri)
O modalitate de a evita creterea bacterian n soluiile proteice este utilizare soluiilor tampon care
au fost n prealabil sterilizate i filtrate. Unele tampoane, cum ar fi cele pe baz de fosfat, acetat i
carbonat, la pH neutru sunt medii bune de dezvoltare a microorganismelor. Tampoanele cu pH uri
sub 3,0 i cele cu pH peste 9,0 nu permit n mod normal creterea microorganismelor cu excepia
unor mucegaiuri. Pentru prevenirea contaminrii bacteriene se recomand adugare de ageni
antibacterieni la soluiile tampon. Cei mai eficieni ageni bacteriostatici sunt : azida de sodiu n
concentraie de 0,001 M, mertiolatul n concentraie 0,005 M i unii alcooli, ca de exemplu
11

butanolul n concentraie de 1%. Azida prezint dezavantajul c este o substan nucleofil care
leag metalele. n cazul n care aceste substane interfer n determinrile de activitate enzimatic
sau n separri cromatografice se recomand adugarea lor doar la soluiile proteice supuse
conservrii.
Formarea radicalilor liberi;
Extractele celulare preparate prin ultrasonicare sunt supuse aciunii radicalilor liberi care apar ca
urmare a scindrii moleculelor de ap la temperaturi locale ridicate induse n aceast metod de
dezintegrare. Studiile intreprinse au artat c efectele nedorite induse de ultrasunete asupra
proteinelor pot fi minimalizate prin sonicare unor suspensii avnd concentraii celulare mari n
prezena n mediu a unor compui de tipul zaharurilor sau a N2O, compui cu aciune protectoare
contra radicalilor liberi.
Formarea de spuma poate duce la distrugerea conformatiei enzimei de interes. Evitarea sau
micsorarea cantitatii de spuma ce poate aparea in procesul de separare/extractie a proteinelor este de
adaugare a unor antispumanti inerti cum sunt de exemplu uleiul alimentar sau Tween.

12