Universitatea tefan cel Mare,Suceava

Facultatea de Inginerie Alimentar

Controlul i Expertiza Produselor Alimentare

Spectroscopia de absorbie molecular n infrarou

Cuprins
Consideraii teoretice..................................................................................................................3
Tehnici ale spectroscopiei de absorbie molecular IR...........................................................4
Analiza IR a substanelor solide insolubile n solveni...........................................................5
Analiza IR la lichide...............................................................................................................5
Analiza IR a substanelor gazoase..........................................................................................6
Analiza ATR............................................................................................................................6
Analiza cu reflexie difuz.......................................................................................................7
Aparatur folosit n spectroscopia IR.......................................................................................8
Spectrometre IR dispersive.....................................................................................................8
Spectrometre nedispersive cu transformat Fourier (FT-IR)................................................10
Spectromicroscoape..............................................................................................................11
Spectrul infrarou i coeficientul de absorbie a cofactorului flavin n ap............................13
Introducere............................................................................................................................13
Materiale i metode...............................................................................................................14
Rezultate...............................................................................................................................15
Discuie.................................................................................................................................19
Concluzii...............................................................................................................................23
Infrared spectrum and absorption coefficient of the cofactor flavin in water..........................24
Bibliografie...............................................................................................................................25

Consideraii teoretice

Spectroscopia n infrarou (IR) reprezint un mijloc performant de analiz calitativ i

cantitativ pentru specii moleculare. Acest tip de spectroscopie se bazeaz pe concluziile ce se
pot trage din studiul oscilaiilor i rotaiilor moleculare ca urmare a aportului de energie ce se
aduce moleculei n domeniul spectral infrarou. O interaciune a componentei electrice a
radiaiei infraroie cu molecula este posibil numai dac n timpul oscilaiei se schimb
simetria repartiie sarcinilor electrice. Radiaia infraroie este absorbit de molecul numai
dac frecvena proprie de oscilaie sau de rotaie a legturilor existente n molecul coincide
cu cea a radiaieiei IR. Att n substanele anorganice ct i organice apar oscilaii mecanice la
absorbia de radiaii n domeniul infrarou al spectrului.
Pot fi deosebite trei feluri diferite de oscilaii:
- Oscilaii simetrice de valen .Sunt oscilaii pe direcia axei de legtur a doi atomi sau
molecule manifestat printr-o ntindere sau o comprimare a legturii (Fig. 1a)
- Oscilaii asimetrice a doi atomi sau molecule manifestat printr-o ntindere i o comprimare
a legturii pe direcia axei de legtur. (Fig. 1b)
- Oscilaii de deformare cu schimbarea unghiului dintre legturi (oscilaii de ncovoiere)
(fig.1c).

Fig. 1: Tipuri de oscilaii n molecule.

Exist dou ci de msurare a oscilaiilor sau rotaiilor moleculare:

1. direct ca absorbii n spectrul infrarou;
2. indirect ca radiaie de mprtiere n spectrul Raman.
Datorit faptului c domeniul lungimilor de und acoperit de radiaia infraroie este mare
domeniul de frecven n infrarou se mparte n trei subdomenii :
3

infrarou apropiat (NIR) absorb oscilaii combinate;

nfrarou mediu (MIR) absorb oscilaii moleculare;

infrarou ndeprtat (FIR)- absorb rotaii ale moleculelor.

Spectroscopia n infrarou apropiat - NIR reprezint metoda ideal pentru analiza rapid de
amestecuri de substane cu aplicaii n special n chimia alimentar, medicamente i
cosmetic.
Spectroscopia n infrarou mediu - MIR este la ora actual una din tehnicile analitice cele mai
performante pentru analiza calitativ a substanelor organice.
Domeniul spectroscopiei n infrarou ndeprtat - FIR este mai puin explorat n el nefiind
attea aplicaii ca n celelalte dou domenii IR.

Tehnici ale spectroscopiei de absorbie molecular IR.

1. Transmisia este tehnica cea mai utilizat la ora actual. Pot fi analizate calitativ i
cantitativ probe sub form lichid, solid sau gazoas. O parte din radiaia IR incident
este absorbit specific de ctre proba de analizat iar diferena este transmis i trece
prin prob ajungnd pe detectorul de radiaie.
2. Absorbia i reflexia este folosit pentru analiza spectral a materialelor solide
netransparente ce nu pot fi aduse n stare solvit sau n stare solid pulverulent.
Procedeul se bazeaz pe transmisia radiaiei IR cu un unghi bine stabilit pe prob.
Radiaia induce oscilaii ale legturilor moleculare din prob, aceasta absorbind
specific o parte din radiaie diferena ajungnd pe detector. La aceast tehnic,
intensitatea radiaiei transmise este mai redus dect la transmisie ceea ce duce la
sensibilitii mai mici la semnalul util.
3. Reflecia difuz este folosit n special pentru analiza spectral IR a pulberilor i a
substanelor solide. Radiaia reflectat difuz de pe material mai este reflectat nc
odat ntr-o sfer interioar i pe urm focalizat pe detector. Dup transformarea
intensitii luminoase n semnal electric acesta este integrat, spectrul obinut este tratat
cu funcia Kubelka Munk obinndu-se n final un spectru de absorbie IR.

4. Emisia se bazeaz pe analiza radiaiei IR emis de proba de analizat. n acest scop se

realizeaz nclzirea probei la minimum 100C i se nregistreaz spectrul de emisie al
acesteia. La ora actual aceast tehnic este folosit pentru determinarea emisiei de
CO i CO 2 n couri industriale . Ca mijloc curent de analiz emisia IR nu este nc
suficient de perfecionat . Se ntlnesc greuti datorit raportului mic semnal
/zgomot mai ales atunci cnd nivelul de emisie infraroie nu depete cu mult de
temperatura mediului ambiant.

Analiza IR a substanelor solide insolubile n solveni

Se realizeaz prin transmisie, prin repartizarea uniform a substanei fin mcinate ntr-o
matrice solid sau lichid transparent la radiaie IR i care nu prezint benzi de absorbie n
domeniul infrarou. Dimensiunile particulelor din matrice trebuie s fie mai mici dect
lungimea de und a radiaiei n caz contrar pierzndu-se o cantitate important a radiaiei
infraroii prin mprtiere difuz.
Atunci cnd substanele solide se gsesc sub form de pulberi i nu sunt perfect
transparente acestea sunt analizate prin reflexie difuz folosind sfere integratoare pentru
amplificarea radiaiei. n analitica alimentar aceste aplicaii sunt folosite la finuri, lapte praf,
zaharuri, aditivi etc.

Analiza IR la lichide
Aceast analiz se realizeaz cu ajutorul tehnicii de transmisie unor cuve
paralelepidedice subiri cu ferestre din materiale ce las s treac radiaia IR. Aceste cuve sunt
de grosime mic deoarece radiaia infraroie este mai srac n energie dect radiaia n
domeniul vizibil precum i faptul c solventul speciilor organice prezint i el o absorbie
accentuat n infrarou. De regul peretele cuvelor este confectionat din NaCl. Datorit
higroscopicitii mari a acestuia, atunci cnd n substana de analizat exist ap care nu poate
fi eliminat , sunt folosite cuve cu perei din CaF 2 i BaF 2 . Dat fiind faptul c si aceste
substane transparente la IR sunt n majoritate higroscopice pentru spectrometria IR (MIR) se
pot folosi numai solveni organici. n cazul n care nu exist la dispoziie un solvent ideal sau
n cazul unor cantiti foarte mici de prob se poate practica i ntinderea probei sub forma
unui film pe materialul ferestrei. n acest scop se scoate garnitura distanoare de teflon din
cuv i se picur proba pe una din plcile cuvei iar cu cealalt plac se preseaz proba pn se
5

obine un film uniform al substanei. Grosimea unui asemenea film de cteva sutimi de mm
grosime este suficient pentru analize calitative ireproabile dar insuficient pentru analize
cantitative precise.

Analiza IR a substanelor gazoase

Se efectueaz pentru majoritatea gazelor dar i pentru substane solide cu punct de
evaporare sczut. Proba n stare gazoas este absorbit ntr-o celul cilindric special, cu
pereii din material transparent la radiaie IR, vidat n prealabil. Celula este plasat n traseul
radiaiei infraroii nregistrndu-se spectrul ei de absorbie. Pentru a exista absorbii
detectabile celulele trebuie s aib lungimi apreciabile, acestea ajung de la ordinul
centimetrilor pn la ordinul zecilor de centimetri . Exist i celule speciale cu perei reflectori
care fac ca fasciculul IR s fie reflectat de mai multe ori n interiorul celulei nainte de a o
prsi ceea ce are acelai efect ca o celul de lungime mare de ordinul metrilor.

Analiza ATR

Reprezint un mijloc de analiz a spectroscopie IR folosit pentru probe deosebite cum

ar fi: substane vscoase, suspensii vscoase, materiale solide cu solubilitate limitat sau
insolubile, filme i biofilme, paste, fire, pulberi, adezivi etc.
La aceast tehnic se introduce un dispozitiv optic special ntre monocromator i
detector (figura 2). Elementul de baz al acestui dispozitiv l reprezint o plac (2) cu dou
fee planparalele fabricate dintr-un material cristalin transparent cu un indice de refracie
mare, de regul bromur de Thaliu, iodur de Thaliu sau plci din Germaniu sau selenur de
zinc. Pe ambele fee planparalele ale materialului cristalin transparent se depune un strat ct
mai uniform din materialul (1) analizat i se fixeaz placa pe suportul (10) reglabil dup care
se slabete surubul (11) i se poziioneaz suportul (10) reglabil la unul din unghiurile de
inciden a radiaiei de 30 0 ,45 0 sau 60 0 dup care urubul (11) se strnge din nou.
Radiaiile incidente (3), care vin de la monocromator sub unul din unghiurile menionate se
reflect multiplu total pe feele plan paralele ale plcii cristaline cu indice de refacie mare.
nainte de a se reflecta de pe una din feele plan paralele radiaia ptrunde ns i de la cteva
fraciuni de lungimi de und pn la cteva uniti de lungimi de und n materialul analizat
6

depus pe cele dou fee ale plcii. Adncimea de ptrundere a radiaiei n materialul analizat
depinde de valoarea lungimii de und a radiaiei, de unghiul de inciden a acesteia, de natura
materialului analizat i de natura materialului cristalin al plcii plan paralele, n schimb nu
depinde de grosimea probei ntruct radiaia nu ptrunde dect civa micrometri n aceasta.
n urma patrunderii n materialul analizat radiaia sufer att modificri ale lungimii de und ,
dependente de natura speciilor analizate, ct i atenuri ale intensitii determinate de
concentraia acestor specii.

Fig.2 : a) -Principiul spectroscopiei IR cu reflecie totat bazat pe msurarea atenurii (ATR), 1prob de analizat, 2-material solid transparent cu indice de refracie mare, 3- radia ie incident, 4radiaie reflectat i refractat multiplu. b) - Schema de principiu a unui dispozitiv IR-ATR cu traseul
radiaiei i aranjamentul unghiular dispozitivului ATR, 5- corpul dispozitivului ATR, 6,7,8,9 oglinzi
cu reflexie total, 10-suport reglabil, 11-urub de strngere.

Analiza cu reflexie difuz.

Acesat tip de spectroscopie este practicat la analiza pulberilor fine (finuri, pulberi de
medicamente, stupefiante etc). n vederea determinrii cantitative este analizat intensitatea
radiaiei difuze ce cade pe detector. Tehnica de lucru const n iradierea succesiv a probei cu
lungimi de und n domeniul spectral 1000 nm- 4000 nm cu benzi spectrale nguste,

obinute fie cu filtre de interferen fie cu monocromatoare, a cror lungimi de und

corespund fiecare unei anumite specii analizate. Datorit faptul c cea mai mare parte a
radiaiei este reflectat pe alte direcii dect cea pe care se gsete detectorul pentru creterea
sensibilitii metodei sunt folosite aa numite sfere (1) integratoare ( figura 3). Pereii acestor
sfere sunt cptuiti cu un material cu reflecie difuz ideal aa cum este de exemplu sulfatul
de bariu. Dup reflecii multiple pe aceti perei radiaiia IR ajunge pe detector (5). Chopperul
permite alternativ transmiterea radiaiei prin proba (2) de analizat i ctre peretele din sulfat
de bariu a sferei (1) integratoare. Spectrul rezultat dup scanarea tuturor lungimilor de und
urmrite este reprezentat n coordonate logaritmul inversului valorii gradului de reflexie R
(log 1/R). La rndul lui gradul de reflexie este dat de raportul dintre intensitatea radiaiei IR
reflectate de proba 29) i intensitate radiaiei IR reflectate de peretele de sulfat de bariu a
sferei (1) integratoare.

Fig 3.: Schema de principiu a spectroscopiei IR cu reflexie difuz. 1-sfer integratoare cptu it cu
un strat de cu sulfat de bariu, 2-prob de analizat sub form pulverulent, 3-vas prob, 4,8,9-oglinzi
cu reflecie total, 5-detector, 6-chopper, 7-micromotor electric.

Aparatur folosit n spectroscopia IR

Spectrometre IR dispersive
Spectrometrele IR prezint particulariti importante fa de spectrometrele UV-VIS
proba de analizat fiind plasat imediat dup sursa de radiaie i nu dup monocromator a a
cum este n cazul celor UV VIS.
Acest aranjament este posibil i necesar datorit urmtoarelor:

1. Radiaiile infraroii sunt energetic mai slabe dect cele UV-VIS de aceea nu exist pericolul
afectrii sau chiar a distrugerii probei prin cinetic fotochimic ce poate aprea n timpul
analizelor spectrale.
2. Exist un ctig important de rezoluie spectral datorit faptului c plasarea probei naintea
monocromatorului duce la eliminarea prin acesta radiaiei de dispersie, ce apare n prob n
timpul analizei acesteia.
3. Intensitatea surselor IR i sensibilitatea detectoarelor IR este mai redus dect a
spectrometrelor din domeniul UV-VIS, de aceea cstigul de intensitate a semnalului realizat
cu dublu fascicul este benefic la creterea sensibilitii msurrii.
4. Prezena apei i a bioxidului de carbon influeneaz sensibil determinrile n domeniul
spectral IR doarece ambele absorb radiaie n acest domeniu.
Principiul de funcionare a spectrometrelor IR cu scanare ( figura 4) este cel de
compensaie la zero specific spectrometrelor cu dublu fascicul. Intensitatea radiaiei
luminoase de pe traseul probei (4) etalon este redus prin deplasarea penei (11) pn cnd
valoarea acesteia coincide cu valoarea intensitii radiaiei de pe traseul probei (5) de analizat.
n momentul n care
pe o anumit lungime de und trecut prin fanta (16) i captat de detectorul (17) apare o
diferen de intensitate, unitatea electronic central comand servomotorul ( 12) care coboar
pana (11) n traseul luminos pn cnd cele dou intensiti au valoare egal. Dat fiind faptul
c micarea penei (11) este realizat sincron cu nregistrarea spectral pe ordonat
(transmisie) rezultatul scanrii este un spectru IR n coordonate Transmisie T(ordonat)
lungime de und (abscis).

Fig.4 : Schema de principiu a unui spectrometru cu scanare .1-surs de radia ie IR, 2,3-oglinzi cu
reflexie total, 4- etalon, 5-prob de analizat, 6,7,8,9,10-oglinzi cu reflexie total, 11-pan optic de
atenuare, 12-servomotor de poziionare, 13-moror electric de antrenare, 14-Chopper, 15,16-fante, 17detector, 18-amplificator electronic, 19-unitate electronic central, 20-dispozitiv ATR.

Spectrometre nedispersive cu transformat Fourier (FT-IR)

La spectroscopia cu transformat Fourier intensitatea radiaiei este reprezentat n

funcie de timp. Avantajul acestui tip de spectroscopie rezult din faptul c analiza tuturor
componentelor din spectru se face aproape instantaneu, spectrometrele conin un numr redus
de elemente optice, rezoluia lungimii de und este deosebit de mare, i prelucrare de date este
complet automat. Ideea de baz la un spectroscop IR cu transformat Fourier este aceea de a
prelua simultan n detector semnalul ce conine toate frecvenele spectrului IR eliminnd
scanarea clasic a spectrului de durat lung. Se reuete acest lucru prin transformarea
radiaiei sursei IR de spectru larg, ce are n orice moment aceeai intensitate, cu ajutorul unui
interferometru, ntr-o interferogram care nu este o funcie de frecven ci o funcie de timp.
Dup trecerea radiaiei astfel preparate prin proba de analizat , interferograma este
transformat printr-o operaie matematic , aa numita Transformat Fourier napoi n
spectrogram (domeniu de frecven).
Spectroscoapele cu transformat Fourier au ca element de baz un interferometru
Michelson, figura 5. Radiaia provenit de la sursa de radiaie (1) traverseaz, sau dup caz se
reflect de pe proba de analizat, dup care cade pe oglinda (2) colimatoare i de aici pe
oglinda semitransparent (3) unde este despit n dou fascicule. O parte din radiaie este
reflectat spre oglinda fix (4) i de aici reflectat din nou spre oglinda semitransparent (3) i
dup traversarea ei trece spre detectorul (6). Cealalt parte a radiaiei traverseaz oglinda (3)
i se reflect de pe oglinda mobil (5) napoi pe oglinda (3) de unde este reflectat spre
detectorul de radiaie (6). Trebuie artat c numai jumtate din radiaia iniial emis ajunge
pe detectorul (6), cealalt jumtate (care conine exact aceleai informaii ca i cea care ajunge
pe detector) ajunge napoi la sursa de radiaie infraroie datorit refleciei sau transmisiei
realizate de ctre oglinda semitransparent (3). Dac oglinda mobil (5) i oglinda fix (4) se
gsesc exact la aceeai distan fa de oglinda semitransparent (3) atunci drumul optic
parcurs de cele dou fascicule de radiaie IR este egal. Prin deplasarea cu precizie a oglinzii
mobile (5) cu un drum de maximum /4 a lungimii de und a radiaiei infraroii, drumul optic
parcurs de fasciculul luminos este mai mare cu o valoare de /2 dect drumul parcurs de
cellalt fasciculul ceea provoac scdere de intensitii

celor dou fascicule reunite pe

detector. Deplasarea n continuare spre stnga sau spre dreapta a oglinzii mobile (5) provoac
din nou o defazare i la un moment dat din nou situaia tuturor componentelor n faz. Prin
10

nregistrarea acestor interferene sesizate de detectorul (6) se obine o interferogram (7) care
reprezint defazarea intensitii celor dou semnale n timp.

Fig.5: Schema de principiu a unui interferometru cu transformat Fourier avnd la baz un

interferometru Michelson. 1-surs de radiaie infraroie, 2-oglind colimatoare, 3-oglind
semitransparent, 4-oglind fix, 5-oglind mobil, 6-detector, 7-interferogramm, 8- spectrogram
obinut prin Transformat Fourier.

Spectromicroscoape

Sunt mijloace performante care permit concomitent i n acelai punct analiza

spectrometric IR de emisie sau transmisie combinat cu imagistic video- microscopic n
domeniul IR, cu specificaia c imaginea video nu are culori reale ci pseudoculori obinute
prin alocarea unei culori pentru un anumit domeniu de nivele de gri.
Din punct de vedere constructiv exist dou tipuri de spectromicroscoape IR:

Spectromicroscoape cu spectrometru dispersiv avnd reea de difracie fix i detector

tip Diode Array sau de tip CCD.

Spectromicroscoape cu spectrometru nedispersiv avnd interferometru i interpretarea

datelor prin Transformata Fourier.
In figura 6 este reprezentat schema de principiu a unui spectromicroscop IR echipat cu

spectrometru dispersiv i detector Diode-Array (linie punctat) sau cu un interferometru i

interpretatrea datelor cu Transformat Fourier ( linie plin). Trebuie specificat c asemenea
11

spectromicroscoapele sunt echipate i cu camere video n domeniul vizibil pentru a permite

identificarea i studiul zonei examinate inainte de conectarea emisiei n infrarou.

Fig. 6: Schema optic a unui Spectromicroscopul IR dispersiv i nedispersiv. 1-proba de analizat, 2obiectiv optic, 3,5,6-oglinzi semitransparente, 4-fant optic, 7-surs de radia ie infraroie, 8-sursa
de radiaie vizibil, 9-oglind parabolic, 10,12-colimatoare optice, 11-oglind cu reflexie total, 13detector CCD infrarou, 14-cap optic trinocular, 15- camera video vizibil, 16-ocular, 17-unitate
electronic central, 18-calculator,19- spectrogram infrarou, 20-imagine video-microscopic n
domeniul vizibil, 21-imagine videomicroscopic n infrarou.

12

Spectrul infrarou i coeficientul de absorbie a

cofactorului flavin n ap

1.Introducere
Spectroscopia n infrarou pe flavine i proteinele care conin flavine a ctigat
importan n ultimii ani favorizat de fotochimie. O motivaie puternic a fost descifrarea
mecanismelor a trei familii de flavoproteine :fototropine, criptocrom, i domeniul BLUF.
Aceste proteine acioneaz ca o lumin albastr n multe organisme. n paralel, studiile
teoretice s-au ocupat cu proprietile flavinelor n sol. Aceste studii au avut ca scop o predicie
precis de date spetroscopice n infrarou folosind modele pentru soluie i pentru mediul
proteinei.
Comparaia ntre teorie i practic este complicat de faptul c spectrele experimentale
de flavine n soluie n cele mai multe cazuri sunt reacii induse de diferen a dintre dou
spectre. Aceast comparaie poate fi neltoare deoarece benzile negative se pot schimba sau
disprea dac produsul contribuie cu benzi pozitive la aceiai lungime de und. Unele spectre
de absorbie a flavinelor oxidate au fost determinate n stare solid n KBr i n solu ie de D 2
0 i CHCl 3 . n plus, au fost analizate spectrele a izotopilor marcai i a celor nemarcai n
soluie. Cu toate acestea, spectrul de absorbie n infrarou a oricrui flavin n soluie apoas
nu a fost raportat. Dificultatea nregistrrii spectrului unui flavin n soluie apoas const n
faptul c benzile flavin se suprapun cu o absorbie puternic cauzat de vibraiile apei n
mijlocul regiunii IR la 1644 cm 1 . n particular, poziiile C 2 =O i C 4 =O pot fi detectate
n aceast regiune spectral. O scdere precis a apei este necesar pentru prevenirea
schimbrii benzii.
O valoare important pentru a obine informaii calitative n mecanismele reaciilor,
chiar i la cele mai complexe proteine, a fost transformata Fourier. n schimb, o interpretare
cantitativ a spectrului n infrarou a fost realizat rareori. Un exemplu ar putea fi schimbarea
relativ n structura secundar a proteinelor. n general, condiia necesar pentru analiza
cantitativ este determinarea coeficientului molar de absorbie. Pentru lanurile laterale de
aminoacizi, Venyaminov i Kalnin au raportat o serie de valori. Cu toate acestea, pentru
cofactori, valorile au fost puine.
13

Pentru ambele probe, scderea apei de pe fundalul spectrului i determinarea

coeficienilor molari de absorbie n soluie apoas, a artat c este necesar o grosime a
stratului optic de civa micrometri. Se vor prezenta dou abordri care sunt disponibile la ora
actual. n primul rnd, o celul rezistent la presiuni ridicate, cu grosimea stratului optic de 9
m a fost folosit n transmisie. n al doilea rnd, a fost folosit modul de reflexie total care
ofer o grosime a stratului optic numai n funcie de indicele de refracie a mediului i a
lungimii de und. Ambele abordri au dat rezultate, prima a fost mai exact iar a doua a fost
mai convenabil. Spectrul de absorie a flavinelor n ap inclusiv banda C 2 =O i coeficienii
de absorbie molar au fost obinute pentru prima dat.

2.Materiale i metode
2.1. Chimicale folosite
Sare disodic FAD i FMN au fost obinute de la Sigma Aldrich i folosite fr
purificare suplimentar.
2.2. Transformata Fourier n spectroscopia de absorbie molecular
Spectroscopia FT-IR a fost efectuat pe un spectrometru IFS 66v echipat cu un detector
DTGS cu o rezoluie spectral de 2 cm
1

. A fost nregistrat o gam spectral de 7000-0 cm

. Spectrul de absorbie a fost obinut prin scderea spectrul de ap din spectrul de flavin.

Pentru a avea o lumin constant, a fost folosit o celul rezistent la presiuni ridicate cu CaF
2

. A fost dat de ctre productor o grosime a stratului de 8,7 m i a fost determinat la 8,8

m prin aplicarea numrrii franjurilor. FAD a fost preparat n 10mM soluie tampon de fosfat
de sodiu , 10mM NaCl, pH 7. FMN a fost dizolvat n ap i adus la pH 8 prin adaos de
NaOH. La acest pH, FMN este complet descompus la fraciuni fosfat. Soluia a fost filtrat
naintea utilizrii printr-un filtru de 0,2 m.
2.3. Spectroscopia refleciei totale atenuate
O setare a refleciei totale atenuate (ATR) a fost introdus n spectrometrul FT-IR
echipat cu un cristal de diamant cu noua fee de reflecie active. FAD a fost preparat n ap.
2.4. Determinarea concentraiilor
Pentru determinarea exact a concentraiei de FAD spectrul UV/VIS a fost nregistrat pe
un spectrometru UV-2450. Probele au fost diluate cu ap cu un factor de 1000-2000. Un
14

coeficient de absorbie de 11,300 L mol

cm 1 la 450 nm a fost luat pentru calcularea

concentraiei de FAD din absorban n conformitate cu legea Lamber-Beer.

3.Rezultate
Flavin conine un inel isoalloxazin ca o structur bazic i este difereniat prin
subtituierea poziiei N 10 (Fig. 1).

Fig1. :Prezentare general a compuilor flavin, care difer prin substituirea pozi iei N 10
.Structurile sunt prezentate la pH 8.

Biologic, relevani sunt cofactorii riboflavin, flavin mononucleotid (FMN) i flavin

adenin dinucleotid, n timp ce lumiflavin servete ca model pentru studiile teoretice.
Lumiflavin i riboflavin nu au fost studiate datorit limitei solubilitii. Spectrele FT-IR al
cofactorului FAD i FMN au fost determinate ntr-o soluie tampon apoas. Pentru o scdere
corect a contribuiei soluiei tampon, este necesar o grosime a stratului optic mai mic de 20
m (Fig. 2a). Aceast condiie a fost ndeplinit cu ajutorul unei celule rezistent la presiuni
nalte, care este disponibil n comer. Ca un control al grosimi stratului optic, absorbia
experimental a apei la 1644 cm

a fost cu o precizie de 2% fa de valoarea teoretic

derivat din coeficientul de absorbie de (21,8 0,3) L mol

cm

(Fig.2a). Dup

scderea spectrului soluiei tampon, s-a obinut un spectru a FAD n soluie apoas (Fig.2b).

15

Fig. 2: a) Spectrul n infrarou a FAD la o concentraie de 95 mM n soluie tampon de fosfat, pH 7.

b) rezultatul spectrului de absorbie n infrarou a FAD n soluie apoas.

Spectrul infrarou al FAD sub 1500 cm 1 este complex datorit numrului mare de atomi
inclusiv de fraciuni de adenozin. Ca trsturi proeminente, vibraiile asimentrice i simetrice
de PO 2 - au fost detectate n jurul 1100 cm 1 i 1228 cm 1 . Aceste benzi sunt alocate n
analogie cu cele de adenozin trifosfat. Peste 1500 cm 1 au fost detectate patru benzi 1506,
1547, 1580 i 1626 cm 1 care sunt caracteristice pentru flavin oxidat. Cele mai relevante
benzi au fost la 1657 i la 1712 cm 1 . Ambele benzi sunt puternic extinse prin legturile de
hidrogen din mediul apos.
n FAD, spectrul vibraional al flavin se suprapune cu adenina. Pentru comparaie a fost
determinat spectrul FMN, deoarece la FMN lipsete fraciunea adenozin. n regiunea spectral
1350 cm 1 spectrele se potrivesc n intensitate i poziia benzii scade cu 2 cm

pentru

FMN datorit diferenei substituentului N 10 a isoalloxazinei. O excepie este banda la 1661

cm 1 care este deplasat cu 4 cm 1 n comparaie cu FAD

este

mai

slab

intensitate. Aceast deviaie poate fi atribuit unei absorbii puternice de fraciuni adenozinice
a FAD la 1654 cm 1 asa cum se deduce din spectrul ADP i ATP. Restul de banda de la
1661 cm 1 a FMN a fost atribuit modelului C 2 =O din flavin. Frecvena modelului C 2 =O
16

n ap din orice flavin, nu a fost determinat nainte. ntr-un studiu de rezonan Raman la
FAD o band la o lungime de und mai mare de 1676 cm

a fost repartizat modelului C 2

=O. Cu toate acestea, semnalul a fost mai aproape de nivelul de zgomot. A doua band la
1712 cm 1 la spectrele FMN i FAD sunt atribuite modelului C 4 =O n conformitate cu
rezonanele Raman pe FAD n ap. Sunt evideniate i alte comparaii ntre spectrele FMN i
FAD (Fig.3). Benzile n relief la 979 i 1089 cm

sunt atribuite vibraiilor simetrice i

asimetrice de fosfat, n funcie de modelele similare de [HPO 4 ] 2 la 991 i 1080 cm 1 .

Benzile la 1423, 1481 i 1605 cm 1 sunt prezente doar n spectrul FAD. Prin urmare, aceste
benzi provin din resturile adenozin din spectrele ADP i ATP.

Fig. 3: Spectrul IR a FMN de concentraie 65 mM n ap, la pH 8 nregistrat cu o celul de

debit.

Grosimea stratului optic al celulei de debit permite i o analiz cantitativ a spectrului

infrarou. Cea mai proeminent band la 1547 cm 1 a FAD a fost selectat pentru analiz.
Absorbia la aceast lungime de und a fost trasat la diferite concentraii ale FAD ( Fig. 4).
Panta regresiei liniare i randamentul coeficientului de absorbie molar sunt n conformitate
cu legea Lambert-Beer. Acordul ntre potrivire i datele experimentale cu R 2 -0,999
demonstreaz aplicabilitatea legii Lambert-Beer n acest interval de concentraii.
Lund n considerare o limit de precizie 2 n determinarea grosimii stratului optic a celuli
de debit, coeficientul de absorbie la 1547 cm 1 a FAD n ap a fost determinat la (2200
50) L mol 1 cm

. O valoare de referin pentru orice band de vibraie a flavin n orice

mediu,nu a fost gsit n literatur. Coeficientul de absorbie este dependent de limea benzi
de analizat.

17

n a doua abordare, FAD a fost analizat la o serie de concentraii diferite cu ajutorul

ATR. n comparaie cu setrile celulei de debit, setrile ATR sunt disponibile n laboratoare i
mai uor de aplicat.
Adncimea penetrrii d

este definit ca fiind distana de la care intensitatea indicelui

scade cu 1/e.

Fig.4: Absorbia IR a FAD la 1547 cm 1 obinut la concentraii diferite.

De aceea, adncimea stratului de penetrare la o anumit lungime de und este constant

pentru concentraii diferite ale soluiilor i ar putea permite o determinare direct a
coeficienilor de absorbie. Spectrul FAD nregistrat n ATR apropiat este asemntor cu
setrile transmisiei (Fig. 5a). Absorbia la 1547 cm 1 versus concentraia arat o dependen
liniar, cel puin la concentraii mai mari de 40mM (Fig. 5b). Pentru ob inerea efectiv a stratului
optic, absorbana apei la 1644 cm 1 , cu un coeficient de absorbie cunoscut de 21,8 L mol
1

cm

a fost obinut ca rezultat n d e - 6,2 m. Dac lungimea de und depinde de adncimea stratului

de penetrare, este luat n considerare o valoare corect a d

e e

- 6,2 m X 1644 cm 1 / 1547 cm 1

-6,6 m ete obinut la 1547 cm 1 . Acest calcul este valabil deoarece indicele de reflec ie al apei la
aceeai lungime de und este acelai. Din panta de regresie liniar i grosimea stratului optic la 1547
cm 1 s-a calculat un coeficient de absorbie de 2100 L mol

cm 1 . Aceast valoare este n acord

cu ce s-a obinut n configurarea transmisiei cu o deviaie static de R 2 -0,991 (Fig. 5b).

18

Fig.5: a) Spectrul IR al

FAD nregistrat n configuraia reflec iei totale atenuate la

concentraiile indicate dup scderea contribuiei apei. b) Regresia liniar a absorban ei la 1547 cm
1

4. Discuie
4.1. Analiza vibraiilor carbonil
n experimentele anterioare, spectrele infrarou de flavin oxidate au fost obinute n ap
prin spectroscopie, diferena fiind reaciile redox induse. Poziia celor mai proeminente
19

grupri apar n Fig. 2 i 3, cu toate acestea, n special poziia carbonil de pn la 13 cm 1 .

Abaterile sunt datorate schimbrii efectului de spectroscopie diferit pe benzi late de
compensare, cu ajutorul contribuiei reduse a flavinului. ntr-o alternativ mai apropiat, cu un
efect mai slab, Nishina a folosit

13

C/ 18 O izotopic, pentru a genera o diferen a spectrului

de vibraiile carbonil la FAD n D 2 O. Vibraiile carbonil au fost amplasate de la 1643 i 1700

cm 1 , prezentnd astfel o coborre de la N 3 de 18 i 12 cm 1 , respectiv, n comparaie cu
cele n ap (Tabelul 1).
C 2 =O are o puternic dependen cu solventul, ca demonstraie anterioara n DMSO la 15
cm 1 pn la 1676 cm 1 pentru riboflavina i la 1678 cm 1 pentru lumiflavin . Acest
comportament este n concordan cu C 4 = O care prezint frecvene similare n DMSO,
comparativ cu 1712 cm 1 n ap. Aceste observaii contradictorii necesit o analiz
suplimentar teoretic. Pentru informaii structurale privind gruprile flavin n proteine,
vibraiile carbonil au fost folosite ca i marcatori senzitivi care indic puterea de lipirea de
hidrogen i distribuia densitii electronilor. Dar aceste abordri au ntampinat unele limitri.
n prima abordre Flavin a trebuit s fie obligatoriu descompus. A doua abordare care
utilizeaz spectroscopia Raman poate rezolva doar modul C 4 = O . Dificultatea n detectarea
modului C 2 =O n experimentarea punctelor Raman are o polaritate sczut, prin urmare o
seciune transversal redus. Aceast observaie este n concordan cu intensitatea integral
proeminent a benzii n infrarou, ~ 1,8 ori fa de cea a modelul C 4 = O (Tabelul 1).

Tabelul 1: Poziiile benzii FT-IR a FAD i FMN oxidate n ap.

Ambele modele sunt accesibile la repartizarea prin spectroscopie n infrarou n ap, folosind
13

C ale flavoproteinelor. Vibraii carbonilice au fost determinate la 1670/1713 cm 1 pentru

un senzor de lumin albastr utiliznd domeniul FAD (Bluf) i 1677/1711 cm 1 pentru o

lumin-, oxigen-, sau tensiune sensibil . Din nou, modelul C 2 =O prezint o caracteristic
mai puternic schimbatoare n comparaie cu apa dect modelul C 4 = O . Un studiu sistematic
al dependenei sale este necesar n colaborare cu evaluarea disponibil structural X-ray i o
20

comparaie cu calculele teoretice. Rezultatele sistematice ar putea fie aplicabile n viitor

pentru a deduce n mod direct micromediul obligatoriu de flavoproteina dat de frecvenele
carbonil.
4.2. Comparaia cu teoria
Pentru o misiune final a benzilor enumerate n tabelul 1 i etichetate n Fig. 2 i 3 a
modurilor normale de Flavin n ap, teoria tratamentului trebuie s fie mbunt it n
continuare. n scopul de a atribui n condiii de siguran toate benzi relevante, abaterile n
poziiile lor spectrale ar trebui s fie mai mici dect distana medie a maximelor benzilor. Cele
mai multe studiile teoretice s-au folosit de compusul lumiflavin, neglijnd cuplarea
substituentuli de la N 10 . Mai mult dect att, legturi intramoleculare de hidrogen, cum ar fi
ntre restul de ribityl i izoalcanii de N 1 au fost omii. Aceste legturi de hidrogen ar putea
exercita un efect puternic asupra calculelor rezultate, aa cum a fost demonstrat pentru
spectrele de fluorescen a riboflavinei. Recent, mai multe modele au fost accesibile, cum ar fi
riboflavina , 10 - glicerinlflavina, i chiar i FAD , dei cele mai multe dintre ele fara a lua n
considerare posibilele legturi intramoleculare de hidrogen. Progresele nregistrate n
metodele de calcul i de vitez va permite un calcul a valorilor normale a modurilor de FMN
i FAD, la un nivel mai ridicat de precizie.
O alt problem este cea a mediului, care apare adesea pentru a simplifica lucrurile.
Studiile mai avansate au luat n considerare modelul polarizat continuu i / sau mai puine
molecule de ap pentru a imita pe baz de hidrogen mediul. Un studiu recent promi tor a
rezolvat spectrul infrarou de lumiflavin n ap, mediu folosind un cuantum combinat
mecanic / molecular mecanic. Rezultatele sunt ntr-un acord rezonabil cu experimentul nostru
cu abateri de 1-18 cm 1 pentru cinci benzi selectate de marcare (Tabelul 1). Trebuie
menionat faptul c, din cauza de o lips de date experimentale adecvate la acel moment,
autorii au folosit o frecven C 2 =O de 1670 cm 1 n loc de 1661 cm 1 1 pentru
compararea lor.Pentru alte mbuntiri, un model mai bun de ap MM trebuie s fie
dezvoltate.

4.3. Coeficienii de absorbie i aplicarea lor

21

Banda de 1547 cm 1 a fost selectat pentru determinarea coeficientului de absorbie

pentru c fraciunea adenozin de FAD nu absorbe n acest domeniu spectral . Depentena slab
asupra mediului este exemplificat de diferena de spectrul FAD obligat s planteze
Cryptocrom . Acolo, valorile se afl de la 1545 cm 1 i FWHM a fost determinat la 14,8
cm 1 (datele nu apar pe site), care este foarte similar cu FWHM de FAD n ap de 14.2 cm
1

. n concluzie, este plauzibil s-i asume o valoare similar a coeficientul de absorb ie n

mediul de proteine. Coeficientul de absorbie de 2200 L mol 1 cm 1 pentru 1547 cm 1

band de FAD poate fi acum utilizat pentru a obine partea superioar i parte integrant,
coeficienii de absorbie pentru alte grupe importante (Tabelul 1). Valorile de referin pentru
coeficienii de absorbie i mai ales integrate, sunt rare n literatura de specialitate. ntr-o
comparaie a integralei coeficienilor de absorbie a vibraiilor carbonil Flavin de 21.000 i
12000 L mol 1 cm 1 la cele de acid aspartic i glutamic cu 20500 i 18.000 L mol
1

cm

i cu cele ale asparaginei i glutamina cu 13500 si 15500 L mol 1 cm 1 reiese c toate

aceste valori sunt similare ntr-o grupa. Pe de alt parte, coeficientul de absorbie integral a
Flavin la 1547 cm 1 , cu 50000 L mol 1 cm 1 este mai mult dect de dou ori mai mare
ca toate contribuiile posibile din lanurile de amino-acizi n afar de partea la fel de puternic
ca (CO) de glutamat cu 35500 L mol 1 cm 1 .
Disponibilitatea coeficienilor de absorbie permite cuantificarea randamentelor de
reacie din spectrul infrarou diferena dintre flavine si flavoproteinele. Semnalul infrarou
diferit poate fi evaluat cu privire la o modificare a concentraiei n funcie de A / A = C / C cu
ajutorul coeficientului de absorbie Flavin dat aici. Concentraia total C de Flavin oxidat,
nainte de reacie, poate fi determinat independent de spectroscopie UV / VIS privind celula
infrarou cu grosimea stratului optic

d. Pentru determinarea A n diferena spectrului

infrarosu, o band trebuie s fie selectat dintre care limea trebuie sa fie suficient de mic i
diferena de frecven la cel mai apropiat produs ce permite o separare clar.
4.4. Evaluarea abordrii ATR
n general, abordarea ATR este avantajoas pe transport cu privire la manipularea uoar
a experimentului. Cu toate acestea, dependena lungimii de und a adncimii de penetrare
distorsioneaz spectrulul de frecvene i o evaluare cantitativ necesit o etalonare cu un de
coeficient de absorbie cunoscut. n ciuda tuturor acestor dificulti, coeficientul de absorbie
determinat apare cu o precizie n limita de 5%. Chiar i valorile pentru vibra iile fosfat de la
22

1228 cm 1 i vibraiile carbonil de la 1712 cm 1 sunt n concordanta ntre ATR i modul

de transmitere, dup corecia pentru lungimea de und dependent. Ar trebui remarcat faptul
c, n regiuni ale dispersiei anormal de puternic aceasta corecie nu este aplicabil. ntr-o
reevaluare, precizia n ambele abordri este n principal limitat de determinarea grosimii
stratului optic. O alt mbuntire ar necesita o variaie sistematic a grosimii stratului optic
de a urma o evaluare statistic.

5. Concluzii
Specrul IR al FMN i FAD n ap a fost determinat pe un domeniu spectral larg de la
920-1800 cm 1 . Comparaia direct a celor doi derivai disponibili a permis identificarea
contribuiei fraciunii adenozin din FAD. Vibraiile carbonil a flavin au fost caracterizate
pentru prima dat cu privire la poziia benzii, limea, coeficientul de absorie i dependena
de solvent.
Acest studiu s-a axat pe studiul folosirii unei celule de transmisie cu grosimea stratului
optic mai mic de 10 m. Aceast aplicaie a facilitat determinarea coeficientului de absorbie
n ap. Comparaia direct cu spectrul obinut cu o celul ATR a permis determinarea
coeficientului de absorbie folosind ATR. Rezultatele indic faptul c abordarea ATR poate da
rezultate cantitative corecte, dei cu o precizie mai sczut dect prin transmisie.
Dou aplicaii sunt greu de crezut c sunt bazate pe rezultatele prezentate. n primul
rnd, o reprezentare teoretic corect a spectrului FMN sau FAD n ap necesit rezultate
experimentale pentru evaluarea corectitudinii poziiei benzii vibraionale i a limii acesteia.
Aceasta nseamn c n acest articol s-a oferit pentru prima dat spectrul de referin necesar
pentru ap. n al doilea rnd, problema randamentului de reacie a flavinelor i
flavoproteinelor n spectroscopia IR poate fi acum abordat folosind coeficientul de absorbie
determinat n acest articol.

23

Bibliografie
1. Gutt G.,Analiz instrumental-spectroscopie, Suceava,Editura Universitii tefan
cel Mare Suceava,2005;
2. Gutt S., Analiz instrumental, Suceava,Editura Universitii tefan cel Mare
Suceava,1997;
3. Luca C.,Duca Al.,Crian I.Al.,Chimie analitic i Analiz instrumental, Bucureti,
Editura Didactic i Pedagogic, 1983;
4. Meike Spexard, Dominik Immeln, Christian Thing, Tilman Kottke, Spectrul
infrarou i coeficientul de absorbie a cofactorului flavin n ap, Germania,2011;
5. www.sciencedirect.ro
6.

www.regielive.ro

24