LP 1

Tehnicile generale de laborator:

- calitative [raspunsul e intotdeauna prezent/absent]
- cantitative [unitate de masura, ex: ELIZA]
Diferenta intre tehnica sensibila si specifica:
sensibila tehnica care are foarte putine rezultate fals negative
[selecteaza o cantitate mare de rezultate potentiale]; nu e niciodata
diagnostica; se foloseste in screening ce sa cuprinda o cantitate cat
mai mare de indivizi
specifica are rezultate fals pozitive putine; se foloseste pentru
diagnostic [confirma rezultatele, dupa screening]
ex: frotiul Papanicolau tehnica sensibila, daca este pozitiv nu e cancer
neaparat; tehnica specifica este biopsia, care confirma diagnosticul
Reactiile serologice
- simple si complexe
- simpla nu e nevoie sa mai adaugam nimic in reactie
- complexa tb adaugat un marker pentru a vizualiza reactia
1. Reactiile simple sunt 2 importante: aglutinarea si precipitarea
a)
- Ag sau Ac sunt fixate pe o particula, iar perechile sunt libere in solutie
[dizolvate]
exista 2 reactii importante de aglutinare:
tehnica LATEX se foloseste pentru determinarea factorului
reumatoid; astazi este folosita pt diagnosticul bacteriologic rapid
- pe suprafata particulei de latex e situat Ac impotriva bacteriei pe care
vrem sa o determinam
- peste latex se adauga produsul biologic
- la reactia Ag-Ac are loc aglutinarea particulelor de latex in mase
vizibile cu ochiul liber [adica in produsul biologic exista bacteria]
- tehnica de confirmare este cultura
- poate fi folosita si pentru identificarea Ac

 testul COOMBS se foloseste pentru detectia Ac antieritrocitari care

determina anemiile hemolitice autoimune
- Ac antieritrocitari pot fi fixati pe suprafata hematiilor [acestia se
determina prin testul Coombs direct] sau pot fi liberi, circulanti in ser
[Coombs indirect]
Coombs direct
- se recolteaza de la pacient sange pe anticoagulant, apoi se separa
hematiile prin centrifugare
- se presupune ca hematiile ar avea pe suprafata Ac antieritrocitari
- acestea se pun in contact cu ser SAG [anti-gama-globulina umana
polispecifica], indreptat impotriva tuturor claselor de Ac
- daca hematiile au pe suprafata Ac, adaugarea SAG duce la aglutinare
[Coombs +]
- daca nu sunt prezenti Ac pe hematii, gelul ii opreste si aglutineaza in
gel [Coombs -]
a doua etapa se repeta testul cu hematiile, punandu-le in contact cu
SAG monospecific [anti-IgG, anti-IgM etc], doar daca polispecific e
pozitiv
a treia etapa testul Coombs poate fi si cantitativ = determinarea titrului
Ac antieritrocitari prin dilutii progresive ale cantitatii de hematii: cu nr
mare dilutia la care apare aglutinarea reprezinta titrul Ac
a patra etapa determinarea amplitudinii termice a Ac [anemiile
hemolitice pot aparea la cald sau la rece]
- la cald: temperatura corpului 37 grade celsius, hemoliza continua
[cronica]
- la rece: 2 situatii: 22 grade celsius, 4 grade celsius; anemia apare in
pusee [expunere la frig]
testul se face in triplicat: hematiile se pun in 3 tuburi deodata;
- primul tub se baga la incubator 37 grade celsius
- al doilea tub se lasa pe masa 22 grade celsius
- al treilea tub se baga la frigider 4 grade celsius [poate sa apara chiar la
toate trei!]
tratamentul pacientului este complet diferit in functie de amplitudinea
termica a Ac

b)
- atat Ag, cat si Ac sunt solubile
- la intalnirea dintre Ag si Ac precipita intr-o masa solida
- exista 2 tehnici
dubla imunodifuzie [DID] tehnica calitativa
- identificare Ag, Ac
- in godeul central Ac impotriva Ag de identificat
- in unul din godeurile periferice Ag de laborator
- in celelalte godeuri serurile pacientilor
- daca apare arc de precipitare => exista Ag
imunodifuzia radiala simpla [IDR]
- de obicei se face in continuarea IDD pentru determinarea titrului
- Ac anti-Ag e distribuit uniform in placa
- in godeuri seruri de pacienti in care sigur e prezent Ag
- Ag difuzeaza circular in jurul godeului
- se masoara fie diametrul, fie raza
- se raporteaza la curba de calibrare
Alte tehnici de precipitare:
- imunelectroforeza determina cantitatea de Ig din fiecare clasa
- imunofixare se foloseste pentru evaluarea Ac monoclonali
2. Reactii serologice complexe
- folosirea unui marker
in functie de marker, avem:
- tehnici de imunofluorescenta
- tehnici enzimatice EIA [enzyme-imuno-assay]
- izotopii radioactivi => tehnici RIA [radio-immuno-assay]
- luciferina [din licurici] => tehnici de chemiluminiscenta
a) Imunofluorescenta
- substantele folosite pt marcaj: substante fluorescente: fluoresceina
[verde], rodamina [rosie], fluorocromi [alte culori]
- fluorescenta se emite la iradiere cu raze UV: lampi UV si camp
intunecat pentru contrast
- e o tehnica calitativa, insa e inalt specifica se foloseste pt
confirmarea diagnosticului

- directa identifica antigene

- indirecta identifica anticorpi
Imunofluorescenta directa
- Ag de determinat se fixeaza pe o lama
- peste Ag se adauga Ac marcat fluorescent [specific pt Ag respectiv]
- urmeaza spalarea daca Ag era prezent pe lama, Ac s-a fixat si el si
nu se spala; ne uitam la microscop; daca apare fluorescenta => exista
Ag
- se foloseste in dg bacteriologic
- fiind specifica, se foloseste pt diagnostic, doar ca se foloseste pt
bacteriile care nu cresc in cultura [ex: chlamydia sau mycoplasma]
- se mai foloseste in dg oncologic al Ag tumorale e atat de specifica
incat nu se accepta dg oncologic fara aceasta tehnica =
imunohistochimie [nu se poate examen extemporaneu fara
imunohistochimie] = biopsia de tesut, urmata de fixare pe lama; se
presupune ca are Ag, se pun Ac marcati fluorescent => pune dg de
certitudine dar arata si unde e localizat Ag in tesut [deasupra sau sub
membrana bazala, cu potential metastazant]
Imunofluorescenta indirecta IFI
- identifica prezenta Ac prin tehnica sandwich
- se pune pe o lama se fixeaza Ag cunoscut impotriva caruia vrem sa
vedem daca avem Ac
- peste lama se adauga serul pacientului presupus a contine Ac
- se incubeaza
- adaugam un reactiv: SAG polispecific marcat fluorescent
- iar incubare
- spalare
- analiza microscopica: nu exista Ac -> nu se fixeaza SAG [s-a spalat];
daca exista Ac, SAG apare fluorescent
b)
-

tehnica RIA
markerul folosit e un izotop radioactiv [radioactivitatea se masoara]
e o tehnica cantitativa si inalt specifica
se poate face competitiv pentru determinarea Ag si necompetitiv
pentru determinarea Ac

RIA competitiv:
- Ag se pune in contact cu Ag cunoscut in cantitate cunoscuta si cu Ac
cunoscuti
- se formeaza 2 tipuri de complexe Ag-Ac
- intre Ag de determinat si Ag cunoscut [marcat radioactiv] exista
competitie pentru legarea Ac si se masoara radioactivitatea
amestecului
- daca nu exista AgX, tot AgA se leaga de Ac => radioactivitate 100%
- cu cat AgX creste, disloca AgA* si radioactivitatea scade direct
proportional cu cantitatea de AgX [poate scadea pana la 50%] => se
determina titrul
(tehnica e automatizata)
RIA necompetitiv: prin metoda sandwich:
- avem Ag cunoscut, se pune in contact cu produsul biologic
[presupusul Ac] + ser SAG marcat radioactiv
- se masoara radioactivitatea amestecului direct proportional cu
cantitatea de Ac
- tehnica RIA e o tehnica dificil de efectuat din cauza expunerii la
izotopi radioactivi [masuri de protectie] + substante marcate cu izotop
radioactiv sunt extrem de instabili [timp de f scurt] deci trebuie
reinnoiti mereu
- folosita doar in cercetare
c) tehnicile EIA
- identice cu tehnicile RIA ca principiu, doar ca marcajul se face
enzimatic + etapa suplimentara in care se adauga substratul enzimei
[se obtine o reactie de culoare care se citeste spectrofotometric]
- cantitativa siinalt specifica, doar ca e foarte laborioasa [2-3 zile]
d) chemiluminiscenta
- EIA tinde sa fie inlocuita de chemiluminiscenta in care marcajul se face
cu luciferina: emisia de lumina se masoara [cantitativ] => identica cu
RIA si nu necesita etapa suplimentara ca si EIA