fac att n aerobioz, ct i n anaerobioz, urmnd s se identifice microorganismele izolate.

1.4.2.5. Recoltarea lichidului cefalorahidian (LCR)

Examinarea bacteriologic a lichidului cefalorahidian este una din cele mai urgente
probe de microbiologie clinic, dat fiind gravitatea deosebit a meningitelor. Acest examen
se practic ori de cte ori este prezent un sindrom meningian sau chiar o stare de intoxicaie
grav.
Infecia LCR i a membranelor meningiene (meningita), cu interesarea eventual a
creierului i a mduvei spinrii (meningoencefalita), apare ca o consecin a variate situaii:
invazia meningelui, pe cale hematogen, de ctre bacteriile, virusurile sau fungii prezeni n
diferite focare infecioase de vecintate sau de la distan, ori introducerea din exterior a
germenilor patogeni n mod accidental.
Recoltarea se execut la patul bolnavului (fig.24 a i b) de ctre medicul clinician, n
condiii de absolut sterilitate, dup tehnica bine cunoscut. Datorit presiunii crescute a LCR
n meningite, acesta poate fi recoltat direct pe ac n eprubete sterile.
Aspectul lichidului orienteaz medicul clinician spre operaiunile de urgen i spre cele
ulterioare. Lichidul normal este limpede ca apa de stnc.

Fig. 24 a

Fig. 24 b

n afar de acest aspect, care nu nseamn neaprat normalitate, se poate constata, n

funcie de agentul etiologic, aspectul de:
- lichid clar, incolor (fig. 25-A); tulbure (fig. 25-B), coninnd snge (fig. 25-C);
- lichid hemoragic (fig. 26): al crui supernatant este limpede (hemoragie prin
atingere accidental a vaselor); al crui supernatant este colorat (hemoragie
subarahnoidian);
- lichid xantocromic (colorat glbui); opalescent, tulbure (purulent) (fig.27).

Fig. 25

Fig. 26

Fig.27

n cazul unui lichid tulbure, se va proceda la o nsmnare la patul bolnavului a 0,2

0,5 ml LCR n tuburi cu diferite medii sau se va transporta imediat flaconul cu LCR la
laborator, meninndu-se la temperatura de 37 0C. Laboratorul va continua explorarea.

1.4.2.6. Recoltarea exsudatelor i transsudatelor din seroase

(lichide pleurale, peritoneale i articulare)
Exsudatele i transsudatele cavitilor nchise reprezint reacia de tip inflamator sau
neinflamator a seroaselor respective fa de anumii excitani, ducnd la acumularea de lichid
ntre membrana visceral i cea parietal.
Prelevarea lichidelor amintite se efectueaz n mod obligatoriu prin puncie cu seringa,
n condiii de asepsie foarte riguroas. ntruct n aceste produse se gsesc adeseori bacterii
anaerobe, se vor lua msuri ca lichidele s nu vin n contact cu aerul (seringa s nu conin
bule de aer), iar pentru nsmnarea n condiii anaerobe este indicat transportul acestora n
seringa folosit pentru recoltare, cu acul nfipt ntr-un dop de cauciuc steril.
1.4.2.7. Prelevarea secreiilor purulente din coleciile deschise
Secreiile purulente rezultate din infeciile pielii i din plgile de diferite categorii
(traumatice, chirurgicale, arsuri), conin ageni microbieni foarte diferii, adeseori, n asociere.
Astfel, bolile pielii i esuturilor subiacente sunt dominate de piodermitele stafilococice
(foliculite, hidrosadenite, panariii, furunculoze etc.) i streptococice (impetigo, panariii,
ectime etc.), singulare sau n asociere. Alte infecii, subacute sau cronice, ale pielii sunt
cauzate de variate bacterii patogene.
Prelevarea se poate face n orice unitate sanitar dac examenul se limiteaz la
bacterioscopie. n general, recoltarea se face, ns, n scop de cultivare. Din coleciile
purulente relativ profunde, neabcedate, prelevarea se face prin puncie, dup aseptizarea
regiunii respective. n cazul plgilor profunde, insuficient drenate, fistulizate, se recolteaz
produsul de la baza leziunii, n sering sau n tuburi. Din leziunile cutanate superficiale
nchise (vezicule, pustule, furuncule) se indic prelevarea prin puncionare cu pipeta Pasteur
(flambat i rcit), dup aseptizarea regiunii cu alcool i apoi splare cu ser fiziologic steril.
n unele situaii, se iau msuri de recoltare n vederea izolrii bacteriilor anaerobe.
1.4.2.8. Probe de exerez chirurgical i necroptice
Examenul microbiologic al acestor probe poate constitui, n unele cazuri, singurul
mijloc de diagnostic etiologic al unei infecii. Eficacitatea acestui examen depinde de
respectarea unor condiii, dintre care mai importante sunt: recoltarea unei probe din zona
implicat n procesul infecios; evitarea contaminrii produsului n cursul recoltrii; efectuarea
necropsiei n primele 6 ore dup deces; efectuarea nsmnrilor pe o varietate mare de
medii.
Se recolteaz prin puncie-biopsie: esut ganglionar, medular, hepatic, pulmonar etc. n
caz de necropsie, se recolteaz snge din inim, organe, esuturi i colecii purulente.
Deoarece n astfel de produse se gsesc frecvent bacterii anaerobe, este recomandabil
recoltarea pentru anaerobioz i, pe ct posibil, nsmnarea pe loc.

1.5. METODE DE IZOLARE I DE IDENTIFICARE A BACTERIILOR

1.5.1. Cultivarea
-

Etap principal n stabilirea unui diagnostic etiologic, cultivarea bacteriilor include:

nsmnarea prelevatelor;
examinarea coloniilor (culturilor) i repicarea lor n vederea identificrii.

1.5.1.1. nsmnarea prelevatelor

Izolarea agenilor microbieni dintr-un prelevat sau a unei bacterii cu potenial patogen
dintr-un produs pluricontaminat izolare numit i cultur primar este hotrtoare pentru
diagnostic cnd rezult din produse normal lipsite de microorganisme (LCR, snge, lichide
pleural, peritoneal, articular) sau are valoare orientativ mare cnd provine din produse n
care predomin flora bacterian comensal (tract respirator, digestiv etc.).
n scopul izolrii bacteriilor, se practic nsmnarea prelevatelor pe medii de cultur
potrivite, la suprafaa sau n profunzimea acestora.
nsmnarea primar necesit medii cu potenialitate deosebit, care s permit
dezvoltarea unei mari varieti de bacterii, iar inocularea trebuie executat n aa fel nct s
obin o cultur reprezentativ pe medii lichide i colonii izolate pe medii solide.
O colonie reprezint o populaie bacterian, omogen, provenit dintr-o singur celul.
Genetic, aceast populaie reprezint o clon. Prelund cu ansa bacteriologic o singur
colonie i nsmnnd-o pe un alt mediu de cultur adecvat repicare se obine o cultur
pur, care poate fi studiat n continuare n vederea identificrii.
nainte de inoculare, mediile se prenclzesc, operaie care este absolut obligatorie
pentru bacteriile termosensibile ca neisseriile patogene, pneumococi, haemophili etc.
Inocularea se execut cu ansa, tamponul sau cu pipeta Pasteur. Ansa este mai
frecvent utilizat pentru inoculare. Se depune inoculul pe un sector limitat al plcii Petri, cu
ansa, cu tamponul pe care s-a fcut prelevarea sau cu pipeta Pasteur. Apoi, cu ansa
sterilizat i rcit se disperseaz inoculul pe aproximativ o treime din suprafaa plcii
(fig.28 sector 1). Se flambeaz ansa i apoi se fac striuri perpendiculare pe primele i
pornind de la aceasta (fig.28 sector 2), dup care se flambeaz din nou i se continu
dispersia n striuri pe restul suprafeei plcii (fig. 28 sector 3).

Fig. 28 Sensul micrii ansei (1, 2, 3, sectoarele de dispersie)

Dac inoculul nu este prea bogat, se poate proceda la dispersia continu n striuri
perpendiculare, fr flambarea intermediar a ansei, pn la epuizarea inoculului. Astfel se

vor obine colonii izolate (fig. 29).

Fig. 29 Colonii izolate din care se va face repicarea pentru subcultur

n afara depunerii inoculului pentru o ulterioar dispersie cu ansa, nsmnarea cu

pipeta Pasteur este indicat pentru inocularea n serie a tuburilor cu medii lichide sau solide
nclinate.
nsmnarea direct cu tamponul se practic pentru unele produse, cnd acestea se
inoculeaz pe geloz nclinat (fig. 30) sau pe medii de conservare (fig. 31).
nsmnarea n profunzime a mediilor solide se poate face prin nepare cu o ans
bacteriologic dreapt sau prin nglobare n mediu topit, pentru: cercetarea mobilitii
bacteriilor, a unor proprieti biochimice, cultivarea anaerobilor (vezi diagnosticul infeciilor cu
anaerobi).

Fig. 30

Fig. 31

1.5.1.2. Examinarea culturilor

Mediile de cultur nsmnate, dup incubare la 37C, se examineaz sub aspectul
dezvoltrii coloniilor pe mediile solide i a caracterelor de cultur pe mediile lichide.
Perioada de incubare obinuit este peste noapte, dar n cazul mediilor selective, se
va prelungi la 48 ore i la 5 zile pentru bacteriile cu dezvoltare lent (haemophil, meningococ,
gonococ, yersinia etc.). Urmrirea plcilor incubate anaerob, se va face la 24-48-92 ore;
pentru plcile Sabouraud 2-5 zile, iar pentru mediul Lwenstein 5-8 sptmni.
Se noteaz aspectul culturii, numrul i felul coloniilor pe diferite medii; chiar i
absena creterii pe un anumit mediu poate s constituie un factor relevant.
Caracterizarea culturilor n medii lichide
Gradul dezvoltrii: absent, srac, moderat, abundent.
Turbiditatea - absent sau prezent: moderat, intens, uniform, granulat, floconar;
majoritatea bacteriilor tulbur uniform mediul; altele se sedimenteaz i supernatantul rmne
limpede.
Depozitul - absent sau prezent: puin, abundent, granular, floconar.
Creterea la suprafa - absent sau prezent: cu inel sau pelicul subire sau groas.
Culoarea - absent sau prezent: verde (pentru bacilul piocianic).
Mirosul - absent sau prezent: aromat (piocianic), fetid (anaerobi).
Aspectul culturilor pe medii solide
Pentru descrierea aspectului culturii sau a coloniilor pe plci, se vor nota cel puin o
parte din urmtoarele caracteristici (fig.32):
- relieful: turtit sau bombat, redus, pronunat, ombilicat, cu suprafa neted sau
rugoas, mucoid;
- conturul: bine delimitat, circular, dantelat, cu prelungiri;
- opacitatea: transparente, translucide, opace;
- culoarea: alb, pigmentare aurie, rou etc.
- consistena: mucoas, untoas, friabil, cremoas;
- suspendarea n ser fiziologic: omogen sau granular.
n funcie de aceste caracteristici, se deosebesc dou tipuri de colonii:
colonii de tip S (smooth = neted) cu suprafa bombat, neted, lucioas, contur
bine delimitat, consisten cremoas, uor emulsionabil;
- colonii de tip R (rough = rugos), cu suprafaa turtit, neregulat, contur crenelat,
uscate, cu suspensii granulare.
-

Importana diagnostic a acestor aspecte este dat de faptul c majoritatea speciilor

patogene se dezvolt sub form de colonii S. Excepie fac bacilul difteric, crbunos i bacilul
tuberculozei, care se izoleaz de la bolnavi i sunt patogene n forma R.

Fig. 32 Aspectul coloniilor pe medii solide (mrime normal).

(A) Staphylococcus epidermidis pe agar nutritiv; (B) Streptococcus faecalis pe agar lactozat cu
indicator rou neutru (colonii punctiforme); (C) Shigella sonnei pe agar nutritiv (colonii S i R);
(D) Klebsiella pneumoniae pe agar nutritiv lactozat (colonii mucoide datorate produciei
viguroase de polizaharide capsulare).

Alte caracteristici
Pe plcile de snge se urmrete tipul hemolizei: alpha, beta i gamma; precum i
raportul dintre aria de hemoliz i mrimea coloniei (plana II-3).
Pe mediile difereniale i selectiv-difereniale se apreciaz frecvena coloniilor
lactozopozitive sau lactozonegative (plana II-4).
Repicarea coloniilor bacteriilor potenial patogene, dup aspectul coloniei, natura
prelevatului, rezultatele examenului bacterioscopic, cu scopul de a obine culturi pure, este
obligatorie. Aceast repicare se recomand a fi fcut cu ansa n form de bucl fin (sau fir
de ans fr bucl), astfel nct 1/2 din colonie s fie trecut pe mediul de repicare, iar
cealalt jumtate pe frotiu, operaie necesar pentru antibiogram i, mai ales, pentru
identificare.

1.5.2. Principalele metode de identificare a agentului etiologic

Scopul final al examinrii oricrui prelevat este identificarea agentului etiologic, care n
unele situaii se poate realiza pe baza datelor oferite de caracterele morfotinctoriale i cultur.
n cele mai multe cazuri este nevoie de completarea informaiilor amintite cu cele oferite de:
- caracterele metabolice generale (de gen) i particulare (de specie);
- caracterele antigenice;
- caracterele proprietilor de patogenitate ale bacteriei n cauz.
1.5.2.1. Teste metabolice de identificare
n investigarea proprietilor metabolice, accentul este pus pe cele generale: catalaza,
oxidaza, testele de fermentare-oxidare (F-O) ale glucozei i producerea de gaz. Pentru
determinri suplimentare se mai folosesc i alte teste.
Catalaza
Catalazele sunt enzime care catalizeaz descompunerea apei oxigenate n ap i
oxigen:

2H2O2 + catalaz 2H2O + O2

Testul este pozitiv dac bacteriile au metabolism oxidativ, i se execut prin
descompunerea pe suprafaa culturii a soluiei reactiv (hidrogen peroxid H 2O2 15%), fie n
tubul cu cultur, fie ntr-o suspensie de cultur pe lam. Apariia bulelor de gaz denot un
rezultat pozitiv.
Testul fermentare-oxidare (testul F-O)
Principiul. Modul de degradare a glucozei sau altui substrat de ctre bacterii: pe cale
fermentativ (F) prin fosforilare; prin oxidare direct (O) sau prin ambele modaliti (F+O).
Se utilizeaz o geloz semimoale, tamponat i cu adaos de glucoz sau alt substrat,
i un indicator de pH (albastru de bromtimol). Mediul repartizat n tuburi se nsmneaz n
toat coloana. Dup incubare, prin degradarea substratului cu formare de acizi, indicatorul va
vira n galben.
Bacteriile care degradeaz oxidativ glucoza, vireaz n galben numai la suprafa.
Bacteriile care degradeaz oxidativ i fermentativ glucoza, vor vira n galben toat coloana
mediului, iar cele care degradeaz fermentativ substratul, vireaz coloana mediului n galben
numai n profunzime (anaerobii).
Oxidaza
Este o enzim oxidativ prezent la unele specii bacteriene, care acioneaz asupra
unor amine aromate producnd compui colorai. Fiind pozitiv la grupul Neisseria, se
folosete curent n identificarea meningococilor i gonococilor.
Pentru executarea testului sunt mai multe procedee, dintre care metoda Kovacs este
frecvent folosit. Aceasta const n mbibarea unei fii de hrtie de filtru n reactivul pentru
oxidaz, pe care se aplic o poriune din colonie, cu ansa. Testul pozitiv se traduce prin
apariia culorii purpurii n decurs de 10 secunde.

Fermentarea hidrailor de carbon

Utilizeaz medii de cultur cu bulion de baz pentru fermentaie, care conine unul din
carbohidrai: glucoz, lactoz, zaharoz, manit, dulcit.
Mediile cu pH de 7,1-7,2 (indicatori: bromthymol blau sau bromcrezol purpur),
repartizate n tubuoare de fermentaie, se inoculeaz cu o cantitate mic dintr-o cultur
tnr (18-20 ore de incubare). Incubate la 37C, se examineaz zilnic 4-5 zile, notndu-se
producia de acid (prin virarea mediului) i volumul de gaz produs de bacteriile aerogene.
Testul este util identificrii grupurilor principale de Enterobacteriaceae.
Testul Voges-Proskauer
Unii germeni au capacitatea ca prin fermentaia acetonic s degradeze acidul piruvic
(rezultat din desfacerea glucozei) i s dea natere la acetilmetil carbinol, care este oxidat n
prezena aerului i n mediu alcalin pentru a forma diacetil, ce poate fi evideniat printr-o
reacie chimic.
Institutul Cantacuzino prepar o soluie de cupru amoniacal pentru efectuarea
testului. La 1 ml cultur, se adaug 1 ml soluie cupru amoniacal. Citire dup 20 de minute.
Rezultat pozitiv: apariia unei culori roii.
Testul beta-galactozidazei
Pentru identificarea multor bacterii, degradarea lactozei prin beta-galactozidaze are
mare importan. Prezena enzimei se deceleaz prin determinarea colorimetric a
ortonitrofenolului eliberat dintr-un substrat ONPG (ortonitrofenil galactozid), atunci cnd este
pus n contact cu o suspensie bacterian dens.
La o suspensie n soluie salin fiziologic de cultur, se adaug o rondel mbibat cu
ONGP. nclzind eprubeta n palm, soluia devine galben (la testul pozitiv), datorit formrii
ortonitrofenolului sub aciunea beta-galactozidazei. Testul este pozitiv pentru Escherichia coli.
Testul producerii de indol
Unele bacterii, prin enzima triptofanaz, catalizeaz triptofanul, ducnd la formarea de
indol. Acest produs, n prezena reactivului, duce la formarea de nitrozoindol de culoare roie
(fig. 33).
Testul se poate efectua uor prin folosirea de benzi pentru reacia indolului, preparate
de Institutul Cantacuzino. Acestea se ataeaz la dopul tubului cu mediu (ap peptonat
sau mediu MIU), astfel nct, captul poriunii impregnate cu reactiv s ajung la un cm
deasupra mediului. n caz de pozitivare, apare o culoare roie n 24 de ore. Testul este pozitiv
la Escherichia coli.
Testul decarboxilazelor
Prezena enzimelor care pot decarboxila aminoacizii, la unele bacterii, face din acesta
un test important pentru identificarea enterobacteriilor.
Sunt folosii ca substraturi urmtorii aminoacizi : lizina, arginina i ornitina. Fiecare din
acetia, sunt decarboxilai de o enzim specific, cu eliberare de CO 2 i a aminei
corespunztoare.

Producerea de hidrogen sulfurat

Unele microorganisme posed o enzim din grupul liazelor (C-S-liaze), care
acioneaz pe substane organice derivate din pepton, ca cisteina, cistina sau pe produi
anorganici ca sulfurii-tiosulfurii, dnd natere la H2S (hidrogen sulfurat), care intr n
combinaie cu srurile de fier sau de plumb, producnd sulfuri de culoare neagr.
Tehnica de referin pentru testarea formrii de H2S, este folosirea mediului TSI,
preparat de Institutul Cantacuzino.

Fig. 33 Testul producerii de indol. Tubul din stnga arat un test pozitiv
(inel rou). Tubul din dreapta cu testul indol negativ (inel galben).

Pentru efectuarea testului, mediul se nsmneaz prin depunerea culturii n striuri, pe

partea nclinat, i prin neparea prii drepte. n majoritatea cazurilor, reacia pozitiv apare
n 24 de ore, i se evideniaz prin nnegrirea coloanei drepte a mediului.
O alt tehnic pentru folosirea formrii de H 2S, const n folosirea de benzi de hrtie
impregnate cu o soluie de acetat de Pb, care se depune n tubul de cultur.
Testul ureazei

Enzima ureaz, prezent la unele bacterii, are capacitatea de a

scinda ureea, cu eliberarea de CO 2 i NH3. Producerea de amoniac, se
nsoete de virarea spre alcalin a mediului, decelabil prin indicatorul
rou fenol. Testul este util n identificarea germenilor din genurile Proteus
i Yersinia, i se execut pe mediul