2.7.1.3.

Izolarea
Cultivarea produselor pentru diagnosticul de tuberculoz este important deoarece:
ofer rezultate pozitive n plus fa de examenul microscopic; permite izolarea n cultur pur
a micobacteriilor i identificarea acestora; ofer posibilitatea testrii sensibilitii
micobacteriilor la antibiotice (antibiograma la tuberculostatice).
Speciile de micobacterii difer mult ntre ele n ce privete viteza de multiplicare i
necesitile nutriionale. Astfel se explic dezvoltarea unor micobacterii atipice n 5-12 zile de
la nsmnare i a altora, ca M. ulcerans care se dezvolt, n condiii similare, dup o
incubare de cteva luni. n aceast ierarhie, M. tuberculosis se situeaz ctre zona
micobacteriilor pretenioase din punct de vedere nutritiv i cu dezvoltare lent (ntre 3-8
sptmni de la nsmnare).
Mediile de cultur pentru micobacterii sunt complexe i deosebit de variate. Actual,
pentru diagnostic se utilizeaz doar mediul cu ou Lwenstein-Jensen i varianta acestuia,
mediul Tebeglut.
Pe aceste medii, produsele care nu conin alte bacterii (ex.: LCR), pot fi nsmnate
ca atare. Celelalte produse, fiind n general contaminate cu ali germeni (flora bacterian
nespecific), se trateaz cu o soluie de hidroxid de sodiu 4% i dup 30 de minute la 37 0C se
neutralizeaz cu HCl 8-10% pentru obinerea unui pH de 7. Incubarea mediilor nsmnate,
dup acoperirea eprubetelor cu mediu cu dopuri de cauciuc sau prin parafinare, se face la
370C i se examineaz la fiecare a treia sptmn. Dac pe medii nu se dezvolt bacterii,
dup 8 sptmni, se d rezultatul negativ i culturile se scot din lucru.
n cazul culturilor pozitive, notarea rezultatelor se face cantitativ, preciznd numrul
coloniilor sau intensitatea pozitivrii. Se utilizeaz urmtoarea notaie: +++ = cretere
confluent; ++ = colonii izolate; + = 20-100 colonii izolate; sub 20 de colonii se consemneaz
numrul acestora; 0 = cultur negativ.
2.7.1.4. Identificarea tipului de micobacterie
Pentru identificarea micobacteriilor au fost propuse teste privind:
- aspectele morfologice;
- formarea de pigment la lumin i ntuneric;
- timpul de cretere la 370C;
- patogenitatea pentru diverse animale de laborator;
- teste enzimatice (punerea n eviden a niacinei, a catalazei, a lipazei, a nitratreductazei etc.);
- compararea structurii antigenice prin teste imunologice;
- sensibilitatea fa de chimioterapice sau alte substane.
Dat fiind numrul extrem de mare de teste propuse, s-a simit nevoia unor scheme
simplificate pentru a putea fi utilizate n practic. n mod obligatoriu, din bateria de teste
trebuie s fac parte determinarea sensibilitii fa de tuberculostatice, n primul rnd pentru
c un anumit spectru al chimiorezistenei este caracteristic pentru micobacterii atipice, dar i
pentru faptul c, prin instalarea chimiorezistenei, micobacteriile tipice i modific unele
caractere biochimice i de patogenitate.
Proprietile morfologice i de cultur
Pe mediul Lwenstein i variantele sale, micobacteriile tuberculoase de tip uman se

dezvolt n 21-60 zile de la nsmnare, sub forma unor colonii rugoase, bine dezvoltate,
proeminente, conopidiforme: cretere de tip eugonic (fig.73). Micobacteriile de tip bovin cresc
sub forma unor colonii mrunte, plate, uniforme, comparate cu creterea n gazon,
cunoscut sub denumirea de cretere disgonic.
Micobacteriile atipice cresc pe mediile amintite n 5-12 zile, sub forma unor colonii de
tip S, pentru unele specii cromogene (grupa II a lui Runion - galben portocaliu intens
scotocromogene, de exemplu), sau necromogene (grupa III avium - intracelulare).

Fig. 73 Colonii proeminente, conopidiforme (eugonice)

de Mycobacterium tuberculosis pe mediul Lwenstein-Jensen.

Caractere biochimice
Testul niacinei (Konno) are valoare deosebit, fiind un test de triere a tulpinilor de tip
uman care au proprietatea de a produce niacin (o enzim bacterian) - comparativ cu
micobacteriile de tip bovin i cele atipice la care testul este negativ. Testul se efectueaz n
eprubete cu culturi de testat, n care se adaug 0,5 ml ap distilat, se nclin astfel ca s fie
acoperit cultura de bacili i se nclzete pn la fierbere pentru a extrage niacina liber.
Lichidul este transvazat ntr-o eprubet de hemoliz sau ntr-o plac cu godeuri pentru
efectuarea reaciei de culoare. Reacia se obine prin adugare la lichidul cu extract a 2-3
picturi de anilin 4% n alcool etilic (preparat extemporaneu) i 2-3 picturi de bromur de
cianogen 10%. Operaiunea se face sub ni prevzut cu exhaustor. n cazul prezenei
niacinei, lichidul se coloreaz n galben, indicnd testul pozitiv (M. tuberculosis var. hominis).
Testul nitratreductazei este util pentru a diferenia M. tuberculosis de tip uman (test
pozitiv) de M. bovis (test negativ), micobacteriile atipice comportndu-se diferit n funcie de
specie.
Reacia se execut pe cultur de patru sptmni. Cu o ans bacteriologic calibrat
se racleaz cultura (aproximativ 5 mg) i se suspend n soluie de nitrat de sodiu tamponat
la pH 7. Suspensia se incubeaz la 37 0C timp de 4 ore, dup care se acidifiaz cu HCl diluat
, apoi se pun dou picturi de soluie apoas de sulfanilamid 0,2% i dou picturi de
diclorur de naftil-etil-diamin 0,1%. Dac cultura conine enzima nitratreductaz, apare
imediat culoarea roie (rou deschis).
Testul activitii catalazice
Reacia se bazeaz pe aprecierea intensitii de formare a bulelor de oxigen ce se
degaj la contactul culturilor de micobacterii cu apa oxigenat sub aciunea catalazei. Se
poate face o apreciere vizual aproximativ efectund reacia direct pe tuburi cu cultur de
micobacterii sau dup raclarea unei anse de cultur (5 mg) n dou tuburi de hemoliz care
conin 0,5 ml dintr-o soluie apoas de 10% de Tween 80. Unul din tuburi va fi nclzit 15
minute la 700C n baia de ap pentru inactivare. n ambele tuburi se adaug 0,5 ml perhidrol

15%. Dac tulpina elibereaz catalaz, n tuburi se formeaz numeroase bule de aer (test
pozitiv). Dac n tubul care conine cultura inactiv nu este evideniat activitatea catalazic,
iar n cellalt reacia este pozitiv, se identific M. tuberculosis var. hominis sau bovis. Dac
ambele tuburi au catalaz se identific micobacterii atipice (catalaz termo-rezistent).
Ambele tuburi catalazo-negative indic bacili Koch cu rezisten secundar sau primar la
izoniazid.
Caractere antigenice
Antigenele de suprafa ale unor micobacterii au fost utilizate n cadrul unor cercetri
de imunologie (serotipaj), apelndu-se la metode complicate i costisitoare care ns nu s-au
dovedit a fi deosebit de utile pentru identificare.
Din punct de vedere practic sunt importante antigenele extrase din culturi de
micobacterii, numite senzitine i utilizate pentru evidenierea, in vivo, a hipersensibilitii de tip
ntrziat.
Tipizarea cu ajutorul bacteriofagilor (lizotipia)
Este o metod de identificare relativ nou (aplicat n scop de cercetare). Au fost izolai
un numr de 12 fagi, desemnai cu codul MTPH (Mycobacterial Typing Phage Human) i
numerotai de la 1 la 12. Din punct de vedere al sensibilitii la fagi, M. tuberculosis a fost
divizat n trei tipuri fagice: A, B i C. S-au ntocmit scheme de fagotipaj pentru diferite
micobacterii cu potenial crescut de patogenitate, n scopul urmririi surselor de infecie, n
cadrul anchetelor epidemiologice.
Testele de sensibilitate la tuberculostatice
Sunt utile att pentru identificarea unor specii de micobacterii, ct i pentru instituirea
tratamentului cu tuberculostatice.
Testul de rezisten la hidraza acidului tiofen-2-carboxilic (THC). Pe medii de cultur ce
conin aceast substan, se dezvolt numai M. tuberculosis varietatea european, n timp ce
M. bovis, M. africanum i M. asiaticum nu se dezvolt.
Rezistena la pirazinamid constituie un criteriu de difereniere ntre tipurile umane,
care sunt sensibile, i cele bovine, inclusiv BCG, care sunt rezistente.
Constatarea chimiorezistenei la mai multe tuberculostatice, inclusiv PAS, ndreptete
suspiciunea c tulpina testat este o micobacterie atipic.
Antibiograma pentru micobacterii poate fi fcut prin variate metode, cea mai frecvent
utilizat fiind metoda concentraiilor absolute care const n inocularea tulpinii de testat pe
mediu cu anumite concentraii de tuberculostatice, denumite concentraii critice, alese pentru
fiecare antibiotic n funcie de concentraia minim inhibitorie a acestuia (CMI). n alegerea
CMI exist o relaie direct ntre sensibilitatea germenilor i concentraiile obinuite realizate
n organismul uman.
Din cultura pur de bacili obinut pe medii de izolare se fac suspensii ce se
inoculeaz pe medii cu tuberculostatice (de obicei, cu 2 concentraii pentru fiecare antibiotic)
i pe tuburi martor (fr antibiotice).
Prin aceast metod se exprim rezistena la concentraia tuberculostaticului n tubul
pe care s-a observat creterea micobacteriilor, comparativ cu tuburile martor.
Infecia experimental micobacterian
Cobaiul este animalul cel mai sensibil la infecia cu M. tuberculosis, iar iepurele este
foarte sensibil la infecia cu M. bovis i M. avium.

Inocularea subcutanat la cobai a unei suspensii dintr-o cultur de bacili Koch este
urmat, dup 10-15 zile, de fistulizare la locul de inoculare, apare un abces cazeos numit
ancru de inoculare, care va dura pn la moartea animalului. Simultan, au loc reacii
inflamatorii ale ganglionilor regionali, leziuni ale suprarenalelor, splinei, ficatului i apoi ale
plmnilor. Moartea animalelor are loc la 6 pn la 8 sptmni de la inoculare.
Fenomenul Koch arat c, dac la cobaiul aflat n plin infecie tuberculoas se
inoculeaz intradermic o nou doz de bacili, se produce o reacie precoce de necroz la
locul inoculrii, explicat printr-o stare de reactivitate specific de sensibilizare de tip imun,
demonstrat prin metode moderne ca fiind deosebit de complex.

2.7.2. Diagnosticul indirect

n diagnosticul tuberculozei nu exist metode serologice care s aduc un aport
important, fapt explicabil prin suportul celular al imunitii antituberculoase. n schimb,
diagnosticul biologic are importan n evidenierea stadiului hipersensibilizrii vis-a-vis de
proteinele purificate ale bacilului Koch (IDR la tuberculin), alturi de testarea imunitii
celulare prin inhibiia migrrii macrofagelor i alte metode.
Tuberculina sau senzitina bacililor tuberculozei este un preparat purificat PPD (derivat
proteic purificat), coninnd 2 sau 10 uniti /0,1 ml.
Intradermoreacia la tuberculin (tehnica Mantoux) se practic prin inocularea strict
intradermic pe faa anterioar a antebraului a 0,1 ml din soluia de PPD. Citirea se face la 72
de ore, lund n considerare induraia palpabil a crui diametru este peste 10 mm n cazul
unei reacii de hipersensibilitate tardiv pozitiv. Apariia unei reacii pozitive se interpreteaz
n raport cu vrsta subiectului. La copii mari i la aduli, rspunsurile pozitive au semnificaie
cnd sunt foarte intense, sugernd infecia cu bacilul tuberculozei.
Reacia negativ este ntlnit la persoane neinfectate, nevaccinate BCG sau la cele
care sunt lipsite de reactivitate de tip tardiv.
Utilizarea n scop epidemiologic a reaciilor la tuberculin servete la selecionarea
subiecilor neinfectai i care urmeaz s fie vaccinai cu BCG.
Vaccinul BCG provine dintr-o surs de M. bovis pe care Calmette i Guerin au obinuto dup numeroase repicaje pe medii cu cartof, bil i glicerin pn cnd virulena acesteia sa atenuat att de mult, nct nu mai produce infecia tuberculoas, dar stimuleaz imunitatea
celular, protejnd organismul de infecie.

2.8 DIAGNOSTICUL INFECIILOR CU

ENTEROBACTERIACEAE
2.8.1. Caracterele generale ale enterobacteriilor
Numele de enterobacterii este dat acelor bacterii care sunt n general localizate,
normal sau patologic, n tubul digestiv al omului i animalelor.
Prezena enterobacteriilor n mediul exterior prezint importan n igiena alimentar,
deoarece se ntlnesc unele specii (ca E. coli) frecvent contaminante, indicnd o poluare
fecal a elementelor din mediu.
Natural, enterobacteriile pot fi gsite i pe mucoase i tegumente.
Pe planul patologiei umane se disting mai multe specii bacteriene:
- Bacterii patogene specifice, cu patogenitate cert, care mbolnvesc omul datorit

contaminrii, fie prin contact direct, fie prin intermediul alimentelor sau animalelor:
Salmonella, Shigella i Yersinia pestis.
Bacterii patogene oportuniste, aparinnd florei digestive comensale, condiionat
patogene cum sunt: Escherichia, Proteus, Klebsiella etc., care prezint o
importan deosebit prin mbolnviri i uneori prin extinderea lor n mediul
spitalicesc.

2.8.1.1. Morfologia
Sunt bacili Gram-negativi nesporulai, mobili datorit cililor peritrichi sau imobili
(Klebsiella, Shigella). Unele pot poseda capsul (Klebsiella), altele au microcapsul (aceasta
prezint antigene de suprafa).
2.8.1.2. Cultivarea
Enterobacteriile se dezvolt uor pe medii simple i sunt aero-anaerobe facultativ. n
mediile nutritive simple, formele S se dezvolt omogen tulburnd uniform mediul. Formele R
determin o turbiditate redus, culturile prezentnd depozit i pelicul incomplet. Pe geloz
simpl, exceptnd bacteriile din genul Proteus, formele S dezvolt colonii rotunde de 1-3 mm
diametru, bombate, semitransparente, cu marginile regulate, n timp ce formele R cresc sub
form de colonii plate, cu suprafaa i marginile neregulate. Klebsiella dezvolt colonii mari
bombate, lucioase, mucoide, cu tendin de confluen.
Pentru izolarea enterobacteriilor din produsele patologice (materii fecale, urin, puroi
din plgi deschise etc.) se utilizeaz o gam larg de medii selective care inhib dezvoltarea
fungilor i bacteriilor Gram-pozitive.

2.8.1.3. Caracteristici metabolice

Pentru a ncadra o tulpin ca enterobacterie, precum i ntr-un gen sau specie, sunt
utile o serie de teste biochimice:
-

degradarea oxidativ i fermentativ a glucozei;

reducerea nitrailor la nitrii (nitratreductaza);
citocromoxidaza se evideniaz pe geloz nclinat;
testul indol evideniaz prezena triptofanazei;
testul rou-metil (fermentaia mixt a glucozei);
testul Voges-Proskauer (fermentaia acetonic);
ntrebuinarea citratului (pe mediul Simmons).

Ultimele patru teste sunt de mare valoare n identificarea enterobacteriilor i sunt

notate ca IMVIC.
n afara testelor mai sus amintite se utilizeaz i altele, care evideniaz: scindarea
ureei (ureaza), decarboxilarea aminoacizilor i, mai ales, testele de fermentare a
carbohidrailor (glucoz, lactoz, manitol, zaharoz etc.).
O tulpin poate fi ncadrat n familia Enterobacteriaceelor dac, alturi de proprietile
morfotinctoriale i de cultur, are urmtoarele caracteristici:

- degradeaz oxidativ i fermentativ glucoza;

- reduce nitraii la nitrii;
- este citocromoxidazo-negativ.
Aceste teste difereniaz enterobacteriile de alte bacterii Gram-negative
(Pseudomonas, Alcaligenes, Moraxella etc.).
Studiul caracterelor biochimice a permis ncadrarea enterobacteriilor n mai multe
genuri, fiecare gen cuprinznd specii diferite. Principalele genuri recunoscute la om sunt:
- Escherichia
- Klebsiella - Enterobacter - Hafnia Serratia
- Proteus Morganella Providencia
- Citrobacter
- Edwarsiella
- Salmonella
- Shigella
- Yersinia.
Alte caractere biochimice i/sau imunologice, pe lng caracterele de cultur, au
condus la noiunea de specie i serotipuri.
2.8.1.4. Structura antigenic
La enterobacterii se pot distinge:
-

antigenul somatic -de perete- sau antigenul O, totdeauna prezent, comun mai
multor serotipuri, constituindu-se pe aceast baz grupe antigenice (Salmonella,
Escherichia, Klebsiella etc.);

antigenul flagelar sau antigenul H, cu importan mare n definirea tipurilor

antigenice (Salmonella);

antigenul de suprafa (capsular sau de nveli) numit antigen K (Klebsiella,

Escherichia).

Antigenele O coninute n peretele bacterian, prezint o structur complex de natur

lipozaharidic, cuprinznd:
- fraciunea lipidic, lipidul A, care este responsabil de toxicitate;
- fraciunea poliozidic care, prin natura sa, determin specificitate.
Acest antigen O este o endotoxin, care n cursul infeciei provoac la om ocul
endotoxinic. Bacteriile care posed acest antigen, n prezena anticorpilor specifici
aglutinina O vor aglutina bacteriile corp la corp sub forma unor formaiuni granulare mici,
dificil de a fi disociate prin agitare.
Antigenul H, flagelar, este constituit dintr-o substan proteic. Bacteriile care
posed acest antigen, n prezena aglutininei H (anticorp specific) ce leag bacteriile prin
flagelii lor, producnd o aglutinare floconoas, uor de disociat prin agitare.
Studiul diferitelor antigene permite stabilirea serotipurilor, acestea avnd importan n
descoperirea surselor de infecie.
n prezena unei infecii cu o enterobacterie, instituirea tratamentului cu antibiotice se

face n funcie de rezultatul antibiogramei i de localizarea infeciei.

2.8.2. Diagnosticul infeciilor cu Salmonella

Genul Salmonella cuprinde bacterii larg rspndite n natur, toate serotipurile
cunoscute fiind patogene pentru om i animale. Cele dou rezervoare naturale mari,
animalele i omul (bolnavi sau purttori sntoi) se afl la polii unui lan ale crui verigi
eseniale sunt alimentele, apele de suprafa i furajele.
Exist salmonelle adaptate strict la om (S. typhi, S. paratyphi A), altele ntlnite la
animale cu spectru restrns de gazd i altele cu spectru larg de gazd (S. typhimurium, S.
enteritidis etc.) care pot da infecii i la om. Aceste bacterii cu patogenitate specific,
ajungnd din tubul digestiv al omului i/sau animalelor, bolnave sau sntoase, n mediul
exterior i provoac mbolnvirea prin ingerare de ap sau alimente contaminate.
Salmonellele sunt agenii etiologici ai salmonelozelor, maladii ce pot mbrca diferite
aspecte clinice.
Febrele tifoparatifoide -enterice- forme septicemice, datorate unei contaminri orale,
caracterizate printr-o evoluie febril, determinat n mod frecvent de S. typhi (febra tifoid),
S. paratyphi A, S. paratyphi B i S. paratyphi C (febrele paratifoide). n patogenia febrelor
enterice a fost descris o faz iniial cnd Salmonella se multiplic activ n submucoas i
formaiunile limfoide ale intestinului (plcile Peyer) i apoi trece n ganglionii mezenterici. De
aici, prin canalul toracic, determin bacteriemia de debut i invadarea formaiunilor limfatice,
splinei, ficatului etc. Multiplicarea n aceste organe determin bacteriemie masiv cu
eliminarea germenilor prin bil i urin. Din foliculii intestinali, necrozai i abcedai, precum i
din bil, la sfritul primei sptmni de boal, eliminarea se face prin materiile fecale.
Toxiinfecia alimentar salmonelozic - gastroenterita - este forma comun de boal
dat de toate celelalte serotipuri (mai frecvent S. typhimurium, S. enteritidis, S. panama etc.)
i se datorete ingestiei unei cantiti mari de bacterii vii, de regul prin intermediul unui
aliment contaminat. Simptomatologia digestiv brutal apare dup 6-48 ore (spre deosebire
de cea dat de toxiinfecia stafilococic ce apare n 2-6 ore) de la consumul alimentului
contaminat i const n: diaree, vrsturi nsoite de febr, cefalee i alterarea strii generale;
n formele severe putnd apare fenomene grave de deshidratare i oc toxiinfecios. Dup
remisiunea strii acute, unii indivizi rmn purttori de Salmonella pe timp de mai multe luni.
Septicemia sau determinrile septico-piemice la copii i la aduli cu rezisten sczut
sau imunitate deprimat, apare n cursul toxiinfeciei alimentare, dar i n situaii n care nu se
manifest o interesare a tractului digestiv. Acestea pot determina localizri ale unor focare
piemice din cele mai variate (osteoarticulare, pulmonare, meningeale etc.) i sunt cauzate cel
mai frecvent de S. paratyphi C i S. cholerae suis.
Alte salmoneloze sunt mai rare: meningite, osteite, infecii urinare etc.