ACADEMIA DE ŞTIINŢE A MOLDOVEI

GRĂDINA BOTANICĂ (INSTITUT)

Cu titlu de manuscris
C.Z.U: 582.717.7:581.1.085

ROMANCIUC Gabriela

Cercetarea proceselor de dezvoltare şi

multiplicare microclonală in vitro la
Actinidia chinensis Planch.

03.00.05 – Botanică

Autoreferat al tezei de doctor în biologie

CHIŞINĂU, 2009
 Teza a fost elaborată în laboratorul de Embriologie şi Biotehnologie al Grădinii Botanice
(Institut) a Academiei de Ştiinţe a Moldovei.
Conducător ştiinţific:
CIUBOTARU Alexandru, acad., dr. hab. în biol., prof. univ., Grădina Botanică (I), A.Ş.M.
Referenţi oficiali:
TODERAŞ Lidia, dr. hab. în biol., conf. cerc., Consiliul Naţional pentru Acreditare şi
Atestare;
PÂNTEA Maria, dr. hab. în biol., Institutul ştiinţifico-practic de Horticultură şi Tehnologii
alimentare.
Componenţa consiliului ştiinţific specializat:
NEGRU Andrei, acad., dr.hab. biol., prof. univ., Grădina Botanică (I) a A.Ş.M. (Preşedinte);
COLŢUN Maricica, dr.biol., cerc. conf., Grădina Botanică (I) a A.Ş.M. (Secretar ştiinţific);
GRATI Vasile, dr.hab. în biol, prof. univ., UST, catedra Biologie Vegetală;
ŞALARU Vasile, dr.hab. în biol., prof. univ., membru corespondent, USM, Catedra de
Botanică, Ecologie şi Sivicultură;
TOPALĂ Ştefan, dr.hab. în biol., cerc. princ., Grădina Botanică (I) a A.Ş.M.

Susţinerea va avea loc la „11 ” august 2009, ora 1400, în şedinţa Consiliului ştiinţific specializat
DH 11.03.00.05-08 din cadrul Grădinii Botanice (I) a Academiei de Ştiinţe a Moldovei, MD-2002,
Chişinău, str.Pădurii 18, tel/fax. (+373 22) 55 04 43, e-mail: gradinabotanica@moldnet.md

Teza de doctor şi autoreferatul pot fi consultate la biblioteca Academiei de Ştiinţe a Moldovei

(str.Academiei 5, MD-2028, Chişinău) şi pe pagina web a C.N.A.A. (www.cnaa.acad.md )

Autoreferatul a fost expediat la 10 iulie 2009

Secretar ştiinţific
al Consiliului ştiinţific specializat DH 11.03.00.05-08,
dr. în biologie Colţun Maricica

Conducător ştiinţific
academician Ciubotaru Alexandru

Autor Romanciuc Gabriela

2
 Actualitatea temei şi gradul de studiere a acesteia. Actualitatea cercetărilor efectuate este
determinată de necesitatea introducerii unor noi specii alohtone – culturi cu proprietăţi avantajoase,
care ar contribui esenţial la extinderea diversităţii culturilor pomicole în Republica Moldova. Acest
fapt va conduce nemijlocit la valorificarea a noi surse de materie primă vegetală în sectorul agro-
alimentar, contribuind esenţial la fortificarea sănătăţii şi a securităţii alimentare. Asemenea cultură
poate fi numită Actinidia chinensis sau kiwi, apreciată, în special pentru calităţi speciale gustative,
dietice, terapeutice ale fructelor, precum şi prin rentabilitatea economică ridicată, datorită roadei
destul de impunătoare. Metodele tradiţionale de înmulţire a acestei culturi nu sunt destul de
efective, astfel, apare necesitatea de a elabora metode noi, moderne ce ar facilita şi eficientiza acest
proces. Sporirea randamentului de obţinere a materialului săditor poate fi posibil prin realizarea
obiectivelor ce ţin de stabilirea legităţilor biomorfogenice în cultura in vitro a speciei date. Aceasta
va permite de a căpăta dintr-un material biologic redus volumul necesar de material săditor liber de
agenţi patogeni, într-un timp relativ scurt.
Scopul tezei constă în evidenţierea potenţialului morfogenetic a diferitor tipuri de explante a
speciei Actinidia chinensis, prin testarea fazelor de iniţiere, multiplicare şi înrădăcinare in vitro pe
diferite medii de cultură şi balanţe hormonale, asociate cu stabilirea condiţiilor optime de cultivare.
În final, realizarea acestor etape va conduce, nemijlocit, la elaborarea tehnologiei de înmulţire in
vitro a speciei luate în studiu, ce reprezintă o cerinţă de bază a cultivării în condiţii aseptice a
oricărui obiect supus cercetării. În vederea atingerii scopului dat au fost stabilite următoarele
obiective:
• Elaborarea metodelor de multiplicare pentru a obţine material iniţial de plante funcţional
feminine, efectuând:
o testarea explantelor de diferită provenienţă;
o determinarea agentului de sterilizare şi a timpului de expunere;
o selectarea mediilor de cultură, adecvate pentru fiecare etapă de cultivare, urmată de
determinarea tipului şi concentraţiei de fitohormoni;
o stabilirea condiţiilor optime pentru derularea proceselor de regenerare.
• Analiza biologiei dezvoltării plantelor de kiwi in vitro şi ex vitro;
• Selectarea plantelor regenerate şi trecerea lor în condiţii de seră.
Noutatea ştiinţifică a rezultatelor obţinute constă în stabilirea particularităţilor de creştere şi
dezvoltare a speciei Actinidia chinensis în condiţiile Moldovei. Înmulţirea acestei culturi pe cale
tradiţională – prin butăşire sau seminţe, implică anumite dificultăţi, care au fost înlăturate de noi
prin utilizarea metodelor biotehnologice de cultură in vitro. Rezultatele obţinute au scos în
evidenţă o diferenţiere a derulării proceselor de calusogeneză şi morfogeneză, care au fost
demonstrate paralel şi prin analizele histologice efectuate la nivel de ţesut calusal. În investigaţiile

3
noastre am reuşit să depăşim problemele legate de multiplicare, în special, a plantelor feminine,
care au manifestat unele impedimente. Pentru realizarea scopului propus au fost efectuate
următoarele proceduri: au fost optimizate mediile de cultură pentru fiecare etapă de cultivare
aparte; au fost testate şi selectate diferite tipuri de explante (frunză, peţiol, muguri florali),
stabilindu-se potenţialul lor morfogenetic; s-a determinat gradul de influenţă a diferitor regulatori
de creştere; s-au evidenţiat factorii şi condiţiile specifice de înrădăcinare a plantulelor; a fost
stabilit regimul microclimatic de cultivare in vitro a culturii de kiwi.
Experienţele de multiplicare a plantelor de kiwi au demonstrat, că această specie manifestă
o sporită capacitate morfogenetică şi o adaptare bună la condiţiile particulare ale culturii in vitro.
Importanţa teoretică şi valoarea aplicativă a lucrării.
Importanţa teoretică a lucrării ţine de faptul, că prin utilizarea anumitor metode şi procedee
este posibil de a demonstra capacitatea unor fragmente detaşate din ţesuturile plantelor de a genera
pe medii de creştere adecvate şi în condiţii aseptice întregul organism - fenomen numit totipotenţă.
În acelaşi timp potenţialul şi modul de regenerare al diferitelor organe sau ţesuturi ale
plantelor sunt foarte diferite. Aceste caracteristici sunt cunoscute sub numele de competenţă,
respectiv potenţialul endogen al unui anumit ţesut sau celulă de a se dezvolta într-un mod
particular. Astfel, în cadrul tezei sunt evidenţiate căile specifice de regenerare a diferitor tipuri de
explante în condiţii in vitro. De asemenea sunt stabilite particularităţile morfogenetice a lor,
determinate de capacitatea de dediferenţiere a ţesutului calusal la specia Actinidia chinensis.
Valoarea aplicativă a lucrării reiese din faptul, că în condiţii de laborator a fost stabilit
protocolul de înmulţire in vitro a speciei Actinidia chinensis Planch. Protocolul de înmulţire a
culturii date elaborat ca rezultat al cercetărilor efectuate în cadrul Grădinii Botanice (Institut) va
servi drept suport metodologic, ce va constitui un ghid în vederea cultivării explantelor de kiwi în
condiţii aseptice soldate, în final, cu obţinerea plantulelor - material săditor pomicol propriu zis.
Respectarea protocolului elaborat va asigura succesul cultivării kiwi in vitro. Studiul realizat
permite de a constata o posibilitate reală de iniţiere în viitorul apropiat a plantaţiilor de kiwi în
microarealuri protejate.
Postulatele de bază prezentate pentru susţinere:
Principalele rezultate ştiinţifice obţinute pe parcursul investigaţiilor efectuate în lucrarea de
faţă se rezumă la:
1. Mediul optim pentru regenerarea plantulelor de kiwi este mediul S 2,5 (Standardi A., 1983)
2. Folosirea zeatinei în mediul de cultură determină formarea calusului la toate tipurile de
explante;
3. Formarea calusului şi structura sa morfoanatomică depinde de tipul explantului
4. Zonele morfogene sunt distribuite în straturile exterioare al ţesutului calusal

4
 5. Procesul de geneză a lăstarilor variază în dependenţă de originea calusului.
Aprobarea rezultatelor: Rezultatele cercetărilor au fost comunicate şi publicate la:
Congresul II al Societăţii de Botanică din Republica Moldova: „Biodiversitatea vegetală a
Republicii în preajma mileniului III”, Chişinău, noiembrie 1998; Conferinţa „Agrobiodiversitatea
vegetală în Republica Moldova: Evaluarea, conservarea şi utilizarea”, Chişinău, iunie, 2008;
Conferinţa Naţională cu participare internaţională „Probleme actuale ale geneticii, fiziologiei şi
ameliorării plantelor”, Chişinău, octombrie, 2008; Simpozionul ştiinţific internaţional „Agricultura
modernă – realizări şi perspective”, Chişinău, octombrie, 2008.
Structura şi volumul lucrării: Teza este expusă pe 118 pagini text dactilografiat, inclusiv 12
tabele şi 51 figuri. Constă din introducere şi 5 capitole, ce reflectă rezultatele cercetărilor şi tratarea
lor ştiinţifică, concluzii, recomandări practice, bibliografie cu 242 titluri, adnotarea tezei în limbile
română, engleză şi rusă, anexă compusă din 2 tabele şi 10 figuri..
Publicaţii la tema tezei: Materialele tezei au fost publicate în 9 lucrări ştiinţifice, dintre care 2
în reviste cu recenzenţi, 5 în culegeri ştiinţifice şi 2 teze.
Cuvinte cheie: Actinidia chinensis, cultura in vitro, mediul de cultură, fitohormoni, calus,
centre morfogene, organogeneza, plantule.

CONŢINUTUL TEZEI
2. MATERIALE ŞI METODE DE CERCETARE
Experienţele au fost efectuate în laboratorul Embriologie şi Biotehnologie al Grădinii Botanice
(I) A.Ş.M.
Material de studiu.
În calitate de material biologic a servit specia Actinidia chinensis, creşterea şi dezvoltarea
căreia are loc în serele Grădinii Botanice. În scopul iniţierii culturilor in vitro la A. chinensis au
fost utilizate trei tipuri de inoculi: fragmente de limb foliar, peţiol şi muguri florali. Prelevarea
materialului vegetativ s-a efectuat după pornirea plantelor în vegetaţie şi anume, în luna aprilie.
Sterilizarea
Protocolul de sterilizare elaborat prevede: menţinerea sub jet de apă şi spălarea cu apă
curentă; dezinfectarea prealabilă cu soluţie slabă de KMnO4 la care s-a adăugat Tween 80, timp de
10 min; imersarea în soluţie sterilizantă, utilizând diacid de 0,1% timp de 7 minute cu agitare
continuă; după fiecare procedură s-a recurs la trei spălări succesive cu apă distilată.
Mediile de cultură
La diferite faze a procesului de multiplicare a speciei Actinidia chinensis în condiţii in vitro
au fost utilizate diverse medii de cultură. Astfel, în scopul inducerii calusogenezei au fost utilizate
mediile: MS (Murashige-Skoog, 1962); Schenk-Hildebrandt (1972); macroelemente după Pierik

5
(1976), vitaminele şi microelementele după Murashige-Skoog; S 2,5 (Standardi A. 1983); mediu
B5 (Gamborg, 1968). Mediile pentru inducerea organogenezei au constituit: MS; S 2,5 şi B5.
Înrădăcinarea plantulelor în condiţii in vitro s-a realizat pe mediul MS, în timp ce înrădăcinarea ex
vitro pe mediul ¼ MS lichid.
Inocularea
Inocularea a constat în dimensionarea explantelor (limbul foliar decuplat în pătrăţele mici 4x4
mm, iar peţiolul fragmentat în porţiuni de 5-7 mm) şi plasarea nemijlocită a lor pe suprafaţa
mediului de cultură.
Condiţiile de cultivare
După inoculare timp de 7 zile vasele cu fitoinoculii au fost ţinute la întuneric în camera de
cultivare, după care au fost transferate la lumină. Durata unei subculturi a fost de 30 zile. În
camera de creştere s-a menţinut temperatura de 24°C±1°C; intensitatea luminoasă de 2000 lucşi şi
fotoperioada de 16 ore lumină şi 8 ore întuneric. Au fost efectuate 6 pasaje.
Prepararea secţiunilor semifine
Preparatele au fost obţinute utilizând metoda de preparare a secţiunilor semifine (după Furst
G., 1979), parcurgând următoarele etape: fixarea ţesutului calusal în soluţie de formalină;
deshidratarea cu alcool etilc; deshidratare cu chloroform; includerea în parafină; prepararea
blocurilor de parafină; obţinerea secţiunilor semifine cu ajutorul microtomului SANÎI. Colorarea
preparatelor s-a efectuat cu eosin-hematoxilină Delafilde (Прозина, 1960). Secţiunile semifine au
fost analizate la microscopul LOMO-MICMED-2.
Prelucrarea statistică a datelor
Prelucrarea datelor obţinute s-a efectuat conform schemei de analiză dispersională bifactorială,
utilizându-se pachetul de programe STATGRAPHICS Plus 2.1 Pentru determinarea frecvenţei
procesului de calusogeneză s-a folosit testul ANOVA.

3. PARTICULARITĂŢILE BIOMORFOLOGICE DE DEZVOLTARE A PLANTELOR

DE ACTINIDIA CHINENSIS ÎN TEREN PROTEJAT
Rezultatele investigaţiilor privind creşterea şi dezvoltarea plantelor de kiwi în condiţii de
teren protejat au contribuit la evidenţierea particularităţilor biomorfologice şi ecologice a speciei
date. Ţinând cont de faptul, că A. chinensis este o planta dioică, s-a efectuat descrierea comparată a
exemplarelor masculine şi a celor feminine, evidenţiind unele trăsături distinctive precum:
prezenţa perişorilor de pe suprafaţa tulpinii, care este mai densă la plantele masculine; lungimea
internodurilor, ce s-a dovedit a fi mai mică la exemplarele feminine; structura florii, diferenţa
căreia este determinată de faptul, că florile masculine, spre deosebire de cele feminine, au un ovar
incomplet dezvoltat, dar prezintă un număr mare de stamine bogate în polen viabil. Florile

6
feminine, de obicei, de dimensiuni mai mari sunt solitare, iar cele masculine, mai mici, grupate în
inflorescenţă.
Cercetările efectuate au scos în evidenţă faptul, că în condiţiile Republicii Moldova,
Actinidia chinensis începe să vegeteze în luna martie – aprilie, faza de înflorire se înregistrează la
începutul lunii mai şi durează 10-15 zile. Kiwi are nevoie de o perioadă lungă de dezvoltare, cel
puţin 150 de zile calde, fără îngheţ, care nu trebuie să se suprapună peste perioadele reci din
toamnă sau iarna târzie. Cunoaşterea acestor aspecte ne-a permis să constatăm o posibilitate reală
de cultivare a speciei Actinidia chinensis în condiţiile Republicii Moldova, în microarealuri
protejate.

4. INFLUENŢA FACTORILOR EXOGENI ŞI ENDOGENI ASUPRA PROCESULUI

DE CALUSOGENEZĂ ŞI MORFOGENEZĂ IN VITRO
Realizarea unei căi concrete de morfogeneză este determinată de caracteristica genetico-
fiziologică a plantei – donor, conţinutul mediilor de cultură, combinaţia şi concentraţia
fitohormonilor, asociate cu condiţiile de cultivare.

4.1. Particularităţile acţiunii citochininelor la etapele iniţiale de inducere a calusogenezei

Rezultatele obţinute permit de a constata, că după 30 zile de cultivare în condiţii in vitro,
o dezvoltare satisfăcătoare au manifestat explantele peţiol, cultivate pe mediul S 2,5 suplinit cu
zeatină în cantitate de 1,0 mg/l.
Iniţial calusul primar consistent a fost obţinut din peţiol, fiind de un verde intens, urmat
de limbul foliar. În subculturile succesive calusul format a manifestat o creştere lentă, mai ales în
cazul inoculilor de tip limb foliar. Cel mai mic procent de explante care au format calus s-a atestat
în cazul variantei martor. Cu sporirea cantităţii de zeatină, s-a atestat şi o creştere vădită a
procentului de explante ce au format calus. Aşa dar, zeatina adăugată în mediul de cultură a avut ca
efect sporirea diviziunii celulare şi ca urmare formarea ţesutului calusal (Figura 1).

Influenţa zeatinei asupra formării calusului

80

70
frecvenţa calusogenezei, %

60

50

40

30

20

10

0
Peţiol Lim b Peţiol Lim b Peţiol Lim b
foliar foliar foliar

Control 0,5 1
cantitatea de zeatină, mg/l

f recvenţa calusogenezei

Figura 1. Influenţa zeatinei asupra calusogenezei

7
 În ceea ce priveşte utilizarea BAP (benzil aminopurină) în mediul de cultură, rezultatele
obţinute relevă faptul, că cantitatea optimă necesară pentru iniţierea culturii de calus la kiwi este de
0,5 mg/l. Datele prezentate în Figura 2 scot în evidenţă faptul, că sporirea cantităţii de BAP a
condus la scăderea capacităţii explantelor de a forma calus. În lipsa citochininei calusogeneza a
atins cel mai jos grad de dezvoltare. Din cele relatate putem conchide, că suplinirea mediului MS
cu BAP a condus la scăderea potenţialului calusogenetic la ambele tipuri de explante.

Influenţa BAP asupra frecvenţei calusogenezei

60

50
frecvenţa calusogenezei, %

40

30

20

10

0
Peţiol Limb foliar Peţiol Limb foliar Peţiol Limb foliar

Control 0,5 mg/l 1,0 mg/l

Frecvenţa calusogenezei

Figura 2. Influenţa BAP asupra calusogenezei

În concluzie, pentru Actinidia chinensis, la etapa de formare a calusului, varianta optimă

în ceea ce priveşte mediul de cultură şi regulatorii de creştere constituie mediul S 2,5 suplinit cu
1,0 mg/l zeatină şi 0,02 mg/l ANA (acid naftil acetic).
4.2. Influenţa explantului, a mediului de cultură şi a regulatorilor de creştere asupra
activităţii calusului
În scopul determinării influenţei mediilor de cultură asupra procesului de calusogeneză au
fost testate mediile, compoziţia cărora este descrisă în Tabelul 1.
Tabelul 1.Componenţa mediilor pentru inducerea calusogenezei
MSI MSII MS MSIII S 2,5 B5 SH
Mediu
Vitamine MS MS MS MS S 2,5 B5 SH
Hormoni, BAP+ AIA+ BAP+ ANA+ ANA+ BAP+ BAP+
mg/l ANA 2IP ANA zeatină zeatină IBA AIA
0,5+0,25 0,5+0,25 0,25+0,1 0,25+ 0,5 0,02+1,0 0,04+0,2 1,0+0,25
Zaharoză, 25,0 25,0 25,0 25,0 25,0 25,0 25,0
g/l
Agar, g/l 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0
pH 5,8 5,8 5,8 7,0 7,0 5,8 5,8

După două săptămâni de cultivare, la nivelul explantelor cultivate pe mediile MS, B5 şi

S 2,5 a avut loc formarea calusului din explantele peţiol şi limb foliar. În cazul explantelor muguri
florali rezultate pozitive nu au fost atestate.

8
 Iniţial formarea calusului a fost depistată la explantele derivate din peţiol cultivate pe
mediul S 2,5 la a 14-ea zi de cultivare. Rezultate satisfăcătoare au fost înregistrate după 30 zile de
cultivare a explantelor peţiol pe mediile S 2,5; B5 şi MSI. În cazul explantelor provenite din limbul
foliar, formarea calusului a avut loc doar după 20 zile de cultivare pe toate mediile testate. Cele
mai bune rezultate s-au evidenţiat pe mediul B5, urmat de S 2,5 (Tabelul 2).

Tabelul 2. Dinamica formării calusului la Actinidia chinensis

Mediu pH Explant Explante ce au Explante ce au Explante ce au
format calus format calus format calus
după 14 zile; după 20 zile; după 30 zile;
% % %
S 2,5 7,0 peţiol 35,72±3,36 70,57±1,24 81,03±1,05
frunză 0 16,66±1,92 66,29±3,53
B5 5,6- peţiol 24,55±0,89 52,65±0,16 77,20±0,87
5,8 frunză 0 55,77±1,17 68,11±0,76
MSI 5,8 peţiol 22,09±1,72 61,00±0,55 79,57±0,94
frunză 0 24,51±2,12 60,08±2,16
MSII 5,8 peţiol 0 0 13,68±4,56
frunză 0 0 6,72±2,24

Din cele relatate putem conchide, că o evoluţie satisfăcătoare au manifestat explantele cu

origine peţiol pe mediul S 2,5, iar pentru limbul foliar mediu favorabil s-a adeverit a fi B5. Valorile
minime pentru ambele explante au fost depistate pe mediul MSII. Rezultatele obţinute relevă
faptul, că dinamica apariţiei calusului la Actinidia chinensis este determinată de mediul de cultură,
hormoni şi tipul de explant.
Observaţiile efectuate la această etapă au scos în evidenţă deosebiri în ceea ce priveşte
compactitatea şi culoarea calusului. Pe baza datelor prezentate în Tabelul 3 putem conchide, că
aceste caracteristici sunt dependente de mediul de cultură şi tipul explantului. Calusul consistent,
ce manifestă un interes practic a fost obţinut pe mediile MSI şi S 2,5 din explantele cu origine
peţiol.
Tabelul 3. Caracteristicile primare a calusului la Actinidia chinensis
Mediul Explant Culoarea Compactitatea
calusului (de la 1 - 5)
S 2,5 peţiol verde deschis 5,0
limb foliar verde intens 3,8
B5 peţiol verde pal 4,3
limb foliar verzui- alb 3,6
MSI peţiol verde-gălbui 4,6
limb foliar verde intens 3,8
cu pete brune
MSII peţiol verde pal 4,0
limb foliar verde intens 3,5

9
 Mediul Gamborg având ca supliment BAP şi AIA (acid indolilacetic) se caracterizează
printr-un potenţial calogenetic sporit, în special pentru explantele provenite din limbul foliar.
Calusul verde deschis pe parcursul subcultivărilor succesive capătă o nuanţă de verde albicios
(promoroacă) şi este destul de consistent. Spre deosebire de mediul S 2,5 pe mediul B5 se atestă o
creştere mai sporită şi abundentă a ţesutului calusal. Pe mediu MSI cu BAP şi ANA frecvenţa
formării calusului a fost mai joasă decât pe mediile sus-numite. Creşterea masei calusale într-un
randament mai sporit s-a înregistrat la explantele ce au originea peţiol. Pe mediul MSII cu adaos de
2iP (2-izopentiladenina) şi AIA, iniţial, s-a semnalat formarea calusului, dar creşterea şi
dezvoltarea lui de mai departe, la a 2-3 subcultură a încetat. Din aceste considerente s-a renunţat de
a utiliza în continuare această variantă de mediu nutritiv cu combinaţia dată de fitohormoni.
Mediile MSI cu BAP şi ANA, B5 cu BAP şi IBA (acid indolil butiric) şi S 2,5 cu zeatină
şi ANA s-au dovedit a fi favorabile pentru iniţierea şi menţinerea culturii de calus. Aceste medii au
fost utilizate în continuare pentru pasări succesive în vederea menţinerii calusului în cultură şi apoi
pasarea lui pe mediile ce manifestă proprietăţi morfogene.

4.3. Interacţiunea factorilor mediu de cultură – explant - fitohormoni

Experienţele de laborator conduse în scopul aprecierii influenţei factorilor mediu de cultură
– explant şi interacţiunii lor asupra procesului de calusogeneză s-au efectuat conform schemei de
analiză dispersională bifactorială.
În urma cercetărilor efectuate s-a stabilit, că frecvenţa medie a calusogenezei reprezintă
57,80% şi variază în funcţie de explant şi mediul nutritiv utilizat. Astfel, cota explantelor cu
rezultate pozitive în cazul iniţierii culturii din peţiol a constituit 63,48%, iar pentru limb foliar -
57,12%.
De menţionat, că cele mai semnificative valori ale frecvenţei calusogenezei în cazul iniţierii
culturii de calus din peţiol şi limb foliar s-au înregistrat pe mediile S 2,5, B5 şi MS1, iar valorile
minime s-au stabilit pe mediul MSII (Figura 3).

Influenţa mediului de cultură şi a explantului asupra

frecvenţei calusogenezei

90
80
70
60
50 MSII
%
40 B5
30 S 2,5
20 MSI
MSI
10 B5 S 2,5
0 MSII
1
2
1 - petiol
2 - frunza

Figura 3. Interacţiunea factorilor mediu de cultură – explant

10
 Prelucrarea statistică a datelor obţinute prin analiza dispersională bifactorială pune în
evidenţă o influenţă semnificativă asupra frecvenţei calusogenezei pentru factorul „mediul de
cultură” la nivel de 99,9% şi pentru factorul „tipul explantului” la nivel de 99%, contribuţia
majoră în variaţie (F=121,07) revine pe seama mediului de cultură selectat (Tabelul 4).

Tabelul 4. Rezultatele analizei dispersionale bifactoriale în cercetarea frecvenţei calusogenezei

(Testul ANOVA)
Sursa Suma Gradul de S2 Factorul
variaţiei pătratelor libertate Fisher
(F)
Mediul de cultură (A) 18183,1 3 6061,04 121,07***
Tip explant, (B) 773,503 1 773,503 15,45**
Interacţiunea AB 141,454 3 47,1515 0,94
Rezidual 800,967 16 50,0604
Total 19899,0 23
** ; *** - diferenţe semnificative pentru P≤ 0,01; P≤ 0,001
4.4. Dinamică dezvoltării explantelor limb foliar şi peţiol la Actinidia chinensis
cultivate in vitro
Comportarea explantelor ce au format calus variază în dependenţă de originea lor. Un
interes deosebit prezintă localizarea calusului format la explantele peţiol. În urma observaţiilor am
constatat, că diviziunea celulară în jurul ţesuturilor lezate a explantelor peţiol are loc atât în zona
apicală cât şi în cea bazală. Formarea calusului la nivelul ambelor zone poate fi explicată prin
aceea, că anume aceste suprafeţe se află în contact direct cu mediu de cultură şi de altfel, nu există
bariere fizice ca cuticula, perişorii prezenţi pe peţiol, în stabilirea legăturii dintre componenţii
substratului nutritiv şi explant. Diferenţa în dezvoltarea calusului în regiunea apicală şi cea bazală
a segmentului de peţiol poate fi explicată şi prin diferenţa stării ontogenetice de-a lungul acestuia.
După o perioadă de 2-3 săptămâni de cultivare a calusului s-a constatat, că în partea apicală s-a
format de 2-3 ori mai mult calus, decât în cea bazală.
Spre deosebire de calusul derivat din peţiol, acel format din limbul foliar este de
dimensiuni mai mici concentrat în special, la nivelul regiunilor lezate şi a nervaţiunilor. S-a
constatat, că potenţialul calusogenetic este diferit de-a lungul limbului foliar şi sporeşte de la bază
spre vârful de creştere.
În perioada subculturii III pe suprafaţa calusului provenit atât de la peţiol cât şi de la limb
foliar cultivat pe mediul S 2,5 au apărut nişte regiuni colorate în roşu-vişiniu, fapt ce denotă,
prezenţa antocianilor. Acest fenomen a fost descris la Actinidia anterior şi de Oliveira şi Pais
(1992), evidenţiind celule ce acumulează antocian. Prezenţa antocianilor la nivel de calus la
explantele derivate din limb foliar şi peţiol s-a confirmat în experienţele efectuate.

11
 4.5. Studierea aspectelor histologice la nivel de calus
Deosebirile morfologice evidenţiate la diferite explante ca limb foliar şi peţiol, cultivate pe
substratul nutritiv, au fost demonstrate şi la nivel histologic, în urma fixării calusului ce se afla la a
40-ea zi de cultivare. Calusurile obţinute din limb foliar sau peţiol inoculate pe mediul S 2,5
prezintă un aspect compact, de o culoare verde intensă. Asemenea calusuri se caracterizează
printr-o creştere organizată. Analiza histologică a permis de a evidenţia unele particularităţi de
structură specifice calusului compact.
Astfel, din punct de vedere morfologic se disting două tipuri de calusuri: morfogen şi
nonmorfogen. Conform tabloului histologic pentru calusul morfogen se remarcă amplasarea
compactă a celulelor parenchimale, la suprafaţa căruia se disting multiple zone morfogene alcătuite
din celule meristematice. În cazul calusului nonmorfogen, masa principală o constituie celulele
parenchimatice. După aspectul exterior prezintă un ţesut opalescent verde pal, ce manifestă o
creştere abundentă.
În urma analizei histologice efectuate, s-au evidenţiat deosebiri în structura
morfoanatomică a calusului morfogen în dependenţă de explant. Ţesutul calusal derivat din peţiol
are un aspect mai compact, în timp ce cel derivat din limb foliar prezintă un aspect mai difuz. În
ambele tipuri de calus sunt bine vizualizate celule parenchimatice vacuolizate cu spaţii
intercelulare mici, în interiorul cărora are loc acumularea amidonului.
În toate cazurile examinate printre celulele parenchimatice se disting celule ce
înmagazinează compuşi hipocromatici, care conform datelor literaturii se consideră a fi compuşi
antocianici. De regulă ele sunt distribuite la periferia calusurilor în apropierea centrelor morfogene
(Figura 4, 5).

x 150 x 150
Figura 4. Localizarea compuşilor Figura 5. Localizarea compuşilor
hipocromatici la calusul derivat din peţiol hipocromatici la calusul derivat din limb foliar

12
 5. ORGANOGENEZA IN VITRO LA ACTINIDIA CHINENSIS
Aspectul ulterior al cercetărilor a fost determinat de aprecierea tipului de calus format,
interes practic prezentând doar cel regenerativ. Iniţierea proceselor de organogeneză la Actinidia
chinensis este determinată de aşa factori ca: tipul explantului, mediul nutritiv şi regulatorii de
creştere.

5.1. Acţiunea factorilor mediul de cultură - explant - regulatorii de creştere asupra

iniţierii proceselor de organogeneză
În urma investigaţiilor efectuate s-a constatat, că diferenţierea ţesutului calusal s-a atestat în
cazul utilizării mediilor nutritive S 2,5 şi B5, în timp ce pe mediul MS declanşarea acestui proces
nu a fost evidenţiată. Studiul comparat al mediilor ce au manifestat o reacţie pozitivă în acest sens,
a scos în evidenţă o diferenţiere în ceea ce priveşte tipul organogenezei şi frecvenţa inducerii ei.
După 40 zile de cultivare in vitro pe mediu S 2,5 la nivel de calus a fost atestată iniţierea
organogenezei, manifestată prin formarea mugurilor, care mai apoi au dat naştere lăstarilor -
caulogeneza. Regulatorii de creştere BAP şi GA3 (giberilină) în mediu S 2,5 au contribuit la
alungirea plantei prin creşterea numărului de internoduri, precum şi creşterea numărului de lăstari
şi frunzuliţe. În cele din urmă putem conchide, că mediu S 2,5 împreună cu regulatorii de creştere
BAP (1 mg/l) şi GA3 (1 mg/l) prezintă un potenţial sporit în ceea ce priveşte procesul de regenerare
in vitro la Actinidia chinensis.
De menţionat, că pe mediu B5 (Gamborg 1968) de asemenea, a fost semnalizată iniţierea
procesului de organogeneză, manifestată, însă prin formarea rădăcinilor – rizogeneza. Pe acest
mediu, în afară de formarea rădăcinilor, s-a constatat şi o creşterea abundentă a masei calusale.
Rădăcinile transparente cu un geotropism negativ bine pronunţat sunt de culoare albă, care mai
apoi capătă o nuanţă verzuie şi pe suprafaţa cărora sunt bine vizibili perişori subţiri. Observaţiile
vizuale efectuate au scos în evidenţă faptul, că iniţierea procesului de regenerare la nivel de calus
are loc, în deosebi, în partea bazală a lui. În cazul dat formarea excesiva a masei calusale nu a
condus la derularea proceselor morfogenetice. Se poate conchide, că producţia de calus sporită
reduce procentul de organogeneză.
Făcând o paralelă între procesul de calusogeneză şi organogeneză putem afirma, că
frecvenţa lor diferă de la un explant la altul (Tabelul 5). Valoarea frecvenţei calusogenezei pentru
explantul peţiol este mai ridicată decât cea a organogenezei, iar în cazul limbului foliar, din contra,
procesul de proliferare a calusului este mai înalt în comparaţie cu cel de formare a lui.

13
 Tabelul 5. Particularităţile procesul de calusogeneză şi organogeneză

Explant Nr. Calusogeneza Organogeneza

de Nr. Min- Frecvenţa Nr. Min- Frecvenţa
exp. exp. Max calusoge- calus Max organoge-
calus nezei, % regene nezei, %
rativ
peţiol 71 58 77,27- 81,48±3,31 45 70,59- 76,88±4,82
88,00 86,36
limb 69 48 65,21- 69,46±2,89 35 61,11- 73,70±6,30
foliar 75,00 80,00

5.2. Analiza histologică comparativă a centrelor meristematice

Iniţierea proceselor de organogeneză la nivel de calus sunt demonstrate şi prin analizele
histologice efectuate. Rezultatele acestor investigaţii scot în evidenţă deosebiri neesenţiale în
structura ţesutului calusal derivat din peţiol şi din limb foliar, în ceea ce priveşte numărul şi
distribuirea centrelor morfogene. Conform acestor examinări aspectul tisular al calusului derivat
din limbul foliar prezintă zone morfogene mai abundente. La acea perioadă în ţesutul calusal
obţinut din peţiol centrele morfogene erau mai răzleţe, mai dispersate şi într-un număr mai redus.
Celulele centrelor morfogene sunt reprezentate prin celule meristematice, cu structură
tipică, ce sunt caracterizate printr-o citoplasmă compactă, bogată în organite celulare, în deosebi
cloroplaste.
Un interes deosebit prezintă distribuirea zonelor morfogene. Concomitent cu constatările
vizuale, analiza histologică a pus în evidenţă faptul, că zonele morfogene sunt distribuite la
suprafaţa calusului. Astfel, la nivelul calusul de kiwi, diviziunea celulară şi diferenţierea lui de mai
departe are loc în celulele straturilor exterioare (Figura 6, 7).

x 150 x 150
Figura 6. Distribuirea zonelor meristematice Figura 7. Distribuirea zonelor meristematice
la calusul din limb foliar la calusul din limb foliar

Mediile selectate pe care se cultivă calusul prezintă capacitate regenerativă, fapt demonstrat
prin începutul formării primordiilor foliare. Analiza histologică a relevat, că masa calusală constă

14
în interior din celule mari, parenchimatice, care se disting uşor prin citoplasma vacuolizată. La
periferie se constată multiple celule meristematice compact aranjate (Figura 8, 9)

x 150 x 150
Figura 8. Iniţierea proceselor morfogenetice Figura 9. Iniţierea proceselor morfogenetice
la calusul derivat din peţiol la calusul derivat din limbul foliar

5.3. Influenţa centrelor meristematice asupra procesului de morfogeneză

Din examinările secţiunilor semifine efectuate sub microscop s-a constatat, că numărul
centrelor meristematice în câmpul de viziune se reduce în dependenţă de originea calusului. Astfel,
la nivel de calus provenit din limbul foliar centrele meristematice sunt mai numeroase, în
comparaţie cu cele din peţiol. Este important de menţionat, că în timpul cultivării kiwi in vitro nu
toate centrele meristematice au evoluat în minilăstari. Reducerea semnificativă a numărului de
lăstari regeneraţi poate fi cauzată de anumiţi factori ca activitatea diferenţiată a genelor, absenţa
sau represia unora dintre ele la o anumită etapă de dezvoltare sau acumularea unor proteine
inhibitoare extracelulare etc.

5.4. Analiza comparată a minilăstarilor obţinuţi

Observaţiile efectuate au scos în evidenţă faptul, că geneza lăstarilor diferă de la un tip de
explant la altul. În cazul calusului derivat din peţiol s-au format 1-2 lăstari situaţi în partea apicală.
Apariţia lăstarilor la nivel de calus derivat din limb foliar a avut loc în diferite centre
meristematice, formând astfel o rozetă a câte 3-7 minilăstari. Lăstarii obţiniţi la nivelul calusului
au fost prelevaţi de pe acestea şi inoculaţi pe medii de cultură proaspete.
Este important de menţionat, că diferenţierea mugurilor în lăstari are loc doar până la un
anumit moment. Pe baza datelor experimentale am constatat, că pentru Actinidia chinensis este
caracteristic formarea lăstarilor până la a 3-4-a subcultură, care mai apoi încetează şi urmează
creşterea şi dezvoltarea ulterioară a lor .
Observaţiile efectuate la nivel de minilăstari în faza de menţinere au permis de a evidenţia
o creştere neuniformă a lor în aceeaşi perioadă de timp. Prezenţa lăstarilor la diferite etape de
dezvoltare în acelaşi timp, pe acelaşi calus, ne vorbeşte despre o asincronizare a procesului de

15
regenerare. Cercetările ulterioare au condus la determinarea caracteristicilor lăstarilor regeneraţi
prin organogeneză, ce ţin de numărul, lungimea lăstarilor şi a frunzuliţelor formate (Tabelul 6).

Tabelul 6. Comportarea explantelor pe mediul de menţinere

Explant Explante Nr. Nr. Lungimea Nr. total
cu organo- explante lăstari/ lăstarului, frunze
geneză cu lăstari calus cm
Peţiol 14 7 1,29 2,30±0,25 3,20±0,2
12 5 1,0 3,28±0,21 4,20±0,58
19 8 1,13 3,50±0,39 3,60±0,51
Limb 12 8 1,75 3,08±0,23 3,20±0,37
foliar 11 6 1,83 2,84±0,23 3,4±0,24
12 6 1,67 2,62±0,12 3,20±0,2

Astfel putem remarca faptul, că valoarea înregistrată a lungimii lăstarului şi numărul

frunzelor nu diferă semnificativ, deci nu depind de explant.

5.5. Testarea potenţialului de înrădăcinare in vitro

În cazul utilizării mediului lichid de înrădăcinare s-a constatat, că mediul MS s-a dovedit a
fi favorabil în acest scop. După trei săptămâni de menţinere în mediul lichid, la baza tulpinii s-au
atestat primele semne de formare a rădăcinilor alb-verzuie, acoperite cu perişori absorbanţi mici şi
subţirii.
Pentru a favoriza iniţierea rizogenezei în cazul tratării directe a bazei plantulei cu soluţie de
IBA (a. indolil butiric) în concentraţie de 750 mg/l timp de 10 şi 15 sec. cel puţin în condiţiile
noastre nu au dat rezultate.
S-a constatat, că înrădăcinarea regeneranţilor in vitro pe mediul rizogen MS cu BAP şi IBA
în concentraţie de 1,0 mg/l au dat rezultate satisfăcătoare pentru ambele tipuri de explante.
Formarea acestora a fost vizibilă după 20 zile de cultivare, prezentând o creştere cu un geotropism
negativ.
După 6 subculturi plantulele formate, au fost transferate în condiţii ex vitro, preventiv
fiind pregătit un substrat format din perlit şi nisip steril şi umezit în raport de 2:1, precum şi direct
în sol specializat. După 20 zile plantulele înrădăcinate în substratul de perlit şi nisip steril au fost
plantate în vase de cultură şi transferate în seră, pentru creşterea şi dezvoltarea ulterioară.

SINTEZA REZULTATELOR OBŢINUTE.

Durata întregului ciclu de dezvoltare a speciei Actinidia chinensis în condiţii de cultură in
vitro, care include în sine formarea calusului la nivel de explante, proliferarea ulterioară a lui,
manifestată prin procesul de formare a lăstarilor (caulogeneză) şi a rădăcinilor (rizogeneza), ce se

16
finalizează cu aclimatizarea şi transferul plantulelor în seră constituie 6-7 luni. Prin urmare toate
procesele morfogenetice, indiferent de explantul cultivat, schematic pot fi reprezentate în felul
următor (Figura 10)

EXPLANT

Sterilizare cu
diacid de 0,1%
STERILIZAREA Sterilizare materialului vegetal timp de 7 min
cu KMnO4-10 min

Mediul pentru inducerea calusului

• MS (0,5mg/l BAP, 0,25mg/l ANA; 25 g/l - zaharoză; pH=5,8)
• S 2,5 (1mg/l zeatină, 0,02mg/l ANA; 25 g/l - zaharoză; pH=7,0)
• B5 (0,04 mg/l BAP, 0,2 mg/l IBA; 25 g/l - zaharoză; pH=5,8)

Intervalul
dintre
Condiţiile de cultivare: 22°C, subculturi
fotoperioada 16 ore lumină, 8 ore
întuneric 30 zile

Mediul de menţinere-proliferare
• S 2,5 (1 mg/l BAP şi 1 mg/ GA3; 25 g/l - zaharoză; pH=7,0)

4-5 săptămăni

Mediul pentru înrădăcinare

• MS (BAP-1mg/l şi IBA-1mg/l; 25 g/l - zaharoză; pH=7,0)

30 zile

Transferarea în condiţii ex vitro

în camera de cultivare
Substratul de
înrădăcinare:
20 zile perlit şi nisip
steril (2:1)
umezit
Condiţii de cultivare: 24°C, cu
lumină continuu

Creşterea şi dezvoltarea
în seră

Total: 6-7 luni

Figura 10 Protocolul de înmulţire in vitro la Actinidia chinensis

17
 CONCLUZII:
1. În iniţierea culturii in vitro la Actinidia chinensis cea mai reuşită dezvoltare a fost marcată la
explantele limb foliar şi peţiol, inoculate pe mediu S 2,5 cu adaos de 1mg/l zeatină şi 0,02mg/l
ANA.
2. Iniţierea procesului de calusogeneză s-a constatat pe mediile S 2,5; MSI, MSII; B5 după două
săptămâni de cultivare la explantele peţiol, urmat de limbul foliar. Dinamica apariţiei calusului
la Actinidia chinensis este determinată de mediul de cultură, hormoni şi explant.
3. Cercetările efectuate au scos în evidenţă faptul, că frecvenţa medie a calusogenezei constituie
57,80% şi nu depinde de tipul explantului. Valori înalte s-au atestat pe mediile S 2,5, B5 şi
MSI în cazul iniţierii culturii de calus din peţiol.
4. Din punct de vedere morfologic şi funcţional se disting două tipuri de calusuri: morfogen şi
nonmorfogen.
5. Cercetarea efectuată a scos în evidenţă procesul de organogeneza indirectă, manifestată prin
caulogeneză înregistrată pe mediul S 2,5 şi rizogeneza - pe B5.
6. S-a constatat, că pentru Actinidia chinensis este caracteristic distribuirea zonelor morfogene în
straturile superioare a calusului.
7. Procesul de geneză a lăstarilor variază în funcţie de originea calusului. În cazul calusului
derivat din peţiol s-au format 1-2 lăstari situaţi în partea apicală, în timp ce pe cel derivat din
limbul foliar, formarea lor a avut loc concomitent în diferite centre morfogene.
8. Cele mai bune rezultate privind rizogeneza la plantule au fost înregistrate pe mediu de cultură
MS suplinită cu BAP (1mg/l) şi IBA (1mg/l).
9. Caracteristicile biomorfologice complexe şi cerinţele faţă de condiţiile mediului ambiant
permit de a constata o reală posibilitate de introducere în cultură a speciei Actinidia chinensis,
în Republica noastră, în special în microarealuri protejate fără riscuri microclimatice.

RECOMANDĂRI PRACTICE
Pentru utilizarea practică se recomandă:
1. La etapa de iniţiere a culturii in vitro a preleva materialul vegetal în faza de creştere intensivă a
plantei de kiwi, în lunile martie-aprilie;
2. În procesul de sterilizare durata de menţinere maximă a explantelor în soluţia sterilizantă
trebuie să nu fie mai mult de 7 minute, în caz contrar, există riscul de a pierde matrialul
selectat;
3. Cultivarea in vitro se recomandă de a fi iniţiată pe mediul S 2,5 (Standardi A., 1981) cu o
balanţă hormonală alcătuită din zeatină 1,0 mg/l şi ANA 0,25 mg/l, cu pH=7,0. După inoculare
vasele cu explante trebuie menţinute la întuneric timp de 7 zile. În vederea declanşării

18
 proceselor morfogenetice cel mai eficient mediu este S 2,5 cu fitohormonii BAP (1,0 mg/l) şi
GA3 (1,0 mg/l). Înrădăcinarea de a efectua pe MS mediu cu BAP (1mg/l) şi IBA (1,0 mg/l);
4. Plantarea Actinidie se recomandă de a fi efectuată în locuri parţial umbrite, în apropierea
bazinelor acvatice pe soluri argilo – nisipoase cu pH - ul 5,5 - 7,5.
LISTA
lucrărilor ştiinţifice publicate la tema tezei
Articole ştiinţifice în reviste cu recenzenţi:
1. Romanciuc, Gabriela. Aspecte ale organogenezei in vitro la plantele speciei Actinidia chinensis
Planch. Chişinău, Rev. şt. “Studia Universitatis”, 2008, nr.7 (17), p. 72-75.
2. Romanciuc, Gabriela. Particularităţile bioecologice ale speciilor de cultură din genul Actinidia
în condiţiile Rep. Moldova. Chişinău, Mediul ambiant, 2008, nr.3(39) iunie, p.1-7
Articole în culegeri ştiinţifice:
3. Romanciuc, G., Ciorchină, N. Particularităţile regenerării unor specii ale genului Actinidia. În
mat-lele Simp. Naţ. „Agrobiodiversitatea vegetală în Republica Moldova: Evaluarea,
Conservarea şi Utilizarea”, Chişinău, 26-27 iunie, 2008, p.266-274.
4. Romanciuc, Gabriela. Particularităţile potenţialului morfogenetic a speciei Actinidia chinensis
în condiţii in vitro. În mat-lele Conf. Naţ. cu part. Internaţ. „Probleme actuale ale geneticii,
fiziologiei şi ameliorarea plantelor, 9-10 octombrie 2008, p.429-434.
5. Romanciuc, Gabriela. Particularităţile procesului de calusogeneză la specia Actinidia chinensis.
În mat-lele Conf. Naţ. cu part. Internaţ. „Probleme actuale ale geneticii, fiziologiei şi
ameliorarea plantelor, 9-10 octombrie 2008, p.435-442.
6. Romanciuc, G., Ciubotaru, A. Stabilirea metodologiei de microînmulţire a speciei Actinidia
chinensis Planch. În Simp. şt. Internaţ. „Agricultura modernă – realizări şi perspective”,
Chişinău, 21-23 octombrie, 2008, p. 124-128.
7. Romanciuc, Gabriela. Optimizarea mediilor de cultură pentru inducerea calusogenezei şi
regenerarea plantelor la Actinidia chinensis. În Simp. şt. Internaţ. „Agricultura modernă –
realizări şi perspective”, Chişinău, 21-23 octombrie, 2008, p. 129-132.
Teze şi prezentări la forurile naţionale şi internaţionale:
8. Romanciuc, G., Ciubotaru, A., Sofronii, M. Calusogeneza obţinută din frunze la Actinidia
chinensis. Congresul II al Societăţii de Botanică din Rep. Moldova: „Biodiversitatea vegetală a
Republicii în preajma mileniului III”, Chişinău, noiembrie 1998; p.96.
9. Ciubotaru, A., Romanciuc, G., Derid, E., Sofronii, M. Testarea posibilităţii de înmulţire in
vitro la Actinidia ssp. Congresul II al Societăţii de Botanică din Republica Moldova:
„Biodiversitatea vegetală a Republicii în preajma mileniului III”, Chişinău, noiembrie 1998;
p.72.

19
 ADNOTARE

la teza de doctor în biologie cu tema „Cercetarea proceselor de dezvoltare şi multiplicare

microclonală in vitro la Actinidia chinensis Planch.” specialitatea 03.00.05-botanica a dnei
Romanciuc Gabriela
Cuvinte cheie: Actinidia chinensis, cultura in vitro, mediul de cultură, calus, fitohormoni, centre
meristematice, organogeneza, plantule.

Lucrarea prezintă rezultatele cercetării în domeniul cultivării în condiţii in vitro a speciei

Actinidia chinensis. Scopul acestui studiu constituie testarea fazelor de iniţiere şi multiplicare in
vitro a speciei luată în studiu, prin optimizarea mediilor de cultură şi a balanţei hormonale.
Capacitatea proliferativă şi organogenetică a calusului obţinut a fost studiată pe o durată de 6-7
subculturi.
Ca explante primare au fost utilizate fragmente de frunze şi peţiol, la nivelul cărora s-a
efectuat un studiu comparat al capacităţii de regenerare. La etapa de iniţiere a culturi in vitro, în
calitate de medii nutritive au fost folosite mediile MS, B5, S 2,5 suplinite cu regulatorii de creştere
BAP, zeatină, IBA, ANA, 2,4 -D, 2 IP şi GA3. În dependenţă de etapa de cultivare s-a recurs la
utilizarea unui raport diferit de fitohormoni. Fragmente de ţesuturi în primele 7 zile au fost
menţinute la întuneric, care mai apoi au fost transferate în camera de cultivare, creându-se condiţii
optime de creştere şi dezvoltare ca: fotoperioadă 16 ore lumină şi 8 ore întuneric, temperatura de
24 ± 1°C. Iniţial formarea calusului a avut loc pe mediul S 2,5 după 14 zile de cultivare, ce
reprezenta o structură compactă de un verde intens. În urma analizei histologice la nivel de ţesut
calusal au fost puse în evidenţă formarea a două tipuri de calus: morfogen şi nonmorfogen.
Iniţierea proceselor morfogenetice la nivel de calus a fost condiţionată de formarea
centrelor morfogene, constituite din celule meristematice, ce au capacitatea de a prolifera şi
regenera. Cultivarea ulterioară a ţesutului calusal pe mediul de regenerare S 2,5 suplinit cu 1,0
mg/l BAP şi 1,0 mg/l GA3 a condus la dezvoltarea centrelor morfogene, soldate cu înregistrarea
organogenezei indirecte manifestate prin formarea mugurilor - caulogeneza, atestată pe mediul S
2,5 şi paralel formarea rădăcinilor (rizogeneza) pe mediul B5. Cercetările efectuate la această etapă
de cultivare au permis de a face concluzia că anume mediul 2,5 S este cel mai eficient pentru
regenerarea Actinidia chinensis în condiţii in vitro. Formarea plantulelor pe mediul S 2,5 a fost
constatată după 4-5 luni de cultivare, după care a urmat etapa de înrădăcinare. Plantulele obţinute
au fost plantate în vase de cultură şi transferate în seră, pentru creşterea şi dezvoltarea ulterioară.

20
 АННОТАЦИЯ
к диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук,
специальность 03.00.05- ботаника, автора
Романчук Габриела
на тему: „Изучение процессов развития и размножения in vitro у Actinidia
chinensis Planch.”
Ключевые слова: актинидия китайская, культура in vitro, питательные среды,
фитогормоны, каллус, меристематические центры, органогенез, растения-регенеранты

В работе представлены результаты научных исследований в области

культивирования в условиях in vitro вида Actinidia chinensis. Цель исследований состояла в
определении оптимального сочетания питательных сред и регуляторов роста на этапах
введения в культуру in vitro и собственно микроразмножения. Изучен регенерационный
потенциал актинидии на протяжении 6-7 пассажей.
В качестве первичных эксплантов были использованы фрагменты листовой
пластинки и черешка, на уровне которых было проведено сравнительное изучение их
регенерационной способности. На этапах введения в культуру in vitro в качестве основных
питательных сред, использовали среды MS, B5, S 2,5 в состав которых, в зависимости от
этапа культивирования, вводили экзогенные регуляторы роста как БАП, зеатин, ИМК, НУК,
2,4-Д, ГК3. Фрагменты тканей в течение первых 7 дней культивировали в темноте, а затем,
культуральные сосуды с эксплантами перенесли в условия фотопериода 16/8 часов
свет/темнота, при 24 ±1°С. Каллусы были получены через 14 дней культивирования на
питательной среде S 2,5, которые представляли собой плотное зелёноватое образование. В
результате гистологического анализа каллусной ткани было отмечено образования двух
типов каллуса, а именно морфогенный и неморфогенный.
Начальным этапом морфогенеза in vitro в каллусе, явилось формирование
морфогенетических очагов, представленными главным образом меристематическими
клетками, способными к пролиферации и непосредственной регенерации. После переноса
каллусов на питательную среду для регенерации S 2,5, в ходе дальнейшего культивирования
in vitro морфогенетические очаги дают начало таким путям органогенеза как ризогенез на
среде В5 и геммогенез на среде S 2,5. К 4-5 месяцу культивирования на питательной среде S
2,5 образовались проростки растений–регенерантов, которые нормально росли и
развивались. После этого растения–регенеранты извлекали из пробирок и переносили в
условия ex vitro в вегетационные сосуды с почвой.

21
 SUMMARY

Gabriela Romanciuc, “The study of development and in vitro multiplication of Actinidia

chinensis Planch.” Doctor thesis in Biology, Chisinau, 2009

Key words: Actinidia chinensis, in vitro culture, medium, plant hormones, callus, meristematic
centers, organogenesis, regenerated plants.

This work contains the results of scientific researches of in vitro plant regeneration of
Actinidia chinensis Planch. The aim of this study was the establishment of the optimal relationship
between culture medium, growth regulators and culture conditions for all stages of
micropropagation of mentioned specie.
An efficient plant regeneration protocol for Actinidia chinensis was developed via
organogenesis from the leaf blades and petioles. The explants were cultured on different medium
such as S 2,5 (Standardi A. 1983), B5 (Gamborg, 1968), MS (Murashige-Skoog, 1962) with
different concentrations of exogenous plant hormones as BAP (benzyladenine), Zeatin, IBA
(indole-3-butyric acid), ANA (α-naphthaleneacetic acid), 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid)
and GA3 (gibberellic acid). The first seven days the explants were kept in the dark and then
transferred in the culture room. The cultures were incubated at a temperature of 24±1°C under 16-
h photoperiod with illumination by white fluorescent light with an intensity of 2000. The callus
initiation started in about two weeks after inoculation. Optimal callus induction was established for
S 2,5 medium with 0,02mg/l ANA and 1,0 mg/l Zeatin for all types of explants. Was distinguished
two types of callus present in culture: morphogenetic and nonmorphogenic, which differed not
only in their capacity for organ formation, but also in their structure, appearance and morphology.
Histological studies of calli segments confirmed this fact after 4-5 month of cultivation. The callus
was subcultured into regeneration medium. This medium was S 2,5 added with 1,0 mg/l BAP and
1,0 mg/l GA3 which was established more effective for shoot formation and plant regeneration,
especially for Actinidia culture. Histological examination revealed the presence of meristematic
centers in morphologic callus after one month of culture on regeneration medium. These centers
consisted of meristematic cells with regeneration ability. Cells with numerous starch grains were
presented adjacent to these centers. Transferring regenerated shoots without roots to new rooting
medium produced whole fertile plants.

22
 ROMANCIUC Gabriela

CERCETAREA PROCESELOR DE DEZVOLTARE ŞI

MULTIPLICARE MICROCLONALĂ IN VITRO
LA ACTINIDIA CHINENSIS PLANCH.

03.00.05 – Botanică

Autoreferatul tezei de doctor în biologie

Bun de tipar 08.07.2009. Coli de tipar 1,0

Comanda: Tiraj 40 ex.
Tipografia

23