Notiuni generale - Cromatografia

Cromatografia este o metoda de separare si analiza a substantelor chimice din amestecuri,

care se bazeaza pe interactiunea diferentiata a doi sau mai multi compusi de separat (numiti soluti)
cu doua faze cromatografice: faza mobila si faza stationara.

Izolarea substantelor chimice din amestecuri si id 525j99f entificarea componentelor a

reprezentat întotdeauna una dintre obiectivele prioritare ale chimiei. La ora actuala nu numai în
chimia analitica ci si în tehnologia chimica se manifesta o cerere din ce in ce mai mare de compusi
cu puritate foarte avansata. Separarea amestecurilor în componente este o operatie esentiala care
permite obtinerea acestora într-o stare cât mai pura. Aceasta separare se poate face la scara
analitica, daca ne intereseaza sa cunoastem numai compozitia amestecului sau la scara preparativa,
daca vrem sa obtinem fizic componentele separate.

În prezent exista un mare numar de metode de separare care si-au gasit aplicatii în chimie.
Fiecare dintre aceste metode poate cuprinde mai multe tehnici de separare. Cele mai importante
dintre metode de separare sunt cele bazate pe echilibrul între faze, care valorifica diferenta dintre
proprietatile de distributie ale componentelor unui amestec între doua faze nemiscibile aflate în
contact. Asemenea metode sunt distilarea, cristalizarea, precipitarea, sublimarea, extractia. Aceste
metode, cunoscute si aplicate de multa vreme, s-au dovedit a fi insuficiente atunci când s-a pus
problema separarii unor amestecuri foarte complexe si a fost nevoie de dezvoltarea unor noi
metode, printre care s-au impus mai ales cele cromatografice.

Principalele avanteje pe care le prezinta cromatografia ca metoda de separare sunt:

- Permite separarea, identificarea si dozarea cantitativa simultana a componentelor unui

amestec.

- Se poate aplica unui numar foarte mare de produse, practic orice compus organic
putând fi separat printr-o metoda cromatografica

- Sensibilitatea metodelor cromatografice este extrem de ridicata, ceea ce înseamna ca

necesita doar cantitate foarte mica de proba. În acelasi timp însa se pot aplica si la scara
preparativa.

- Durata analizei este redusa, comparativ cu alte metode de analiza ale amestecurilor
complexe.

1.1. Istoric

Cromatografia a fost initiata în 1901 de botanistul rus Tswet, care a separat niste pigmenti
vegetali pe o coloana umpluta cu carbonat de calciu, folosind ca eluent eterul de petrol. Denumirea
de cromatografie pe care a dat-o acestei metode provine de la faptul ca initial a folosit-o pentru
separarea unor coloranti (chromos = culoare, graphos = scriere în limba greaca).

Urmatorul pas important în dezvoltarea cromatografiei a fost facut în 1941, când A. Martin
si R. Synge au initiat cromatografia lichida de repartitie pe coloana, pentru care au primit ulterior
Premiul Nobel pentru chimie în 1952. Ei au separat aminoacizi acilati pe o coloana ce continea
silicagel saturat cu apa, iar drept faza mobila au utilizat n-butanol saturat cu apa. În 1944, au fost
puse bazele cromatografiei pe hârtie, prima forma de cromatografie planara, iar cromatografia de
schimb ionic este utilizata începând din 1947. Începuturile cromatografiei de gaze se leaga tot de
numele lui Archer J.P. Martin, care împreuna cu A.T. James a separat acizi organici volatili pe o
coloana de sticla umpluta cu Celite acoperita cu ulei siliconic, utilizând ca faza mobila azotul.

Cromatografia pe coloane cu gel a fost initiata în 1959 de Porath si Flodin, iar cea de
bioafinitate se utilizeaza din 1967. Cromatografia de lichide moderna pe coloana, numita de înalta
performanta sau de înalta presiune (HPLC) poate fi datata la începutul anilor 1960 si se bazeaza pe
lucrarile lui Csaba Horváth, efectuate la Univesitatea Yale.

1.2. Principiul separarii cromatografice

Principiul de baza al separarii cromatografice consta în distributia inegala a componentelor unui amestec între faza mobila si
faza stationara. Acest amestec strabate sistemul cromatografic, fiind antrenat de catre faza mobila. Distributia inegala este
determinata fie de afinitatea diferita a componentelor amestecului fata de cele doua faze, fie de capacitatea diferita de a difuza
în acestea. Acest principiu este ilustrat în Figura 1.1, pe un exemplu din cromatografia de gaze pe coloane capilare. Aceste
coloane se caracterizeaza prin faptul ca faza stationara se gaseste depusa în strat foarte subtire pe peretii coloanei.

Figura 1.1. Principiul separarii cromatografice

Moleculele celor doi compusi, 1 si 2 care se gasesc în momentul initial ametecate, într-un
volum restrâns, vor avea tendinta de a se transfera continuu din faza mobila în faza stationara si
invers, din cauza agitatiei termice. Deoarece moleculele compusului 2 au o afinitate mai mare fata
de faza stationara, ele vor fi mai puternic retinute în aceasta faza. Drept urmare, dupa un anumit
interval de timp se va înregistra o ramânere în urma a acestei componente, comparativ cu
componenta mai slab retinuta 1. Trebuie remarcat faptul ca aceasta separare are loc în timpul
deplasarii în coloana, deci este in proces dinamic.

1.3. Clasificarea metodelor cromatografice

Exista o serie de criterii pe baza carora se poate face o clasificare a metodelor
cromatografice: mecanismul separarii, natura fazelor cromatografice, configuratia sistemului
cromatografic, etc.
1. Clasificarea în functie de mecanismul separarii

1.1. Cromatografie de adsorbtie

1.2. Cromatografie de repartitie

1.3. Cromatografie cu faze chimic legate

1.4. Cromatografie de schimb ionic

1.5. Cromatografie de excluziune

1.6. Cromatografie de afinitate

În functie de mecanismul separarii, metodele cromatografice se clasifica în:

- Cromatografie de adsorbtie, în care fenomenul principal care sta la baza separarri este
adsorbtia, iar afinitatea componentelor pentru cele doua faze este în functie de
coeficientii lor de adsorbtie.

- Cromatografie de repartitie, în care fenomenul care determina separarea este extractia

si separarea componentelor se face în functie de diferenta dintre coeficientii lor de
repartitie între cele doua faze.

- Cromatografie cu faze chimic legate, care este intermediara între cromatografia de

adsorbtie si cea de repartitie, fiind o combinare a acestora.

- Cromatografia de schimb ionic, care are la baza interactiunile electrostatice si difuzia,

iar separarea componentelor se face în functie de sarcinile lor electrice, constantele de
disociere si diametrul efectiv al ionilor.

- Cromatografia de excluziune (numita si cromatografie pe gel), în care fenomenul

principal este difuzia, iar separarea se face în functie de marimile efective ale
moleculelor componentelor.

- Cromatografia de bioafinitate, în care separarea are loc datorita unor interactiuni

biochimice specifice cu asa-numitele grupari de afinitate.

Trebuie mentionat ca în afara în practica cromatografica se întâlnesc si variante

intermediare sau mixte între aceste tipuri principale si ca exista si alte tipuri de cromatografie, care
sunt însa mai putin uzuale.

2. Clasificarea în functie de natura fazelor cromatografice

2.1. Cromatografie de gaze

2.1. Gaz-lichid (GLC)

2.2. Gaz-solid (GSC)

 2.2. Cromatografie de lichide

2.1. Lichid-lichid (LLC)

2.2. Lichid-solid (LSC)

2.3. Cromatografie cu fluide supercritice (SFC)

În functie de starea de agregare a fazei mobile, avem trei tipuri de cromatografie: gazoasa,
lichida si cu fluide supercritice. Fiecare dintre acestea se subîmparte în functie de natura fazei
stationare, care poate fi solida sau lichida. În cazul cromatografiei cu fluide supercritice în
denumire nu se face referire la natura fazei stationare. Mai trebuie precizat ca în cazul în care faza
stationara este lichida, ea trebuie fixata pe un suport solid corespunzator, în general un material
poros.

3. Clasificarea în functie de configuratia sistemului cromatografic

3.1. Cromatografie pe coloana

3.1. Cromatografie pe coloane clasice (cu umplutura)

3.2. Cromatografie pe coloane capilare

3.2. Cromatografie planara

3.1. Cromatografie în strat subtire

3.2. Cromatografie pe hîrtie

În functie de configuratia sistemului cromatografic, avem cromatografie pe coloana si

cromatografie planara. Cromatografia pe coloana cuprinde cromatografia pe coloane clasice (cu
umplutura) si cromatografia pe coloane capilare (numite si coloane tubulare deschise).
Cromatografia planara cuprinde la rândul ei cromatografia pe hârtie si cromatografia în strat
subtire.

1.4. Schema de principiu a cromatografului

Este prezentata în Figura 1.2. Faza mobila care se gaseste într-un rezervor de faza mobila 1
trece printr-un dispozitiv de masurare si reglare a debitului 2, apoi ajunge în dispozitivul pentru
introducerea probei 3. Aici are loc preluarea probei de catre faza mobila, peoba fiind în continuare
transportata prin coloana cromatografica 4, unde are loc separarea componentelor. Coloana 4 se
gaseste în mod uzual într-o incinta termostatata (cuptor în cazul cromatografiei de gaze) pentru ca
analiza sa se desfasoare la o temperatura stabilita. Componentele separate ajung în detectorul 5,
unde fiecare componenta este pusa în evidenta sub forma unui semnal distinct. Aceste semnale
sunt înregistrate de un înregistrator 6 sau reprezinta semnalul de intrare al unui sistem de achizitii
de date (integrator sau calculator) care permite prelucrarea si stocarea rezultatelor.
 1 - rezervor faza mobila

2 - dispozitiv de reglare si

masurare a debitului

3 - dispozitiv de introducere a

probei

4 - coloana cromatografica

5 - detector

6 - înregistrator sau integrator

Probǎ →

Figura 1.2. Schema de principiu a cromatografului

Diagrama care reprezinta rezultatul analizei cromatografice se numeste cromatograma. Ea

este înregistrata în general ca o functie a intensitatii semnalului detectorului în raport cu timpul.
Semnalul corespunzator fiecarei componente care apare în cromatograma se numeste pic
cromatografic, iar aria picului este proportionala cu concentratia componentei respective. În cazul
cromatografiei planare, cromatograma este chiar placa sau hârtia pe care a avut loc analiza, iar
componentele sunt evidentiate sub forma unor spoturi. Un exemplu de cromatograma este data în
Figura 1.3.
 Figura 1.3. Analiza
cromatografica a unui amestec de hidrocarburi. Fiecare pic cromatografic reprezinta câte o componenta separata.