Interferon I

4
REFERATE GENERALE
O JUMTATE DE SECOL DE CERCETARE N DOMENIUL INTERFERONILOR

Half a Century of Research in the Field of Interferons
1Institutul
Marius Corniescu1, Teodora Corniescu2 de Virusologie tefan S. Nicolau al Academiei Romne, Bucureti, Romnia 2University of Giessen Lung Center (UGLC), Germania
REZUMAT
Interferonii reprezint glicoproteine semnalizatoare sintetizate de celulele organismelor vertebrate ca rspuns la detecia unor modele moleculare asociate patogenilor i care transmit n mediul tisular mesajul inductor al unor stri celulare refractare pentru replicarea acestora. Existena interferonilor a fost postulat acum mai mult de o jumtate de secol, iar timpul scurs de atunci a adus un flux continuu de informaii privind proprietile lor i privind mecanismele prin care i desfoar aciunea. Prezentul articol trece n revist principalele etape din procesul de descifrare a mecanismelor de aciune ale interferonilor i ofer o imagine de ansamblu asupra cunotinelor acumulate. Cuvinte cheie: interferoni.
ABSTRACT
Interferons are signaling glycoproteins synthetized by the cells of vertebrate organisms in response to the detection of pathogen-associated molecular patterns that transmit into the tissular environment the inducing message for cellular states refractory to the pathogen replication. The existence of interferons was postulated more than half a century ago and the passed time brought a continuous flux of information regarding their properties and mechanisms of action. The present article reviews the main events that occurred in the deciphering of the mechanisms of action of interferons and gives an overview of the accumulated knowledge. Key words: interferons.
Interferonii sunt glicoproteine cu rol de declanare a unor mecanisme celulare de aprare produse, la majoritatea vertebratelor, ca rspuns la detecia n celule a unor modele moleculare percepute ca strine organismului (n general componente microbiene). Interferonii aparin clasei mari de glicoproteine citokine, fiind primele citokine purificate la omogenitate, clonate, secveniate complet, produse n form recombinant i aplicate clinic pe scar larg.
I. ISTORICUL CERCETRII N DOMENIUL INTERFERONILOR

Postularea existenei interferonilor n anumite condiii experimentale, celulele animale infectate cu un virus nu susin creterea unui al doilea virus, nrudit sau nu. Acest fenomen de inhibiie de ctre un virus a replicrii altui virus, cunoscut sub numele de interferen viral, a fost observat de mult timp. n 1804, medicul britanic Edward Jenner, iniiatorul n medicin al metodei
Adresa de coresponden: Marius Corniescu, Institutul de Virusologie tefan S. Nicolau, os. Mihai Bravu, Nr. 285, Sector 3, Bucureti email: mariuscornitescu@yahoo.com
98
REVISTA ROMN DE BOLI INFECIOASE VOL. XII, NR. 2, AN 2009
99
vaccinrii, comunica ntr-o scrisoare ctre editor n revista Medical and Physical Journal c afeciunile herpetice au mpiedicat deseori virusul vaccinal s i produc activitatea corect (56). Fenomenul de interferen viral a fost pentru prima dat numit astfel de ctre cercettorii britanici Gerald Findlay i Frank MacCallum n 1937. Acetia au observat c infecia cu virusul febrei Vii Rift a protejat maimuele de infecia cu virusul nenrudit al febrei galbene (25). n anii 1940 virusologii americani Werner i Gertrude Henle au artat c fenomenul de interferen poate fi studiat convenabil n oul de gin embrionat (45). Folosirea acestui sistem evita factori complicani de la experimentele pe animale de laborator, precum faptul c animalele de laborator dezvolt adesea infecii supraadugate, cu ageni greu de detectat; de asemenea, sistemul imun la psri este mai puin complicat dect la mamifere, iar oul de gin este un sistem experimental mai uor de manipulat i mai economic dect cel reprezentat de animalele de laborator. Multe experimente eseniale privind interferena viral, inclusiv experimentele din 1957 ale lui Isaacs i colab., au fost desfurate pe modelul oului de gin embrionat. n anii 1950 au fost evaluate mai multe posibile explicaii pentru fenomenul de interferen viral: (1) Anticorpii neutralizani indui de virusul inductor. Aceast explicaie poate fi rapid exclus, avnd n vedere c fenomenul de interferen se observ la cteva ore dup tratamentul cu virusul inductor i, n plus, se manifest nu numai mpotriva unui virus de acelai tip (interferen homotipic), ci i mpotriva virusurilor de tipuri diferite (interferen heterotipic). (2) Consumul de ctre virusul inductor a unor factori ai gazdei eseniali pentru replicarea virusului secund (interferat). Aceasta era explicaia unanim acceptat n anii 1950 pentru fenomenul de interferen viral, nainte s fie afirmat existena interferonului. (3) Sinteza activ de ctre gazda infectat cu virusul inductor a unor factori care induc, pentru o perioad de timp, o stare refractar fa de o nou infecie viral. Aceast explicaie a fost postulat n anii 1950 de dou grupuri independente de cercettori, un grup de la Universitatea Tokio, Japonia, i un grup de la National Institute for Medical Research, Marea Britanie. n ncercarea de a dezvolta un vaccin mbuntit pentru variol, doi virusologi japonezi, Yasuichi Nagano i Yasuhiko Kojima, de la
Institutul pentru Boli Infecioase al Universitii din Tokyo, au efectuat experimente n care inoculau cutanat iepuri cu virus variolic inactivat prin iradiere cu lumin ultraviolet, iar dup un interval administrau la acelai sit virus variolic viu i urmreau reacia tisular la 7 zile post-infecia cu virus viu. Virusul variolic folosit pentru inducia interferenei era produs tot pe iepure, recoltat sub form de omogenate tisulare i apoi inactivat. Cercettorii japonezi au observat c exista o diferen ntre gradul de inducie a interferenei de ctre omogenate inductoare recoltate la 3, respectiv 5 zile postinfecie (omogenatul de la 5 zile avnd activitate inductoare a interferenei crescut), dei titrurile virale din omogenate erau aceleai. Ei au emis ipoteza c acest lucru s-a ntmplat din cauza sintezei de ctre gazd a unui factor inhibitor viral i au nceput s l caracterizeze prin fracionarea prin ultracentrifugare a omogenatelor tisulare inductoare. Au publicat aceste descoperiri n 1954 n revista francez Comptes Rendus des Sances de la Socit de Biologie et de ses Filiales (cu nume schimbat n 1999 in Journal de la Socit de Biologie) (85). Dei aceast lucrare a demonstrat c activitatea de interferen a replicrii (i deci factorul inhibitor viral) era asociat unei fraciuni moleculare separabile de particulele virale, nu a putut explica faptul c au obinut cu aceast fraciune inducia de anticorpi antivirali. O alt lucrare, din 1958, care a descris folosirea unei triple ultracentrifugri a omogenatului, a demonstrat c factorul inhibitor a fost distinct de particulele virale i c imunizarea antiviral din experimentele din 1954 se datorase unei contaminri cu urme virale a fraciunii inhibitoare virale (86). Din pcate, munca lui Nagano nu a fost apreciat pe deplin de-a lungul timpului, meritul pentru descoperirea interferonului atribuindu-li-se n general lui Isaacs i Lindenmann. Virusologul britanic Alick Isaacs i cercettorul elveian Jean Lindenmann, de la National Institute for Medical Research din Londra, au emis ipoteza existenei unui factor de interferen viral produs de gazda infectat, studiind interferena produs de virusul gripal inactivat termic asupra creterii virusului gripal viu n membrane corioalantoidiene de ou de gin aflate ntr-o soluie nutritiv. Studiul interferenei induse de virusurile gripale inactivate termic asupra replicrii virusurilor gripale vii n oule de gin embrionate era un subiect de cercetare mai vechi al lui Isaacs. Acesta publicase anterior lucrri cu colaboratori din Australia folosind acest sistem experimental (51 i
100
seria). La mijlocul anilor 1950 Isaacs conducea la Londra laboratorul World Influenza Centre, stabilit de National Institute for Medical Research n colaborare cu Organizaia Mondial a Sntii drept centru al unei reele globale de laboratoare colaboratoare pentru studiul virusurilor gripale. mpreun cu cercettorul postdoctoral elveian Jean Lindenmann, Isaacs a stabilit un sistem nou de lucru, n care foloseau fragmente de membran corioalantoidian de ou de gin, n mediu nutritiv, n loc de ou de gin embrionate ntregi, pentru a scdea efortul financiar i uman implicat de experimentele pe un numr mare de ou de gin embrionate. n 1956 Isaacs i colab. au desfurat experimente n care incubau timp de cteva ore fragmente de membran corioalantoidian cu virus gripal inactivat, n mediu nutritiv, dup care nlocuiau n acelai mediu fragmentele incubate, cu altele noi, iar fragmentele incubate le introduceau n tuburi cu mediu proaspt. Infectau la acest moment cu virus viu att membranele noi, aflate n mediul vechi, ct i membranele vechi aflate n mediu nou i membrane care fuseser pstrate n mediu nutritiv, fr contact cu virusul inactivat. Au determinat titrurile virusului viu obinute n toate tuburile la 24 de ore post-inoculare. Au detectat titruri asemntoare n membranele vechi (incubate cu virusul inactivat) i n membranele noi (introduse n mediul n care fuseser incubate membranele vechi). Aceste valori erau inferioare titrurilor din tuburile control, unde virusul viu replicase pe membrane care nu avuseser contact cu virusul inactivat. ntruct fenomenul de interferen avea nevoie pentru producere de cteva ore de expunere a membranei la virusul inactivat, faptul c membranele nou introduse n mediul vechi au fost protejate la fel ca acelea incubate timp de ore l-a fcut pe Isaacs s formuleze ipoteza c membranele vechi au eliberat n mediu un factor care a protejat membranele noi mpotriva infeciei cu virusul viu. Astfel, fenomenul de interferen nu s-ar fi bazat exclusiv pe modificri biochimice n membranele incubate cu virus inactivat, ci i pe eliberarea n mediu a unui factor interferent, protector. Dei unele dintre explicaiile sugerate de Lindenmann pentru fenomenul de interferen observat au fost modificarea pH-ului soluiei sau consumul unor factori eseniali din mediu, Isaacs a persistat n ideea produciei active de ctre membranele incubate a unui factor de interferen viral, care a acionat asupra membranelor nou introduse n acel mediu. Isaacs i colab. au publicat n 1957 dou articole, n care descriau interferonul drept factor
eliberat n mediul de cultur n urma incubrii fragmentelor de membran corioalantoidian cu virusuri gripale inactivate i a crui prezen era recunoscut prin capacitatea de a induce un efect inhibitor asupra creterii unui numr de specii virale diferite n fragmentele proaspete de membran (52 i seria). Astzi agentul interferent din experimentele din 1957 ale lui Isaacs este cunoscut drept interferon de tip I. Experimente ulterioare au tatonat condiiile necesare pentru obinerea unor concentraii crescute ale factorului interferon i au urmrit identificarea naturii lui i a activitii fa de diferitele tipuri virale. Isaacs i echipa au artat c puteau obine n cantiti crescute soluii ce conineau interferon (de fapt, preparate proteice n care interferonul reprezenta o mic fracie, aa cum urma s se descopere ulterior), c interferonul era probabil de natur proteic i c interfera cu creterea virusurilor nu numai in vitro, ci i in vivo (la iepuri) (76). Dei articolele din 1957 privind interferonul, ale lui Isaacs i colab. au fost receptate cu scepticism de lumea tiinific, att n Europa, ct i n America, interesul artat de firmele farmaceutice fa de un asemenea produs cu potenial de comercializare a fcut ca n Anglia s se realizeze un consoriu public-privat pentru patentarea i exploatarea acestei descoperiri britanice (consoriu din care fceau parte firmele BurroughsWellcome, Glaxo Laboratories i Imperial Chemical Industries-Pharmaceuticals). S-a dorit, astfel, s nu se repete experiena neplcut a patentrii de ctre americani a penicilinei descoperite de britanicul Alexander Fleming, fapt care a dus la situaia cumprrii, inclusiv de ctre utilizatorii britanici, a antibioticului de la firmele americane. Munca pentru strngerea volumului de date experimentale necesar pentru patentare s-a desfurat n paralel, sub conducerea lui Isaacs, n laboratoarele instituiilor de stat i private din consoriu. Deoarece principala revendicare la patentare era aplicabilitatea la om, s-au fcut toate demersurile pentru testarea rapid la om a interferonului obinut pe linii celulare de maimu. n 1962 a fost efectuat primul trial clinic la om, pe voluntari (102). A fost un trial clinic aprobat cu o rapiditate imposibil de reprodus n prezent, cnd medicamentele ajung mult mai greu n faza de testare la om. Rezultatele trialului au fost interpretate n mod exagerat n publicaia din 1962 ca demonstrnd c interferonul era lipsit de efecte adverse pentru subiecii umani. Date ulterioare au contrazis aceast afirmaie.
101
Sisteme de producere n cantiti industriale a interferonului; descoperirea existenei unor tipuri diferite de interferoni Dup publicarea n 1957 a datelor privind existena unui factor de interferen fa de infeciile virale a urmat o perioad n care natura i proprietile interferonului au fost amnunit analizate. Interferonul, dei indus de un anumit virus, a fost activ mpotriva unor virusuri de tip diferit, fiind astfel principalul candidat pentru explicarea interferenei heterotipice. Spre deosebire de virusul variolic, folosit de Nagano i Kojima, care are genom ADN, virusul gripal, folosit de Isaacs i Lindenmann, are un genom ARN. Astfel, rezultatele experimentelor de interferen viral au artat nc de la nceputul dezvoltrii domeniului de cercetare c acest tip de rspuns al organismelor superioare la detecia agenilor infecioi este un mecanism de aprare cu spectru larg. S-a observat c activitatea interferonului a fost distrus de expunerea la proteaze i nu la nucleaze, ceea ce a sugerat foarte puternic faptul c acest factor era, cel puin parial, de natur proteic. Interferonul obinut n experimentele iniiale a rezistat acidifierii la pH2, o proprietate care a fost mai departe util pentru purificarea sa, deoarece le-a permis cercettorilor s distrug uor din mediul de cultur multe impuriti, inclusiv urmele de virus infecios folosit pentru inducie (ulterior s-a vzut c doar interferonii tip I erau rezisteni la pH 2, nu i interferonul tip II, la care tratamentul acid distruge conformaia dimeric activ; aceast proprietate a contribuit nc de la nceput la diferenierea interferonilor de tip I i II). O proprietate important a interferonului a fost specificitatea de specie, demonstrat n 1959 de faptul c interferonul obinut pe celule de viel a fost inactiv pe celule de gin i invers (120). Aceast proprietate a oferit unele indicii privind faptul c interferonul nu acioneaz direct asupra virusului, ci interacioneaz cu structuri tip receptor ale celulelor int, care au particulariti n funcie de specie. Descifrarea proprietilor interferonilor a fost posibil n anii 1960, ntr-o epoc n care nu apruser tehnicile de clonare a acizilor nucleici, doar prin perseverena unor laboratoare excepionale care au purificat factorul de interferen dup inducia unor cantiti masive de celule. A fost nevoie de operaiuni de mare amploare pentru obinerea interferonilor pentru c, aa cum avea s se dovedeasc, aceste citokine sunt prezente n
esuturi n cantiti infime, datorit potenei semnalului indus de ele. Cea mai avansat unitate de producie a interferonului uman prin inducia culturilor celulare a fost cea nfiinat la nceputul anilor 1960 de Kari Cantell de la National Blood Transfusion Service din Helsinki, Finlanda. n aceast ar, spre deosebire de modul de organizare din restul emisferei vestice, colectarea de snge de pe tot teritoriul a fost centralizat n capital. Avnd la dispoziie mari cantiti de snge uman, Kari Cantell a elaborat un sistem de producie a interferonului pe limfocite umane, crora le-a indus sinteza prin expunere la virus Sendai crescut pe embrioni de gin. Virusul Sendai nu crete pe limfocite umane, dar este un puternic inductor al interferonului n acest sistem. Dei sistemul de producie a interferonului uman pe leucocite a fost reprodus n alte ri, nu s-a atins scala de producie a unitii de la Helsinki. Era evident c era nevoie de o metod alternativ de producie i s-a recurs la obinerea interferonului pe linii celulare umane imortalizate. Spre deosebire de zilele noastre, cnd metodele de meninere a culturilor celulare sunt bine puse la punct i exist experien n cultivarea celulelor n volume foarte mari n firmele de biotehnologii, la nceputul anilor 1970 situaia era cu totul alta. Dou provocri au trebuit tratate: provocarea de a optimiza condiiile experimentale pentru a induce un nivel ct mai crescut al sintezei de interferon n celule i provocarea de a obine linii celulare stabile pentru cultura n volume mari. Liniile celulare continue umane cunoscute la acel moment s-au dovedit neadecvate pentru sarcina propus, singurul sistem potrivit identificat fiind reprezentat de fibroblaste umane diploide din piele. Pentru meninerea n cultur a acestor celule s-au folosit medii de cultur de cea mai bun calitate, bine standardizate, i ser fetal bovin, care, la acel moment, era un component al mediului de cultur neobinuit i scump. De fapt, sistemele de cultur au evoluat la nceputul anilor 1970 i datorit provocrii de producere a interferonilor n cantiti mari. n anii 1971-1972, mai multe laboratoare de cercetare din SUA, Europa i Japonia au stabilit uniti de producie relativ mari pentru interferonul fibroblastic uman (72, 123). Criteriul de comparaie pentru evaluarea capacitii de producie a interferonului din fibroblaste umane n aceste laboratoare a fost capacitatea de producie a interferonului din leucocite n unitatea de la Helsinki. Totui, dup un timp s-au acumulat tot mai multe dovezi c interferonul fibroblastic
102
i interferonul leucocitar erau de fapt entiti moleculare distincte. O observaie important care a contribuit la aceast concluzie a fost aceea c antiserurile mpotriva interferonilor parial purificai, fibroblastic i leucocitar, nu au reacionat ncruciat n teste de neutralizare (42). Aceasta a dus la diferenierea interferonilor n IFN- (principalul component al IFN leucocitar) i IFN- (principalul component al IFN fibro blastic) (111). ntruct interferonul obinut pe fibroblaste (IFN) era diferit de cel obinut pe limfocite (IFN-), rmsese, deci, nerezolvat problema obinerii unei surse de IFN-, ca alternativ la extragerea din limfocitele din sngele periferic; o surs alternativ de IFN- a fost obinut de compania Wellcome, care a elaborat un sistem de producie a IFN- prin inducia cu virusul Sendai a unei linii celulare limfoblastoide tip B, numit Namalwa (26). IFN- i IFN- umani produi prin metodele menionate (IFN- pe leucocite de snge periferic sau pe celule Namalwa i IFN- pe fibroblaste din piele) au fost folosii pentru studii de caracterizare molecular i pentru experimente in vivo, inclusiv n trialuri clinice la om. n paralel cu eforturile de producere a interferonilor umani, unele laboratoare s-au concentrat asupra produciei de interferon de oarece, pentru a avea libertate experimental mai mare n studiul proprietilor in vivo ale acestor citokine. Pentru producerea interferonilor au fost induse linii celulare continue de oarece (precum L929, C2433 sau celule de ascite Ehrlich) prin expunere la virusul bolii Newcastle (60, 114, 119); s-a descoperit c aceste sisteme produceau de fapt amestecuri de IFN- i IFN-, care au fost utile pentru caracterizarea molecular i funcional a interferonilor murini. La mijlocul anilor 1960 au fost comunicate date privind producia unor factori asemntori interferonilor deja cunoscui, n alte circumstane dect infecia viral. Spre exemplu, leucocite umane stimulate cu fitohemaglutinin, proliferau i eliberau un factor antiviral asemntor interferonilor limfocitar i fibroblastic (125). Factorul nou descoperit a diferit de interferonii indui viral prin faptul c nu rezista la expunere la pH acid 2, un tratament aplicat interferonilor indui viral, pentru a inactiva virionii reziduali. n anii 1970 s-a vzut c o protein asemntoare, cu efect antiviral, a fost produs la oarece n timpul rspunsurilor imune celulare antigen-specifice; de aceea, acest nou tip de interferon a fost numit
interferon tip II (129) (spre deosebire de cel indus viral, numit de tip I) sau interferon imun (22). n 1980 un comitet internaional a czut de acord asupra unei nomenclaturi n care interferonii indui viral (interferonii de tip I) au fost numii IFN- (fostul IFN leucocitar) i IFN- (fostul IFN fibroblastic), iar IFN de tip II sau imun a fost redenumit IFN- (111). ntr-o perioad n care se cutau metode pentru producerea n cantiti crescute a interferonilor, Charles Weissmann i colaboratorii au raportat n 1980 clonarea i expresia unei gene pentru IFN- uman n Escherichia Coli (87). Cteva luni mai trziu a fost comunicat de ctre alte echipe un rezultat similar pentru IFN- uman (17, 36, 115, 117). Clonarea interferonilor nu ar fi fost posibil fr optimizri anterioare ale metodelor de inducie a ARN mesager pentru interferoni n celulele eucariote i fr progresele din domeniul tehnologiei ADN recombinant (metode care au permis clonarea i expresia unor secvene ADN strine n E. Coli). Au fost comparate proprietile interferonilor produi pe E. Coli cu ale celor naturali, din punct de vedere al activitii antivirale, al efectelor stimulatoare pentru celulele NK, al efectelor de inhibare a creterii celulelor tumorale (79). Din fericire, majoritatea interferonilor tip I de la om sunt n mod natural neglicozilai, cu excepia IFN- i a dou specii IFN- (1, 89), astfel nct, n urma clonrii i expresiei n E. Coli (care nu glicozileaz proteine, spre deosebire de celulele eucariote) s-au obinut produi cu activitate asemntoare interferonilor produi natural. Speciile de interferoni , i reprezint cele mai importante specii cunoscute i cele ale cror proprieti au fost cel mai bine studiate. Au fost descoperite i alte specii, inclusiv un tip III de interferoni (mai multe detalii n partea a doua a prezentului articol), ale cror roluri sunt evaluate n prezent. Au fost secveniate i comparate genele codificatoare, au fost identificai receptorii folosii i descifrate multe etape din cascadele de inducie i de aciune ale acestor citokine. Studiul mecanismelor de inducie a interferonilor De la nceputul studiului interferonilor era clar c inducia acestora era mediat de contactul celulelor cu virusuri, fie ele vii sau inactivate, cu genom ADN, ca virusul variolic, folosit de Nagano i Kojima (85), sau cu genom ARN, ca virusul gripal, folosit de Isaacs i Lindenmann (52).
103
Se cunoteau din anii anteriori lansrii ipotezei existenei interferonilor dou preparate de origine fungic, buni inhibitori ai replicrii virale, numite statolon i helenin. S-a demonstrat c interferena cu replicarea viral avea ca substrat inducia interferonului i c principiul inductor al interferonului din compoziia lor era de natur ARN dublucatenar (69), probabil provenit dintr-un micofag (virus polyhedra care infecta fungii de origine ai extraselor). Testarea unor structuri sintetice ARN dublucatenar a confirmat faptul c induceau sinteza interferonului, secvenele de tip poly-rI:rC fiind cele mai bune inductoare (24). ntruct se credea c ARN dublucatenar este un produs exclusiv viral i se tia c majoritatea virusurilor ARN sintetizeaz un astfel de produs la o etap oarecare n cursul replicrii lor, s-a crezut timp de cteva decenii c ARN dublucatenar este principalul inductor al interferonului din infeciile virale. Au fost descoperite multe mecanisme celulare centrate in jurul ARN dublucatenar fie activate de acest tip molecular, fie care acionau asupra lui, pentru a inhiba infeciile virale. Dei multe date experimentale au artat c nu numai componente virale, ci i bacteriene, precum lipopolizaharidul bacterian (LPS) (47, 112) sau lectine mitogene, precum fitohemaglutinina (125), induc interferonii, un progres enorm n nelegerea mecanismelor de inducie a interferonilor a fost fcut abia n ultimul deceniu. Au fost descoperite n ultimii ani o pleiad de componente ale mecanismelor de detecie a patogenilor i de inducie a sintezei de interferoni. Se cunoate azi c exist o sum de senzori celulari, de tip Toll-like, helicaze citoplasmatice (precum RIG-I i Mda-5) sau NOD, care leag molecule improprii organismelor vertebrate. Aceste modele moleculare improprii sunt denumite modele moleculare asociate patogenilor (pathogen-associated molecular patterns, PAMPs). Detecia PAMP de ctre senzorii celulari specifici activeaz cascade de semnalizare al cror final este translocarea n nucleul celular a unor complexe activatoare ale transcripiei i care se leag la secvene din promotorii genelor pentru citokine (ISRE). Studiul mecanismelor de inducie a efectelor antivirale ale interferonilor n timpul primului deceniu de cercetare privind interferonii, se credea c molecula interferon nsi, dup intrarea n celul i probabil dup unele modificri metabolice, era inhibitorul direct al replicrii virale. Specificitatea de specie a interferonilor, demonstrat n 1959 de faptul c interferonii produi
pe celule de viel au fost inactivi pe celule de gin i invers (120) a indus pentru prima dat ideea unei posibile aciuni a interferonilor pe structuri tip receptor de pe celulele int. La sfritul anilor 1960 au fost comunicate pentru prima dat dovezi privind legarea interferonilor la suprafaa celular (29). La nceputul anilor 1980, studii de legare cu proteine marcate radioactiv au dus la concluzia c pe suprafaa celular exist receptori specifici, de nalt afinitate, pentru interferoni, c subspeciile diferite de interferoni tip I (IFN- i IFN-) folosesc un receptor comun i c acesta este distinct de receptorul pentru interferon tip II (2, 7). n plus, n ultimii ani au fost descoperii interferonii tip III i s-a identificat i receptorul pentru ei (66, 105). Ultimul deceniu a cunoscut achiziia unui volum enorm de date privind cascadele de proteine adaptoare care transmit mesajul de la receptorii IFN la inducia transcripiei genelor specifice cu efect antiviral. Exist sute de proteine a cror sintez este indus de interferoni i pn n prezent numai rolul ctorva este bine studiat (mai multe detalii n partea a doua a articolului). n ciuda volumului mare de date acumulat de la postularea existenei interferonilor n 1957, multe aspecte din funcionarea acestui sistem de aprare ateapt nc s fie clarificate i multe aplicaii terapeutice i vor avea probabil originea n nelegerea sa aprofundat.
II. PRIVIRE DE ANSAMBLU ASUPRA ORGANIZRII I FUNCIONRII SISTEMULUI INTERFERON

n prima parte a articolului am prezentat cteva elemente privind istoricul descoperii interferonilor i al proprietilor acestora. n prezenta parte trecem n revist cteva aspecte privind organizarea i funcionarea sistemului interferon la mamifere, n particular la om. A. Interferonii Interferonii sunt citokine produse de celulele organismelor vertebrate la detecia de ctre senzorii acestora a unor modele moleculare asociate patogenilor; interferonii transmit att autocrin, ct i paracrin, un mesaj de modificare temporar a funciilor celulare, n scopul restrngerii replicrii acestora. Au fost identificate mai multe tipuri de interferoni. Primele dovezi privind faptul c interferonii sunt o familie de citokine au provenit din observarea diferenelor de antigenicitate ntre interferonii
104
obinui din leucocite umane (IFN-) i din fibroblaste umane (IFN-) (42). Odat cu clonarea IFN-1, IFN-2 i IFN- a devenit evident natura multigenic a codificrii n genom a interferonilor (37, 113, 116). Pn n prezent au fost descoperite la mamifere aproximativ 10 specii de IFN: IFN-, , , , , , , , , , , care aparin mai multor tipuri: IFN- aparine tipului II, IFN-l tipului III, iar restul de specii tipului I. Dintre toate speciile de interferoni amintite, numai 7 sunt ntlnite la om (cele subliniate n enumerarea de mai sus). Numrul de gene funcionale care codific interferoni tip I, identificate pn n prezent, este variabil la diferitele specii mamifere (IFN- exist numai la porci i IFN- numai la rumegtoare; IFN- lipsete la oareci). n cadrul speciei IFN- au fost descrise nu meroase subspecii (13 la om). Pentru IFN-, , , , se cunoate cte o singur variant. Pentru IFN- au fost descrise la om 3 subspecii (numite i interleukine IL-28A, IL-28B i IL-29). La om, genele pentru interferonii tip I au n general omologie mai mare de 30% i sunt localizate pe un acelai cromozom, cromozomul 9 (19). Genele IFN- formeaz un cluster din care nu face parte gena IFN-. Tuturor genelor IFN tip I de la om le lipsesc intronii (41). Genele IFN tip II i III, n schimb, conin introni. Gena pentru IFN- este localizat pe cromozomul 12 i genele pentru IFN- pe cromozomul 19; genele pentru IFN- au 15-20% omologie de secven cu cele ale IFN- (38, 105). Interferonii tip I prezint diferene calitative i cantitative n inducia activitilor specifice, att antivirale, ct i non-antivirale (13, 28, 46). Cercetrile n curs caut s gseasc explicaii pentru pstrarea n genom a unor multiple specii de IFN tip I i pentru exercitarea de ctre aceste citokine a unor efecte diferite n condiiile folosirii unui complex receptor comun (121). B. Mecanismele de inducie a interferonilor Experimentele din anii 1950 ale grupurilor lui Nagano i Isaacs i care au stat la baza emiterii teoriei privind existena factorilor tip interferon au identificat ca inductori ai fenomenului de interferen viral virusurile vii sau inactivate replicativ, cu genom ADN (virusul variolic) sau ARN (virusurile gripale) (52, 85). Observaia c inducia interferonului a fost produs de ctre virusuri inactivate a artat c replicarea viral nu este o cerin pentru producerea
acestui fenomen. S-a emis ipoteza c detecia de ctre celule a informaiei genetice strine ar fi declanatorul sintezei interferonilor. n anii 1948 i respectiv 1950 se identificaser deja dou substane, numite helenin i statolon, care posedau activitate antiviral larg. Ambele erau extracte provenite din fungi de tipul Penicillium: statolonul era numit astfel dup fungul de origine, Penicillium stoloniferum (94), iar helenina dup numele Helen al soiei cercettorului care a descris preparatul, i care l obinuse prin cultivarea unei colonii fungice de pe o fotografie a ei (106). n cazul statolonului, testarea capacitii de inducie a interferonului s-a fcut n mod intenionat, pe baza afirmaiei lui Isaacs c ARN heterolog poate declana inducia interferonului, tiindu-se c statolonul avea natur polianionic, asemntor ARN (64). Mai trziu s-a vzut c statolonul coninea de fapt ARN dublucatenar. n cazul heleninei, se tia din 1948 c exercita un efect profilactic mpotriva virusurilor din familii diferite, att la oareci, ct i la maimue (106). Au existat multiple studii privind natura heleninei i mecanismul subiacent al efectului su larg antiviral (107 i seria). Acestea au fost reluate dup lansarea de ctre Isaacs a teoriei interferonului. Astfel, n 1966, analizndu-se n detaliu compoziia chimic a heleninei, s-a descoperit c principalul element inductor al interferonului din compoziia sa, identificabil i n cazul statolonului, era ARN dublucatenar, provenit dintr-un virus din familia polyhedra ce infecteaz fungi (un micofag) (69). Identificarea ARN dublucatenar ca element inductor al IFN s-a fcut ncercndu-se s se rezolve problema capacitii variabile de inducie a interferonului deinute de preparatele de helenin; ncercndu-se standardizarea principiului inductor, s-a vzut c acesta putea fi extras i purificat cu ajutorul fenolului i c avea, de fapt, natur ARN. Studii amnunite ale capacitii de inducie a interferonului deinute de diferitele ARN naturale sau sintetice au artat c aspectul dublucatenar al ARN a fost o proprietate esenial pentru inducie. La sfritul anilor 1960 era n curs de descifrare ciclul replicativ al principalelor familii virale i devenise clar c majoritatea familiilor de virusuri ARN au n cursul replicativ un stadiu ARN dublucatenar. De asemenea, la acel moment se credea c celulele neinfectate viral ale vertebratelor nu conin n mod fiziologic ARN dublucatenar, fapt care a fost demonstrat ca nefiind valabil abia n anii 1990, cnd s-a descoperit fenomenul de
105
Ani 1957 1962 1964 1965 1967 1969 1972-1976 1973 1974-1976 1975 1975-1977 1979 1980 1981 1982
1985 1988 1990
1992-1994 1993 1995-1998 1997 1999 2000 2001 2004-2005
Tabelul 1. Momente semnificative din istoria cercetrii n domeniul interferonilor Evenimente Referine bibliografice Descrierea interferonului ca factor de interferen viral 52 Primul trial clinic, cu interferon nepurificat, la voluntari umani 102 Descrierea induciei interferonului de ctre bacterii i endotoxine 47; 112 bacteriene 125 Descrierea IFN tip II (IFN- ) Identificarea ARN dublucatenar ca inductor al IFN 24 Descrierea efectului inhibitor asupra creterii tumorale la oareci 39 Descrierea aciunilor imunoreglatoare ale IFN 73; 74 Trialuri clinice cu preparate impure de IFN 80 Descrierea proteinelor induse de IFN care mediaz aciuni antivirale 61; 70 42 Identificarea de subtipuri distincte de IFN tip I (IFN- i IFN- ) Descrierea efectelor adverse ale IFN la animale 40; 95 115 Izolarea i secvenierea ADNc IFN- uman Izolarea, secvenierea i expresia ADNc IFN-a uman 87 65; 134 Purificarea i secvenierea parial a proteinelor IFN- i IFN- umane Demonstrarea efectelor clinice ale IFN n scleroza multipl 54 Efectuarea de trialuri clinice cu IFN recombinant n cancer 50 38 Izolarea i secvenierea ADNc IFN- uman Clonat o prim gen stimulat de interferoni (2',5'-oligoadenilat 78 sintetaza) Identificarea elementelor ISRE, n regiunile reglatoare din amonte de 31 genele inductibile de interferonii tip I Descoperirea familiei de factori de transcripie IRF 83 Clonarea receptorului IFN tip II 84 Identificarea complexului proteic ISGF-3, care mediaz activarea genelor 32 induse de interferonii tip I Clonarea receptorului IFN tip I 20; 88 Aprobarea de ctre FDA a folosirii clinice a IFN-a2 pentru tratamentul HCV Identificarea cii de semnalizare JAK-STAT drept cale major pentru 15 expresia genic indus de interferoni Aprobarea de ctre FDA a folosirii clinice a IFN- pentru tratamentul sclerozei multiple Identificarea rolurilor cheie jucate de IRF-3 i IRF-7 n inducia 58; 101 interferonilor tip I Clonat primul receptor Toll 98 Identificarea celulelor dendritice plasmocitoide ca productori robuti de 109 IFN tip I Aprobarea de ctre FDA a folosirii clinice a IFN- recombinant pentru tratamentul granulomatozei cronice Identificarea TLR3 drept inductor al IFN la detecia ARN dublucatenar 3 Identificarea helicazelor citosolice RIG-I i Mda-5 drept inductori ai IFN 128 ca rspuns la ARN dublucatenar sau virusuri ARN
interferen ARN ca mijloc de reglare a expresiei unor gene (precursorul moleculelor de ARN interferent are o structur dublucatenar, ns mecanismele de protecie mpotriva semnalizrii pe calea interferonului de la acest precursor nu sunt nc pe deplin descifrate). Astfel, n anii 1960 s-a spus c ARN dublucatenar de origine viral ar putea fi agentul de elecie declanator al sintezei interferonului, deinut de virusuri. n timp s-a vzut c virusurile au i alte componente, n afar de ARN dublucatenar, care induc interferonii, i c exist i ali inductori ai interferonilor, care nu sunt ntlnii deloc la
virusuri. Totui, descoperirea ARN dublucatenar ca inductor al interferonilor a fost un mare progres, deoarece a fcut s fie testate mai departe o gam larg de molecule din aceast clas ca inductori. Unul dintre cei mai cunoscui inductori, de natur ARN dublucatenar, descoperit n acest context, este poly-rI:rC; acesta induce puternic sinteza interferonilor n culturi celulare de rinichi de iepure sau de fibroblaste diploide umane din piele (fibroblastele din piele fiind sistemul folosit pentru producerea n cantiti industriale a interferonului fibroblastic, IFN-), precum i in vivo dup injectarea intravenoas la iepuri sau oareci (24).
106
Identificarea ARN dublucatenar ca inductor al interferonilor a fost o confirmare a teoriei c rspunsul interferon este datorat deteciei de ctre senzorii celulari a unor structuri moleculare recunoscute ca strine. Mai mult, s-a vzut c ARN dublucatenar nu reprezint numai un inductor al sintezei interferonilor, ci i o int a mecanismelor de aprare induse de acetia. De exemplu, sistemul enzimatic antiviral indus de interferoni, format din 2',5'-oligoadenilat-sintetaz (2',5'-OAS) i ribonucleaza L (RNaza L) are nevoie de ARN dublucatenar pentru activare (62, 70) i i exercit activitatea antiviral prin aciune direct asupra ARN. Aa cum artam, s-au acumulat numeroase dovezi experimentale care au demonstrat c ARN dublucatenar este doar unul dintre modelele moleculare inductoare ale sintezei interferonilor. nc din anii 1960 producia de interferon a fost demonstrat la gini, oareci i iepuri injectai cu o varietate de bacterii sau cu lipopolizaharid
bacterian (LPS) (47, 112). De asemenea, IFN- a fost descoperit ca interferon indus n suspensiile de leucocite umane n urma tratamentului cu fitohemaglutinin (PHA), o lectin mitogen (125). n prezent se cunoate c de fapt interferonii sunt indui de produi moleculari diveri, precum acizi nucleici, lipide, polizaharide, proteine microbiene, care sunt recunoscui ca necaracteristici organismelor vertebrate. Aceste modele moleculare inductoare ale interferonilor au fost numite cu termenul generic modele moleculare asociate patogenilor (pathogen-associated molecular patterns, PAMPs). Au fost identificate mai multe sisteme celulare de detecie a PAMP: receptori extracelulari sau endozomali tip Toll-like sau lectine; senzori intracitoplasmatici precum helicazele RIG-I i Mdr-5; senzori intracitoplasmatici tip NOD (figura 1 i tabelul 2). Detecia PAMP de ctre senzorii celulari declaneaz cascade complexe de semnalizare, la care
Figura 1. Privire de ansamblu asupra mecanismelor de inducie a sintezei interferonilor.
107
Tabelul 2. Elemente privind specificitile de recunoatere a modelelor moleculare asociate patogenilor (PAMP) de ctre senzorii celulari.
Senzorul TLR1 TLR2 Modelul PAMP recunoscut nu sunt identificai liganzi direci; i exercit funcia n asociere cu TLR2 particip la recunoaterea unei mari varieti de molecule strine: - singur recunoate: - peptidoglican, acid lipoteichoic i lipoproteine din bacterii Gram-pozitive; - lipoarabinomanan din micobacterii; - zymosan din peretele celular fungic; - heterodimerizeaz cu alte TLR, ceea ce i extinde domeniul de molecule microbiene recunoscute: - TLR2 + TLR6: lipopeptide diacilate din micoplasme; - TLR2 + TLR1: lipopeptide triacilate. recunoate ARN dublucatenar i analogul sintetic al ARN dublucatenar, polyrI:rC primul TLR uman identificat; recunoate lipopolizaharidul bacterian (LPS) din bacteriile Gram-negative flagelina, component al bacteriilor Gram-pozitive i Gram-negative foarte asemntor cu TLR1; i exercit funcia n asociere cu TLR2 ARN monocatenar ARN monocatenar ADN bogat n secvene CpG, nemetilat i monocatenar (ceea ce distinge ADN bacterian de ADN mamifer) funcia i ligandul direct sunt nc necunoscute; mutaii n TLR10 la om sunt asociate cu astmul bronic peptidoglicani -glucan ARN dublucatenar Referine bibliografice 35; 90
TLR3 TLR4 TLR5 TLR6 TLR7 TLR8 TLR9 TLR10 NOD-1,2 Dectina 1 RIG-I, Mda-5
3 93 43 44 44 99 68 71 8 128
particip zeci de proteine adaptor i care duc la translocarea n nucleul celular a unor elemente transcripionale activate, de tip IRF (interferon regulatory factor), care declaneaz sinteza IFN, sau de tip AP1, NF-kB, care declaneaz sinteza altor citokine, proinflamatorii. Au fost identificate n promotorii genelor pentru interferoni secvene comune, numite ISRE (IFNstimulated response element), la care se leag factorii transcripionali activai de recunoaterea PAMP. C. Receptorii pentru interferoni n prezent se cunoate c, asemntor majoritii citokinelor i factorilor de cretere, interferonii i mediaz efectele prin intermediul interaciunii cu receptorii specifici de pe suprafaa celular. Interferonii de tip I (IFN- i IFN-) folosesc un complex receptor comun, notat IFNAR; interferonul de tip II (IFN-) folosete un receptor specific, IFNGR; interferonii de tip III se leag de un complex receptor format dintr-un lan specific, IFNLR1 i un lan folosit i de IL10, lanul IL10R2. Complexul receptor pentru interferonii tip I (complexul IFNAR) const din dou lanuri proteice transmembranare: IFN-aR1 (numit i IFNAR1)
i IFN-aR2 (numit i IFNAR2), acesta din urm fiind i lanul major de legare a ligandului. Genele pentru cele dou lanuri ale receptorilor IFNAR sunt situate pe cromozomul uman 21 (121). Afinitatea de legare a interferonului de ctre lanul IFNAR2 se situeaz n domeniul concentraiilor nanomolare, pe cnd cea de legare a interferonului de ctre lanul IFNAR1 este de 1000 de ori mai slab (121). Studiile de legare sugereaz existena unui complex ternar ntre IFNAR1, IFN i IFNAR2, avnd stoichiometrie 1:1:1 i arhitectur similar, dac nu identic, pentru toi interferonii tip I. Asamblarea complexului ternar interferon-receptor este probabil un proces n doi pai, n care interferonul se leag la un lan IFNAR (cel mai probabil la lanul IFNAR2, din cauza afinitii crescute), apoi l recruteaz i pe al doilea, fr interacie anterioar ntre cele dou lanuri receptor (121). Dei interferonii tip I folosesc acelai complex receptor, specii diferite de interferon tip I induc rspunsuri biologice ntructva diferite (122). Se consider c mai muli factori dicteaz efectele diferite ale diverilor interferoni tip I n contextul folosirii aceluiai complex receptor: (1) Afinitatea diferit de legare a respectivului IFN de ctre lanurile IFNAR 1 i 2 i
108
deci stabilitatea complexului IFN-receptor (53, 55, 59, 121). n general, IFNAR2 are afinitate mai mare pentru interferon dect IFNAR1, existnd i excepii: IFN-1 are o afinitate sczut de legare a lanului IFNAR2 (34). (2) Concentraia pe suprafaa celular a receptorilor IFNAR i organizarea lor lateral n microdomenii. Acest aspect poate modela responsivitatea fiecrui tip celular fa de diferitele specii de interferoni (104). Componentele complexului IFNAR prezint domenii de interacie cu kinaze intracelulare: lanul IFNAR1 interacioneaz cu kinaza Tyk2, iar lanul IFNAR2 cu kinaza Jak1. Semnalizarea prin receptorul IFNAR duce la fosforilarea de ctre aceste kinaze a proteinelor STAT1 i STAT2 i la formarea unui complex ntre STAT1 i STAT2 fosforilate i proteina IRF9, numit complex ISGF3 (IFN-stimulated gene factor 3). Acest complex transloc n nucleu i activeaz transcripia genelor induse de interferonii tip I prin legare la secvenele ISRE (IFN-stimulated response element) din promotorii acestor gene (figura 2). Receptorul pentru interferon tip II (IFN-), notat IFNGR, este un complex de patru lanuri proteice, cte dou din fiecare tip IFNGR1 i IFNGR2. Un complex receptor IFNGR leag un homodimer antiparalel de IFN- (4). Lanul IFNGR1 este codificat de o gen de pe cromozomul uman 6 i prezint un domeniu de legare pentru kinaza Jak1 i un sit de docking pentru STAT1. Lanul IFNGR2 deine un domeniu
de legare a Jak2 i este codificat de o gen de pe cromozomul uman 21, situat ntr-un cluster care mai conine i secvene codificante pentru IFNAR1, IFNAR2 i receptorul 2 pentru interleukina 10 (IL10R2, numit i IL10RB) (67). Dei lanul IFNGR1 este constitutiv exprimat pe toate celulele organismului, expresia lanului IFNGR2 este reglat strict, acesta fiind puin exprimat constitutiv. Legarea IFN- la lanurile IFNGR1 i IFNGR2 activeaz kinazele Jak1 i Jak2, care fosforileaz proteina STAT1; dimeri de STAT1 fosforilat transloc n nucleu i induc transcripia genelor care conin n promotor secvena de activare specific IFN- (gamma activating sequence, GAS) (108) (figura 2). Receptorul pentru interferonii tip III (IFN-l) folosete aceeai cale de semnalizare cu receptorii pentru interferonii tip I, dar reprezint o structur molecular complet diferit. Este alctuit dintr-un lan specific, IFNLR1, care interacioneaz cu kinaza Jak1 i un lan receptor pe care l folosete i interleukina 10, lanul IL10R2, i care prezint un domeniu de interacie cu kinaza Tyk2. Legarea IFN-l la receptor duce la activarea unei ci de semnalizare asemntoare celei induse de interferonii tip I: se formeaz un complex ntre proteinele STAT1 i STAT2 fosforilate i IRF9, care transloc n nucleul celular i activeaz transcripia genelor care conin n promotor secvene ISRE (figura 2).
Figura 2. Reprezentare schematic a mecanismelor de inducie a genelor stimulate de interferoni.
109
D. Mecanismele de aciune ale interferonilor Mecanisme de inducie de ctre interferoni a proteinelor efectoare Dup acumularea n anii 1950 de dovezi experimentale n favoarea existenei reale a interferonilor, s-a pus problema modului cum i desfoar interferonii activitatea antiviral, i anume prin ce mecanism concret biologic, chimic sau fizic, i la nivelul crei etape din replicarea viral. Experimente din anii 1960 au artat c este necesar, pentru exercitarea efectelor antivirale ale interferonilor, ca transcripia ADN n ARN s funcioneze corect n celula infectat. Taylor a artat c tratarea celulelor cu actinomicin D, o substan care se intercaleaz n mod ireversibil n moleculele ADN i le mpiedic transcripia n ARN, mpiedic exercitarea efectului interferonilor (118). Dup tratarea culturilor celulare cu actinomicin D pe perioade scurte de timp (1 or), apoi cu interferon, s-a observat o replicare identic, la nivel crescut, a virusurilor ARN pe celulele netratate cu interferon, indiferent dac acestea fuseser anterior expuse la actinomicin D sau nu, i pe celule tratate cu actinomicin D plus interferon. Singurul caz n care a fost inhibat replicarea viral a fost pe celule netratate cu actinomicin D, dar tratate cu interferon. Experimentele lui Taylor au demonstrat c, pentru exercitarea efectului antiviral al interferonului, trebuia s aib loc transcrierea ADN n ARN, inclusiv n infeciile cu virusuri care nu conin ADN n ciclul replicativ, cum au fost virusurile cu genom ARN, folosite de el. Prin urmare, ADN celular era cel care trebuia transcris n ARN. Aceast concluzie era o dovad n plus c interferonul nu aciona direct asupra virusurilor, ci indirect, prin inducia unor efectori ai gazdei, i c acetia trebuiau produi n mod activ, cu transcrierea ADN celular. Cel mai probabil acetia erau de natur proteic. Concluziile privind natura proteic a efectorilor antivirali indui de interferoni, desprinse din experimentele lui Taylor, erau indirecte. Teste specifice privind necesitatea translaiei proteice pentru exercitarea efectelor interferonilor (teste realizate prin inhibiia translaiei cu ajutorul cicloheximidei, puromicinei sau fluorofenilalaninei) nu au dus la rezultate unanime. Aceasta, deoarece inhibiia sintezei proteice avea efecte att asupra replicrii virale, ct i asupra mecanismelor de aprare ale gazdei, induse de interferoni. Dovada induciei sintezei unor efectori proteici de ctre interferoni a venit din analiza n geluri 2D a proteinelor din
lizate celulare induse i neinduse cu ei; n lizatele induse de interferoni s-a putut observa apariia a zeci de proteine care nu erau prezente sau erau prezente n cantiti minime n celule n stare obinuit. Din zecile de proteine induse de interferoni, cteva au fost studiate n mai mare detaliu; le-au fost identificate secvenele aminoacidice i secvenele genice corespunztoare. Cunoscndu-se secvenele genice, s-au descoperit secvene consens n promotori (30,31,81,131). Au fost folosite aceste secvene consens drept sonde nucleotidice pentru identificarea proteinelor adaptor care se leag la aceti promotori n procesul de activare a transcripiei genice. Au fost astfel identificate ca proteine ce se leag la promotorii genelor stimulate de interferonii tip I proteinele STAT1, STAT2 i IRF9 (32,124). O alt metod folosit pentru identificarea elementelor cascadei de semnalizare de la interferoni la proteinele efectoare antivirale a fost generarea prin mutagenez chimic de linii celulare cu defecte ale elementelor cascadelor de semnalizare. n acest sens, au fost modificate linii celulare normale prin introducerea n genomul lor a unor gene toxice, sub promotorul unor gene induse de interferoni (de exemplu, gena pentru guanil-fosforibozil-transferaz, sub controlul promotorului genei 6-16). Astfel, genele toxice nou introduse se exprimau numai prin inducia de ctre interferoni. Liniile celulare transgenice au fost supuse apoi mutagenezei chimice, cu generarea de variate defecte genomice, inclusiv n cascadele de semnalizare de la interferoni. Tratamentul cu interferoni a dus la inducia genelor toxice n celulele cu semnalizare intact, dar nu i n celulele cu defecte de semnalizare de la interferoni. Adiia substratului enzimei toxice (adiia 6-thioguaninei, n cazul celulelor transgenice pentru guaninfosforibozil-transferaz) a dus la moartea celulelor care o exprimau i a selectat clonele mutante cu defect n cascadele de semnalizare de la interferoni, care nu au exprimat-o. Studii ulterioare au identificat genele i proteinele afectate de mutaii i au permis studiul amnunit al rolului acestor proteine n cascadele de semnalizare. Au fost identificate astfel ca proteine implicate n semnalizarea de la interferoni tirozinkinaza Tyk2, 7 membri ai familiei STAT i 4 membri ai familiei Jak, i s-a artat c aceti factori transcripionali i tirozinkinaze sunt eseniali pentru rspunsurile nu numai de la interferoni, ci i de la alte citokine i factori de cretere (103).
110
Elementele eseniale pentru rspunsul fa de IFN tip I sunt receptorul heterodimer pentru IFN tip I (IFNAR), tirozinkinazele Tyk2 i Jak1, proteinele STAT1 i STAT2, care sunt fosforilate ca rspuns la semnal, i proteina IRF9 (figura 2). Ataarea complexului format din proteinele STAT1 i STAT2 fosforilate i din IRF9 la secvene specifice din promotorul genelor stimulate de interferonii tip I iniiaz transcripia acestor gene. Elementele eseniale pentru rspunsul la IFN tip II sunt cele 2 proteine din alctuirea receptorului IFNGR, tirozinkinazele Jak1 i Jak2, i proteina STAT1, care este fosforilat ca rspuns la semnal. Dimerul de proteine STAT1 fosforilate transloc n nucleu i particip la declanarea transcripiei de pe promotorii ce conin secvene GAS (gamma activating sequence). Elementele eseniale pentru rspunsul la IFN tip III sunt tirozinkinazele Tyk2 i Jak1, proteinele STAT1 i STAT2, care sunt fosforilate ca rspuns la semnal, i IRF9 nefosforilat (figura 2). Complexul format din proteinele fosforilate STAT1 i STAT2 i din proteina IRF9 particip la activarea transcripiei genelor induse de interferonii tip III, n mod asemntor mecanismului folosit de interferonii tip I. Proteine cu efect antiviral induse de interferoni i mecanismele lor de aciune O problem important n descifrarea mecanismelor de aprare prin interferoni a fost legat de etapele din ciclul replicativ viral inhibate de acest sistem de aprare. Experimentele desfurate n anii imediat urmtori descoperirii interferonilor au artat c ntre etapele interferate nu se numrau adsorbia i internalizarea viral, ci etape intracelulare ale replicrii virale. Au fost identificate dou mecanisme principale antivirale exercitate de proteinele induse de interferoni: 1) degradarea ARN i inhibiia sintezei proteice n experimentele de identificare a factorilor inhibitori virali din celulele tratate cu interferoni, Kerr i colaboratorii au descoperit c ARN dublucatenar putea s i exercite rolul antiviral numai dac celulele deineau suficient ATP (96). ATP nu era numai necesar pentru desfurarea activitii endonucleazelor cu efect antiviral, ci i pentru producerea unui factor cu efect antiviral, cu mas molecular mic i care rmnea n volumul de excludere n experimentele de filtrare n gel (97). Analiza chimic a artat c acest factor este un oligoadenilat cu legturi 2'-5', diferit fa de acizii nucleici uzuali, cu legturi 3'-5' (63). S-a vzut c
2',5'-oligoadenilaii sunt sintetizai din ATP de ctre enzime (2',5'-oligoadenilat-sintetaze) induse de IFN (49) i care necesit ARN dublucatenar drept cofactor. 2',5'-oligoadenilaii activeaz consecutiv o endonucleaz (ribonucleaza L, notat i RN-aza L) care degradeaz ARN, inhibnd astfel sinteza de proteine att microbiene (virale), ct i celulare, i participnd la inducia apoptozei celulelor infectate. Inducia apoptozei de ctre interferoni este un mecanism cu beneficii att n aprarea antimicrobian (n particular antiviral), ct i antitumoral a organismului (9, 10). 2) captarea componentelor virale nainte de asamblarea i eliberarea virionilor nc din anii 1970 au aprut din studiul retrovirusurilor dovezi c interferonii pot inhiba eliberarea particulelor virale printr-un mecanism diferit de inhibare a sintezei proteice. n anii 1970 retrovirusurile erau numite oncornavirusuri (prescurtare pentru oncogenic RNA viruses, virusuri oncogene cu genom ARN), deoarece principalii membri cunoscui ai familiei produceau leucemii i sarcoame la gini i oareci. S-a intuit c existau i la om virusuri din aceast familie, care erau probabil responsabile de unele forme de cancer. Au fost descoperii ulterior n aceast familie reprezentani la om, virusurile HTLV (human T- cell leukemia virus). Tratamentul cu interferon al liniilor celulare care deineau retrovirusuri integrate i active replicativ a dus la scderea eliberrii de virioni. Cum n acel timp cuantificarea virusurilor prin metode moleculare nu era uoar, una dintre metodele folosite era cuantificarea n preparate de microscopie electronic a numrului de virioni din celule i din exteriorul lor. S-a observat prin aceast metod c, dei n supernatant sczuse eliberarea de virioni, n celule numrul particulelor virale era crescut (5,6,11); n plus, particulele virale eliberate de celulele tratate cu interferoni, attea cte erau, prezentau defect replicativ (92). Studii ulterioare au artat c celulele tratate cu interferoni produc enzime cu rol n deaminarea genomurilor ARN virale (de exemplu, proteinele din familia APOBEC), pentru a induce mutaii si a face virusurile incompetente replicativ i c unele virusuri au dezvoltat factori de contracarare a aciunii acestor proteine (de exemplu, s-a gsit ca rol al proteinei vif a virusului HIV contracararea aciunii proteinelor APOBEC, n particular APOBEC3G). n plus, au fost descoperite proteine tip dinamin, din familia Mx, induse de interferoni, care sechestreaz componente virale de-a lungul
111
cilor de transport intracelular i mpiedic asamblarea i eliberarea de virioni (activitate identificat iniial fa de virusurile din familia Orthomyxoviridae). Interferonii induc expresia a aproximativ 200 de gene (interferon stimulated genes, ISGs). Numrul i natura acestor gene depind de tipul de interferon, de tipul celular examinat i de starea anterioar de activare a celulei de ctre alte citokine din reelele de semnalizare imune (16, 18). Cteva proteine cu aciune antiviral induse de interferoni sunt cunoscute de mai mult timp i, astfel, au fost studiate n mai mare detaliu: 1) 2',5'-oligoadenilat sintetazele (2',5'-OAS) i ribonucleaza L (RNaza L) formeaz un sistem de lupt al gazdei mpotriva virusurilor ARN. Enzimele 2',5'-oligoadenilat sintetaze sunt activate direct de ARN dublucatenar i produc din ATP un lan oligoadenilat de 3-6 baze, cu legturi 2'-5' (61). Mainria celular nu folosete legturi 2'-5' pentru stocarea informaiei n ARN, singura funcie bine stabilit pn n prezent pentru 2',5'-oligoadenilai fiind activarea enzimei ubiquitare latente RNaz L. La legarea 2',5'-oligoadenilailor la ea, RNaza L monomeric inactiv dimerizeaz ntr-o ribonucleaz activ (21), care cliveaz de la captul 3' al catenelor ARN grupri dinucleotidice UU sau UA (27, 127). A fost demonstrat rolul esenial al cii constituite din 2',5'-OAS i RNaza L n inhibiia replicrii virusului encefalomiocarditei (EMCV), a virusului Coxsackie B4, a virusului West Nile, a unor retrovirusuri i a virusului hepatitic C (HCV) (110). 2) Protein-kinaza activat de ARN dublucatenar (PKR) a fost ntre primele enzime induse de interferoni identificate (130). PKR este o serin/treonin kinaz care inhib activitatea celular de translaie proteic, drept rspuns la detecia ARN dublucatenar i la alte semnale (126). PKR poate fi activat direct de ARN dublucatenar sau de proteina PACT, n absena ARN dublucatenar (91) i controleaz translaia ARN mesagere n proteine prin intermediul fosforilrii factorului de iniiere a sintezei proteice EIF2. Fosforilarea EIF2 duce la formarea unui complex inactiv ntre EIF2-GDP i factorul de reciclare EIF2; blocarea n acest fel a EIF2 are ca efect inhibiia global a sintezei proteice, blocarea replicrii virale i rspuns de stres celular. Importana PKR n aprarea antiviral este dovedit de faptul c multe virusuri prezint strategii de ocolire a acestei proteine, precum sechestrarea ARN dublucatenar pentru evitarea
recunoaterii de ctre PKR sau inhibarea activitii kinazice a PKR (33). 3) Proteine nrudite cu p56 (p56, p54) inhib translaia n proteine a ARN mesagere prin legarea la diferite subuniti ale factorului de iniiere a translaiei EIF3 i blocarea activitii acestuia (100). 4) Proteinele Mx au fost identificate n 1986, observndu-se c linia de oareci A2G era rezistent la virusurile gripale (48,75). S-a vzut c responsabil pentru aceast rezisten era proteina Mx1, a crei gen era intact la linia de oareci A2G i defectiv la majoritatea celorlalte linii de oareci de laborator. A fost investigat distribuia la diferite specii a acestor proteine i s-a vzut c sunt ntlnite i la alte mamifere, inclusiv la om. Proteinele Mx sunt GTP-aze mari (aprox. 80 kDa) din superfamilia dinaminelor, care se autoasambleaz i leag nucleoproteinele virale, astfel interfernd cu traficul lor intracelular i implicit cu asamblarea i eliberarea viral. Demonstraia n 1999 a faptului c celulele de la oareci triplu knockout pentru PKR, RNaza L i Mx sunt nc protejate antiviral de ctre tratamentul cu interferon (133) indic faptul c sistemul genelor induse de interferoni are un mare spectru de elemente efectoare, c exist i alte ci de aprare antiviral foarte puternice, exercitate de proteine efectoare nc incomplet studiate pn n prezent. E. Interferonii ca elemente integratoare ntre imunitatea nnscut i n cea adaptiv Pe lng rolul de citokine semnalizatoare ale infeciei, responsabile de punerea n practic n interval de cteva ore de la detecia agenilor strini, a unei stri tisulare nefavorabile replicrii acestora, interferonii i celulele imune specializate n producia de interferoni reprezint elemente importante n activarea rspunsului imun adaptiv mpotriva agenilor patogeni. Dei orice celul a organismului poate sintetiza interferoni n momentul deteciei infeciei, anumite celule specializate sintetizeaz aceste citokine la nivele mult crescute, datorit expresiei crescute a senzorilor pentru detecia PAMP i a unui grad de preactivare fiziologic n aceste celule a cascadelor de semnalizare intracelular care duc la sinteza interferonilor. Celulele specializate n sinteza masiv de interferoni la detecia patogenilor sunt celulele dendritice, att cele asociate esuturilor, ct i cele circulante. Tipul circulant, celulele dendritice plasmocitoide produc masiv interferoni tip I (109) i prezint limfocitelor T CD4+ fragmente
112
peptidice derivate din patogen, pe molecule de suprafa aparinnd complexului major de histocompatibilitate (MHC) clasa a II-a. Fragmentele peptidice virale sunt prezentate n mod funcional de ctre celulele sistemului imun pe complexe MHC II, iar de ctre celulele infectate pe complexe MHC I. Limfocitele T CD8+ recunosc fragmentele peptidice exprimate pe complexe MHC I de ctre celulele infectate i le elimin, n acest fel eliminnd o surs de rspndire a infeciei virale. Expresia proteinelor MHC de clasa a II-a pe suprafaa celulelor imune specializate este stimulat de IFN-, dar nu i de interferonii de tip I (132). Prezentarea antigenelor virale pe MHC clasa I este upregulat marcat att de interferonii tip I, ct i de IFN tip II (IFN-) (82). Interferonii promoveaz acumularea de leucocite la siturile de invazie a patogenilor. Alturi de alte citokine, precum TNF- i IL-1, interferonii stimuleaz expresia moleculelor de adeziune precum ICAM1 (intercellular adhesion molecule 1) (12). Au fost identificate un efect stimulator al IFN- asupra celulelor natural killer (NK), macrofagelor i limfocitelor T (cu difereniere spre Th1), i un efect activator al IFN- asupra limfocitelor T (n concert cu interleukina 2), macrofagelor i celulelor prezentatoare de antigen APC (57). Interferonii induc producia de citokine chemotactice (chemokine) care particip la recrutarea leucocitelor. Trei chemokine foarte nrudite implicate n acumularea de limfocite T activate i macrofage la locul infeciei sunt proteinele induse de interferoni CXCL9, cunoscut i sub numele de monokina indus de IFN- (monokine induced by IFN-, MIG), CXCL10, cunoscut i ca proteina de 10 kDa inductibil de IFN- (IFN- 10 kDa inducible protein, IP-10) i CXCL11, cunoscut i ca a-chemoatractantul limfocitelor T inductibil de interferon (interferoninducible T-cell a-chemoattractant, I-TAC) (14, 23, 77). F. Aplicaii clinice i efecte adverse ale interferonilor Iniial, pe baza unor studii limitate la animale i la om i sub presiunea utilitii comerciale, interferonii au fost ludai ca medicamente cu larg potenial terapeutic i fr efecte adverse (102). Totui, n timp au fost observate efectele adverse ale administrrii interferonilor, care sunt att de
neplcute, nct le limiteaz foarte mult aplicabilitatea clinic. Din mai multe motive, administrarea terapeutic a interferonilor, aa cum este ea efectuat n prezent, pe cale sistemic, n doze relativ mari i de lung durat, nu este uor acceptabil de organism. n primul rnd, starea celular indus de interferoni este o stare de stres celular, improprie unei administrri de durat a acestor citokine. n al doilea rnd, datele experimentale arat c interferonii sunt eliberai n mod natural n cantiti mici, datorit potenei lor, i c zona de distribuie i de exercitare a efectului este limitat, tisular. n cazul infeciilor cu rsunet sistemic, sinteza masiv n esuturi i trecerea n snge a interferonilor se asociaz cu o stare de ru general a organismului. Din aceste considerente, tratamentul cu interferoni pe cale sistemic reprezint un element de stres major pentru organismul primitorului i este rezervat pentru afeciuni pentru care nu exist alt opiune terapeutic. Efectele adverse ale interferonilor pot fi clasificate n: 1) efecte constituionale: stare de ru general, oboseal, frisoane, febr, mialgii; 2) efecte neurologice: la nivelul sistemului nervos central somnolen, letargie, tremor, alterarea statusului mental (ameeal, confuzie); la nivelul sistemului nervos periferic amoreli, parestezii; 3) efecte psihice: modificri de dispoziie (depresie, uneori avansat); 4) efecte toxice: endocrine: stimularea sintezei hormonilor hipofizari ACTH, prolactin, hormon de cretere; indirect creterea nivelului seric al cortizolului (din cauza creterii ACTH); disfuncie tiroidian mediat autoimun, cu hipotiroidism; hepatice: creterea nivelului transaminazelor serice; hematologice: neutropenie. n prezent, interferonii sunt folosii n aplicaii terapeutice, n principal n urmtoarele tipuri de afeciuni: 1) afeciuni virale hepatitele cronice B i C; 2) afeciuni de natur oncologic melanom malign, carcinom cu celule renale; 3) afeciuni imunitare cu cauz genetic boala granulomatoas cronic; 4) boli neurodegenerative scleroza multipl. Tendina general a fost de a se renuna la folosirea interferonilor n cazul identificrii unor terapii
113
mai puin toxice i cu beneficiu terapeutic asemntor, sau de a folosi interferonii ca adjuvani; de asemenea, pegilarea interferonilor a reprezentat un mare pas nainte n terapie, deoarece timpul de njumtire crescut a permis scderea dozelor administrate sistemic i scderea efectelor adverse, cu pstrarea efectului terapeutic.
CONCLUZII
Interferonii au fost descoperii n urm cu o jumtate de secol, iar studiul lor a dus la o mai bun nelegere a mecanismelor de funcionare a sistemului imun. Iniial, datele privind funcionalitatea interferonilor s-au acumulat lent, din cauza dificultii de purificare i a diversitii lor, n condiiile n care echipe diferite au lucrat pe sisteme experi-
mentale diferite i au obinut rezultate ntructva diferite. Iniial, interferonii au fost vzui ca fiind lipsii de efecte secundare i ca reprezentnd un posibil remediu universal, fie antiviral, fie antitumoral. n timp s-a vzut c starea celular indus de interferoni este o stare improprie funcionrii normale a celulei, dar necesar pentru limitarea replicrii n organism a patogenilor. Din cauza efectelor adverse, aplicaiile clinice ale interferonilor sunt strict limitate la afeciuni n care nu exist tratamente alternative care s aib beneficii terapeutice asemntoare. mbuntirea continu a nelegerii funcionrii sistemului imun i a sistemului interferon n particular, va duce la gsirea de noi soluii terapeutice, mai rafinate i cu mai puine efecte adverse dect tratamentele disponibile n prezent.
BIBLIOGRAFIE
1. 2. Adolf GR, Kalsner I, Ahorn H, Maurer-Fogy I, Cantell K Natural human interferon-alpha 2 is O-glycosylated. Biochem J, 1991; 276: 511-518. Aguet M, Belardelli F, Blanchard B, Marcucci F, Gresser I High-affinity binding of 125I-labeled mouse interferon to a specific cell surface receptor. IV. Mouse gamma interferon and cholera toxin do not compete for the common receptor site of alpha/beta interferon. Virology, 1982; 117: 541-544. Alexopoulou L, Holt AC, Medzhitov R, Flavell RA. Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor 3. Nature, 2001; 413: 732-738. Bach EA, Aguet M, Schreiber RD The IFN-g receptor: a paradigm for cytokine receptor signaling. Annu Rev Immunol, 1997; 15: 563-591. Billiau A, Heremans H, Allen PT, De Maeyer-Guignard J, De Somer P Trapping of oncornavirus particles at the surface of IFN-treated cells. Virology, 1976; 73: 537-542. Billiau A, Heremans H, Allen PT, Barin S, De Somer P IFN inhibits C-type virus at a posttranscriptional, prerelease step. Arch Virol, 1978; 57: 205-220. Branca AA, Baglioni C Evidence that types I and II interferons have different receptors. Nature, 1981; 294: 768-770. Brown GD, Gordon S Immune recognition. A new receptor for beta-glucans. Nature, 2001; 413: 36-37. Castelli JC, Hassel BA, Maran A, Paranjape J, Hewitt JA, Li XL et al The role of 2'-5' oligoadenilate-activated ribonuclease L in apoptosis. Cell Death Differ, 1998; 5: 313-320. Castelli JC, Hassel BA, Wood KA, Li XL, Amemiya K, Dalakas MC et al A study of the interferon antiviral mechanism: apoptosis activation by the 2-5A system. J Exp Med, 1997; 186: 967-972. Chang EH, Mims SJ, Triche TJ, Friedman RM IFN inhibits mouse leukaemia virus release: an electron microscope study. J Gen Virol, 1977; 34: 363-367. Chang Y-J, Holtzman MJ, Chen C-C Interferon-gammainduced epithelial ICAM-1 expression and monocyte adhesion. J Biol Chem, 2002; 277: 7118-7126. Coelho LF, de Freitas Almeida GM, Mennechet FJ, Blangy A, Uze G Interferon-a and -b differentially regulate osteoclastogenesis: role of differential induction of chemokine CXCL11 expression. Proc Natl Acad Sci USA, 2005; 102: 11917-11922. Cole KE, Strick CA, Paradis TJ, Ogborne KT, Loetscher M, Gladue RP et al Interferon-inducible T cell alpha chemoattractant (I-TAC): a novel non-ELR CXC chemokine with potent activity on activated T cells through selective high affinity binding to CXCR3. J Exp Med, 1998; 187: 2009-2021. 15. Darnell Jr JE, Kerr IM, Stark GR Jak-STAT pathways and transcriptional activation in response to IFNs and other extracellular signaling proteins. Science, 1994; 264: 1415-1421. 16. Der SD, Zhou A, Williams BR, Silverman RH Identification of genes differentially regulated by interferon a, b or g using oligonucleotide arrays. Proc Natl Acad Sci USA, 1998; 95: 15623-15628. 17. Derynck R, Remaut E, Saman E, Stanssens P, De Clercq E, Content J et al Expression of human fibroblast IFN gene in Escherichia coli. Nature, 1980; 287: 193-197. 18. de Veer MJ, Holko M, Frevel M, Walker E, Der S, Paranjape JM et al Functional classification of interferon-stimulated genes identified using microarrays. J Leukoc Biol, 2001; 69: 912-920. 19. Daz MO The human type I interferon gene cluster. Seminars in Virology, 1995; 6: 143-149. 20. Domanski P, Colamonici OR The type-I interferon receptor. The long and short of it. Cytokine Growth Factor Rev, 1996; 7: 143-151. 21. Dong B, Silverman RH 2-5A-dependent RNase molecules dimerize during activation by 2-5A. J Biol Chem, 1995; 270: 4133- 4137. 22. Falcoff R Some properties of virus- and immune-induced human lymphocyte IFNs. J Gen Virol, 1972; 16: 251-253. 23. Farber JM A macrophage mRNA selectively induced by gammainterferon encodes a member of the platelet factor 4 family of cytokines. Proc Natl Acad Sci USA, 1990; 87: 5238-5242. 24. Field AK, Tytell AA, Lampson GP, Hilleman MR Inducers of IFN and host resistance. II. Multistranded synthetic polynucleotide complexes. Proc Natl Acad Sci USA, 1967; 58: 1004-1010. 25. Findlay GM, MacCallum FO An interference phenomenon in relation to yellow fever and other viruses. J Path and Bact, 1937; 44: 405-424. 26. Finter NB Large-scale production of human IFN from lymphoblastoid cells. Texas Rep Med Biol, 1982; 175-178. 27. Floyd-Smith G, Slattery E, Lengyel P Interferon action: RNA cleavage pattern of a (2'-5')oligoadenylate-dependent endonuclease. Science, 1981; 212: 1030-1032. 28. Foster GR, Masri SH, David R, Jones M, Datta A, Lombardi G et al IFN-a subtypes differentially affect human T cell motility. J Immunol, 2004; 173: 1663-1670. 29. Friedman, RM Interferon binding: the first step in establishment of antiviral activity. Science, 1967; 156:1760-1761. 30. Friedman RL, Manly SP, McMahon M, Kerr IM, Stark GR Transcriptional and posttranscriptional regulation of interferoninduced gene expression in human cells. Cell, 1984; 38: 745-755. 31. Friedman RL, Stark GR a-Interferon-induced transcription of HLA and metallothionein genes containing homologous upstream sequences. Nature, 1985; 314: 637-639.
3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13.
14.
114

transcription by interferon regulatory factor 3. Proc Natl Acad Sci USA, 1998; 95: 9837-9842. Kalie E, Jaitlin DA, Abramovich R, Schreiber G An interferon a2 mutant optimized by phage display for IFNAR1 binding confers specifically enhanced antitumor activities, J Biol Chem, 2007; 282: 11602-11611. Kawade Y, Yamamoto Y Induction and production of L cell IFN. In: S. Pestka, Editor, IFNs. Part A. Methods in enzymology vol. 78, Academic Press, New York (1981), pp. 175-184. Kerr IM, Brown RE, Ball LA Increased sensitivity of cell-free protein synthesis to double-stranded RNA after interferon treatment. Nature, 1974; 250: 57-59. Kerr IM, Brown RE, Hovanessian AG Nature of inhibitor of cell-free protein synthesis formed in response to IFN and doublestranded RNA. Nature, 1977; 268: 540-542. Kerr IM, Brown RE pppA2p5A2p5A: an inhibitor of proteins synthesis synthesized with an enzyme fraction from interferontreated cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1978; 75: 256-260. Kleinschmidt WJ, Cline JC, Murphy EB Interferon production by statolon. Proc Natl Acad Sci USA, 1964; 52: 741-744. Knight Jr E, Hunkapiller MW, Korant BD, Hardy RW, Hood LE Human fibroblast interferon: amino acid analysis and amino terminal amino acid sequence. Science, 1980; 207: 525-526. Kotenko SV, Gallagher G, Baurin VV, Lewis-Antes A, Shen M, Shah NK et al IFN-lambdas mediate antiviral protection through a distinct class II cytokine receptor complex. Nat Immunol, 2003; 4: 69-77. Kotenko SV, Langer JA Full house: 12 receptors for 27 cytokines. Int Immunopharmacol, 2004; 4: 593-608. Lazarus R, Raby BA, Lange C, Silverman EK, Kwiatkowski DJ, Vercelli D et al Toll-like receptor 10 genetic variation is associated with asthma in two independent samples. Am J Respir Crit Care Med, 2004; 170: 594-600. Lampson GP, Tytell AA, Field AK, Nemes MM, Hilleman MR Inducers of IFN and host resistance. I. Double-stranded RNA from extracts of Penicillium funiculosum. Proc Natl Acad Sci USA, 1967; 58: 782-789. Lebleu B, Sen GC, Shaila S, Cabrer B, Lengyel P Interferon, double-stranded RNA, and protein phosphorilation. Proc Natl Acad Sci USA, 1976; 73: 3107-3111. Le Bourhis L, Benko S, Girardin SE Nod1 and Nod2 in innate immunity and human inflammatory disorders. Biochem Soc Trans, 2007; 35(Pt 6): 1479-1484. Leong SS, Horoscewicz J Production and preparation of human fibroblast IFN for clinical trials. In: S. Pestka, Editor, IFNs. Part A. Methods in enzymology vol. 78, Academic Press, New York (1981), pp. 87-101. Lindahl P, Leary P, Gresser I Enhancement by interferon of the specific cytotoxicity of sensitized lymphocytes, Proc Natl Acad Sci USA, 1972; 69: 721-725. Lindahl P, Gresser I, Leary P, Tovey M Interferon treatment of mice: enhanced expression of histocompatibility antigens on lymphoid cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1976; 73: 1284-1287. Lindenmann J Inheritance of resistance to influenza virus in mice. Proc Soc Exp Biol Med, 1964; 116, 506-509. Lindenmann J, Burke DC, Isaacs A Studies on the production, mode of action and properties of interferon. Br J Exp Path, 1957, 38: 551-562. Luster AD, Unkeless JC, Ravetch JV Gamma-interferon transcriptionally regulates an early-response gene containing homology to platelet proteins. Nature, 1985; 315: 672-676. Marie I, Hovanessian AG The 69-kDa 2-5A synthetase is composed of two homologous and adjacent functional domains. J Biol Chem, 1992; 267: 9933-9939. Masucci MG, Szigeti R, Klein E, Gruest J, Montagnier L, Taira H et al Effect of IFN-1 from E. coli on some cell functions. Science, 1980; 209: 1431-1435. Merigan TC, Reed SE, Hall TS, Tyrrell DA Inhibition of respiratory virus infection by locally applied interferon. Lancet, 1973; 1: 563-567. Merlin G, Chebath J, Benech P, Metz R, Revel M Molecular cloning and sequence of partial cDNA for interferon-induced (2'5')oligo(A) synthetase mRNA from human cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1983; 80: 4904-4908. Miller DM, Zhang Y, Rahill BM, Kazor K, Rofagha S, Eckel JJ et al Human cytomegalovirus blocks interferon-gamma stimulated up-regulation of major histocompatibility complex class I expression and the class I antigen processing machinery. Transplantation, 2000; 69: 687-690. Miyamoto M, Fujita T, Kimura Y, Maruyama M, Harada H, Sudo Y, et al Regulated expression of a gene encoding a nuclear factor, IRF-1, that specifically binds to IFN- gene regulatory elements. Cell, 1988; 54: 903-913.
32. Fu XY, Schindler C, Improta T, Aebersold R, Darnell JE Jr The proteins of ISGF-3, the interferon a-induced transcriptional activator, define a gene family involved in signal transduction. Proc Natl Acad Sci USA, 1992; 89: 7840-7843. 33. Gale M Jr, Katze MG Molecular mechanisms of interferon resistance mediated by viral-directed inhibition of PKR, the interferoninduced protein kinase. Pharmacol Ther, 1998; 78: 29-46. 34. Gavutis M, Jaks E, Lamken P, Piehler J Determination of the two-dimensional interaction rate constants of a cytokine receptor complex. Biophys J, 2006; 90: 3345-3355. 35. Girard R, Pedron T, Uematsu S, Balloy V, Chignard M, Akira S et al Lipopolysaccharides from Legionella and Rhizobium stimulate mouse bone marrow granulocytes via Toll-like receptor 2. J Cell Sci, 2003; 116(Pt 2): 293-302. 36. Goeddel DV, Shepard HM, Yelverton E, Leung D, Crea R Synthesis of human fibroblast IFN by E. coli, Nucl Acids Res, 1980; 8: 4057-4074. 37. Goeddel DV, Leung DW, Dull TJ, Gross M, Lawn RM, McCandliss R et al The structure of eight distinct cloned human leukocyte interferon cDNAs. Nature, 1981; 290: 20-26. 38. Gray PW, Goeddel DV Structure of the human immune interferon gene. Nature, 1982; 298: 859-863. 39. Gresser I, Bourali C, Levy JP, Fontaine-Brouty-Boye D, Thomas MT Increased survival in mice inoculated with tumor cells and treated with interferon preparations. Proc Natl Acad Sci USA, 1969; 63: 51-57. 40. Gresser I, Tovey MG, Maury C, Chouroulinkov I Lethality of interferon preparations for newborn mice. Nature, 1975; 258: 76-78. 41. Hardy MP, Owczarek CM, Jermiin LS, Ejdeback M, Hertzog PJ Characterization of the type I interferon locus and identification of novel genes. Genomics, 2004; 84: 331-345. 42. Havell EA, Berman B, Ogburn CA, Berg K, Paucker K, Vilcek J Two antigenically distinct species of human IFN, Proc Natl Acad Sci USA, 1975; 72: 2185-2187. 43. Hayashi F, Smith KD, Ozinsky A, Hawn TR, Yi EC, Goodlett DR et al The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll-like receptor 5. Nature, 2001; 410: 1099-1103. 44. Heil F, Hemmi H, Hochrein H, Ampenberger F, Kirschning C, Akira S et al Species-specific recognition of single-stranded RNA via toll-like receptor 7 and 8. Science, 2004; 303: 1526-1529. 45. Henle W Interference phenomena between animal viruses: a review, J Immunol, 1950, 64: 203-235. 46. Hilkens CM, Schlaak JF, Kerr IM Differential responses to IFN-a subtypes in human T cells and dendritic cells. J Immunol, 2003; 171: 5255-5263. 47. Ho M Interferon-like viral inhibitor in rabbits after intravenous administration of endotoxin. Science, 1964; 146: 1472-1474. 48. Horisberger MA, Staeheli P, Haller O Interferon induces a unique protein in mouse cells bearing a gene for resistance to influenza virus. Proc Natl Acad Sci USA, 1983; 80: 1910-1914. 49. Hovanessian AG, Brown RE, Kerr IM Synthesis of low molecular weight inhibitor of protein synthesis with enzyme from IFN-treated cells. Nature, 1977; 268: 537-540. 50. Iki D, Nola P, Marici Z, Smudj K, Oresi V, Knezevi M et al Application of human leucocyte interferon in patients with urinary bladder papillomatosis, breast cancer, and melanoma. Lancet, 1981; 1: 1022-1024. 51. Isaacs A, Edney M Interference between inactive and active influenza viruses in the chick embryo. I. Quantitative aspects of interference. Aust J Exp Biol Med Sci, 1950; 28: 219-230. 52. Isaacs A, Lindenmann J Virus interference. I. The interferon. Proc R Soc Lond, B, Biol Sci, 1957; 147: 258-267. 53. Jaitin DA, Roisman LC, Jaks E, Gavutis M, Piehler J, Van der Heyden J et al Inquiring into the differential action of interferons (IFNs): an IFN-a2 mutant with enhanced affinity to IFNAR1 is functionally similar to IFN-b. Mol Cell Biol, 2006; 26: 1888-1897. 54. Jacobs L, OMalley J, Freeman A, Ekes R Intrathecal interferon reduces exacerbations of multiple sclerosis. Science, 1981; 214: 1026-1028. 55. Jaks E, Gavutis M, Uze G, Martal J, Piehler J Differential receptor subunit affinities of type I interferons govern differential signal activation. J Mol Biol, 2007; 366: 525-539. 56. Jenner E Letter to the Editor. Med and Phys J, 1804; 12: 97-102. 57. Jonasch E, Haluska FG Interferon in Oncological Practice: Review of Interferon Biology, Clinical Applications, and Toxicities. The Oncologist, 2001; 6: 34-55. 58. Juang YT, Lowther W, Kellum M, Au WC, Lin R, Hiscott J et al Primary activation of interferon A and interferon B gene
59.
60. 61. 62. 63. 64. 65. 66. 67. 68.
69. 70. 71. 72.
73. 74. 75. 76. 77. 78. 79. 80. 81.
82.
83.

84. Munro S, Maniatis T Expression cloning of the murine interferon gamma receptor cDNA. Proc Natl Acad Sci USA, 1989; 86: 9248-9252. 85. Nagano Y, Kojima Y Pouvoir immunisant du virus vaccinal inactiv par des rayons ultraviolets. C R Seances Soc Biol Fil, 1954; 148: 1700-1702. 86. Nagano Y, Kojima Y Inhibition de linfection vaccinale par un facteur liquide dans le tissu infect par le virus homologue. C R Seances Soc Biol Fil, 1958; 152: 1627-1629. 87. Nagata S, Taira H, Hall A, Johnsrud L, Streuli M, Ecsdi J et al Synthesis in E. coli of a polypeptide with human leukocyte IFN activity. Nature, 1980; 204: 316-320. 88. Novick D, Cohen B, Rubinstein M The human interferon a/b receptor: characterization and molecular cloning. Cell, 1994; 77: 391-400. 89. Nyman TA, Kalkkinen N, Tolo H, Helin J Structural characterisation of N-linked and O-linked oligosaccharides derived from interferon-alpha2b and interferon-alpha14c produced by Sendai-virus-induced human peripheral blood leukocytes. Eur J Biochem, 1998; 253: 485-493. 90. Ozinsky A, Underhill DM, Fontenot JD, Hajjar AM, Smith KD, Wilson CB et al The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between toll-like receptors. Proc Natl Acad Sci USA, 2000; 97: 13766-13771. 91. Patel RC, Sen GC PACT, a protein activator of the interferoninduced protein kinase, PKR. EMBO J, 1998; 17: 4379-4390. 92. Pitha PM, Wivel NA, Fernie BF, Harper HP Effect of IFN on murine leukaemia virus infection. IV. Formation of non-infectious virus in chronically infected cells. J Gen Virol, 1979; 42: 467-480. 93. Poltorak A, He X, Smirnova I, Liu MY, Van Huffel C, Du X et al Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene. Science, 1998; 282: 2085-2088. 94. Powell HM, Culbertson CG, McGuire JM, Hoehn MM, Baker LA A filtrate with chemoprophylactic and chemotherapeutic action against MM and Semliki Forest viruses in mice. Antibiot Chemother, 1952; 2: 113-118. 95. Riviere Y, Gresser I, Guillon J-C, Tovey MG Inhibition by antiinterferon serum of lymphocytic choriomeningitis virus disease in suckling mice, Proc Natl Acad Sci USA, 1977; 74: 21352139. 96. Roberts WK, Clemens MJ, Kerr IM IFN-induced inhibition of protein synthesis in L-cell extracts: an ATP-dependent step in the activation of an inhibitor by double-stranded RNA. Proc Natl Acad Sci USA, 1976; 73: 3136-3140. 97. Roberts WK, Hovanessian A, Brown RE, Clemens MJ, Kerr IM IFN-mediated protein kinase and low-molecular-weight inhibitor of protein synthesis. Nature, 1976; 254: 477-480. 98. Rose D, Zhu X, Kose H, Hoang B, Cho J, Chiba A Toll, a muscle cell surface molecule, locally inhibits synaptic initiation of the RP3 motoneuron growth cone in Drosophila. Development, 1997; 124: 1561-1571. 99. Rutz M, Metzger J, Gellert T, Luppa P, Lipford GB, Wagner H et al Toll-like receptor 9 binds single-stranded CpG-DNA in a sequence- and pH-dependent manner. Eur J Immunol, 2004; 34: 2541-2550. 100. Sarkar SN, Sen GC Novel functions of proteins encoded by viral stress-inducible genes. Pharmacol Ther, 2004; 103: 245-259. 101. Sato M, Hata N, Asagiri M, Nakaya T, Taniguchi T, Tanaka N Positive feedback regulation of type I IFN genes by the IFN-inducible transcription factor IRF-7. FEBS Lett, 1998; 441: 106110. 102. Scientific Committee on Interferon Effect of interferon on vaccination in volunteers. Lancet, 1962; i: 873-875. 103. Schindler C, Levy DE, Decker T JAK-STAT signaling: from interferons to cytokines. J Biol Chem, 2007; 282: 20059-20063. 104. Severa M, Remoli ME, Giacomini E, Ragimbeau J, Lande R, Uz G et al Differential responsiveness to IFN-a and IFN-b of human mature DC through modulation of IFNAR expression. J Leukoc Biol, 2006; 79:1286-1294. 105. Sheppard P, Kindsvogel W, Xu W, Henderson K, Schlutsmeyer S, Whitmore TE et al IL-28, IL-29 and their class II cytokine receptor IL-28R. Nat Immunol, 2003; 4: 63-68. 106. Shope RE Therapeutic activity of a substance from Penicillium funiculosum Thom against swine influenza virus infection in mice. Am J Bot, 1948; 35: 803. 107. Shope RE An antiviral substance from Penicillium funiculosum. I Effect upon infection in mice with swine influenza virus and Columbia SK encephalomyelitis virus. J Exp Med, 1953; 97: 601-625.
115
108. Shuai K, Schindler C, Prezioso VR, Darnell JE Jr Activation of transcription by IFN-gamma: tyrosine phosphorylation of a 91-kD DNA binding protein. Science, 1992; 258: 1808-1812. 109. Siegal FP, Kadowaki N, Shodell M, Fitzgerald-Bocarsly PA, Shah K, Ho S et al The nature of the principal type I interferonproducing cells in human blood. Science, 1999; 284:1835-1837. 110. Silverman RH Viral encounters with 2',5'-oligoadenylate synthetase and RNase L during the interferon antiviral response. J Virol, 2007; 81: 12720-12729. 111. Interferon Nomenclature Meeting sponsored by the National Institute of Allergy and Infectious Diseases and the World Health Organization- U.S., National Centre on Interferon. Nature, 1980; 286: 110. 112. Stinebring WR, Youngner JS Patterns of interferon appearance in mice infected with bacteria or bacterial endotoxin. Nature, 1964; 204: 712. 113. Streuli M, Nagata S, Weissmann C At least three human type a-interferons: structure of a 2. Science, 1980; 209: 1343-1347. 114. Taira H, Broeze RJ, Slattery E, Lengyel P Large-scale production of mouse IFNs from monolayers of Ehrlich ascites tumor cells, J Gen Virol, 1980; 49: 231-234. 115. Taniguchi T, Saka M, Fujii-Kuriyama Y, Muramatsu M, Kobayashi M, Sudo T Construction and identification of a bacterial plasmid containing the human fibroblast interferon gene sequence. Proc Jpn Acad, 1979; 55B: 464469. 116. Taniguchi T, Mantei N, Schwarzstein M, Nagata S, Muramatsu M, Weissmann C Human leukocyte and fibroblast interferons are structurally related. Nature, 1980; 285: 547-549. 117. Taniguchi T, Guarente L, Roberts T, Kimelman D, Douhan JI, Ptashne M Expression of the human fibroblast IFN gene in E. coli. Proc Natl Acad Sci USA, 1980; 77: 5230-5233. 118. Taylor J Inhibition of IFN action by actinomycin D. Biochem Biophys Res Commun, 1964; 14: 447-453. 119. Tovey MG, Begon-Lours J, Gresser I A method for the largescale production of potent IFN preparations. Proc Soc Exp Biol Med, 1974; 146: 809-815. 120. Tyrrell D IFN produced by cultures of calf kidney cells. Nature, 1959; 184: 452-453. 121. Uze G, Schreiber G, Piehler J, Pellegrini S The receptor of the type I interferon family. Cur Topics Microbiol Immunol, 2007; 316: 71-95. 122. van Boxel-Dezaire AHH, Rani MRS, Stark GR Complex modulation of cell type-specific signalling in response to type I interferons. Immunity, 2006; 25: 361-372. 123. van Damme J, Billiau A Large-scale production of human fibroblast IFN. In: S. Pestka, Editor, IFNs. Part A. Methods in enzymology vol. 78, Academic Press, New York (1981), pp. 101-119. 124. Velazquez L, Fellois M, Stark GR, Pellegrini S A protein tyrosine kinase in the interferon a/b signaling pathway. Cell, 1992; 70: 313-322. 125. Wheelock EF IFN-like virus inhibitor induced in human leukocytes by phytohemagglutinin. Science, 1965; 141: 310-311. 126. Williams BR Signal integration via PKR. Sci STKE, 2001; 89: RE2. 127. Wreschner DH, McCauley JW, Skehel JJ, Kerr IM Interferon action- sequence specificity of the ppp(A2p)nA-dependent ribonuclease. Nature, 1981; 289: 414-417. 128. Yoneyama M, Kikuchi M, Natsukawa T, Shinobu N, Imaizumi T, Miyagishi M et al The RNA helicase RIG-I has an essential function in double-stranded RNA-induced innate antiviral responses. Nat Immunol, 2004; 5: 730-737. 129. Youngner J, Salvin SB Production and properties of migration inhibitory factor and IFN in the circulation of mice with delayed type hypersensitivity. J Immunol, 1973; 111: 1914-1922. 130. Zilberstein A, Kimchi A, Schmidt A, Revel M Isolation of two interferon-induced translational inhibitors: a protein kinase and an oligoisoadenylate synthetase. Proc Natl Acad Sci USA, 1978; 75: 4734-4738. 131. Zinn K, DiMaio D, Maniatis T Identification of two distinct regulatory regions adjacent to the human b-interferon gene. Cell, 1983; 34: 865-879. 132. Zhao W, Cha EN, Lee C, Park CY, Schindler C Stat2dependent regulation of MHC class II expression. J Immunol, 2007; 179: 463-471. 133. Zhou A, Paranjape JM, Der SD, Williams BR, Silverman RH Interferon action in triply deficient mice reveals the existence of alternative antiviral pathways. Virology, 1999; 258: 435-440. 134. Zoon KC, Smith ME, Bridgen PJ, Anfinsen CB, Hunkapiller MW, Hood LE Amino terminal sequence of the major component of human lymphoblastoid interferon. Science, 1980; 207: 527-528.

Interferon I

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Interferon I

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

4

O JUMTATE DE SECOL DE CERCETARE N DOMENIUL INTERFERONILOR

I. ISTORICUL CERCETRII N DOMENIUL INTERFERONILOR

REVISTA ROMN DE BOLI INFECIOASE VOL. XII, NR. 2, AN 2009

REVISTA ROMN DE BOLI INFECIOASE VOL. XII, NR. 2, AN 2009

REVISTA ROMN DE BOLI INFECIOASE VOL. XII, NR. 2, AN 2009

REVISTA ROMN DE BOLI INFECIOASE VOL. XII, NR. 2, AN 2009

REVISTA ROMN DE BOLI INFECIOASE VOL. XII, NR. 2, AN 2009

REVISTA ROMN DE BOLI INFECIOASE VOL. XII, NR. 2, AN 2009

II. PRIVIRE DE ANSAMBLU ASUPRA ORGANIZRII I FUNCIONRII SISTEMULUI INTERFERON

REVISTA ROMN DE BOLI INFECIOASE VOL. XII, NR. 2, AN 2009

REVISTA ROMN DE BOLI INFECIOASE VOL. XII, NR. 2, AN 2009

1985 1988 1990

1992-1994 1993 1995-1998 1997 1999 2000 2001 2004-2005

REVISTA ROMN DE BOLI INFECIOASE VOL. XII, NR. 2, AN 2009

Figura 1. Privire de ansamblu asupra mecanismelor de inducie a sintezei interferonilor.

REVISTA ROMN DE BOLI INFECIOASE VOL. XII, NR. 2, AN 2009

REVISTA ROMN DE BOLI INFECIOASE VOL. XII, NR. 2, AN 2009

Figura 2. Reprezentare schematic a mecanismelor de inducie a genelor stimulate de interferoni.

REVISTA ROMN DE BOLI INFECIOASE VOL. XII, NR. 2, AN 2009

REVISTA ROMN DE BOLI INFECIOASE VOL. XII, NR. 2, AN 2009

REVISTA ROMN DE BOLI INFECIOASE VOL. XII, NR. 2, AN 2009

REVISTA ROMN DE BOLI INFECIOASE VOL. XII, NR. 2, AN 2009

REVISTA ROMN DE BOLI INFECIOASE VOL. XII, NR. 2, AN 2009

3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13.

REVISTA ROMN DE BOLI INFECIOASE VOL. XII, NR. 2, AN 2009

60. 61. 62. 63. 64. 65. 66. 67. 68.

69. 70. 71. 72.

73. 74. 75. 76. 77. 78. 79. 80. 81.

REVISTA ROMN DE BOLI INFECIOASE VOL. XII, NR. 2, AN 2009

S-ar putea să vă placă și