Utilizarea introgresiunilor genetice in biotehnologii

Introgresiune - formare de hibrizi interspecifici fertili, ca urmare a ptrunderii unei gene strine n genofondul unei populaii. (< engl. introgression) Biotehnologie - Orice aplicaie tehnologic care utilizeaz sisteme biologice, organisme vii sau derivate ale acestora, pentru a crea sau modifica produse sau procese n scopuri bine determinate. Biotehnologia vegetal creeaz culturi cu caracteristici mbuntite, ca de exemplu plante care produc cantiti mai mari de alimente sntoase cu mai puin ap i mai puine erbicide/pesticide. Iniial, agricultorii i cultivatorii au creat noi plante prin ncruciare, adic prin amestecarea genelor, care are ca i rezultat variaia, un rezultat care ns nu poate fi controlat. Pe de alt parte, biotehnologia ne permite s definim caracteristica dorit i s introducem gena care o exprim, pentru a obine o ameliorare a plantei respective.

Sunt relativ puine lucrri care abordeaz, n mod critic, problema metodelor utilizate pentru transformarea genetic a plantelor (Potrykus, 1991), respectiv a mecanismelor biolo gice care permit transferul i integrarea unui fragment de ADN strin ntr-o celul vegetal int. In numeroase laboratoare s-a reuit transformarea genetic a diferitelor specii de plante, fie ele plante model cum ar fi tutunul ( Nicotiana tabacum) sau petunia ( Petuniahybrida), sau dimpotriv plante considerate recalcitrante dar de un mare interes economic,cum ar fi soia sau unele cereale. Pentru o anumit specie de plante poate fi aplicat eficient o metod de transformare genetic, sau mai multe. Pentru o specie cum ar fi Arabidopsis thaliana, specie model pentru cercetrile degenetic molecular, al crui genom a fost deja cartat n ntregime, se pot aplica cu succes, n funcie de scopul urmrit, mai multe metode de transformare genetic: transformare a seminelor, a explantelor radiculare sau chiar a inflorescenelor in planta, cu ajutorul vectorului Agrobacterium tumefaciens, transformarea direct a protoplastelor, metoda biolistic sau microinjectarea. Din pcate, ns, nu se pot aplica cu aceeai eficien diferite metode la specii considerate recalcitrante, iar celulele int pentru transformare nu sunt ntotdeauna cele care posed totipotenialitate i deci pot regenera plante ntregi. Mai mult,eficiena transformrii este dependent nu numai de specie, dar chiar i de genotip. De aceea, gsirea unei metode general aplicabile care s permit transformarea eficient i de rutin a tuturor genotipurilor i speciilor de plante dorite de experimentatori, rmne un obiectiv al cercetrii din acest domeniu. Metodele de transformare pot fi clasificate n metode indirecte, bazate pe utilizarea unor vectori de ADN, i metode directe . Metode indirecte de transformare a plantelor Transformarea mediat de Agrobacterium Bacteriile din sol, Agrobacterium tumefaciens i Agrobacterium rhizogenes realizez ceea ce adeseori s-a numit inginerie genetic natural. Aceaste bacterii sunt capabile s transfere n esutul vegetal lezat, un fragment de ADN propriu, ADN-T, de pe plasmida Ti(tumor inducing) n cazul speciei A. tumefaciens sau Ri (root inducing) n cazul speciei A. Rhizogenes, c a r e s e i n t e g r e a z n genomul plantei. C a u r m a r e b a c t e r i a A.tumefaciens induce formarea de tumori la nivelul coletului (crown gall disease) iar A.rhizogenes formarea de rdcini firoase (hairy roots). In decursul coevoluiei plant microorganism aceste bacterii au devenit capabile s transforme plantele pentru a le exploatamai bine ca i surse de energie. ADN T se transmite prin semine dup legile Mendeliene, ca gen dominant. Exist date care confirm faptul c o astfel de

transformare genetic are loc n natur fr intervenia omului. Astfel, s-a demonstrat c plasmida Ri poate purta una sau dou copii de ADN-T, iar o parte din una dintre aceste secvene a fost regsit n genomul unor plante nemodificate genetic (Potrykus i Spangenberg, 1995). Celulele vegetale care poart ADN-T devin celule tumorale, deoarece acest fragment de ADN conine gene cu efect oncogen. Deleia acestor gene din ADN-T nu interfer, din fericire, cu transferul i integrareaADN-T n genomul celulei vegetale receptoare. Doar capetele ADN-T, aa numitele laturd r e a p t i s t n g c o n s t n d d i n o s e c v e n a l c t u i t d i n 2 4 d e n u c l e o t i d e c a r e s e r e p e t , reprezint situri de recunoatere pentru sistemul de transfer. Prin nlocuirea oncogenelor dinADN-T cu gene de interes este posibil transferul acestora n celule vegetale int, celule carenu mai dobndesc caracter tumoral i deci pot regenera plante transformate genetic. Genele de interes fie ele gene marker sau raportoare sau gene cu importan economic pot fi introduse n plante fie prin lincaj cu regiunea ADN-T dezarmat prin recombinare, obinndu-se un aa numit vector de integrare, fie prin clonarea lor ntre secvenele repetate lateralentr-un replicon independent, ceea ce se numete vector binar. Existena mai multor regiuniT n c e l u l a d e Agrobacterium conduce la cotransferul acestora n celula vegetal int cueficien crescut. Pe de alt parte pentru integrarea ADN-T n celula vegetal se pot utilizasecvene omoloage ADN vegetal int care induc, cu frecven relativ sczut, recombinarea omolag ntre ADN-T i ADN vegetal. Agrobacterium tumefaciens poate transfera ADN-T diferitelor specii de plante chiar dac unele dintre acestea nu formez tumori (de la Riva i colab., 1998). Dei spectrul de gazde pentru aceast bacteriei este limitat la plantele dicotiledonate s-au obinut tulpini supervirulente, capabile s infecteze eficient i celulele plantelor monocotiledonate (Potrykusi Spangenberg, 1995). S-a deschis, astfel, calea transformrii cerealelor i prin intermediul acestui vector bacterian. Eficiena transformrii celulei vegetale de ctre A. tumefaciens, variaz destul de mult n funcie de specie, genotip sau chiar de esutul int. Este foarte important, totodat, ca esutul supus transformrii s fie totipotent i deci s regenereze plante transformate genetic. De cele mai multe ori, ns, dintr-un esut doar un numr limitat de celule sunt totipotente i nu ntodeauna acestea sunt i cele transformate de agrobacterium. Pentru diferite specii de plante s-au identificat metode potrivite pentru transformarea eficient mediat de A. tumefaciens. Ca esuturi int pot fi utilizate: discuri sau fragmente foliare,fragmente de rdcini, hipocotile, peiol, cotiledoane sau semine ntregi. Primele plante transformate prin intermediul lui A. tumefaciens a u f o s t r e g e n e r a t e n 1 9 8 3 ( F r a l e y i colab.,1983), succesele iniiale limitndu-se la solanacee, n particular la sistemul model tutunul ( Nicotiana tabacum L.). In anii optzeci i nouzeci ai secolului douzeci, tot mai multe specii de plante au putut fi transformate prin intermediul vectorului A. Tumefaciens, multe dintre ele, specii cu o mare importan economic, cum ar fi: soia, bumbacul, orezul,o v z u l , s o r g u l , t r e s t i a d e z a h r , g r u l i m u l t e a l t e l e ( P o t r y k u s i S p a n g e n b e r g , 1 9 9 5 ; Songstad i colab., 1995; de la Riva i colab., 1998). Eficiena transformrii variaz foarte mult de la o specie la alta n funcie de: - identificarea metodei optime de cultur a esutului int, condiiile de cultur a materiallului surs, sau sua bacterian utilizat. Aceti factori afecteaz i numrul de copii de ADN-T care se integreaz n genomul vegetal receptor. Predominant s-a constatat, la diferite specii de plante, integrarea unei singure copii de ADN-T. - Mai recent, cercetrile au vizat descifrarea mecanismelor implicate n c o l o n i z a r e a esuturilor vegetale de ctre bacterii, relevndu-se noi detalii privind controlul genetic al virulenei bacteriene (de la Riva i colab., 1998).

Agrobacterium rhizogenes a fost utilizat pentru prima oar pentru transformarea plantelor de tutun n anul 1977 (Ackermann, 1977). Aceast bacterie transfernd ADN-T de pe plamida Ri determin formarea rdcinilor firoase pe diferite organe ale plantelor, rdcini care pot purta g e n e d e interes, dac acestea au fost integrate n ADN-T, respectiv pot regenera plante transformate genetic. O e t a p i n t e r m e d i a r , n p r o c e s u l d e t r a n s f o r m a r e m e d i a t d e A. rhizogenes, este cultura rdcinilor firoase care au capacitatea de a se alungi i ramifica.Astfel, prin cultura rdcinilor firoase se pot obine metabolii secundari sau pot fi realizate studii fundamentale privind creterea i dezvoltarea rdcinilor. Acest sistem experimental este foarte potrivit i pentru analize biochimice, rdcinile prezentnd ci biochimice mai simple i, deci, mai uor de analizat. Rdcinile firoase pot fi cultivate uor, folosind un echipament simplu i ieftin iar, comparativ cu suspensiile celulare, celulele radiculare sunt stabile din punct de vedere genetic. Asemntor sistemului A. tumefaciens, bacteria A.rhizogenes poate co-tranfera ADN-T de pe plasmida Ri i un vector binar, de obicei o plasmid mai mic. Aceasta din urm poate purta n ADNT o gen marker, de exemplu o gen care confer rezisten la un antibiotic, o gen raportoare sau marker pentru vizualizare fenotipic i o gen cu importan economic. Avantajul acestui sistem este acela c cele dou tipuri de ADN-T, cel care determin dezvoltarea rdcinilor firoase, i ADN-T de pe vectorul binar, se integreaz de obicei pe cromozomi diferii n plantele transformate i deci,vor segrega independent n descenden. Un avantaj aparte al sistemului de transformare Ri este faptul c toate celulele vegetale care integreaz ADN-T de pe plasmida Ri pot fi uor identificate i selectate prin prezena fenotipului de rdcin firoas.Sistemul de transformare mediat de A. Rhizogenes a fost aplicat unui mare numr de specii de plante (n jur de 200 nc n 1989 Tepfer 1989), dar asemntor sistemului A.tumefaciens r s p u n s u l o p t i m v a r i a z n f u n c i e d e s p e c i e , g e n o t i p s a u s u a b a c t e r i a n . Organele vegetale potrivite pentru transformarea cu A. rhizogenes sunt: fragmente de tulpin de l a p l a n t e t i n e r e , f r a g m e n t e d e p e i o l , f r a g m e n t e f o l i a r e , s e g m e n t e d e h i p o c o t i l e s a u cotiledoane, sau fragmente ale unor organe de rezerv cum ar fi rdcinile de morcov sau tuberculii de cartof. Uneori astfel de explante prezint un rspuns polar, formnd rdcini fi r o a s e n u m a i l a una din extremele explantului, rdcini capabile s ignore f o r a gravitaional. Mai mult, exist date experimentale care sugereaz efe ctul de piticire a plantelor indus de una dintre genele de virulen, rolA, d e l a A. rhizogenes, e f e c t c u importan practic mai ales pentru unele plante horticole (Curtis i colab., 1996). Transformarea mediat de virusuri Utilizarea vectorilor virali pentru transformarea plantelor, n ciuda numeroaselor eforturi experimentale, nu a adus rezultate spectaculoase. Dei, n 1984 a fost posibil transferul unei gene de rezistena la antibiotic cu ajutorul unui virus ADN (Brisson i colab.,1984), cercetrile ulterioare au demonstrat c genomul viral nu poate accepta i transfera fragmente mai lungi de ADN strin. Descoperirea faptului c virusurile ARN pot genera ADNc prin transcripie invers a generat sperena c, mult mai numeroasele virusuri ARN ar putea fi utilizate ca vectori de gene pentru celula vegetal. Din pcate, ns, s-au ntmpinatalte dificulti. ADNc viral nu se integreaz n genomul vegetal iar meristemele, principalasurs de celule totipotente, nu sunt infectate de virusuri. De aceea, vectorii virali sunt mai rar utilizai n experimentele de transformare genetic a plantelor.

Metode directe de transformare a plantelor Utilizarea protoplastelor pentru transferul direct de ADN Protoplastele - celulele vegetale lipsite de perete celular, reprezint limita de expresie atotipotenialitii. De la primele plante de tutun regenerate din protoplaste izolate (Takebe i colab., 1971) pn astzi numrul plantelor pentru care regenerarea din protoplaste a devenit posibil a crescut permanent, ajungnd actualmente la aproximativ 400 de specii de plante. Dac pn n anul 1985 tehnologia protoplastelor se putea aplica cu succes mai ales Solanaceaelor i Brassicaceaelor, o dat cu descoperirea totipotenialitii protoplastelor izolate din suspensii celulare embriogene de cereale s-au deschis noi oportuniti de modificare genetic a acestui important grup de plante.Protoplastele sunt sistemele celulare ideale pentru transferul de ADN i selecia transformanilor. Indeprtarea peretelui celular elimin principala barier n calea ptrunderii ADN strin n celula vegetal. Izolarea enzimatic a protoplastelor acioneaz ca un factor de stress care induce reacii de rspuns la rnire reacii presupuse a declana starea de competen att de important pentru transformarea eficient. Mai mult, suspensia de protoplaste se aseamn cu o suspensie bacterian avnd avantaje similare prin posibilitateade a cultiva populaii mari de celule individuale n medii de cultur bine definite. Tesuturile derivate din protoplaste au n general origine clonal provenind din celule individuale.Eficiena seleciei transformanilor este, prin urmare, maxim n cazul protoplastelor deoarece se evit formarea de himere, destul de frecvente la nivelul sistemelor multicelulare. Pentru transferul ADN, de obicei plasmidial, n protoplastele izolate se pot utiliza diferite metode, i anume: Tratamente chimice cu ageni permeabilizani (mai ales polietilenglicol PEG): PEG i ali ageni chimici pot permeabiliza membrana plasmatic permind intrarea unor macromolecule, ADN, n citoplasm. Mecanismul intim al acestui proces nu este pedeplin neles. Primele date raportate n literatur se refer la transferul ADN-T, provenind de la Agrobacterium tumefaciens, n protoplaste de petunia n prezena PEG (Draper i colab., 1982). Primele plante transgenice au fost obinute la tutun prin aceast metod dectre Paszkowski i colab. (1984). Transformarea protoplastelor prin permeabilizare cu PEG a fost realizat cu succes pentru multe specii de plante, att dicotiledonate ct i monocotiledonate, cheia succesului reprentnd-o existena unui protocol eficient de regenerare a plantelor din protoplaste. Electroporarea Implic permeabilizarea reversibil a membranei plasmatice n prezena unor pulsuri de curent continuu avnd amplitudine crescut i durat foarte scurt, porii formai n membran permind intrarea ADN strin n citoplasm (vezi Rakosy-Tican si colab., 2000). Electroporarea a devenit o metod de rutin pentru transformarea protoplastelor vegetale, dar i pentru celulele de mamifere sau bacteriene. La plante electroporarea protoplastelor se folosete eficient att pentru analiza expresiei transiente a transgenelor ct i pentru transformarea permenet, pentru numeroase specii de plante incluznd cerealele. Mai mult, prin electroporarea protoplastelor se elimin necesitatea utilizrii unor gene marker, ceea ce reprezint un avantaj deosebit n condiiile oponenei acerbe a opiniei publice fat de eliberarea n cmp a unor plante purtnd gene marker.Avantajele

electroporrii constau n eficiena crescut a incorporrii ADN strin,reproductibilitatea i simplitatea acestei metode. Singura limitare a aplicrii electroporrii o reprezint capacitatea de regenerare a protoplastelor, dar i acest dezavantaj a fost depit prin extinderea aplicrii electroporrii celulelor sau chiar esuturilor ntregi. Sonicarea permeabilizarea membranei protoplastelor n prezena ultrasunetelor s-a dovedit, de asemenea o metod eficient pentru transferul ADN n protoplaste vegetale. Ulterior metoda a fost aplicat i celulelor sau esuturilor ntregi, dar este utilizat pe scar mai redus comparativ cu electroporarea (Zhang i colab., 1991). Microinjectarea const n introducerea cu ajutorul unei micropipete a ADN direct n protoplaste, acestea fiind fixate cu o alt micropipet. Microinjectarea celulei vegetale ntregi sau a esuturilor este, de asemenea posibil, dar se realizeaz mai greu din punct devedere tehnic. Un sistem eficient a fost utilizat mai recent (Kost i colab., 1995) i constn imobilizarea protoplastelor recipiente de tutun ntr-un strat foarte subire de mediu solidificat cu agaroz sau alginat. Protoplastele au fost imobilizate deasupra unei grile care a permis localizarea i monitorizarea prin fotografiere a protoplastelor microinjectate, respectiv a celulelor sau calusurilor derivate din acestea. Fuziunea cu lipozomi fuziunea lipozomilor ncrcai cu ADN cu membrana plasmatic a protoplastelor i eliberarea ADN strin n citoplasm a fost demonstrat n 1990(Cacboche, 1990). Metoda nu prezint avantaje deosebite comparativ cu alte metode de transfer direct, de aceea este mai puin utilizat. S-a ncercat, de asemenea, utilizarea lipozomilor pentru a transporta ADN n celule sau esuturi ntregi, n ideea trecerii lipozomilor prin plasmodesme. S-a demonstrat ns c peretele celular este o barier de netrecut pentru lipozomi iar plasmodesmele se nchid ca rspuns la rnire. O idee interesant a fost aceea a injectrii lipozomilor n vacuola unor celule vacuolate. In acest caz s-a constatat fuziunea lipozomilor cu tonoplastul i eliberarea ADN n citoplasm. Dei elegant aceast metod are aplicaii restrnse deoarece celulele vacuolate nu sunt totipotente (Potrykus, 1991). Metoda biolistics mpucarea direct a ADN n celule Metoda biolistic (biolostics) sau particle gun, de mpucare direct a ADN n esuturi int (Klein i colab., 1987), este cea mai spectaculoas metod de transformare genetic a plantelor care a declanat un val de entuziasm n rndul specialitilor din acest domeniu. In dezvoltarea acestei tehnici s-a investit foarte mult efort i bani dar i rezultatele obinute au fost pe msura ateptrilor. Metoda const n accelerarea unor particule foarte mici (1m diametru) din tungsten sau aur coloidal, pe care a fost precipitat ADN, n esuturi vegetale int. Aceast tehnic are numeroase avantaje care o recomand pentru aplicabilitate general: este o metod uor de aplicat, printr-o mpuctur pot fi intite mai multe celule, celulele supravieuiesc dup mpucare, genele purtate de particule i pstreaz activitatea biologic, particulele pot fi mpucate n straturile superficiale sau n profunzimea unui organvegetal, celulele int pot fi foarte diferite: polen, celule n suspensie,

embrioni imaturi, celule din esuturi difereniate sau chiar meristeme. Datorit avantajelor sale biolisticul a devenit metoda favorit n numeroase laboratoare, permind transformarea cu succes a unor plante pentru care alte metode nu au dat rezultate cum ar fi: soia, porumbul, ovzul, orezul, sorgul,trestia de zahr, grul, plante forestiere etc. O aplicaie aparte a fost utilizarea mpucrii de microproiectile pentru rnirea apexurilor la floarea soarelui, eficientiznd astfel transformarea mediat de Agrobacterium tumefaciens(Bidney i colab., 1992). Mai mult, s-a reuit mpucarea direct n esuturi vegetale a celulelor bacteriene ntregi. Electroforeza Migrarea ADN printr-un esut vegetal int a fost o alt idee interesant pentru transferul de gene i a fost aplicat pentru prima oar embrionilor intaci de orz (Ahokas,1989). In aceste experimente sa demonstrat expresia tranzient a alogenelor. Ulterior s-a imaginat un sistem simplu pentru realizarea electroforezei folosind embrioni zigotici(Songstad i colab., 1995) Condiiile optime pentru electroforeza embrionilor sunt considerate: un curent de 0,5mA la 25V/embrion, timp de 15 min. In aceste condiii n jur de 50% din embrioni rmn viabili. S-a reuit, de asemenea, transformarea permanent, folosind genele marker de rezisten la kanamicin i GUS (-glucuronidaz), a embrionilor unei specii de orhidee(Griesbach i Hammond, 1993). Aplicarea acestei tehnici prezint interes deosebit pentru acele specii care nu au dat rezultate prin aplicarea unor metode ca biolisticul sau electroporarea. Utilizarea fibrelor de carbur de siliciu (silicon carbide technology) Fibrele de carbur de siliciu se utilizeaz n industrie. Transformarea genetic prin aceast tehnologie este relativ simpl, constnd n vortexarea (agitarea) esuturilor mpreun cu ADN i fibre de carbur de siliciu. Astfel, fibrele penetreaz pereii celulari permindADN s ptrund n citoplasm. Metoda a fost aplicat iniial transformrii embrionilor de insecte, iar ulterior s-a dovedit eficient i n transformarea celulelor vegetale (Kaeppler i colab., 1990). Cercetrile de microscopie electronic au relevat penetrarea peretelui celular de ctre astfel de fibre, sugernd c ADN ader de suprafaa fibrelor i este introdus odat cu acestea n celul. Avnd proprieti fizice asemntoare azbestului fibrele de carbur de siliciu sunt probabil carcinogene. Transformarea genetic tranzient a fost raportat folosind aceast tehnologie pentru suspensii celulare de porumb, ovz, tutun i Agrostis alba. Transformarea stabil a fost, de asemenea posibil folosind suspensii celulare de porumb i tutun. Datele obinute au indicat transformarea preponderent a aglomeratelor celulare neembriogene la porumb, de aceea se impun cercetri ulterioare pentru optimizarea acestei metode. Metoda prezint avantajul de a fi foarte simpl i ieftin, dar datorit riscurilor poteniale pentru sntatea uman se caut materiale alternative, eventual biodegradabile (Songstad i colab.,1995). Alte metode de transfer direct al ADN n celulele vegetale: exist o serie de alte metode cu aplicabilitate restrns de transformare a celulei vegetale cum ar fi: mbibarea ADN n esuturi utiliznd semine uscate sau embrioni, transformarea polenului sau a tubului polinic, macroinjectarea ADN n esuturi sau utilizarea microlaserului pentru a perfora peret ele celular i plasmalema. Astfel de metode se afl, actualmente, n diferite faze de experimentare. De un interes deosebit, se vor bucura metodele alternative care nu necesitfaze de cultur in vitro.

O astfel de metod, cu potenial deosebit este transformarea gruncioarelor de polen, dar deocamdat rezultatele n acest domeniu sunt relativ modeste(Potrykus, 1991).