Curs 7 Genetic MUTAIILE I MUTAGENEZA Materialul genetic prezint, n mod normal, o structur de o mare stabilitate, care face s fie

e protejat fa de apariia schimbrilor neprogramate, i care asigur transmiterea nealterat a structurii cromosomilor de la celulele le mame la celulele fiice i de la o generaie la alta. Pe de alt parte, ns, structura ADN, prin fenomenul de tautomerie, poate suferi modificri n proprietile de mperechere a bazelor azotate i de aici n schimbarea de-a lungul generaiilor a secvenei de nucleotide. Modificrile aprute n structura i funcia materialului genetic, care se transmit de la o generaie la alta i care nu sunt rezultatul segregrii genetice sau recombinrii genetice, se numesc mutaii genetice , iar capacitatea materialului genetic de a suferi asemenea mutaii se numete mutabilitate. Procesul de aparie a mutaiilor sub aciunea unor factori mutageni (fizici, chimici sau biologici) se numete mutagenez. Termenul de mutant se refer la un individ care rezult dintr-un organism normal dar care fenotipic prezint anumite diferene, mai mult sau mai puin evidente. Uneori aceste modificri pot fi reparate iar celulele respective redobndesc fenotipul normal. Pentru a clarifica termenii utilizai n experimentele de mutagenez, se poate recurge la urmtorul exemplu: o cultur de Pseudomonas fluorescens are particularitatea c pe mediu agarizat, formeaz colonii de culoare verde. Uneori, n mod spontan, printre coloniile colorate apare i una fr culoare, care a rezultat prin multiplicarea unei celule mutante. n acest caz, fenotipul mutant este lipsa culorii, iar fenotipul normal este culoarea verde a coloniei. Bacteriile mutante prezint o mutaie la nivelul genei ce codific sinteza unei enzime necesare pentru producerea pigmentului verde. Astfel, bacteriile mutante i cele normale (de tip slbatic), conin gene alele (alela normal pentru culoarea verde i alela mutant). n acest caz, mutaia produs la nivel genetic poate fi cunoscut datorit efectului fenotipic pe care l-a determinat. Exist cazuri n care nu toate modificrile de la nivelul genelor sunt urmate de efecte fenotipice evidente; n acest caz se poate spune c genele sunt tcute sau silenioase (silent genes). Exist mai multe variante n ceea ce privete notaia genelor. De exemplu, notaia his se refer la o gen ce codific enzima necesar pentru sinteza aminoacidului histidin. Uneori exist mai multe gene ce codific proteine cu funcii asemntoare: his A i his B sunt gene ce codific polipeptide necesare pentru biosinteza histidinei. Notaia his A se refer la mutaia care afecteaz gena respectiv i care nu mai permite sinteza polipeptidului normal. Reciproc, notaia his A + desemneaz gena alel normal. Uneori, pentru desemnarea genei mutante se folosesc cifre arabe care nsoesc denumirea genei normale. Astfel, notaia his A4 se refer la gena his A cu mutaia numrul 4 (alela 4 a genei respective). Atunci cnd mutaia determin modificarea genei de tip slbatic i conduce la apariia unei alele mutante, ea se numete mutaie nainte (forward mutation), iar mutaia de la tipul mutant la tipul normal se numete mutaie napoi (back mutation). Pentru desemnarea fenotipurilor normale sau mutante, notaiile sunt similare celor pentru gene cu deosebirea c prima liter este o majuscul. De exemplu, notaia His se refer la fenotipul unui organism incapabil s creasc pe un mediu minimal lipsit de histidin; notaia Rfmr se refer la un organism rezistent la aciunea rifampicinei, n timp ce Lac- se refer la un organism incapabil de a metaboliza lactoza.

Clasificarea mutaiilor
Clasificarea mutaiilor ine cont de mai multe criterii: mrimea secvenei de ADN afectate, efectul mutaiei, modul de producere etc.

Mutaiile pot aprea n mod spontan mutaii spontane sau naturale- cu o rat foarte sczut, ele fiind cauzate de o serie de factori naturali, sau pot fi induse prin utilizarea unor factori mutageni variai (fizici, chimici, biologici) mutaii induse sau artificiale. Dup mrimea segmentului de ADN afectat, se deosebesc: - mutaiile genice care afecteaz structura i funcia genei; cnd este afectat doar o pereche de nucleotide mutaia se numete mutaie punctiform. - Mutaiile cromosomale- determinnd modificri ale structurii i numrului cromosomilor la eucariote. Dup tipul de celul n care se produce evenimentul mutaional: - mutaii somatice cnd mutaia se desfoar n celulele somatice i mutaii gametice cnd aceasta afecteaz gameii. Mutaia somatic, aprut ntr-o celul a corpului ntr-un stadiu iniial al evoluiei ontogenetice (la nceputul dezvoltrii embrionare), va face ca din acea celul, prin diviziune mitotic, s rezulte o clon mutant care va genera o parte o corpului la nivelul creia se va produce fenotipic mutaia: petale albe alturi de petale roii la diferite specii de plante, un ram de mr ce produce fructe de alt culoare dect restul pomului sau la om, uvia alb de pr ntr-un pr castaniu sau negru. Mutaia somatic la organismele cu reproducere sexuat nu se transmite la descendeni. Ea se transmite la descenden numai n cazul organismelor ce se reproduc vegetativ. Pe de alt parte, mutaia gametic se transmite n descenden la organismele cu reproducere sexuat, putnd afecta n totalitate organe diferite sau ntregul organism. Pentru analiza genetic sunt folosite dou tipuri de mutante: - mutantele auxotrofe organisme care nu se pot multiplica pe medii minimale n absena unor factori de nutriie (prezint modificri la nivelul unor gene ce codific enzime implicate n biosinteza unor aminoacizi, baze azotate etc.) sau care nu pot utiliza pentru cretere anumite substane (genele afectate mpiedic desfurarea normal a unor ci metabolice de degradare); - mutantele condiionat letale: organisme care prezint anumite modificri ce determin moartea acestora n anumite condiii (restrictive sau nonpermisive) sau supravieuirea lor n alte condiii (condiii permisive). De exemplu, la Bacillus stearothermophilus, o mutant termosensibil sintetizeaz anumite proteine, inactive atunci cnd bacteria este cultivat la 55o C (temperatur nonpermisiv), n timp ce, la temperatura de 47oC (temperatur permisiv) proteinele sintetizate prezint funcii normale. Deseori, mutaiile determin moartea celulelor afectate, fiind astfel letale, sau alteori, le confer acestora anumite avantaje selective (de exemplu, rezisten la anumite antibiotice, la aciunea unor virusuri etc.). 1. Mutaiile spontane sau naturale Frecvena de apariie a mutaiilor spontane este, de regul, foarte mic ea depinznd de condiiile de mediu i de genele afectate. De exemplu, la Drosophila melanogaster, frecvena de apariie a mutaiilor la nivelul genelor plasate pe cromosomul X este de 0,1 %, n timp ce n cazul genelor plasate pe cromosomii 2 i 3, frecvena mutaiilor spontane este 0,5 %. n medie, rata mutaiilor per locus la o generaie este de ordinul 1/100,000, conform estimrilor lui Muller. Frecvena de apariie a mutaiilor se calculeaz diferit, n funcie de specie. Astfel, n cazul mamiferelor, producerea unei mutaii dominante se poate realiza la nivelul unui singur gamet dintre cei doi gamei participani la procesul de fecundaie. Dac aceast mutaie dominant apare cu o frecven de 1/1000, nseamn c, de fapt, o mutaie se produce la 2000 de gamei. Pentru a afla frecvena mutaiilor pe gamet, frecvena mutaiilor la nivel individual se nmulete cu . Un exemplu n acest sens este cel al mutaiei ce determin la om , o tumor a retinei (retinoblastomul). n 1951, analiza cazurilor aprute ntr-o populaie din SUA, a evideniat apariia a 49 2

cazuri la 1.054.984 nateri. n acest caz, rata mutaiei per gamet este (49: 1.054.984) x = 0,000023. corelarea acestor date cu altele obinute pentru diferite gene a condus la concluzia c la om, rata mutaiilor per gen este de 4 la 100.000 de gamei. 2. Mutaii induse Evidenierea faptului c unele organisme mutante pot prezenta anumite avantaje (productivitate crescut, rezisten la anumii factori de stres etc.) i pot fi utilizate n practic, a condus la examinarea posibilitii obinerii unor mutaii cu o frecven crescut, prin utilizarea unor ageni mutageni variai (fizici, chimici, biologici). Agenii mutageni fizici O categorie important de ageni mutageni este reprezentat de radiaii. Acestea sunt, n principal, de 2 tipuri: ionizante i neionizante. Radiaiile ionizante pot fi clasificate, la rndul lor n: - radiaii electromagnetice (razele X Rntgen, raze gamma) i - radiaii corpusculare (raze beta, raze alfa, protonii, neutronii) Dintre acestea, cele mai puternice sunt radiaiile electromagnetice care au o lungime de und mic i o putere de penterare foarte mare, producnd fenomene de ionizare. Efectele radiaiilor ionizante sunt dependente de doz, tipul radiaiei, tipul de organism asupra cruia acioneaz, de viteza diviziunii celulare. La nivelul macromoleculelor de ADN radiaiile ionizante determin ionizarea bazelor azotate care nu se mai pot mperechea corect conducnd la apariia mutaiilor. De asemenea, aceste radiaii pot determina, pe lng dezaminarea sau dehidroxilarea bazelor azotate i oxidarea dezoxiribozei, consecina fiind ruperea catenelor de ADN, precum i blocarea proceselor de replicare i transcriere. La anumite doze de radiaii ionizante, se produc diferite tipuri de restructurri cromosomale: rupturi cromosomale, inversii terminale sau paracentrice, translocaii, duplicaii. n mod natural, pe Pmnt, exist un fond de radiaii compus din radiaia cosmic, radiaii emise de elementele radioactive existente n scoara terestr sau a emisiuniloe provenite de la diferii radioizotopi existeni n organismele vii. n ultimele decenii ns, nivelul radiaiei naturale a crescut destul de mult ca o consecin a contaminrii radioactive a mediului, datorit experienelor nucleare, accidentelor sau a eliberrii necontrolate de deeuri radioactive. Consecina: creterea numrului de cazuri de cancer precum i de copii cu malformaii congenitale severe. Radiaiile neionizante cuprind radiaiile ultraviolete (UV). Aceste radiaii aparin spectrului solar invizibil, avnd o lungime de und cuprins ntre 100 i 400 nm, dar efectul mutagen maxim l au radiaiile UV cu lungimea de und de 258 nm, deoarece spectrul de absorbie a ADN corespunde cu aceast lungime de und. Radiaiile UV nu au proprieti ionizante, dar n contact cu materialul genetic, i transfer acestuia suficient energie care imprim nucleotidelor o stare de excitare. Prin acest mecanism, radiaiile UV pot induce, la interacia cu moleculele de ADN, tautomerizri i erori de mperechere. Cele mai sensibile nucleotide la aciunea radiaiilor UV sunt cele ce conin baze pirimidinice (timina i citozina). Efectul cel mai caracteristic al iradierii cu UV este formarea dimerilor pirimidinici, fapt ce distorsioneaz forma moleculei de ADN perturbnd replicarea. In urma acestor modificri efectul poate fi letal dac nu se desfoar procesul reparator. Pentru a contracara efectele negative ale radiaiilor UV, organismele prezint mecanisme reparatorii (fotoreactivarea, repararea prin excizie, repararea replicativ prin recombinare).

Doza de radiaii folosit i timpul de aciune variaz n funcie de specia testat, iar simplitatea echipamentului necesar i efectele obinute in vitro, fac din iradierea cu UV principala modalitate de inducere a mutaiilor la microorganisme. Agenii mutageni chimici Agenii mutageni chimici grupeaz o gam larg de substane chimice cum ar fi: analogii bazelor azotate, agenii alkilani, substantele de intercalare, colorani, antibiotice, alcaloizi etc. Efectele acestor substane asupra materialului genetic sunt i ele diverse. Analogii bazelor azotate- sunt compui asemntori bazelor azotate normale, astfel c, n cursul proceselor de replicare ei le pot nlocui producnd erori de mperechere i deci mutaii punctiforme. De exemplu, 5-bromouracilul (BU) este un analog al timinei care, n cursul procesului de replicare poate s nlocuiasc timina n perechea AT (AT ABU), iar pe de alt parte poate s se mperecheze n mod incorect cu guanina. Efecte similare 5-bromouracilului pot prezenta i alte substane, fie analogi ai celorlalte baze azotate, fie precursori ai ADN: 5-bromodeoxiuridina, 2-oxipurina, 2-aminopurina, cafeina etc. Agenii alkilani reprezint grupul de substane chimice cu efectele mutagene cele mai puternice, asemntoare din acest punct de vedere cu radiaiile ionizante. Din aceast categorie fac parte: iperita, etil metan sulfonatul (EMS), dimetil sulfatul (DMS), nitrosoguanidina (NTG) etc. Aceste substane determin introducerea n structura nucleotidelor a unor grupri alchil: la nivelul atomului din poziia 7 din structura guanidinei (cel mai adesea), n poziia 3 a adeninei, foarte rar n poziia 1 a adeninei. De asemenea, prezena gruprii alkil la nivelul guanidinei, slbete legtura - glucozidic i determin eliminarea guaninei (depurinare), cu formarea unor bree n structura ADN. Consecina, n absena reparrii genetice, poate fi deleia sau ncorporarea la ntmplare a unei alte nucleotide (tranziie sau transversie). Urmarea procesului de alchilare a bazelor purinice este eroarea procesului de mperechere a nucleotidelor (de exemplu, guanina alchilat se mperecheaz cu T n loc de C). Bazele azotate pirimidinice sunt mai rezistente la aciunea agenilor alkilani, dei EMS poate determina uneori alchilarea citozinei. Alkilarea este nsoit de fenomene de denaturare a ADN sau de formarea unor legturi ncruciate sau transversale ntre nucleotide, ceea ce mpiedic mperecherea normal. Agenii alkilani NTG sau EMS prezint o eficien crescut n modificarea materialului genetic, att al celulelor procariote ct i al celor eucariote. Substanele de intercalare sunt substane care, n soluii apoase, se pot nsera n ADN ntre bazele azotate adiacente proces denumit intercalare. Din aceast categorie fac parte coloranii acridinici de tipul acriflavinei, acridin oranjului sau proflavinei. Intercalarea acridinelor n ADN determin alungiri ale perechilor de baze, modificarea vitezei de sedimentare i a vscozitii sau chiar derulri locale ale moleculei de ADN. Atunci cnd o asemenea molecul de ADN este supus fenomenului de replicare, poate avea loc introducerea unor baze azotate suplimentare n structura ADN sau chiar deleia anumitor nucleotide. Consecina, n ambele situaii, este modificarea cadrului de citire a mesajului genetic. S a dovedit c prin utilizarea coloranilor acridinici se poate realiza eliminarea preferenial a unor molecule de ADN din celulele purttoare. De exemplu utilizarea acridin oranjului permite eliminarea plasmidelor din celulele bacteriene ce le conin, datorit fenomenului de interferen cu procesul de 4

replicare. Fenomenul a fost denumit vindecare (curing), el fiind evideniat la numeroase bacterii Gram negative. Ali ageni mutageni chimici. Procesul de mutagenez poate fi determinat i prin utilizarea altor ageni mutageni chimici: acidul nitros, hidroxilamina, colorani, colchicina etc. Acidul nitros determin dezaminarea oxidativ a citozinei i adeninei, iar prin ndeprtarea unor grupri amino i nlocuirea lor cu grupri ceto rezult uracil, respectiv hipoxantin. Ca urmare perechea GC este transformat n AT (datorita dezaminrii citozinei), iar perechea AT este nlocuit cu perechea GC, datorit dezaminrii adeninei. Hidroxilamina, este unul dintre cei mai specifici ageni mutageni ce determin mutaii punctiforme. Ea este utilizat pentru mutageneza in vitro a moleculelor de ADN purificat sau asupra virusurilor deoarece nu ptrunde n interiorul celulei. Acest mutagen reacioneaz specific cu citozina pe care o hidroxileaz. Rezultatul: o mutaie de tip tranziie unidirecional nlocuirea perechii GC cu AT. O alt categorie de ageni mutageni, acioneaz asupra fusului celular a crui activitate este inhibat. n aceast categorie intr colchicina, substana cel mai des utilizat pentru inducerea de mutaii prin blocarea diviziunii celulare. Colchicina poate inhiba formarea fibrelor fusului de diviziune sau poate bloca migrarea cromosomilor ataai la fibrele fusului n cursul mitozei sau meiozei. Ca urmare, celulele nu se mai divid dar numrul de cromosomi crete (se dubleaz), rezultnd astfel celule poliploide. Ageni biologici cu efect mutagen Din categoria agenilor biologici care determin modificri ale structurii i funciei cromosomilor cei mai cunoscui sunt virusurile i micoplasmele.

MUTAGENEZA SI TERATOGENEZA
1) Mutageneza si agentii mutageni Mutatiile pot aparea in orice celula si pot prezenta o gama larga de efecte fenotopice, de la alterari minore, care pot fi detectate numai prin metode biochimice, pana la modificari ale metabolismului, care pot provoca moartea celulelor si a organismului. Efectul mutatiilor este determinat de tipul de cellule in care apar, stadiul ciclului cellular sau stadiul de dezvoltare al organismului in care actioneaza factorul mutagen, starea de dominanta sau recesivitate a genei afectate. O mutatie recesiva este detectata in generatiile ulterioare, in timp ce o mutatie dominanta este detectata in generatia in care s-a produs. Agentul mutagen este orice agent de mediu care determina cresterea numarului de mutatii intr-o populatie.Agentii mutageni opereaza fie prin inducerea de modificari in molecula de ADN, fie prin inducerea leziunilor cromozomiale.Colchicina si radiatiile X au fost identificate ca fiind mutagene. Clasificarea mutatiilor se face dupa diferite criterii: - modul de aparitie(spontane sau induse) - cantitatea de material genetic afectat(genice, cromozomiale sau genomice) - tipul de celule in care sunt prezente(mutatii somatice sau ga - metice) - modul in care sunt exprimate - efectul lor asupra organismului. Mutatiile genice induc schimbari in ordinea nucleotidelor. Daca este afectat un singur nucleotide, mutatia este punctiforma.Dependent de pozitia nucleotidului in codon, efectul mutatiei punctiforme este diferit. In urma unei mutatii punctiforme, codonul mutant poate determina pozitia aceluiasi aminoacid(mutatie silentioasa).Codomul mutant poate determina includerea altui aminoacid putand fi schimbata structura proteinei sintetizate(mutatie missens) sau codomul mutant devine codon stop si sinteza catenei polipeptidice este oprita (mutatie non-sens). Mutatiile cromozomiale afecteaza structura si functia cromozomului, ordinea genelor fiind schimbata sub actiunea factorilor mutageni. Efectul este dependent de marimea cromozomului afectat, genele implicate etc.Mecanismul de producere a unei mutatii cromozomiale este explicat prin mai multe ipoteze si anume: - ipoteza ruptura-reunire, ipoteza regiunilor deinstabilitate etc. Comform ipotezei ruptura-reunire sub actiunea unui factor mutagen de-a lungul cromozomului se produc rupturi, majoritatea acestora se reunesc in pozitie initiala, fiind refacuta structura normala a cromozomului(fenomenul de restaurare), o parte din rupture pot ramane ca atare sau interactioneaza intre ele, conducand la modificari in structura si functia cromozomului. Principalele tipuri de mutatii cromozomiale: Deletia consta in in pierderea unui segment terminal sau intercalar de cromozom.La om au fost raportate putine cazuri cand deletiile au fost vizibile, producand insa malformatii grave.Deletia produce maladia Cri-du-chat. Duplicatia secaracterizeaza prin prezenta unui mic segment de cromozom in stare dubla.Inversia consta in inversarea ordinii genelor dintr-un segment de cromozom cu 180 . Din grupul mutatiilor intercromozomiale,fac parte translocatiile reciproce si translocatiile nereciproce ,fuziuni si fusiuni cromozomiale. Mutatiile genomice constau in multiplicarea intregului genom(poliploidia), sau in prezenta unor cromozomi in plus sau in minus(aneuploidia)La om cazuri de poliploidie au fost depistate numai la embrionii avortati. Cazuri de aneuploidie au viabile au fost depistate in cazul heterozomilor si al cromozomilor mici(la adolescenta sau maturitate ajungand numai indivizii cu sindromul Down trisomia 21). Fenotip similar sindromului Down este intalnit si in cazul trisomiei 22(populatia asiatica).Absenta cromozomului X nu este compatibila cu viata.

2)Teratogeneza si agentii teratogeni Teratogeneza reprezinta totalitatea mecanismelor care determina producerea de malformatii la embrion sau la fetus. Agent teratogen este orice factor de mediu care actioneaza asupra fatului uman, determinand anomalii congenitale. Exemple: radiatiile ionizante(radiatii X) in timpul sarcinii, carentele alimentare, unele medicamente(thalidomida),substante chimice toxice si infectiile virale materne (rubeola),testele hormonaleefectuate in timpul sarcinii,consumul mare de alcool etc. Un agent teratogen determina malformatii numai daca actioneaza in perioada in care embrionul este sensibil la efectele sale, respectiv in intervalul dintre zilele 12-56 de dezvoltare intrauterina. Astfel in primul trimestru al sarcinii, medicamentul warfarin poate cauza sindromul fetal warfarin (chondrodis-plazia punctata, hipoplazie nazala), iar in cazul actiunii in stadiile ulterioare ale sarcinii el va produce deficiente ale sistemului nervos central. Producerea malformatiilor depinde de mai multi factori: natura agentului teratogen, momentul organogenezei in care acesta actioneaza, durata expunerii la agentul teratogen si doza in care se afla acesta, particularitati genetice ale embrionului etc. 3)Fenotipul cancerului. Tipuri de cancer Cancerul este o boala genetica produsa de orice perturbare a dezvoltarii celulelor, care are drept consecinta invazia si distrugerea tesutului sanatos din jur, de catre celulele anormale.Celulele canceroase provin din celule normale care au suferit modificari ireversibile.Ele se multiplica mult mai rapid decat celulele normale si nu par a fi supuse unui control nervos sau hormonal. Prin sistemul sangvin sau limfatic, ele se pot raspandi in orice alta parte a organismului, unde vor produce ulterior leziuni ale tesutului(metastaza).Tumoarea maligna este un nume utilizat pentru cancer.Un cancer care se formeaza in epitelii este denumit carcinoma, acela intalnit in tesutul mezenchimal este denumit sarcom.Cancrul globulelor albe este numit leucemie, limfom este cancerul tesutului limfoid, iar cancerul plasmei si al maduvei oaselor mielom.Cancerul este prezentat prin mai multe boli care prezinta caracteristici celulare similare.La aparitia cancerului participa diferite substante chimice, cele existente in fumul de tigara, radiatiile ionizante, particulele de siliciu si azbest, vrusurile oncogene.Este posibil ca la aparitia cancerului sa contribuie si unii factori ereditari, precum si stresul. Cancerul este o boala genetica datorata unor mutatii produse in mai multe tipuri de gene: protooncogene, gene supresoare ale tumorii(antioncogene), gene ale repararii leziunilor din AND etc. 4)Anomalii genetice associate cancerului uman Mutatiile genomice.Fenomenul de aneuploidie este characteristic cancerului, fiind present in procent de 99%, celulele canceroase fiind caracterizate prin instabilitate genomica,iar in multe cazuri sunt poliploide. Mutatiile cromozomiale.Din grupul acestora, translocatiile contau in transferul reciproc sau nereciproc al unor segmente intre cromozomii neomologi.Acest process poate avea consecinte variate: -plasarea proto-oncogenelor langa un promotoractiv sau langa un locus atenuator(care intensifica activitatea lor); -fuziunea intre doua proto-oncogene plasate pe cromozomi diferiti sau intre o proto-oncogena si o alta gena, rezultand gene himere care vor codifica oncoproteine care determina crestere celulara necontrolata. Mutatiile punctiforme si amplificarea genetica pot activa proto-oncgenele.Acest lucru conduce la cresterea cantitatii de proteina sintetizata, consecintele fiind aparitia unor cromozomi tip minutes in stare dubla si a regiunilor colorate omogen. Implicarea situsurilor fragile in cancer conduce la aparitia mai multor forme de cancer: leucemia limfocitica acuta s.a.