http://www.creeaza.

com/familie/medicina/D
ETERMINAREA-SPECTRULUI-DE-SEN568.php

DETERMINAREA SPECTRULUI DE SENSIBILITATE LA ANTIBIOTICE A

SPECIILOR MICROBIENE. ANTIBIOGRAMA
Datorita specificitatii lor de actiune, antibioticele manifesta eficienta diferita fata de
diferite specii microbiene; totalitatea speciilor microbiene sensibile la un anumit antibiotic
defineste spectrul de activitate al antibioticului respectiv. In functie de numarul si diversitatea
speciilor microbiene afectate, spectrul de activitate al antibioticelor poate fi :
larg (de exemplu, spectrul de actiune al tetraciclinei este reprezentat de bacterii Gramnegative, inclusiv chlamidii si rickettsii si specii Gram-pozitive; penicilinele sunt active
in special fata de specii Gram-pozitive, dar si Gram-negative, inclusiv chlamidii;
nitrofuranii, rifampicina, sulfamidele sunt active pe un numar mare de specii bacteriene
Gram-pozitive si Gram-negative si pe bacteriile acido-alcoolo-rezistente);
ingust (novobiocina este activa pe bacteriile Gram-pozitive, mai ales stafilococi, dar si
pe coci si bacili Gram-negativi, cum ar fi hemofilii si pasteurelele; glicopeptidele,
bacitracina, pe bacterii Gram pozitive);
limitat (nitroimidazolii sunt activi doar pe microorganismele anaerobe).
Chiar in cadrul aceleiasi specii microbiene, pot exista diferente mari de sensibilitate a
diferitelor tulpini fata de un anumit antibiotic, astfel ca stabilirea tratamentului cu antibiotice
in clinica necesita izolarea tulpinii microbiene care reprezinta agentul etiologic al infectiei
respective (mai ales daca acesta apartine unor genuri si specii supuse fenomenului de
dobandire a rezistentei clinice) si determinarea spectrului sau de sensibilitate la antibiotice.
Evaluarea in vitro a eficientei unui antibiotic se realizeaza prin masurarea a 3
parametri, care variaza in functie de concentratia antibioticului si de timpul sau de actiune:
concentratia minima activa (= C.M.A.) - este concentratia la care
antibioticul poate induce anumite perturbari in activitatea metabolica a
microorganismelor, fara a afecta capacitatea de multiplicare si
viabilitatea microorganismelor;
concentratie minima inhibitorie (= C.M.I.) - este concentratia la care un antibiotic
inhiba multiplicarea microorganismelor (efect bacteriostatic);
concentratie minima bactericida (= C.M.B.) - este concentratia la care un antibiotic are
actiune letala asupra microorganismelor (efect bactericid).
Cunoasterea acestor parametri prezinta o importanta clinica deosebita, deoarece,
pentru unele antibiotice, concentratia bactericida este foarte greu de atins in vivo. Din acest

motiv, unele antibiotice ca tetraciclina, cloramfenicolul, rifampicina sunt considerate

antibiotice bacteriostatice.
Pe langa valoarea C.M.I. determinata in vitro, in alegerea tratamentului cu un anumit
antibiotic, trebuie sa se tina cont si de calitatile farmacologice ale antibioticului respectiv (de
exemplu, posibilitatea realizarii concentratiei active la nivelul focarului de infectie), de
eventualele efecte secundare si de starea fiziologica a bolnavului.
Tehnica de evidentiere a sensibilitatii la antibiotice a unei tulpini microbiene se
numeste antibiograma. Antibiograma trebuie practicata in mod obligatoriu in cazul
microorganismelor patogene, supuse fenomenului de dobandire a rezistentei, inaintea
inceperii oricarui tratament cu antibiotice.
Dupa determinarea spectrului de sensibilitate la antibiotice prin
tehnici calitative (in care tulpina microbiana de testat este pusa in
contact cu diferite antibiotice aflate intr-o anumita concentratie), se pot
practica teste cantitative pentru determinarea valorii C.M.I. (in care
tulpina microbiana este pusa in contact cu concentratii crescatoare ale
aceluiasi antibiotic).
1. Metode calitative de determinare a spectrului de susceptibilitate la antibiotice
Metoda difuzimetrica (Kirby-Bauer)
Este o metoda foarte simpla si rapida, care permite determinarea concomitenta a
spectrului de sensibilitate a microorganismului si a valorii C.M.I. in vederea calcularii dozelor
terapeutice de antibiotice. Metoda are mai multe variante, in practica folosindu-se curent
tehnica discurilor impregnate cu antibiotice, standardizata, recomandata de NCCLS (National
Committee for Clinical Laboratory Standardisation).
O serie de factori, ca de exemplu, tulpina microbiana studiata (densitatea inoculului,
specia, varsta culturii), mediul de cultura (compozitia mediului, pH-ul, densitatea si grosimea
stratului de mediu), tehnica folosita si criteriile de interpretare a rezultatelor obtinute, pot
influenta rezultatele unei antibiograme. Din acest motiv, tehnica trebuie efectuata in conditii
standardizate, reproductibile, conform indicatiilor forurilor internationale in domeniu.
Pe suprafata unui mediu agarizat insamantat in panza cu un inocul standardizat, obtinut
din tulpina de testat, se plaseaza la distante egale discuri impregnate cu solutii de antibiotice
de o anumita concentratie care vor difuza in mediu, realizand un gradient de concentratie
invers proportional cu diametrul zonei de difuzie, deci cu distanta fata de disc. Daca tulpina
este sensibila la un anumit antibiotic, cresterea microbiana va fi inhibata pe o anumita
suprafata in jurul discului impregnat cu antibioticul respectiv, suprafata denumita zona de
inhibitie a cresterii.
Citirea rezultatelor se realizeaza prin masurarea diametrelor zonelor de inhibitie a cresterii
determinate de diferite antibiotice, cu ajutorul unei rigle gradate. In cazuri de urgenta clinica
se poate realiza o prima citire la 6-8 h de la incubare. Interpretarea rezultatelor se face in
functie de dimensiunea zonelor de inhibitie a cresterii, exprimand rezultatul cu termenii de
tulpina sensibila (S), rezistenta(R) sau intermediar sensibila (I), conform tabelelor cu puncte
critice standardizate si corespunzatoare metodei de lucru: tabelele NCCLS pentru metoda

difuzimetrica recomandata de NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory

Standards, USA), in prezent CLSI (Clinical laboratory and Standards Institute)
Termenii S, I, R definesc de fapt si categoriile de antibiotice, in functie de efectul lor
clinic, dupa cum urmeaza:
categoria S, inseamna ca exista o mare probabilitate ca antibioticul, administrat in doze
obisnuite, sa elimine infectia determinata de tulpina testata (C.M.I. are valori net
inferioare celor ale concentratiilor umorale obtinute in urma administrarii unei doze
obisnuite);
categoria I, semnifica probabilitatea ca antibioticul sa fie eficient in vivo prin
administrare locala sau prin realizarea in mod fiziologic a concentratiilor mari in organe
sau tesuturi (rinichi, ficat, cai biliare), la nivelul carora este localizat procesul infectios;
categoria R inseamna ca, cel mai probabil, administrarea antibioticului nu va determina
eliminarea din organism a agentului infectios, a carui sensibilitate a fost testata sau
rezultatul tratamentului este imprevizibil.
La citirea si interpretarea rezultatelor se iau in considerare diametrele zonelor de
inhibitie, lipsite complet de colonii vizibile cu ochiul liber.
Aparitia coloniilor la marginea sau in interiorul zonei de inhibitie se poate datora
urmatorilor factori: cultura este mixta sau suprainfectata; cultura este pura, dar prezinta celule
heterorezistente; aparitia mutantelor rezistente; dezvoltarea tardiva a unor celule, de fapt
sensibile, si aparitia coloniilor dupa ce antibioticul s-a diluat prin difuzie in mediu.
2. Metode cantitative de determinare a valorii C.M.I.
2.1. Metoda dilutiilor in mediul lichid sau in agar
Principiul metodei: un inocul standardizat al tulpinii testate este insamantat intr-un
gradient discontinuu de concentratii ale antibioticului, fie in placi cu mediu agarizat, fie in
tuburi cu bulion nutritiv. Dupa incubarea adecvata, se citeste valoarea C.M.I. prin observarea
macroscopica a tuburilor: in primele tuburi, cu concentratii mari de antibiotic, cresterea
culturii nu este vizibila, microorganismele fiind omorate sau inhibate in prezenta
antibioticului. Concentratia de antibiotic corespunzatoare tubului cu cea mai mica
concentratie, care inhiba cresterea vizibila a culturii microbiene, reprezinta valorea C.M.I.
(mcg/ml) pentru antibioticul respectiv. In tuburile urmatoare, inclusiv tubul martor de
crestere, mediul se tulbura ca urmare a cresterii microbiene. In tubul martor de sterilitate,
obligatoriu mediul trebuie sa ramana steril (limpede), iar pe placile cu mediu agarizat,
coloniile lipsesc. Determinarea C.M.I. se utilizeza pentru stabilirea dozei terapeutice si a caii
de administrare in cazul infectiilor severe, supravegherea evolutiei rezistentei bacteriilor la
antibiotice, cuantificarea activitatii bactericide a substantelor antimicrobiene. Aceasta metoda
permite si aflarea valorii C.M.B. (concentratia minima bactericida) pentru antibioticul testat.
Pentru aceasta, se preleveaza 0.01 ml sau 0.1 ml din tuburile utilizate pentru tehnica dilutiilor
in mediu lichid (din tubul la care s-a stabilit valoarea C.M.I. si din tuburile anterioare care
prezinta concentratii superioare de antibiotic) si se insamanteaza pe suprafata unor placi cu
mediu solid nesuplimentat cu antibioticul testat. Dupa incubare, se va observa dezvoltarea

microorganismelor la dilutia corespunzatoare C.M.I. Valoarea C.M.B. este data de cea mai
mica concentratie de antibiotic care reduce numarul coloniilor pana la 99.9%.
2.2. Metoda E-test
La ora actuala, exista variante ale metodei difuzimetrice pentru determinarea valorii
C.M.I.. O astfel de varianta este E-testul(Epsilometer test), ce utilizeaza benzi impregnate cu
diferite antibiotice ale caror concentratii variaza exponential si sunt inscrise pe banda
respectiva. Zona de inhibitie a cresterii microorganismului testat are aspect de elipsa, al carei
diametru variaza direct proportional cu gradientul de concentratie a antibioticului difuzat in
mediu, diminuandu-se odata cu scaderea concentratiei astfel ca, la o anumita valoare, zona de
inhibitie a cresterii va intersecta banda, concentratia inscrisa pe banda la acest nivel indicand
valorea C.M.I.
3. Controlul de calitate in testarea sesibiltatii la antibiotice
Obiective:
- QC (quality control)are drept scop sa asigure:
- precizia si fiabilitatea tehnicii de testare a sensibilitatii
- performanta reactivilor utilizati
- performanta personalului care efectueaza testele.
Pentru a raspunde acestor deziderate, laboratoarele care realizeaza antibiograma
trebuie sa dispuna de tulpini de referinta :
- Escherichia coli

ATCC 25922

- Escherichia coli

ATCC 35219

- Staphylococcus aureus

ATCC 25923

- Staphylococcus aureus

ATCC 43300

- Staphylococcus aureus

ATCC 25923

CIP 76110

- Enterococcus faecalis

ATCC 29212

CIP 103214

- Haemophilus influenzae

ATCC 49247

- Haemophilus influenzae

ATCC 49766

- Neisseria gonorrhoae

ATTC 49226

- Neisseria gonorrhoae

ATTC 49226

- Streptococcus pneumoniae ATCC 49619

CIP 7624

CIP 7625

Proceduri de control:

Controlul de calitate trebuie sa fie realizat pentru fiecare sarja noua de mediu Mueller Hinton si / sau
antibiotic.

Tulpinile de referinta care trebuie sa fie obligatoriu testate sunt:

o - Escherichia coli

ATCC 25922

o - Staphylococcus aureus

ATCC 25923

o - Staphylococcus aureus

ATCC 25923

Aceste tulpini vor fi testate in aceleasi conditii ca si cele bacteriene a caror rezistenta se evalueaza

Antibiogramele vor fi efectuate zilnic pentru fiecare dintre aceste tulpini

Principalele surse de eroare sunt: utilizarea unui inocul bacterian de densitate necorespunzatoare,
insamantarea (striuri rare) si masurarea neadecvata a diametrelor zonelor de inhibitie.

Daca rezultatele nu sunt satisfacatoare, trebuie controlati urmatorii parametri:

1. citirea si interpretarea diametrelor zonelor de inhibitie

2. mediul de cultura
3. inoculul
4. discurile de antibiotice
5. tulpinile de referinta
Citirea si interpretarea
- citirea antibiogramei trebuie realizata cu ajutorul unei rigle precise si sa se evite la maximum
erorile, mentinandu-se instrumentul de masura perpendicular pe axa optica;
- trebuie verificat daca interpretarile (S, I, R) corespund diametrelor masurate;
- trebuie evitate erorile prin confuzia diferitelor tabele de citire.
Controlul mediului:
pH:
- trebuie sa fie 7,2 - 7,4
- variatiile de pH influenteaza activitatea aminozidelor, macrolidelor si fenicolilor
- controlul trebuie facut pentru fiecare sarja de mediu Mueller Hinton, cu ajutorul unui pHmetru: se plonjeaza electrodul intr-un flacon de MH semilichid (atentie: temperatura nu

trebuie sa fie prea ridicata pentru a evita riscul aprinderii electrodului), geloza trebuie sa se
solidifice in jurul extremitatii electrodului; in acest moment se inregistreaza pH-ul.
Umiditatea:
- placile cu mediu trebuie sa fie uscate iinainte de inoculare
Concentratia in timidina sau timina:
- o concentratie prea crescuta de timidina determina o reducere a diametrelor zonelor de
inhibitie in jurul discurilor de sulfamide si trimetoprim
- pentru aceasta trebuie testat mediul MH cu o tulpina de referinta Enterococcus
faecalis ATCC 29212; diametrul de inhibitie in jurul discului de cotrimoxazol trebuie sa
fie >/= 20 mm.
Concentratia in cationi divalenti:
- o concentratie prea crescuta in ioni bivalenti (in principal de Ca 2+ si Mg2+) determina o
reducere a diametrelor zonelor de inhibitie in jurul discurilor de aminozide (testate pentru P.
aeruginosa), in timp ce concentratii mai mici favorizeaza aparitia unor zone de inhibitie prea
mari
- ionii de Zn influenteaza activitatea carbapenemelor
- concentratiile trebuie sa fie : Ca2+ = 50 100 mg si Mg2+ = 20 - 35 mg.

Controlul inoculului:
- etalonul 0,5 Mc Farland - se poate obtine astfel:
0,5ml Mg Cl2 sol 1% (10 g/l) +
95,5 ml H2SO4 1% (10 ml/ l);
etalonul astfel preparat trebuie sa prezinte o DO de 0,08 - 0,1 la 625 nm.
- se repartizeaza aceasta solutie in volume de 10 ml, in tuburi identice cu acelea care vor servi
la prepararea inoculului
- tuburile se inchid ermetic pentru a evita evaporarea (parafilm, adeziv etc.)
- se marcheaza nivelul lichidului cu un marker si se controleaza periodic masurandu-i DO
- se conserva tuburile la temperatura ambianta, ferit de lumina (hartie de aluminiu)
- tubul etalon se agita inainte de a-l compara cu inoculul preparat: inoculul si etalonul trebuie
sa aiba aceeasi turbiditate atunci cand sunt comparate pe un fond cu dungi.

Discurile de antibiotice (tabelul 10, 11):

-

inainte de utilizare, cartusul de antibiotic trebuie verificat pentru data valabilitatii, mai
ales pentru -lactamine, si pentru incarcatura discului;

stocul de cartuse de antibiotice trebuie sa fie pastrat la -20 oC; aplicatorul incarcat cu
antibiotice trebuie pastrat la + 4 oC;

discurile umede sau in contact direct cu gheata, sau care au fost conservate la
temperatura ambianta nu trebuie utilizate;

cartusele trebuie scoase din frigider sau congelator cu 1-2 h inainte de utilizare.

Tulpinile de referinta:
- de la primirea lor, tulpinile de referinta vor fi izolate pe un mediu adecvat; plecand de la
aceasta cultura se fac 12 subculturi care se repartizeaza in 12 tuburi si se conserva prin
congelare la - 70 C.
Tulpina de referinta

Mod de conservare

Observatii

E. coli ATCC 25922,

- liofilizare

- conservare pe termen lung

S. aureus ATCC 25923,

- congelare la - 70 oC

- conservare pe termen lung

P. aeruginosa ATCC 27853

- geloza profunda

- trecere regulata a tulpinii

S. pneumoniae ATCC 49619

- liofilizare

Alternativ se poate insamanta o

GSC* inclinata, incubata 24 h, apoi
conservata la 20 oC. Aceasta tehnica
permite conservarea pana la 6 luni.

- congelare la -70 oC

GSC = geloza sange Columbia

In fiecare luna se va scoate un tub congelat cu tulpina / tulpinile care vor fi testate; se
refac 12 tuburi cu culturi pentru congelare, pentru anul viitor, pornind de la al 12-lea tub
consevat.
Tabelul 10: Antibiotice de testat pentru cocii Gram-pozitivi

aphylococcus

Streptococcus spp

ureus

(altii decat S. pneumoniae)

sta standard

Lista standard

nicilina*

penicilina G

itromicina

ampicilina sau amoxicilina

ncomicina

oxacilina

istinamicina

anamicina

tetraciclina
eritromicina

bramicina

lincomicina sau clindamicina

ntamicina

pristinamicna

oramfenicol

clindamicina

raciclina

Antibiotice optionale

trimoxazol

rifampicina

id fusidic

cefotaxim

ampicina

cefepim

se testeaza pe geloza
ueller Hinton cu 4%
aCl si6 g/ml
acilina

streptomicina
kanamicina
gentamicina
cloramfenicol
spiramicina
telitromicina
linezolid
cotrimoxazol*
ofloxacin
vancomicina
teicoplamina

Streptococcus pneumoniae
Lista standard
penicilina G
ampicilina sau amoxicilina
oxacilina
cefotaxim sau ceftriaxon
tetraciclina
eritromicina
lincomicina sau clindamicina
pristinamicina
Antibiotice optionale
imipenem)
streptomicina
kanamicina
gentamicina
cloramfenicol
telitromicina
linezolid
cotrimoxazol*
fluorochinolone

Enterococcus spp
Lista standard
- ampicilina
- gentamicina
- nitrofurani
Antibiotice optionale
- oxacilina*
- streptomicina
- kaanamicina
- cloramfenicol
- tetraciclina
- eritromicina
- lincomicina* sau
clindamicina*
- pristinamicina (E.
faecium)
- linezolid
- cotrimoxazol
- rifampicina
- fluorochinolone

fosfomicina

- vancomicina
(Hteicoplamina

vancomicina

* - ajuta la identificarea

teicoplamina

E. faecalis (rezistenta
naturala)

* - se testeaza pe geloza Mueller

Hinton cu 5% sange de cal
hemolizat

Fenotipuri de rezistenta la antibiotice la cocii Gram-pozitivi

Streptococi:

Pneumococi:

Rezistenta naturala:

Rezistenta naturala:

- nivel scazut la aminozide; polimixine, acid fusidic, acid nalidixic; sensibilitate -de nivel scazut la aminozide, acid
moderata la fluoroquinolone; sensibilitate scazuta la acid fusidic.
fusidic, polimixina, acid nalidixic,

NB: Activitatea SXT inhibitata de prezenta timidinei in mediu (geloza Mueller Hinton
cu adaos de 5% sange de cal).

- putin sensibil la pefloxacina si

norfloxacina (sensibil la
sparfloxacina), bacitracina

Rezistenta dobandita la stafilococi:

rezistenta la penicilina G; fenotip MLSb inductibil la eritromicina; fenotip KT.

Rezistenta dobandita la streptococi :

la toate clasele de antibiotice cu exceptia glicopeptidelor. Rezistenta la penicilina decelata cu ajutorului discului de
Oxacilina (5/ 1 g), incrucisata cu toate beta-lactaminele, dar de niveluri diferite (se calculeaza C.M.I.).

Escherichia
coli

Tabelul 11: Antibiotice de testat pentru Enterobacteriaceae si bacili Gram negativi

nonfermentativi
Salmonella

Klebsiella

Amoxicilina/

Amoxicilina/

Ampicilina

Ampicilina

P.
aeruginosa
Acinetob
acterspp.

Vibrio

Haemophilus
influenzae**

Ampicilina C
otrimoxazol

Ampicilina/

Acid nalidixic

Amoxicilina

Tetraciclina

Cefalotin Gentamicina C
loramfenicol

Ticarcilina
Gentamicina/
Tobramicina

Geentamicina/
Tobramicina

Piperacilin
a
Ceftazidim

ftazidim/

Ceftazidim/
Imipenem

Cefotaxim/

Cefotaxim/
Amikacina

Ceftriaxon

Ceftriaxon
Gentamicin

Pristinamicina
Eritromicina Tetraciclina
Pefloxacina Sulfametox
azol Rifampicina.

Ofloxacin/

Ofloxacin/

Ciprofloxacin

Ciprofloxacin

Tobramicin
a

Cotrimoxazol

Cotrimoxaszol

Ofoxacin

Acid nalidixic
*

inocul McFarland 0,5.in bulion Mueller Hinton sau in solutie salina ( 0,9% Na Cl) pornind
de la o cultura de 18 - 24 h pe mediu solid neselectiv
Rezistenta constitutiva: la aminopeniciline, carboxipeniciline, ureidopeniciline- -lactamaza
sensibila la inhibitori, frecvent asociata cu multirezistenta; la aminopeniciline, cefalosporine
generatia I nonenzimatica, sensibilitatea nu este restabilita in prezenta inhibitorilor de betalactamaze.
**

Asadar, antibiograma difuzimetrica poate permite determinarea pattern-urilor de

rezistenta constitutiva, intrinseca, nativa, precum si detectarea fenotipica a unor
mecanisme de rezistenta dobandita.
Plasarea antibioticelor pe placa intr-o anumita ordine permite citirea interpretativa a
testelor de sensibilitate la antibiotice (concept introdus de Patrick Courvalin in 1992) si
detectarea fenotipica a unor mecanisme de rezistenta la antibiotice.

4. Aplicatii practice ale citirii interpretative in evidentierea fenotipica a

diferitelor mecanisme de rezistenta la principalele specii microbiene de
interes clinic
Rezistenta S. aureus la -lactamice
S-au evidentiat mai multe mecanisme de rezistenta la -lactamice (tabelul 12, 13).
Tabelul 12: Mecanismele de rezistenta la agenti antimicrobieni la S. aureus (dupa
Lowy, 2003).
Produsele genelor

Mecanismele de rezistenta

blaZ

-lactamaza

1) Hidroliza enzimatica a nucleului -lactamic

(fig. 24)

mecA

PBA2a

Genele

rezistente

Antibiotice
-lactame

2) Reduce afinitatea pentru PBP

Glicopeptide

VISA

1)
alterat

Peptidoglican 1) Legarea vancomicinei in peretele celular

2) D-Ala-D-Lac
Quinolone

1) parC
2) gyrA sau gyrB

Trimethoprimsulfamethoxazol

1) Sulfonamide:

2) Sinteza dipeptidelor cu reducerea afinitatii

pentru vancomicina

1) Componentul par C 1, 2) Mutatii care au loc in regiunea QRDR

al topoizomerazei IV reduc afinitatea complexului ADN-enzima
pentru quinolone
2) Componentele Gyr
A sau GyrB ale
girazei
1)
Dhidropteroat 1) Supraproductia de acid amino-benzoic de
sintaza
catre enzime

sal A
2)TMP:dfrB
Quinopristindalfopristin

1)Q:ermA

2)
Dhidrofolat 2) Reducerea afinitatii pentru DHFR
reductaza
1)
ribosomale

Metilaze 1) Reduce legarea la subunitatea ribosomala

23S

ermB
(Q-D)

2) Acetiltransferaze

2) Modificarea enzimatica a dalfopristinului

ermC
2)D:vat, vatB
Tabelul 13: Mecanismele de rezistenta la -lactamice la S. aureus (dupa Lowy,
2003).
Mecanism

Penicilina G
Penicilina A

Antibiotic
+ Penicilina M
inhibitor de lactamaze

Cefalosporine
Carbapeneme

Carboxipenicilina
Ureidopenicilina
Salbatic

Penicilinaza

Modificarea PLP,

BORSA

S/R

MODSA

gena mecA

BORSA = S. aureus borderline; MODSA = S. aureus modificat.

Rezistenta la meticilina (respectiv oxacilina) este considerata un
marker al polirezistentei incluzand: cefalosporinele, eritromicina si
clindamicina, iar izbucnirile intraspitalicesti cu acest tip de tulpini au creat
probleme deosebite terapeutice, antiepidemice si de cost al spitalizarii
(Codita, 1993).
Detectarea producerii de -lactamaza este obligatorie pentru toate tulpinile de
stafilococ care prezinta un diametru la penicilina mai mare de 28 mm sau tulpinile de N.
gonorhoeae sau Hemophilus spp.
- exista mai multe tehnici: acidimetrice, cromogenice si iodometrice

- testele pentru detectarea -lactamazei trebuie sa fie rapide (implicatii terapeutice) si sa

preceada realizarea antibiogramei.

Fig. 24. Inducerea sintezei -lactamazei stafilococice in prezenta penicilinei.

BlaI se leaga de regiunea operator, astfel incat se represeaza transcrierea ARN atat
pentru blaZ, cat si pentru blaR1-blaI; II Legarea penicilinei la BlaR1 stimuleaza activarea
autocatalitica a BlaR1; III-IV BlaR1 cliveaza BlaI in fragmente inactive permitand
transcriereablaZ si blaR1-BlaI; V-VIII -lactamaza, enzima extracelulara codificata de blaZ
(V) hidrolizeaza ciclul -lactamic al penicilinei (VI), in consecinta produce inactivarea (VII);
Schema operonului care codifica rezistenta la meticilina a S. aureus. Expunerea MecR1 la un
antibiotic -lactamic induce sinteza MecR1; MecR1 inactiveaza MecI, permitand sinteza lui
PBP2a (dupa Kernodle, 2000).
Testul treflei:
Se insamanteaza o tulpina de S.aureus ATCC 25923 pe o geloza Muller-Hinton (sau
M-H cu sange Chocolat pentruN.gonorroeae si Haemophilus); Se aplica un disc de
peniciclina G in centrul placii (sau de ampicilina in cazul Haemophilus); Se insamanteaza in
striuri radiale (din centrul placii spre periferie) tulpina de testat, o tulpina S. aureus ATCC
25923 (sensibila la penicilina G), o tulpina de S. aureus ATCC 43300 (rezistenta la penicilina
G) (fig. 25). Se incubeaza placa 18 h la 35C in atmosfera normala (sau 24 h in atmosfera
imbogatita cu CO2 pentru Haemophilus si N. gonorrhoeae).

Fig. 25. Reprezentarea testului de detectare a producerii de -lactamaza prin metoda treflei
(dupa Codita si colab., 2005)
Se suspecteaza existenta - lactamazei daca se observa o diferenta intre diametrul de
inhibitie realizat in cele 2 cazuri, in favoarea AMC, cele 2 diametre fiind in categoria
sensibila a valorilor critice admise pentru tulpina testata.
Rezistenta la meticilina in cazul stafilococului auriu este de multe ori asociata cu
mecanisme de rezistenta care determina inactivarea altor familii de antibiotice. S.
aureus rezistent la meticilina prin modificarea PLP este adesea rezistent la aminozide
(amikacina si tobramicina si in peste peste 90% din cazuri la gentamicina), la
fluoroquinolone, macrolide, lincosamide si ketolide, la fosfomicina si uneori la rifampicina.
Ca regula generala, raman active pe stafilococ glicopeptidele, acidul fusidic, streptograminele,
rifampicina si oxazolidinonele.
Rezistenta enterococilor la -lactamice
La enterococi, rezistenta la -lactamine se realizeaza prin producerea -lactamazei si
prin modificarea tintei (ce confera rezistenta naturala la cefalosporine, oxaciline si
monobactami si sensibilitate diminuata la peniciline).
Streptococcus pneumoniae prezinta rezistenta dobandita la penicilina prin producerea
de -lactamaze, evidentiata fenotipic prin testarea sensibilitatii la oxacilina, utilizand discuri
de oxacilina (Ox , 5g). Rezistenta la penicilina este incrucisata pentru toate -lactaminele,
dar prezinta diferite niveluri de expresie in functie de antibiotic. Activitatea amoxicilinei si
cefalosporinelor din generatia a treia a este mai putin modificata decat cea a penicilinei G.
In ceea ce priveste cefalosporinele din prima si a doua generatie si cele orale,
indiferent de generatie, cu exceptia cefpodoximului, ele sunt mai putin active decat penicilina
G.
-lactamine active

Penicilina G

-lactamine mai putin active

Imipenem

Ampicilina

Piperacilina

Amoxicilina

Cefpodoxin

Cefuroxim

Cefotaxim

Cefoperazon

Ceftriaxon

Oxacilina
Cefixim
Cefaclor
Cefotetan

Rezistenta la -lactamine este asociata in proportie de peste 50% cu rezistenta la alte

antibiotice ca: tetraciclinele, macrolidele, cloramfenicolul sau trimetoprim-sulfametoxazolul
(fig. 26). Unele esecuri terapeutice ar putea fi date de fenomenul de toleranta la penicilina,
datorat modificarilor controlului activitatii autolitice, ducand in vivo la selectarea mutantelor
peni-R (raportul CMB/CMI > 32).
Toate tulpinile cu diametrul de inhibitie <26 mm trebuie testate CMI pentru penicilina,
amoxicilina, cefotaxim si toate antibioticele utilizate in tratament.

AMX
amoxicilina

CXM cefuroxim

CTX
cefotaxim

MNO
na

minocicli

SXT
CPD cefpodoxi
m

CEC cefaclor

trimetroprimsulfametoxazol

RA

OXA
oxacilina

DTM

CFM cefixime
rifampicina

C
cloranfenicol

KAN kanamici
na forte

CRO cefpir
oma

PT pristinamicina

AMX

PIP

CTX

OXA

GM

KAN

GEN

SXT

RA

VA

TEC

FOS

Fig. 26. Tulpini de Streptococcus pneumoniae multi-rezistente la antibiotice (original)

Tulpinile de Streptococcus pneumoniae sunt foarte sensibile la optochin, testul la optochin constituind
unul dintre testele simple de identificare sau de confirmare a speciei si de diferentiere fata de ceilalti streptococi
hemolitici (testul Lund 1959). La concentratii de 1 / 500.000 1 / 1.000.000, optochinul are actiune bactericida pentru
pneumococi, in timp ce pentru ceilalti streptococi este nevoie de doze mult mai mari de 1 / 5.000. Se insamanteaza
tulpina de testat pe o placa cu geloza sange continand optochin 0.05% in paralel cu insaamantarea pe o placa de
control fara optochin. In jurul pulberii de optochin apare o zona de inhibitie a cresterii, cu un diametru de peste 20
mm (Fig. 27).

Fig. 27. Pneumococ -hemolitic sensibil la Optochin (original).

Rezistenta la -lactamine la alte specii de streptococi
Se pare ca doar un numar redus de specii ( streptococi orali; S. oralis, S. sanguis, S.
mitis) prezinta sensibilitate diminuata la penicilina G (dupa CLSI).

Evidentierea fenotipica a rezistentei la -lactamice a enterobacteriilor

Dupa sensibilitatea lor naturala la antibioticele -lactamice, Enterobacteriile sunt
clasificate in 4 grupe. Clasificarea are la baza comportamentul fata de urmatoarele antibiotice
-lactamice: aminopeniciline, aminopeniciline + inhibitori ai -lactamazelor (IBL),
carboxipeniciline, ureidopeniciline, cefalosporine din prima generatie (CIG), cefalosporine
din a II a generatie (CIIG), cefalosporine din a III a generatie (CIIIG), cefalosporine din a IV
a generatie CIVG (cu spectru larg), CIIIG + IBL, carbapeneme, cefamicine.
Grupa I
In aceasta grupa sunt clasate tulpinile de Escherichia coli, Proteus mirabilis,
Salmonella ssp. si Shigella spp. (tabelul 14 ). Aceasta grupa prezinta 4 fenotipuri mai
frecvente:
Fenotipul 1: tulpini sensibile la toate -lactamicele (au fost evaluate la aproximativ
60% din frecventa acestei tulpini);
Fenotipul 2: tulpini producatoare de cefalosporinaze cromosomale de nivel scazut
(aproximativ 5% din tulpini).
Fenotipul 3: tulpini producatoare de penicilinaze. Aceasta enzima este in general
transferabila si poate fi exprimata la nivele mai mult sau mai putin importante (au o frecventa
de aproximativ 30% din tulpini).
Fenotipul 4: tulpini producatoare de penicilinaze rezistente la inhibitori.

Grupa II
Aceasta grupa este reprezentata de tulpinile de Klebsiella spp., Citrobacter koseri, C.
amalonaticus, E. Hermannii (tabelul 15).
Fenotipul 1: tulpini rezistente la concentratii scazute de amoxicilina si de ticarcilina.
Fenotipul 2: tulpini producatoare de penicilinaze plasmidiale. Nivelul de producere al
acestor penicilinaze este variabil, dar in general scazut.
Fenotipul 3: tulpini producatoare de BLSE -lactamaze de spectru larg. Aceste tulpini
sunt rezistente la o concentratie relativ scazuta de cefalosporine de a III a generatie. Pot fi
evaluate frecvent la aceste tulpini la aproximativ 15% din toate speciile deKlebsiella.
Grupa III
Este reprezentata de tulpini de Enterobacter spp., Serratia spp., Proteus indol (+)
si Morganella, Providencia spp., Citrobacter freundii (tabelul 16).
Fenotipul 1: tulpini cu rezistenta naturala la amoxicilina si la cefalotin, ca urmare a
exprimarii de cefalosporinaze cromosomale;
Fenotipul 2: tulpini rezistente la amoxicilina, cefalotina si la ticarcilina, prin
producerea unei penicilinaze plasmidiale;
Fenotipul 3: tulpini rezistente la cefalosporinele de generatia a III a;
Fenotipul 4: tulpini de Proteus vulgaris producatoare de cefalosporinaze sensibile la
acid clavulanic (cefuroximaze).
Grupa IV
Grupeaza tulpini de Yersinia rezistente la amoxicilina, ticarcilina, cefalotin si
cefoxitin, dar sensibile la pipercilina (tabelul 17).
Tabelele urmatoare exprima diferitele fenotipuri de rezistenta (ca si
fenotipurile salbatice) stabilind manifestarea fenotipica a productiei de lactamaze in fiecare grup. Cateva fenotipuri particulare pot fi datorate
altor mecanisme. Producerea unei enzime de catre o bacterie nu raspunde
la legea tot sau nimic ci exista niveluri intermediare de exprimare ce
pot fi detectate fenotipic prin citire interpretativa foarte utile in
intelegerea dinamicii fenomenului de antibiorezistenta.
Tabelul 14: Fenotipuri de rezistenta la antibioticele beta-lactamice la enterobacteriile
din grupa I . E.coli, P.mirabilis, Salmonella spp., Shigella spp.
Antibiotic

Fenotip salbatic

Penicilinaza nivel scazut

Penicilinaza nivel ridicat

Aminopeniciline

Aminopeniciline + IBL

I/R

Carboxipeniciline

Ureidopeniciline

I/R

I/R

CIG

I/R

CIIG

S/R

CIIIG

CIIIG + IBL

Cefamicine

CIVG (1)

Carbapeneme

R = rezistent, S = sensibil, I = intermediar, (1) cefalosporine cu spectru larg : cefepim

si cefpirom
Antibiotic

Cefalosporinaza1

TRI 2

BLSE3

CHN4

Aminopeniciline

Aminopeniciline + IBL

Carboxipeniciline

Ureidopeniciline

CIG

CIIG

CIIIG

CIIIG

Cefamicine

S/R

CIVG

Carbapeneme

1-E.coli si Shigella, 2-TEM rezistent la inhibitori, 3--lactamaza cu spectru extins, 4cefalosporinaza de nivel ridicat
Tabelul 15: Fenotipuri de rezistenta la antibioticele beta-lactamice la enterobacteriile din
grupa a II a : Klebsiella spp.,Citrobacter koseri, C.amalonaticus, E.hermannii
Antibiotic

Fenotip

Aminopeniciline

salbatic (1)

Penicilinaza
nivel ridicat

BLSE

CHN

Aminopeniciline +IBL

Carboxipeniciline

Ureidopeniciline

CIG

CIIG

I/R

CIIIG

CIIIG + IBL

Cefamicine

CIVG

Carbapeneme

(1) penicilinaza de nivel scazut

Tabelul 16: Fenotipuri de rezistenta la antibioticele beta-lactamice la enterobacteriile
din grupa a III a : Enterobacter spp., Serratia spp., Providencia spp., Citrobacter freundii,
Proteus vulgaris, P. penneri, Morganella. spp.
Antibiotic

Fenotip

Aminopeniciline

salbatic (1)

Penicilinaza de
nivel ridicat

BLSE

CHN

Aminopeniciline + IBL

R (2)

Carboxipeniciline

Ureidopeniciline

CIG

CIIG

S/R

CIIIC

CIIIG + IBL

Cefamicine

S/R

S/R

S/R

CIVG

S/I

Carbapeneme

(1) cefalosporinaza inductibila, (2) cefalosporinaza inductibila numai pentru P.

vulgaris si P. penneri
Sinergismul dintre augmentin si cefotaxim si/sau aztreonam si/sau cefepim si/sau
cefpirom, permite detectia anumitor BLSE. Cefepimul sau cefpiromul sunt utile in
detectia unei BLSE in prezenta unei CHN.
Tabelul 17: Fenotipuri de rezistenta la antibioticele -lactamice a enterobacteriilor
din grupa a IV a: Yersinia enterocolitica
Fenotip salbatic
Antibiotic

BLSE

Aminopenicilina

Aminopeniciline + IBL

Carbeniciline

Ureidopeniciline

I/R

CIG

CIIG

CIIIG

CIIIG + IBL

Cefamicine

CIVG

Carbapeneme

Unele
tulpini
de K.oxytoca, P.vulgaris, P.
penneri si Citrobacter
hiperproducatoare de <aztreonamaza>, o penicilinaza cromosomala (tabelul 16).

koseri sunt

Tabelul 18: Fenotipuri de rezistenta la -lactamice a tulpinilor producatoare de

aztreonamaza:
Antibiotic

Fenotip

Aminopeniciline

Aminopeniciline + IBL

Carboxipeniciline

Ureidopeniciline

CIG

CIIG

Ceftriaxon

Cefotaxim

S/R

Ceftazidim

AZTREONAM

Cefamicina

Carbapeneme

Rezistenta la carbapeneme apare prin urmatoarele mecanisme:

-

impermeabilitate ( P. mirabilis, E.aerogenes)

impermeabilitate si producere de cefalosporinaza de nivel ridicat ( E. cloacae,

E. aerogenes, P. rettgeri)

carbapenemaze : de tip penicilinaza, inactiva asupra CIIIG (E. cloacae); de tip

metalo-enzima, care hidrolizeaza CIIIG si carbapenemele.

Rezistenta P. aeruginosa la -lactamice

La P. aeruginosa, rezistenta naturala este indusa prin mecanisme
impermeabilitate, eflux, producerea enzimelor inactivatoare si modificarea tintelor.

de

Fenotipul salbatic este legat de producerea unei cefalosporinaze inductibile in prezenta

aminopenicilinelor si cefalosporinelor din prima si a doua generatie, cuplata cu o
impermeabilitate mai mult sau mai putin marcata si de un sistem de eflux constitutiv, care
determina aparitia unui fenotip rezistent la aminopeniciline, ca atare sau asociate cu inhibitori
ai -lactamazelor si la cefalosporine de prima si a II a generatie, cu conservarea sensibilitatii
la carboxipeniciline, ureidopeniciline, la anumite cefalosporine de generatia a III a, la
monobactami si carbapeneme.
Rezistenta dobandita apare in urma manifestarii mecanismelor enzimatice
(penicilinaze, cefalosporinaze, BLSE, metalo-enzime) sau neenzimatice (impermeabilitate,
eflux si modificarea tintelor) (tabelul 19 ).
Rezistenta dobandita enzimatica este mediata de:
a) penicilinaze plasmidiale transferabile cum ar fi: PSE, TEM, OXA (nivel scazut
sau ridicat) care se materializeaza prin rezistenta la carboxipeniciline, ureidopeniciline,
cefoperazona si sensibilitate la: ceftazidim, cefepim, imipenem si inhibitori de -lactamaze.
b) BLSE:

- tip penicilinaza (TEM, SHV, PER, VEB) care dau sensibilitate la imipenem,
carboxipeniciline+ IBL si ureidopeniciline+ IBL
- tip oxacilinaza (OXA-2, OXA-10) : sensibilitate la imipenem
c) cefalosporinaze cromosomale derepresate:
- hiperproduse care confera rezistenta la toate -lactamicele,cu exceptia cefepimului si
imipenemului
- hiperproduse cu nivel inalt care confera sensibilitate doar la imipenem
d) carbapenemaze care dau sensibilitate doar la aztreonam
Rezistenta dobandita neenzimatica este indusa prin:
a) trei sisteme de eflux: MexA, MexB si OprM, constitutiv, confera rezistenta
naturala la carboxipeniciline si aztreonam; MexC, MexD si OprJ, confera rezistenta la
cefepim si cefpirom; MexE, MexF si OprN, cuplata adesea cu D2, confera rezistenta la
imipenem.
b) deficit de porine - se refera la pierderea porinelor - care dau rezistenta variabila la
carbapeneme (uneori asociata cu o cefalosporinaza derepresata)
c) modificarea LPS-ului duce la permeabilitate diminuata pentru toate -lactamicele,
cu exceptia imipenemului.
d) modificarea PLP-urilor 2 si 4 caredau rezistenta la imipenem si 3 care genereaza
rezistenta la toate -lactamicele, cu exceptia imipenemului
Tabelul 19: Evidentierea fenotipurilor de rezistenta la betalactamice pe baza citirii
interpretative la Pseudomonas aeruginosa
Antibiotic

Fenotip salbatic

Penicillinaza(1)

CHN(2)

Aminopeniciline

Aminopeniciline +IBL

Carboxipeniciline

Ureidopeniciline

Cefalosporine 1a generatie

Cefalosporine 2a generatie

Cefoperazona

Ceftazidim

Cefsulodin

Cefalosporine de spectru larg

Aztreonam

Carbapeneme

Cefalosporine 3a generatie

(4)

Cefepim S/R

(1) Ticarcilina +acid clavulanic: S ; Piperacilina+tazobactam : S

(2) Cefalosporinaza de inalt nivel
(3) IBL : inhibitor de beta-lactamaza
(4) in functie de nivelul de producere
Tabelul 20: Fenotipuri de rezistenta la -lactamice la Stenotrophomonas maltophilia
Fenotip
Hiper- sensibil

Sensibil

Imipenem-S

Altele

CAZ-S/CAZ-R
Amoxicilina

Amoxicilina-AC

Ticarcilina

Ticarcilina-AC

Ceftazidim

Aztreonam

Imipenem

Frecventa (%)

5-10

20-30 ; 40-50

<1

5-20

Activitatea si expresia -lactamazelor

L1 (rezistenta la AC)

L2(sensibilitate la AC)

+/-

++

S = sensibil; R = rezistent; I = intermediar; V = variabil; AC= acid clavulanic; CAZ =

ceftazidim
Rezistenta la -lactamine la Acinetobacter spp.
Rezistenta naturala se manifesta aproape fara exceptie la aminopeniciline,
cefalosporine de prima generatie si de generatia a II a.
Rezistenta dobandita (tabelul 21) este indusa prin mai multe mecanisme :

producerea de -lactamaze de tipul penicilinazelor plasmidiale TEM (1 si 2),

CARB5

oxacilinaze: OXA21

cefalosporinaze cromosomiale ACE 1 ACE 4 care hidrolizeaza toate

cefalosporinele

combinarea mecanismelor de tipul: impermeabilitate, modificarea PLP-urilor,

producerea de enzime (induc rezistenta la imipenem)

Tabelul 21: Fenotipuri de rezistenta la -lactamice la Acinetobacter spp

Fenotip

II

III

IV

Mecanism

Penicilinaza

Cefalosporinaza

Penicilinaza+

Acumulare de
mecanisme

cefalosporinaza
Carboxi si

Cefalosporine din
gen. a III a

Aztreonam

Carbapeneme

Frecventa

5%

4%

35%

ureidopeniciline

Rezistenta la -lactamine la Haemophilus influenzae

Se datoreaza mai multor mecanisme, cel mai frecvent fiind producerea de -lactamaze,
care a aparut la 30% dintre tulpinile izolate din infectii bronho-pulmonare la adulti. Aceste lactamaze sunt plasmidiale de tip TEM, mai rar ROB care inactiveaza aminopenicilinele,
carboxi- si ureidopenicilinele. In general raman active asociatia amoxicilina-acid clavulanic si
cefalosporinele din generatia a III-a. Producerea -lactamazelor este usor de evidentiat prin
teste cromogenice (nitrocefin).
Un alt mecanism de rezistenta destul de frecvent este modificarea tintei. De obicei
sunt tulpini necapsulate, rezistenta datorandu-se alterarii uneia sau mai multor PLP-uri si
confera rezistenta de nivel scazut la toate antibioticele din aceasta clasa.
Rezistenta la imipenem
Se pare ca s-ar datora diminuarii permeabilitatii membranei externe printr-un
mecanism inca neelucidat. Exista in acest sens printre tulpinile sensibile la ampicilina un
numar de tulpini rezistente la imipenem.
5. Metode fenotipice calitative si cantitative de evidentiere a beta-lactamazelor
Identificarea definitiva a acesor enzime este posibila numai prin tehnici de secventiere
a proteinelor si genelor, tehnici care sunt totusi mult prea costisitoare pentru a fi utilizate in

clinica si diagnostic. Totusi, metode mai simple de evidentiere si caracterizare a

lactamazelor sunt disponibile pentru laboratoarele clinice.

A.1.Teste fenotipice bazate pe antibiograma difuzimetrica

Antibiograma difuzimetrica calitativa clasica (metoda Kirby
Bauer)

BLSE pot fi sintetizate in cea mai mare parte de catre

enterobacterii si sunt reproduse cel mai adesea in antibiograma prin
imaginea uni sinergism (dop de sampanie) intre un disc de cefalosporina
de generatia a III-a si /sau monobactam si un disc de amoxicilina + acid
clavulanic.
Dar aceasta imagine poate fi discreta sau atipica. Secretia de BLSE
va fi suspectata mai intai, de micsorarea tuturor diametrelor de inhibitie la
toate cefalosporinele de generatia a 3-a : CTX 27 mm, CAZ 22mm,
CRO 25mm, ATM 27mm (tabelul 22). O tulpina de referinta trebuie
testata in aceleasi conditii in scopul verificarii validitatii discurilor de
antibiotice. Prezenta unei BLSE indica faptul ca tulpina este rezistenta la
toate lactaminele cu exceptia imipenemului si cefamicinei (Fig. 28).
Antibiotic

ESBL tip TEM

ESBL tip SHV

Amoxicilina / Ampicilina

Amoxicilina + acid clavulanic

Piperacilina

Cefoxitina

Cefuroxima

Cefotaxima

S/I/R

Ceftazidima

Aztreonam

Cefepima

S/I/R

Imipenem

Tabelul nr 22: Diferentierea ESBL tip TEM de ESBL tip SHV prin
metoda difuzimetrica

Fig. 2 Aspectul antibiogramei la tulpini de E. coli producatoare de -lactamaze de spectru

larg:
stg. aspecte de sinergism (original).

Antibiograma difuzimetrica cantitativa prin metoda E-test.

Principiu: Aceasta metoda se bazazeaza pe proprietatea ESBL de a fi sensibile la inhibitori de
-lactamaze (acidul clavulanic). Exista si exceptii de la aceasta regula enzimele de tip IRT
(Inhibitor Rezistant TEM lactamase).
Benzile E-test contin un gradient de Cefotaxim la un capat si un gradient de Cefotaxim
si acid clavulanic la celalat capat. Concentratia de Cefotaxim este mai mica in cazul in care
acesta este asociat cu acidul clavulanic conform tabelului 23:
Tabelul 23: Concentratiile de antibiotic pe strip-urile E-test
Cefotaxim (mg/L)

Cefotaxim (mg/L) + ac. Clavulanic

0,50

0,125

0,75

0,19

0,25

1,5

0,38

0,5

0,75

1,5

12

16

24

32

Benzile similare continand gradiente de ceftazidim / ceftazidim + clavulanat (TZ /

TZL) sunt deasemenea disponibile si sunt mai potrivite pentru detectarea tipului enzimatic
CTX-M.
Daca raportul dintre concentratia minima inhibitorie (CMI) de Cefotaxim si CMI de
Cefotaxim + clavulanat este mai mare de 8 rezulta ca tulpina respectiva este producatoare de
ESBL-uri.
Alternativ, se pot inregistra urmatoarele aspecte ale placii in urma incubarii:

 Crestere bacteriana de-a lungul intregii benzi (lipsa elipsei de inhibitie)

indica faptul ca valoarea respectiva de CMI este mai mare decat cea mai mare valoare
din scala (Fig. 29).

O elipsa de inhibitie dedesubtul gradientului arata o valoare a CMI mai mica decat

cea mai mica valoare din scala.

Aparitia unei zone fantoma plasata sub gradientul CT, desi o zona de
inhibitie clara in jurul capatului CT nu s-a evidentiat, indica producerea de ESBL
(Fig. 30).

Aparitia unei elipse de inhibitie deformate inspre capatul tiparit indica producerea
de ESBL, datorita sinergismului dintre cefotaxim (CT) si acidul clavulanic difuzat dinspre
regiunea CTL (Fig 31).

Fig. 32. Aspectul E-Test la o tulpina de E.coli J53 (SHV-2) producatoare de ESBL
(dupa L. Stratchounski, I si colab., 2003)
CMIAMC 12 mg/L
CMIPTZ 1,5 mg/L
CMICPS1 mg/L

Fig. 33. Aspectul E-Test la o tulpina de K.pneumoniae producatoare de ESBL (dupa

L. Stratchounski, I si colab., 2003)
(SHV-2 + SHV-1 + TEM-1)
CMIAMC 48 mg/L
CMIPTZ 64 mg/L
CMICPS 4 mg/L
A.2. Metoda discurilor duble
Aceasta metoda presupune compararea diametrelor zonelor de inhibitie date de un
disc impregnate cu o cefalosporina de spectru larg singura cu un alt disc impregnat cu acelasi
antibiotic asociat cu un inhibitor de lactamaze (acidul clavulanic). Daca tulpina testata
produce o enzima de tip ESBL, diametrul zonei este mai mare pentru discul ce contine
antibiotic + inhibitor. NCCLS recomanda compararea diametrelor zonelor de inhibitie date de
catre cefotaxim 30 g/disc cu cele ale cefotaximului + acid clavulanic 30 +10 g/disc,
precum si ceftazidim 30 g/disc cu cele ale ceftazidimului + acid clavulanic 30 + 10 g/disc.
Mzali si colab., 2000 au evaluat discuri cu antibiotice si inhibitori tip MAST DD, folosind

metode conform indicatiilor NCCLS, si au obtinut o sensibilitate de 93% a acestei metode

pentru tulpini bacteriene control, producatoare de ESBLuri, in timp ce perechile de
ceftazidim si cefotaxim s-au dovedit a avea o sensibilitate mai scazuta: 86% si respectiv 66%.
O varianta a metodei discurilor duble cu antibiotice (produse de OXOID) se bazeaza
pe compararea diametrelor zonelor de inhibitie produse de cefpodoxim 10 g/disc si
cefpodoxim + clavulanat 10 + 1 g/disc. Producerea de ESBL-uri este confirmata daca
diametrul zonei de inhibitie data de discul ce contine si clavulanat este cu 5 mm mai mare
decat diametrul zonei discului fara inhibitor (Carter si colab., 2000).

Testul dublei difuzii pentru detectarea ESBL

Pe o placa cu mediu Mueller Hinton inoculata cu tulpina de testat (cultura de 24 h,
insamantare pe placa prin tehnica tamponului) se aplica discuri cu amoxicilina / clavulanat
(AMC) si ceftazidim (CAZ) la 25 -30 mm distanta (Jarlier si colab., 1988 ). De cealalta parte
a discului AMC se plaseaza un disc continand o alta cefalosporina, de preferat cefotaxim
(CT ).
Se incubeaza peste noapte la 37oC.
Producerea de ESBL este certificata daca diametrul zonei de inhibitie este
extins din cauza clavulanatului ( inhibitorul de -lactamaze) (Fig 34, 35).
Avantajul acestei metode simple este costul scazut; dezavantajul este acela ca
separarea optima a discurilor poate varia cu fiecare tulpina. Izolatele cu ESBL-uri de tip TEM
si SHV dau rezultate pozitive, in schimb cele cu enzime de tip CTX-M dau un rezultat pozitiv
numai atunci cand cefotaximul sau cefpodoximul inlocuiesc ceftazidimul, ca indicator de
cefalosporine.
Tulpinile producatoare de ApmC si majoritatea tulpinilor hiperproducatoare de enzime
K1, dau rezultate negative, cu toate cele trei cefalosporine.

Fig. 34. Detectarea producerii de ESBL prin testul dublei difuzii.

Discuri cu antibiotice: stanga: CAZ, centru: AMC, dreapta: CT (original).

Fig. 35. Detectarea ESBL prin testul dublei difuzii AMC-amox. si acid
clavulanic in centru; . CAZ-Ceftazidim. ATM-Aztreonam, CTX-Cefotaxim,
CRO-Ceftriaxone (dupa Shah si colab., 2003).
Se recomanda utilizarea discurilor de cloxacilina pentru detectarea
penicilinazelor (acest antibiotic inhiba cefalosporinazele);
N.B. inoculul dens poate masca hiperproductia de beta-lactamaze;
N.B.- cand sinergismul nu este vizibil din cauza fuzionarii zonelor de inhibitie, se
indeparteaza discurile (30 mm) sau se taie discurile de antibiotic in patru.
N.B.- existenta unor discrepante mari intre diametrul zonelor de inhibitie la CAZ si
CTX se datoreaza prezentei unei alte enzime pe langa ESBL (ex. -lactamaze AmpC
la Enterobacter cloacae).
Teste pentru confirmarea prezentei -lactamazelor cromosomale inductibile (lactamaze tip AmpC)
Cefalosporinele de generatie I (ampicilina si amoxicilina) induc exprimarea enzimelor
tip AmpC si sunt distruse de catre acestea, la majoritatea speciilor de Enterobacteriaceae.
Consecutiv, tulpinile bacteriene producatoare de -lactamaze inductibile tip AmpC devin
rezistente constitutiv. Speciile producatoare de -lactamaze inductibile tip AmpC segrega
mutante derepresate care produc enzime AmpC fara inductie (derepresie stabila). Aceste
mutante sunt rezistente la aproape toate penicilinele si cefalosporinele (Livermore si colab,
2001) si sunt de asemeni frecvente in izolatele clnice.
Speciile producatoare de -lactamaze tip AmpC pot fi recunoscute prin teste de
antagonism intre cefoxitim si cefotaxim (Sanders si colab. 1982). Pentru efectuarea acestui
test se inoculeaza placi, conform protocolului din metoda antibiogramei, si se plaseaza discuri
cu ceftazidim si cefoxitim, pe acceasi placa, la o distanta de 25 mm. Inductia de -lactamaze
este evidentiata prin aplatizarea zonei de inhibitie a ceftazidimului in dreptul discului de
cefoxitim. Astfel, cefoxitimul a determinat producerea de -lactamaze iductibile care au
hidrolizat ceftazidimul (Fig 36).

Acidul clavulanic este un inductor al -lactamazelor tip AmpC si de aceea aparitia

unor mici colonii in interiorul zonei de inhibitie a discului AMC (amoxicilina - acid
clavulanic) poate fi un indicator util pentru detectarea prezentei enzimelor AmpC.

Fig. 36: Detectarea -lactamazelor inductibile tip AmpC. Discul cu

diamterul zonei de inhibitie mare este ceftazidim (CAZ). Cel cu diamtrul
foarte mic este cefoxitim (FOX) (original).
Au fost concepute numeroase teste directe de detectare a activitatii -lactamazice, dar
numai o parte se preteaza ca analize de rutina. Majoritatea folosesc cefalosporine cromogene,
sau coreleaza hidroliza penicilinei cu o schimbare a culorii mediului de reactie, mediata de iod
sau detectata cu un indicator de pH.
Cefalosporinele cromogene sunt foarte specifice, in timp ce acidifierea mediului si
reducerea iodului se poate datora si altor cauze decat actiunii -lactamazelor, generand
rezultate fals pozitive. Datorita slabei specificitati a testului iodometric ar trebui realizate in
paralel controlale pozitive si negative pentru toate testele.
Testul la nitrocefin
Nitrocefinul este o cefalosporina care poate functiona ca substrat cromogen pentru lactmaze, si isi schimba culoarea de la galben la rosu atunci cand este hidrolizat. Acesta
reprezinta testul cel mai sensibil pentru majoritatea lactamazelor, exceptand penicilinazele
stafilococice. Avantajul folosirii acestui antibiotic in testele de evidentiere consta in faptul ca
el este hidrolizat de toate lactamazele cunoscute, indiferent de specificitatea acestora.
Nitrocefinul este disponibil sub forma de pudra purificata de la Becton Dickinson
(Oxford, UK) sau discuri imbibate cu antibiotic (OXOID).
Coloniile bacteriene sunt raclate de pe mediul nutritiv solid si resuspendate in tampon
fosfat obtinandu-se o suspensie densa, peste care se adauga solutie nitrocefin. Activitatea lactamazica este evidentiata prin aparitia culorii rosii in 1 - 2 minute. In cazul enzimelor cu
activitate mai mica raspunsul poate intarzia, insa rezultatele pozitive aparute la mai mult de 10
minute trebuie tratate cu scepticism intrucat ele pot fi cauzate de o activitate lactamazica

secundara a proteinelor care leaga penicilina (penicillin binding protein - PBP) care formeaza
complexe acil instabile (OCallaghan si colab., 1972).
Avantajul acestei metode consta in rapiditatea cu care se pot obtine rezultate despre
prezenta -lactamazelor.
Testul iodometric
Hidroliza penicilinei determina formarea acidului peniciloic, care reduce iodul,
decolorand complexul iodamidon. Aceasta proprietate poate fi exploatata pentru a detecta
activitatea lactamazica in tuburi sau pe hartie. Aceste teste sunt sensibile pentru
penicilinazele stafilococice, dar sunt mai putin sensibile decat nitrocefinul pentru majoritatea
lactamazelor provenite de la bacterii Gram negative.
Metoda in tub: Se poate efectua in cantitati mici atat in tuburi, cat si in placi
cu godeuri. Se distribuie benzilpenicilina (penicilina G) in tampon fosfat, in godeurile
unei placi. In aceasta solutie se suspenda cultura bacteriana, solida (de pe agar) si se
pastraza la temperatura camerei pentru aproximativ 30 60 minute. Se adauga amidon
solubil in apa distilata si ulterior iod in solutie de iodura de potasiu. Activitatea
lactamazica este demonstrata prin decolorarea iodului in maxim 5 minute (Catlin,
1975). Sunt necesare teste de control pozitive si negative deoarece alte proteine pot de
asemenea reduce iodul, iar un inocul concentrat poate da rezultate fals pozitive.
Metoda pe benzi de hartie: Se foloseste hartie de filtru Whatman nr.3,
imbibata in solutie de amidon dizolvat in apa distilata la fierbere, la care s-a adaugat
benzil penicilina la racire. Cand benzile de hartie iodometrica s-au uscat
(aproximativ 2 ore), acestea sunt inmuiate in solutie de iod in iodura de potasiu. Pe
acestea se aplica colonii dintr-o cultura de 24 de ore. Decolorarea apare in 5 minute si
indica activitate lactamazica (Jorgensen si colab. , 1977).
Testul acidimetric
Hidroliza nucleului -lactamic genereaza o grupare carboxil care acidifica un mediu
netamponat. Acidifierea rezultata poate fi detectata in tuburi sau pe hartie de filtru.
Metoda in tub: Se foloseste solutie de rosu fenol la care s-a adaugat
benzilpenicilina, cu pH 8,5. Solutia de culoare violet este distribuita in godeuri si inoculata cu
bacterii din cultura solida pentru a forma o suspensie densa. Activitatea -lactamazica este
indicata de virajul culorii de la rosu la galben in maxim 5 minute (Duma & Kinz, 1968).
Metoda pe benzi de hartie: benzi mici, de hartie de filtru Whatman sunt imbibate
intr-o solutie proaspat preparata de benzilpenicilina, bromo-crezol si NaOH. Benzile se usuca
si se pastreaza pentru mai multe luni. Inainte de folosire ele trebuiesc rehidratate in apa
distilata si apoi se aplica cultura bacteriana de pe agar solid. Aparitia culorii galbene in maxim
5 minute indica activitate -lactamazica (Livermore, 1995).
A.3. Metode de identificare a diferitelor tipuri de -lactamaze: cinetica enzimatica
Obtinerea extractului proteic:

Tulpinile bacteriene care expima constitutiv -lactamaze se cultiva in bulion MuellerHinton peste noapte la 37oC, din care se recolteaza celulele prin centrifugare. Suspensia
celulara obtinuta din fiecare preparat se supune sonicarii urmata de ultracentrifugare.
Supernatantul este dializat si concentrat daca este nevoie (Iaconis si colab., 1989).
Purificarea -lactamazelor:
Intr-o prima etapa, -lactamazele se purifica prin focusare isoelectrica orizontala
(IEFO), intr-un gradient de pH cuprins intre 6.5 si 10.5 obtinut prin metoda amfolitilor.
Dupa migrare, gelul este impartit in 30 de segmente egale in care se testeaza
activitatea lactamazica cu nitrocefin sau benzilpenicilina (OCallaghan si colab. , 1972).
Fractiile din gel care prezinta activitate lactamaizica se incarca pe o coloana
cromatografica de carboxi metil Sephadex si se elueaza cu tampon fosfat conform
protocolului descris de Iaconis si colab., 1989. Fractiile care au prezentat activitate
lactamazica se concentreaza prin ultrafiltrare si au fost trecute in continuare pe o coloana
schimbatoare de ioni.
Hidroliza antibioticelor -lactamice este examinata prin spectrofotometrie UV
(Beckman DU-7). Se folosesc cuve de cuartz, de 1cm, la lungimea de unda maxima de
absorbtie a inelului -lactam, pentru fiecare antibiotic in parte, iar densitatea optica se
masoara la intervale de 10 secunde, timp de 5 minute.
Maximul de absorbtie pentru pricipalele antibiotice folosite sunt:

cefalotin (265 nm)

cefuroxim (274 nm)

cefotaxim (254 nm)

ceftazidim (254 nm)

imipenem (299 nm)

cloxacilin (260 nm)

aztreonam (292 nm)

nitrocefin (489 nm)

Rata de hidroliza a benzilpenicilinei este masurata la 233 nm. Solutiile de antibiotic

sunt preparate in tampon 0,1M, pH 7.0. Pentru stabilirea profilelor substratelor, toate
antibioticele se examineaza la o concentratie de 100 uM, mai putin benzilpenicilina care este
testata pentru 500 uM.
O unitate de activitate -lactamazica, este definita ca fiind cantitatea de enzima care
hidrolizeaza un nmol de substrat / min in etapa liniara a reactiei la 37 oC in tampon fosfat
0,1M, ph 7.0.

Constanta Michaelis (Km) si rata maxima de hidroliza (vm) se determina cu ajutorul

transformarii Lineweaver-Burk a vitezei initiale (v) pentru sase concentratii diferite ale
substratului. Susceptibilitatea -lactamazelor de a fi inhibate de clavulanatul de potasiu si
cloxacilina este masurata cantitativ prin preincubarea enzimei cu concentratii diferite de
inhibitor pentru 10 minute. Pentru masurarea activitatii enzimatice reziduale se adauga
ulterior ca substrat benzilpenicilina (500 uM) sau imipenem (100 uM).
Concentratia de inhibitor necesara pentru a inhiba 50% din activitatea enzimatica se
determina prin teste statisitice de certitudine (Iaconis si colab., 1989).

Evidentierea fenotipica a rezistentei la aminozide la cocii Grampozitivi

La S. aureus rezistenta la aceste antibiotice este enzimatica fiind evidentiate mai
multe fenotipuri (tabelul 24).
Tabelul 24: Rezistenta S. aureus la aminozide
Fenotip

Enzime

Kanamicina

Tobramicina

Amikacina

Gentamicina
Netilmicina

Isepamicina
salbatic

APH3-III

KT

ANT-4-4

KTG

APH 2-AAC6

APH = aminozid-fosfotransferaza; ANT = aminozid nucleotidiltransferaza; AAC = aminozid

acetiltransferaza
Rezistenta la aminoglicozide la enterococi
Rezistenta naturala de nivel scazut (intrinseca) se datoreaza unui transport ineficient al
acestora prin membrana citoplasmatica, insa activitatea lor este sinergica cu -lactaminele si
glicopeptidele. Specia E. faecium produce in mod natural o acetiltransferaza cromosomala
AAC(6) care inactiveaza aminozidele gentamicina ramane activa).

Un numar din ce in ce mai mare de tulpini de enterococi manifesta rezistenta de

nivel inalt la aminoglicozide (HLR) - definita ca CMI 2 mg/mg si, concomitent, rezistenta
la sinergismul cu beta-lactamicele (Tabelul 25). Mecanismul de rezistenta preponderent este
modificarea enzimatica a aminoglicozidelor, ca urmare a achizitionarii uneia sau mai multor
gene. Enzimele codificate de aceste gene sunt sintetizate constitutiv si au localizare
citoplasmatica. Modificarea enzimatica a antibioticului este asociata cu o diminuare a
afinitattii sale pentru proteinele ribosomale (Shaw si al., 1993) si cu alterarea transportului
antibioticului.
Tabelul 25: Principalele fenotipuri de rezistenta ale enterococilor la aminozide
Enzime

Kanamicina

Gentamicina

Netilmicina

Tobramicina

Amikacina

APH3

ANT-4

S/R

APH2-AAC6

APH = aminozid fosfotransferaza; ANT = aminozid nucleotidiltransferaza; AAC =

aminozid acetiltransferaza

Enterobacteriile cu exceptia speciei Providencia stuartii, sunt in mod natural sensibile

la aminoglicozide. Cele patru aminozide utilizate in terapia infectiilor cu enterobacterii sunt:
gentamicina (GM), tobramicina (TM), netilmicina (NET) si amikacina (AN).
P. stuartii are o rezistenta cromosomala la gentamicina, netilmicina si tobramicina.
Rezistenta dobandita la aceste antibiotice este putin frecventa (tabelul 26).
Anumite fenotipuri de rezistenta sunt generate in functie de prezenta anumitor enzime
care modifica aminozidele:
Fenotipul 1: tulpini rezistente la gentamicina (GM), asociate cu prezenta unei 3aminoacil-acetiltrensferazei AAC;
Fenotipul 2: tulpini rezistente la gentamicina (GM) si la netilmicina (NET) asociate cu
o 2-nucleotidiltransferaza ANT;
Fenotipul 3: tulpini rezistente la tobramicina (TM), netilmicina (NET), si la amikacina
(AN) asociate cu o 6-aminoacilacetiltransferaza AAC.

Tabelul 26: Fenotipurile de rezistenta dobandita ale enterobacteriilor la aminozide

Fenotip

Enzime

Gm(G)

To(T)

Nt

Ak(A)

Is(I)

Specii implicate

AAC(3)-I

E.coli,
P.mirabilis,
K.pneumoniae,
E. cloacae

APH(3)-VI

E. cloacae

GT

AAC(3)-VI

E.coli

TA

ANT(4)-II

TOATE

GTNt

AAC(2)-I

P.stuartii

AAC(3)-IV

E.coli

KTG

ANT(2)-I

KTANt

AAC(6)-I

TOATE
S

S.marcescens
E.coli, E.cloacae
K. pneumoniae
E. aerogenes

KTGNt

AAC(3)-II

TOATE

KTGANt

Impermeabilitate

TOATE

Asociatie de enzime

TOATE

Gm = gentamicina, To = tobramicina, Nt = netilmicina, Ak =amikacina, Is =isepamicina,

AAC = aminozid acetiltransferaze, ANT = aminozid nucleotidiltransferaza, APH =
aminozid fosfotransferaze In fiecare clasa, enzimele sunt desemnate prin tipul lor de

activitate, numarul carbonului purtand gruparea modificata (cifre arabe de la 1 la 6) si

ciclul afectat de modificare (primar, secundar sau deloc). Cifra romana care urmeaza
indica spectrul de substrat al enzimei (adica ansamblul de molecule hidrolizate).
Evidentierea fenotipurilor de rezistenta la aminoglicozide la Pseudomonadaceae
Fenotipul salbatic este sensibil la toate aminozidele.
Fenotipurile de rezistenta dobandita se datoreaza mai multor mecanisme:
impermeabilitate, eflux, inactivare enzimatica, mutante respiratorii, combinatii ale acestor
mecanisme (tabel ul 27, 28). La P. aeruginosa cel mai intalnit mecanism este cel de
impermeabilitate (tabelul 27).
Tabelul 27: Principalele fenotipuri de rezistenta ale P. aeruginosa la la aminozide
Fenotip

Enzima

Nt

AAC(3)-I

GNt

AAC(3)

GT

ANT(2)-I

GNtT

AAC(6)-II

AAC(3)-II,IV,V
TNtA

AAC(6 )-I

GTNtA

AAC(6)+ANT(2)-I

Eflux(30-40%)

G = gentamicina ; T= tobramicina ; Nt =netilmicina ; A =amikacina ; I =

isepamicina
AAC = amioacid-acetiltransferaza ; ANT = aminoacid- nucleotidiltransferaza.

Tabelul 28: Fenotipuri de rezistenta la aminozide la Acinetobacter spp

Fenotip de rezistenta

Enzime

Prevalenta ( %)

AAC(3)-I

29,5 - 40

GN

AAC(3)-?

61- 67

GTN

AAC(3)- II

0-8,3

AAC(3)- V

0 -11

TNA

AAC(6)-I

28-35

GTN

AAC(6)- II

0-5

GT

ANT(2 )-I

27-29,5

APH(3)-I

34 -40

AI

APH(3)-VI

48- 48,5

G = gentamicina; N = netilmicina; T = tobramicina; A = amikacina; I = isepamicina;

APH = aminozidfosfotransferaza; ANT = aminozidnucleotidiltransferaza; AAC =
aminozidacetiltransferaza.
Evidentierea fenotipurilor de rezistenta la quinolone
Stafilococii sunt natural rezistenti la quinolone de prima generatie,
in schimb sunt sensibili la fluorochinolone.
Sunt descrise 2 mecanisme de rezistenta:
-

afinitate scazuta prin modificarea tintei, ADN giraza. Dobandirea rezistentei este
legata de aparitia mutatiilor cromosomale in genele gyrA si parC care provoaca o
diminuare a legarii quinolonelor la tintele lor intracelulare, complexele ADN
giraza si ADN topoizomeraza 4.

eflux

Pneumococii prezinta rezistenta naturala la quinolonele din prima generatie si au

sensibilitate redusa la pefloxacin, ofloxacin si ciprofloxacin. Foarte active pe pneumococ sunt
levofloxacina si moxifloxacina.
Mecanismele rezistentei dobandite sunt: efluxul activ si mutatiile topoizomerazei IV
(gena parC) si girazei (gena gyrA)
Toate enterobacteriile prezinta rezistenta incrucisata la toate chinolonele, dar nivelul
de exprimare variaza pentru fiecare substanta antimicrobiana in functie de bacterie. Pentru a
pune in evidenta diferite fenotipuri se testeaza acidul nalidixic (NAL) si doua florochinolone:
de exemplu: pefloxacina (PEF) sau ofloxacina (OFX) si ciprofloxacina (CIP) sau norfloxacina
(NOR) (tabelul 29).
Au fost identificate urmatoarele fenotipuri de rezistenta la chinolone la enterobacterii:
Fenotipul 1: tulpini sensibile la toate chinolonele;
Fenotipul 2: tulpini rezistente la acid nalidixic, dar sensibile la fluorchinolone;
Fenotipul 3: tulpini cu sensibilitate diminuata la pefloxacina si la ofloxacina, dar
sensibile la ciprofloxacina.
Fenotipul 4: tulpini rezistente la toate chinolonele.
Tabelul 29: Fenotipuri de rezistenta a enterobacteriilor la chinolone
Fenotipuri

Ac.
(1)

II

nalidix Norfloxacin

Pefloxacin

Ofloxacin

Ciprofloxacin

III

I/R

I/R

IV

Rar eflux (E. coli)

(1) Ac. Nalidix si toate chinolonele clasice (prima genetatie).

Fenotipurile de rezistenta la chinolone la P. aeruginosa

Fenotipul salbatic este sensibil la toate fluorochinolonele desi in terapie cel mai
utilizat este ciprofloxacinul (tabelul 30). Rezistenta dobandita se datoreaza urmatoarelor
mecanisme: impermeabilitate (porine si LPS); modificarea afinitatii tintei (subunitatile A si B
ale ADN-girazei si Cssi D ale topoizomerazei IV; Eflux activ (OprM, OprJ, OprN confera
rezistenta de nivel scazut)
Tabelul 30: Principalele fenotipuri de rezistenta ale P. aeruginosa la chinolone
Fenotip

Nofloxacin

Pefloxacin

Ofloxacin

Ciprofloxacin

Levofloxacin
I (salbatic)

II

III

IV

eflux

Se considera ca aproape 70% din tulpinile de A. baumanii au dobandit rezistenta

incrucisata la fluoroquinolone, prin mutatii la nivelul tintei.
Evidentierea fenotipurilor de rezistenta la glicopeptide
Rezistenta stafilococilor la glicopeptide
Cazuri de rezistenta sporadica la glicopeptide au fost descrise la stafilococii
coagulazo-negativi inca din 1981. In primele cazuri rezistenta la vancomicina si teicoplanina a
fost de nivel scazut (CMI 8-16mg/ml). Tulpinile raportate ulterior aveau CMI intre 16 si 64
mg/ml la teicoplanina si o sensibilitate mentinuta la vancomicina. Fenotipul de rezistenta a
fost asociat cu prezenta unei proteine membranare de 35 000-39 000da la S.epidermidis si
S.haemolyticus.
Cateva tulpini sunt intermediare la vancomicina (tulpini GISA) si au o rezistenta
crescuta la teicoplanina. Acestea au fost izolate de la pacienti care au urmat multiple
tratamente cu vancomicina. Aceste tulpini GISA nu au genotipul VanA, VanB, VanC,
mecanismul de rezistenta fiind inca necunoscut. Articole recente raporteaza tulpini

ip

de S.aureus cu sensibilitate redusa la teicoplanina (cresterea CMI de 8 ori) si la vancomicina

(CMI dublu), tulpini care sintetizeaza o noua proteina de 39 000da (Fig. 36).
In schimb, tulpini de S.aureus sensibile la vancomicina si cu sensibilitate redusa la
teicoplanina poseda o proteina membranara de 35 000da si prezinta o crestere a exprimarii
PLP 2-1 si PLP 2-2.
Rezistenta la glicopeptide este uneori greu de depistat prin antibiograma difuzimetrica.
Comitetul de Antibiograma al Societatii Franceze de Microbiologie (CA-SFM) recomanda
determinarea CMI pentru toate tulpinile al caror diametru de inhibitie este mai mic de 17 mm.
Detectarea rezistentei pare sa dea rezultate mai bune pe mediu semi-gelozat.
Rezistenta enterococilor la vancomicina
Rezistenta enterococilor la vancomicina a inceput sa fie semnalata din anul 1988
(Leclercq si al., 1988 & 1989). Supravegherea clinica, biochimica si genetica a rezistentei la
glicopeptide in cadrul genului Euterococcus a evidentiat o mare heterogenitate fenotipica si
genotipica. Cele trei fenotipuri (VanA. VanB & VanC) sunt definite prin nivelul
de rezistenta la vancomicina si sensibilitate sau rezistenta la teicoplanina.
Rezistenta intrinseca (naturala) la glicopeptide numita VanC se caracterizeaza prin
rezistenta de nivel scazut la vancomicina si sensibilitate la teicoplanina intalnita la speciile: E.
gallinarum, E. casseliflavus si E. flavescens. Gena VanC codifica o ligaza care substituie DAla-D-Ser in locul D-Ala-D-Ala ca precursor al peptidoglicanului.
Mecanismul rezistentei dobandite este legat de producerea unui nou precursor al
peptidoglicanului in care dipeptidul terminal ( D-Ala-D-Ala) este inlocuit de D-Ala- D-Lac, a
carui afinitate pentru glicopeptide este redusa. Sunt descrise sase fenotipuri de rezistenta
dobandita: VanA, VanB, VanD, VanE,VanG, Van E (la E. faecalis si E. faecium).
VanA (HLR)

VanB (MLR)

VanC

VanD

VanG

VanE

Va(mg/l)

64->1024

4-1000

64

16

16

Tec(mg/l)

16-512

0,5- 1

16

0,5

sie

Inductibila

Inductibila

Constitutiva

Constitutiva

Inductibila

Inductib

t genetic

Plasmidial

Cromosomal

Cromosomal

Cromosomal

Cromosomal

Cromos

transpozon Tn1546

ferabil prin +

gare
bacteriene

E.
faecium
E. E.faecalis
faecalis
E.
faecium
gallinarum E.
flavescens
E.avium
E.
durans
E. hirae

E.

vanC1E.
gallinarum,vanC
2E.
casseliflavus,
andvanC3E.
flavescens

E.faecium

E.faecium
E. faecalis

Transpozonul Tn1546 codifica 9 proteine:

-

doua necesare transpozitiei (ORF1 si ORF2)

doua implicate in reglarea expresiei inductibile a rezistentei ( VanR siVanS)

cinci implicate in rezistenta (VanH-dehidrogenaza, VanA-ligaza, VanXpeptidaza, majore si VanY si VanZ, considerate minore).

A fost descrisa o tulpina de S. bovis rezistenta la vancomicina care poseda gena vanB.
Cea de-a doua forma a rezistentei la vancomicina a rezultat probabil
din transferul conjugativ al operonului vanA de la Enterococcus
faecalis vancomicin-rezistent (fig. 37). Showsh si colaboratorii au
demonstrat ca plasmidul de la Enterococcus faecalis care contine vanA
codifica de asemenea un feromon del sex care este sintetizat si de catre S.
aureus, sugerand posibilitatea transferului conjugal. Aceste izolate VRSA
au rezistenta de nile inalt la vancomicina, cu CMI de 128 g/ml. Rezistenta
la aceste izolate este cauzata de catre alterarea peptidului terminal la DAla-D-Lac in loc de D-Ala-D-Ala (fig. 38). Sinteza D-Ala-D-Lac se produce
doar prin expunerea la concentratii mici de vancomicina.

E. faeca

Fig. 37. Mecanismele de rezistenta la vancomicina a tulpinilor VISA.

Acestea sintetizeaza in exces peptidoglican, avand ca rezultat cresterea
numarului de resturi D-Ala-D-Ala care leaga vancomicina (dupa Walsh si
Howe, 2002).

Fig. 38: Mecanismul de rezistenta la vancomicina a tulpinilor VRSA. (dupa

Hiramatsu si colab., 1997).

Evidentierea rezistentei la macrolide, streptogramine, lincosamide

(MLSb)
Trei mecanisme sunt implicate in rezistenta la aceste molecule:
1. Modificarea tintei ribosomale (sub-unitatea 50S)
Tulpinile rezistente produc o metilaza responsabila de o dimetilare specifica a adeninei
din ARNr 23S. Aceasta provoaca o schimbare de conformatie a ARN, care reduce afinitatea
MLS pentru ribosomi. Metilarea se produce la toate macrolidele si lincosamidele. Aceasta
rezistenta depinde de diferiti determinanti genetici. La stafilococ gasim genele ermA, ermB,
ermC. Aceste gene sunt purtate de transpozoni (ermA) sau plasmide (erm). Exprimarea
fenotipica a rezistentei poate fi inductibila (rezistenta crescuta pentru toate macrolidele cu 14
si 15 atomi de carbon si sensibilitate la macrolidele cu 16 atomi de carbon), sau constitutiva
(rezistenta crescuta la toate macrolidele cu 14-16 atomi de carbon, lincozamidele si
streptograminele B rezistenta de tip MLS B) (tabelul 31). Rezistenta compusului B nu
modifica sinergia a doi compusi ai streptograminelor.
Tabelul 31: Fenotipuri de rezistenta la MLS dobandite de catre stafilococi
14C1
Mecanism

Genotip

Fenotip
15C

Modificare
a tintei

LIN

CLIN

PRIB

PRIA PRIi5

erm
inductibil

MLSB

erm
constituti
v

MLSB

S4

(L)SA

vgb

SB

vga

(L)SA

S/I/R

R/I/S

S/R

msrA

Erm

linA
Inactivare

16C3
2

Vat/vatB

Eflux

(1) 14C: eritromicina, roxitromicina, claritromicina, diritromicina

(2) 15C: azitromicina
(3) 16C: spiramicina, josamicina, midecamicina, tilosina
(4): antibiotic a carui activitate bacteriostatica sau bactericida este diminuata
(5) Pri : pristinamicina
2. Inactivarea antibioticului
Streptogramin A acetiltransferaza confera rezistenta la factorul A astfel incat
streptogramin B hidrolaza, codificata de catre gena vgb, inactiveaza factorul B. Cel putin 2
gene vat si vatB sunt responsabile pentru acetilarea streptograminelor A. Rezistenta izolata la
lincosamide, exceptionala la S.aureus dar detectata la stafilococii coagulazo-negativi
(S.sciurii, S.cohnii, S.xylosus), este datorata achizttionarii unei enzime care modifica prin
adenilare lincomicina si clindamicina. Fenotipul LSA poate fi confundat cu fenotipul L,
ambele rare la S.aureus. Lincosamidele sunt inactivate de catre nucleotidtransferaze codificate
de catre 2 gene plasmidiale foarte apropiate, linA si linA.
3. Efluxul activ de molecule
Exprimarea acestei rezistente depinde de gena msrA, care codifica pentru proteina
MsrA responsabila de eliminarea crescuta a eritromicinei intrabateriene. Au fost izolati
stafilococi rezistenti doar la streptogramina A. Rezistenta dependenta de gena vga este
datorata unei diminuari intracelulare a antibioticului.
La enterococi, rezistenta naturala se manifesta la lincosamide si la compusul A al
streptograminelor (la toate speciile cu exceptia E. faecium si E. durans, astfel ca acest tip de
rezistenta poate fi utilizat ca test de orientare pentru identificare).
Rezistenta dobandita se manifesta prin doua mecanisme: modificarea tintei si
inactivarea antibioticului.
Modificarea tintei (subunitatea 50S ribosomala) este mecanismul principal care
explica rezistenta incrucisata la MLSK. La enterococi gena ermB este responsabila de aceasta
rezistenta.
Inactivarea antibioticului se manifesta la E. faecalis prin actiunea unei
lincomicinnucleotidiltransferaze (codificate de genelinA) care confera rezistenta la
streptograminele A.
Rezistenta dobandita a pneumococului la macrolide este MLSB, datorita metilarii
ARNr 23S, care diminueaza afinitatea macrolidelor pentru tinta. Aceasta rezistenta este
incrucisata pentru toate macrolidele, lincosamidele si streptograminele B si poate fi de
tip inductibil sau constitutiv.
-

Tulpinile care au gena erm imductibila sunt sensibile la ketolide la fel ca cele
rezistente prin mecanismul de eflux .

Alte tulpini, care poseda gena mefE, codifica o rezistenta prin mecanism de eflux
ele fiiind rezistente la eritromicina, dar sensibile la clindamiciaa, quinupristina si
la ketolide. Genele erm si mefE sunt rareori asociate.

Al treilea fenotip de rezistenta a fost descris la un grup de 10 tulpini care nu au

genele erm sau mefE dar sunt ery-R constitutiv si clinda-R.

La S.pyogenes mai putin de 10% dintre tulpini sunt rezistente la eritromicina, cu o

mare heterogenitate
de la o zona la alta (18,3% in Asia, 10,6% in Europa de Est, 9,8% in Europa de Vest).
Doua mecanisme sunt responsabile de aceasta rezistenta: modificarea tintei, care da
fenotipul MLSB constitutiv, codificat de gena ermB si un mecanism de efux care da fenotipul
M codificat de gena mefA.
Telitromicina are o activitate intrinseca superioara celei a macrolidelor.
Evidentierea fenotipurilor de rezistenta la tetracicline

Sunt descrise 2 mecanisme de rezistenta la tetracicline:

primul este legat de o insuficienta concentrare intracelulara a antibioticului datorita unui

eflux excesiv al antibioticului prin membrana citoplasmatica, sub actiunea unei proteine
membranare TET. Acest mecanism confera o rezistenta la tetraciclina, dar nu si la
minociclina.

al doilea mecanism este datorat unei modificari a tintei ribosomale a acestor antibiotice. In
acest caz, exista o rezistenta crescuta la toate tetraciclinele.

La streptococi si enterococi au fost evidentiate 3 gene de rezistenta la tetraciclina, si

anume: tetM, tetO (Zilhao si colab., 1988) si tetL (Chopra si colab., 1992).
Rezistenta la trimetoprim-sulfometoxazol

Rezistenta stafilococului la acesti 2 compusi se realizeaza prin mai multe mecanisme:

- modificarea enzimelor tinta (DHFR si THFR)
- hiperproducerea acestor enzime
Rezistenta la fosfomicina

Rezistenta stafilococului la fosfomicina este rezultatul unor mutatii foarte frecvente ce

tintesc ransportul de antibiotic. A fost raportata o rezistenta plasmidiala la tulpini de stafilococ
coagulazo-negativi si la S.aureus (gena fosB la S.aureus). Mecanismul, prin analogie cu cel
descris la bacilii Gram negativi, ar putea fi inactivarea antibioticului prin conjugare cu
glutation. Specia saprophyticuseste natural rezistenta la fosfomicina.
Rezistenta la acid fuzidic

Rezistenta stafilococului la acidul fusidic este datorata unor mutatii care au loc cu
frecventa mare, fapt pentru care in clinica acest antibiotic se utilizeaza numai in asociere cu
alte antibiotice.
Rezistenta la rifampicina

Se disting doua niveluri de rezistenta:

- de nivel inalt cu CMI > 32mg/l
- sensibilitate diminuata (CMI 1- 4mg/l), tulpini izolate rar
Mecanismele de rezistenta la S.aureus nu sunt inca cunoscute.
La pneumococ, rezistenta la rifampicina, este legata de o mutatie a lantului al ARN
polimerazei care impiedica fixarea antibioticului pe tinta sa.
Rezistenta la cloramfenicol
Este predominant plasmidiala si se datoreaza prezentei la enterococi a unor gene cat omologe cu cele
de origine stafilococica catpC221, catpC194 si catpSCS7 (Trieu-Cuot et al., 1993). CatpC221, este o gena, cu expresie
inductibila. cu secventa cunoscuta (Shaw si al.1985), identificata pe plasmidul pC221 din S.aureus. Plasmidul
conjugativ pIP501 (30,2 kb), cu spectru larg de gazda, a fost izolat pentru prima data din tulpina B96 de S.
agalactiae (Horodniceanu si al., 1976). Prezenta sa confera tulpinii gazda fenotip Cmr-Emr. Studii bazate pe hibridizari
ADN-ADN au evidentiat diseminarea determinantului catpIP501 pe plasmide izolate din enterococi (Pepper si
al.,986).

Spre deosebire de stafilococi si enterococi unde este codificata plasmidial, la pneumococi

cloramfenicol acetil transferaza este de natura cromosomala.
Rezistenta la oxazolidinone
La stafilococi, pana in prezent nu a fost evidentiata rezistenta incrucisata intre
linezolid si alte antibiotice inhibitoare ale sintezei proteice, mai mult oxazolidinonele raman
active asupra tulpinilor de MRSA.
Oxazolidinonele s-au dovedit a fi active asupra tulpinilor de E. faecalis si E.
faecium fie ca sunt sensibile fie ca nu la glicopeptide. In vitro s-au obtinut mutante rezistente
cu o frecventa de 10-9- 10-11 ( mutatii la nivelul subunitatii 23S ribosomale).
La penumococi nu s-a semnalat pana in prezent nici o tulpina rezitenta indiferent de
sensibilitatea la penicilina G si macrolide.

6. Fenotipuri de rezistenta la alte microorganisme

B. cepacia este rezistenta, de asemenea, la aminozide, fosfomicina si polimixine, dar
sensibila la fluoroquinolone si cotrimoxazol si, intr-un anumit procent, la carbapeneme in
special la meropenem. Fenomenul de eflux inactiveaza asupra cloramfenicolul, trimetoprimul
si ciprofloxacinul.

H. influenzae este rezistent la lincosamide si moderat sensibil la macrolide si ketolide.

La aminozide sensibilitatea este variabila iar fata de cloramfenicol, tetracicline, rifampicina,
quinolone si cotrimoxazol se manifesta o rezistenta de nivel scazut.
Biologul sau medicul de laborator care executa antibiograma are obligatia de a
prezenta clinicianului rezultatul sub forma unui document usor de citit si de inteles, care
trebuie sa urmeze logic rezultatului examenului microscopic direct si al culturii.
Mentiunile obligatorii din buletinul de analiza al antibiogramei sunt: metoda utilizata,
lista antibioticelor conform DCI-urilor (denumire comuna internationala), raspunsul
interpretat ca sensibil , intermediar , rezistent, CMI uri in anumite cazuri (in special pentru
microorganismele izolate din infectii severe), mentionarea anumitor fenotipuri de rezistenta si
consecintele lor terapeutice. In anumite cazuri este mai avantajos ca biologul sau medicul de
laborator sa prezinte clinicianului doar rezultatele pentru anumite antibiotice, pentru a evita
selectarea si emergenta unor fenotipuri de rezistenta in mediul spitalicesc (tabelul 33).
Antibiograma este inutila de fiecare data cand tulpina izolata nu poate fi considerata
responsabila de infectia care a determinat prelevarea (ex. -microorganism comensal sau
contaminant, cum este cazul streptococilor orali sau Haemophilus parainfluenzae in
expectoratii, Bacillus intr-o singura hemocultura); cand numarul de UFC/ml este inferior
pragului semnificativ (urina si expectorati); daca tulpina izolata poate fi considerata ca
patogena, dar face parte dintre speciile sensibile in mod obisnuit la tratamentul de referinta si
cand nu exista nici o corelatie in vitro-in vivo (ex. Legionella); in infectiile cutanate pentru
care tratamentul este local sau chirurgical.
Antibiograma trebuie practicata in acord cu clinicianul:
-Daca o bacterie comensala este izolata de la un pacient
imunodeprimat;
- In prelevatele plurimicrobiene care contin specii aerobe/anaerobe
(tabelul 32);
Tabelul 32: Criterii de decizie pentru realizarea unei antibiogramein functie
de natura prelevatului
Prelevat

mocultura

Necesitatea antibiogramei

Fara antibiograma

Pentru toate speciile izolate cu

exceptia contaminarii evidente

Daca sunt
contaminanti normali

Observatii

(Bacillus,
corineformi), iar o
singura hemocultura
este pozitiva
Toate speciile considerate ca

Daca sunt

S. pneumoniae / N.

teter

ocultura

cretii naso-faringiene

responsabile de meningite
comunitare sau nosocomiale

contaminanti normali
(Bacillus,
corineformi )
SCN
Daca examenul
citochimic este
normal

Daca numarul de colonii este

1000 ufc/ml

meningitidis:investigarea
sistematica a rezistentei la
penicilina G
H.influenzae investigare
lactamaze

Efectuare de CMI la antibioticel

utilizate pentru tratament

Daca numarul de
colonii este < 1000
UFC/ml

(Brun Buisson) sau

( Brun Buisson) sau
15 colonii (Maki)
15 colonii ( Maki)
Leucocituria 10000 UFC/ml si
bacteriuria
100000 UFC/ml

Daca leucocituria =
10000 UFC/ml si
bacteriuria 1000
UFC/ml
Daca > 3 specii
bacteriene diferite

Se realizeaza la:
-pacientii imunodeprimat,
dializati, diabetici, batrani,
gravide, sau pacienti cu
antecedente endoscopice sau
chirurgicale pe caile urinare si
leucociturie < 10000 si
bacteriurie
100000 UFC/ml

-la pacientii simptomatici si

izolare de specii uropatogene s
pacientii cu antecedente de
interventii endoscopice si
chirurgicale pe caile urinare sau
nefropatii subiacente si
leucociturie 10000/ml si
bacteriurie 1000 si < 100000
UFC/ml
Investigare de
SAMR, Streptococ A
la pacient alergic la
penicilina

roi din otite si

uzite

pectoratii

cretii bronsice

hid bronho-alveolar

pirate traheoonsice

procultura

procultura cantitativa
pacienti neutropenici

S. pneumoniae, Haemophilus
influenzae, S. aureus,
Enterobacterii, Pseudomonas

Prelevate din otite

S.pneumoniaeinvestigarea
externe, puroi recoltat rezistentei la penicilina
prin paracenteza
SCN

10000000 UFC/ml
nr. leucocite >25/camp

Specii comensale
sau patogene
<10000000 UFC/ml

Idem

<1000 UFC /ml

H. influenzae

nr. celule bucale < 10/camp

(10x)
specii patogene 1000 UFC /ml

( lactamaza)
specii patogene 10000
UFC /ml

<10000 UFC /ml

Idem

specii patogene 10000

UFC /ml

<10000 UFC /ml

Idem

Speciile responsabile de
gastroenterite

Speciile comensale

Interes epidemiologic in specia

Toate speciile izolate 1000

UFC /ml

elevate cutanate

biopsie cutanata

anaritii, arsuri, ulcere

ricoase,escare)

arsi

escare profunde
prelevare chirurgicala

dermatomiozite

elevate
eoarticulare

Sistematic daca prelevarea e

realizata chirurgical sau din
situsuri profunde

Fara antibiograma la
orificii si fistule

Conservarea tulpinilor timp

de 1an

hide de punctie

In functie de examenul

Speciile comensale

Se determina CMI

microscopic si de nr. UFC

(SCN, corinebacterii)

scite, pleural)

Pentru antibioticele R

lectii inchise

Cu prioritate pe speciile
predominante

bcese craniene si
monare)

elevate genitale

N. gonorrhoeae sistematic

Gardnerella

-in functie de examenul

microscopic nr. UFC pentru alte
specii

erme

UFC >1000 /ml

elevate oculare

Ulcere corneene, conjunctivite,

endoftalmii

Speciile comensale

Tabelul 33: Agenti antimicrobieni de prima alegere pentru

tratamentul infectiilor cu bacterii patogene antibiorezistente
Bacterii patogene

Antibioticul indicat pentru

organismul susceptibil

Antibiotice alternative daca organismul est

rezistent la medicamentul indicat

phylococcus aureus

Cloxacilina sau meticilina

Vancomicina

eptococcus pneumoniae

Penicilina

Cefotaxima, ceftriaxon sau vancomicina *

emophilus influenzae

Ampicilina

Cefalosporine de generatia III, eritromicina,

TMP/SMX, Cefaclor, Amoxicilina/clavulanat,
Claritromicina

erococcus fecalis

Ampicilina si gentamicina

Vancomicina

raxella catarrhalis

Ampicilina

La fel ca si pentru H. influenzae

cobacterium tuberculosis

Izoniazida (in combinatie cu

rifamfin si alte medicamente)

O combinatie de 3-6 medicamente la care

organismul este susceptibil

cii de Shigella

Ampicilina sau TMP/SMX

Cefixim, ceftriaxon, cefotaxim, ciprofloxacin

cii de Salmonella

Ampicilina

TMP/SMX, cloramfenicol, ceftriaxon

udomonas aeruginosa

Ticarcilin si tobramicina

Ceftazidim, cefoperazon, quinolone, imipenem

* Alegerea este determinata de localizarea infectiei si de rezultatele antibiogramei;

terapie orale;

Trimetoprim/sulfametoxazol (TMP/SMX);

Sau alta cefalosporina orala de a doua sau a treia generatie;

A nu se folosi in cazul copiilor

Ai probleme de
barbatie? Iata o
metoda vicleana de a
rezolva problema!

Am avut 85 kg! Am
slabit 3 kilograme pe
zi! Cum? Dupa
fiecare masa am...

.com

Am avut 85 kg! Am
Cum poti scapa de
slabit 3 gilograme pe
toata grasimea de pe
zi! Cum? Dupa
abdomen in doar 3
fiecare masa nu am
zile fara dieta si fara
facut d

Cum poti scapa de

toata grasimea de pe
abdomen in doar 3
zile fara dieta si fara

Copyright 2016 - Toate drepturile rezervate.

Toate documentele au caracter informativ cu scop educational.

Grasimea de pe burta
se resoarbe in doar
20 de zile. Nu trebuie
decat sa ...

Proiecte
vezi toate proiectele
PROIECT DE LECTIE MATEMATICA CLASA I Compararea numarului
de elemente a doua multimi
PROIECT DIDACTIC Activitate ecologica GRUPA PRICHINDEILOR
PROIECT Analiza si Sinteza Circuitelor Numerice
PROIECT ROBOTI INDUSTRIALI

Lucrari de diploma
vezi toate lucrarile de diploma
Lucrare de diploma medicina - rolul asistentei medicale in ingrijirea
pacientilor cu infarct miocardic
Relatiile diplomatice dintre Romania si Austro- Ungaria din a doua
jumatate a secolului al XIX-lea
Gestionarea riscurilor bancare - proiect de diploma
LUCRARE DE DIPLOMA MANAGEMENT - MANAGEMENTUL
CALITATII APLICAT IN DOMENIUL FABRICARII BERII. STUDIU DE
CAZ - FABRICA DE BERE SEBES

Lucrari licenta
vezi toate lucrarile de licenta
CONTABILITATEA FINANCIARA TESTE GRILA LICENTA
LUCRARE DE LICENTA EDUCATIE FIZICA SI SPORT - Studiu
statistic privind eficacitatea procedeelor de aruncare la poarta la nivelul
jucatorilor specializ
Lucrare de licenta - cercetare si analiza financiara asupra deseurilor
de ambalaje la sc.ambalaje sa
LUCRARE DE LICENTA - Asigurarea calitatii la firma Trans

Lucrari doctorat
vezi toate lucrarile de doctorat
Doctorat - Modele dinamice de simulare ale accidentelor rutiere
produse intre autovehicul si pieton
Diagnosticul ecografic in unele afectiuni gastroduodenale si
hepatobiliare la animalele de companie - TEZA DE DOCTORAT
LUCRARE DE DOCTORAT ZOOTEHNIE - AMELIORARE - Estimarea
valorii economice a caracterelor din obiectivul ameliorarii intr-o linie
materna de porcine

Proiecte de atestat
vezi toate proiectele de atestat
PROIECT ATESTAT INFORMATICA RECURSIVITATE APLICATA
Proiect atestat Tehnician Electronist - AMPLIFICATOARE
ELECTRONICE
GENERATOR DE TESTE GRILA - Proiect atestat Visual FOX PRO
Lucrare atestat Tehnician in turism - CALITATEA SERVICIILOR
TURISTICE

Paralizia nervilor periferici - remediu natural

Incontinenta de urina - remediu naturist
APARATUL CARDIOVASCULAR - FIBRILATIILE ATRIALE
BOALA MEMBRANELOR HIALINE
MAMITA BRUCELICA (MASTITIS BRUCELLOSA)
Transmiterea virusului HIV
Contraceptia naturala
SUPOZITOARE-F.R.X

Termeni si conditii
Contact
Creeaza si tu
Share to Google BookmarkShare to FacebookShare to TwitterShare to PrinteazaShare to Mai multe...