Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Facultatea de Biologie
LUCRARE DE LICEN
Cuprins
Introducere...........................................................................................................................................3
Caractere de cultur i morfofiziologice..........................................................................................4
Patogeneza la plante.........................................................................................................................6
Protecia pomilor mpotriva focului bacterian................................................................................12
1.3. Descrierea mecanismelor de patogenitate i virulen ale speciei E. amylovora........................13
1.3.1 Factorii de virulen...............................................................................................................13
Proprietile amilovorinei i levanului...........................................................................................14
Formarea biofilmelor......................................................................................................................18
Motilitatea.......................................................................................................................................18
BUCURETI 2016
Introducere
Focul bacterian este o boal devastatoare pentru culturile pomilor fructiferi din familia
Rosaceae, cum sunt Malus, Pyrus, Cydonia, Crategus i Spiraea. Aceasta boal a fost prima dat
menionat n America de Nord dar s-a rspndit n nordul Europei ncepnd cu anii 1950 i a
cucerit pn n 1980-1990 aproape toat Europa i zona Mediteranean. n ara noastr a fost
semnalat n 1992-1993 la o cultur de peri din Brila iar analizele au confirmat prezena
patogenului. Cu timpul, s-a urmrit nlocuirea speciilor susceptibile din culturi cu unele mai
rezistente.
Erwinia amylovora, agentul patogen al focului bacterian, provoac daune considerabile din
punct de vedere economic i fitosanitar. Nu distruge doar recolta din anul curent dar scade i
productivitatea recoltei din anul urmtor, iar copacii din jur, n caz de contaminare, se ard mpreun
cu pomii infectai, cei predispui la infecie i tufele de Crategus din mprejurimi.
De asemenea, exportul este afectat, contaminarea cu E. amylovora fiind supus carantinei
fitosanitare, toate organele plantei cu excepia seminelor sunt poteniale surse de rspndire a
infeciei. Erwinia amylovora este un fitopatogen care semnaleaz o situaie de carantin, ocupnd
un loc important pe lista EPPO A2 (Organizaia European i Mediteranean pentru Protecia
Plantelor).
Plantele produc o serie de compui fr importan pentru metabolismul lor primar, dar care
sunt implicai n capacitatea de adaptare a plantei la condiiile severe de mediu. Aceti compui
organici reprezint n general metabolii secundari ai plantelor i sunt substane biologic active cu
un efect remarcabil asupra altor plante, microorganisme sau animale prezente n imediata lor
vecintate (Stefanovi i colab., 2012). Astfel de compui sunt i uleiurile volatile. De-a lungul
timpului au fost propuse diverse mecanisme de aciune ale uleiurilor volatile asupra celulelor
bacteriene. Uleiurile volatile pot afecta, ntr-un mod dependent de doz i de timpul de aciune,
integritatea i funcionarea membranei celulare bacteriene prin creterea permeabilitii acesteia,
determinnd dereglarea pompelor ionice de H, K sau Na, scderea potenialului membranar i al
pH-ului intracelular i dereglarea producerii intracelulare i extracelulare de ATP (Faleiro i Miguel,
2013).
Rezistena mai mare a bacteriilor Gram-negative la uleiurile volatile ar putea fi atribuit
complexitii nveliului lor dublu membranar, fiind asociat cu rolul protector al proteinelor
membranei externe i al lipopolizaharidelor peretelui celular, care limiteaz viteza de difuzie a
compuilor hidrofobi (Tongnuanchan, i Benjakul 2014).
Rozmarinul (Rosmarinus officinalis) este o plant aromatic, lemnoas, peren, care face
parte din familia Lamiaceae. Este originar din zona mediteranean, dar este ntlnit i n restul
Europei, n Asia i n Africa (Pintore i colab., 2001).
Uleiul volatil de rozmarin este un lichid incolor sau galben deschis, ce pstreaz parfumul
caracteristic al plantei (Raskovic i colab., 2014). Compoziia chimic a uleiului poate varia i este
dependent n special de climat, de compoziia solului, de organul plantei din care este extras, de
vrsta plantei i de stadiul ciclului vegetativ (Faixova i Faix, 2008). Au fost identificai
aproximativ 50 de compui, dar cei mai numeroi sunt monoterpenele i sesquiterpenele, care
variaz n funcie de regiunea geografic. n general, uleiurile sunt bogate n -pinen (11%), 1,8cineol (eucaliptol 46,4%) i camfor (11,4%), n timp ce uleiurile din Frana conin -pinen, 1,8cineol i acetat de bornil. Ali compui ntlnii sunt -pinen (9,2%), -cariofilen, camfen (5,2%),
limonen, mircen, borneol, aterpineol i 4-terpinenol (Offord, 2004).
Datorit toxicitii reduse comparativ cu pesticidele de sintez, biopesticidele, i ntre
acestea uleiurile volatile, sunt alternative valoroase de biocontrol.
3
amylovora,
agentul
etiologic
al
focului
bacterian,
aparine
familiei
Enterobacteriaceae. Din punct de vedere taxonomic se nregistreaz descrierea unor noi specii de
Erwinia i reclasificarea altora considerate ca aparinnd acestui gen. E. amylovora a fost primul
agent etiologic identificat la plante, la finalul secolului al XIX-lea, odat cu descoperiri similare n
domeniul patogenezei infeciilor umane sau animale.
Descrierea speciei conform Lelliott i Dickey (1984) este n prezent astfel: Erwinia
amylovora este Gram negativ (Fig. 1.), nesporulat, cu form de bastona cu capete rotunjite,
formeaz colonii albe pe agar nutritiv 5% , cupuliforme, strlucitoare, mucoide, cu striuri radiale i
un inel central ce se formeaz la 27C. Din aglutinarea Erwiniei cu antiser putem spune ca specia
este omogen i, serologic, are puine aglutinogene n comun cu specii nrudite sau cu saprofitele
gsite n esutul bolnav. Cauzeaz o boal necrotic (focul bacterian) la majoritatea Pomoideaelor i
unele subfamilii de Rosaceae, o form special fiind descris la zmeur. Procentul molar de G + C
al ADN-ului este cuprins ntre 53,6 54,1. Este facultativ anaerob, iar tulpinile hidrolizeaz
esculina. Toate tulpinile produc acid din sorbitol pe care il folosesc ca surs de carbon mpreun cu
acidul aspartic, acidul glutamic, asparagina, glutamina i -alanina pe cnd izoleucina, metionina i
treonina sunt utilizate ca surs de azot. Toate tulpinile sunt sensibile la furazolidon.
Este compus din zaharoz i sorbitol ca surse de carbon i din ciclohexamid, violet cristal
i nitrat de taliu ca inhibitori. Coloniile crescute pe acest mediu prezint o morfologie distinct
5
(colonii netede, mari, pulvinate, albastru opalescent, cu cratere). Pe mediu pentru diagnostic,
Synthetic Nutrient Deficient Agar, formeaz colonii mucoide, rotunde, bombate. Deci dezvolt
caractere net diferite de ale altor specii prezente alturi de aceasta la nivelul leziunilor la plante
afectate de focul bacterian (Pseudomonas spp., E. herbicola).
Patogeneza la plante
O plant este sntoas sau normal atunci cnd ii poate efectua funciile fiziologice la cel
mai nalt nivel al potenialului su genetic (Agrios, 1978). Aceste funcii includ diviziunea celular,
diferenierea i dezvoltarea, absorbia apei i a substanelor minerale din sol i mobilizarea acestora
prin plant, fotosinteza i transportul produilor fotosintetizai n zonele de utilizare i stocare,
metabolismul compuilor sintetizai, reproducerea. Cnd ntre plant i un alt organism se stabilete
o relaie care duneaz gazdei este vorba despre o relaie de patogenez, manifestat prin simptome
de boal ce tulbur echilibrul fiziologic i structural al plantei. (Severin V., 1996)
nsuirile caracteristice ale unui organism patogen sunt: virulena, patogenitatea i
agresivitatea. Patogenitatea este capacitatea de a provoca boala, fiind o calitate intrinsec i
continu ce poate fi doar apreciat, nu i msurat (Grente, 1973). Virulena este expresia care
definete cantitativ gradul de patogenitate iar agresivitatea este nsuirea de a infecta un numr mai
mare sau mai mic de specii.
Bolile plantelor includ toate afeciunile care conduc la performane sczute ale plantelor sau
care reduc capacitatea plantei de a supravieui i de a se menine ntr-o ni ecologic.
Au fost identificate dou clase de factori care provoac boli la plante: biotici i abiotici.
Termenul de patogen se aplic agenilor biotici (bacterii, virusuri, fungi) care provoac cele mai
multe boli ale plantelor. Anomaliile genetice sunt eliminate prin selecie natural.
Reaciile plantelor la agenii patogeni pot fi descrise prin diferite grade de rezisten sau
sensibilitate.
Intensitatea rspunsului celular la un agent patogen este de obicei invers proporional cu
gradul de severitate al bolii suferite de ntreaga plant. Reaciile n care un numr limitat de celule
gazd sunt omorte rapid iar patogenul este cuprins ntr-o leziune necrotic localizat sunt denumite
hipersensibile. Aceasta poate fi privit ca o reacie celular extrem care poate conferi un grad
ridicat de rezisten la boli ntregii plante. Deoarece reaciile de hipersensibiliate reflect
incapacitatea de coexistare dintre plant i patogen sunt numite i reacii de incompatibilitate.
Reaciile n care patogenul se rspandete n interiorul plantei fr a omor celulele gazd sunt
denumite reacii compatibile, avnd ca rezultat susceptibilitatea ntregii plante. (Severin. V., 2011)
Conceptul de toleran definit ca fiind un tip de rezisten a plantelor la boli a fost enunat
de Scafer (1971). Plantele tolerante au capacitatea de a supravieui i de a se descurca la diferite
grade de infectare care la alte plante din aceeai specie provoac pierderi semnificative. Spre
6
2. arsura lstarilor. Fiind organe sensibile, infecia progreseaz rapid cnd condiiile sunt favorabile.
Lstarii pot fi infectai sistemic (intern, sunt pigmentai galben la vrf sau portocaliu nainte de
ofilire) sau extern (infectarea vrfului lstarilor vegetativi care se ofilesc i se ndoaie). Lstarii
bolnavi au frunzele moarte, persistente care apar prlite de foc, de unde i denumirea de foc
bacterian. Din esuturile bolnave se exsudeaz filamente cu aspect de reea incolor, de dimensiuni
variabile care pot fi desprinse de vrf i s disemineze patogenul.
3. ulcere. Pomii care prezint sensibilitate la focul bacterian pot fi infectai pn la ramuri mai vechi
sau trunchi. Infecia coletului se produce prin rni iar arsura acestuia i a rdcinii duce adesea la
moartea pomilor. (Severin. V., 2011)
Focul bacterian prezint simptome care pot fi confundate cu semnele altor boli. Cea mai
frecvent confuzie se produce ntre focul bacterian i arsura bacterian provocat de Pseudomonas
syringae pv. syringae. Infeciile produse de E. amylovora asupra florilor ncep de la esuturile
nectarifere i se extinde la peduncul i ramuri iar vrfurile lstarilor se ncovoaie sub form de
carj, avnd loc exsudri dese. n cazul arsurii comune, aceasta rar se extinde spre peduncul sau
ramura dar apare o delimitare transparent ntre partea vie i cea necrozat a lstarilor, ulceraiile
ramurilor sunt mai deschise la culoare iar scoara se despic des. Cea mai important este ns
absena carjei la lstari. (Severin. V., 2011)
Fig. 3 Procesul de infectare i dezvoltare al focului bacteria cauzat de Erwinia amylovora (Agrios, 2005)
Cele mai multe studii de patogenez implic inocularea bacteriei n plant crend condiii
favorabile pentru dezvoltarea acesteia.
Stadiile patogenezei
1. Contaminarea
Patogeneza cauzat de ageni infecioi ncepe atunci cnd patogenul intr n contact cu o zon
sensibil, infectant, a plantei. Majoritatea infeciilor fungice i cele mai multe infecii bacteriene
iau contact cu planta prin intermediul sporilor din vnt sau din ap.
9
Chiar dac patogenii au reuit s nving barierele structurale preformate, plantele pot s
manifeste diferite grade de rezisten, opunndu-se mai mult sau mai puin invaziei patogenului.
(Severin. V., 2011)
4. Mecanisme de rezisten
Rezistena plantelor la boli depinde de capacitatea de a tolera un agent patogen sau s
restricioneze dezvoltarea acestuia. n unele cazuri, bariere fizice sau chimice impiedic potenialii
ageni patogeni s se stabileasc. De asemenea, este posibil ca modificrile papilare sau ale
peretelui celular ca rspuns la infecia trzie s previn unii patogeni din penetrarea sau stabilirea
lor n interiorul plantei. Uneori, un deficit n nutrienii necesari patogenului poate conferi rezistenta
la boala, dar foarte des penetrarea i dezvoltarea iniial a patogenului se produce la fel de repede n
10
organismele rezistente ca i n cele sensibile. n aceste cazuri, reaciile la boal depind de tipul
rspunsului indus de patogen. (Severin. V., 2011)
12
i Norelli, 1977). Ulceraiile nedelimitate se dezvolt frecvent atunci cnd infeciile au loc cu
ntrziere, pe plantele tinere sau pe anumite soiuri.
de uniti repetitive (Geider K., 2012). Compoziia n zahar i legturile dintre reziduurile de zahr
fac aceste uniti unice.
Amilovorina produs de E. amylovora este activ numai fa de plantele speciilor i soiurilor
sensibile la bacteria producatoare (Hsu i Goodman 1978). Toxinele pot fi grupate dup simptomele
pe care le produc n toxine care produc ofiliri, toxine necrozante i toxine care induc hipertrofii.
Proprietile amilovorinei i levanului
Fig. 4. Sinteza levanului prin levansucroz (Lsc) din sucroz n mediul bacterian. Enzima constitutiv secretat se
ataaz lanului de polimeri. Levanul poate proteja celulele i glucoza eliberat poate fi folosit ca i surs de carbon.
(Joel Vanneste, 2000)
14
alor bacterii Gram-negative fitopatogene, E. amylovora folosete acest sistem conservat evolutiv
pentru a exporta i livra proteine efectoare n citoplasma celulelor vegetale gazd printr-o structur
similar pilului care formeaz elementul central al T3SS. Pe parcursul livrrii, o protein chaperon
este legat la fiecare protein efector care protejeaz proteina efector de interaciunile premature cu
alte proteine. [24] Prin translocarea acestor proteine efector n celulele gazd, T3SS interfereaz cu
un semnal de transducie al celulei gazd i cu alte procese celulare, sporind astfel virulena
bacteriilor n celulele gazd sensibile.
Reglarea procesului de secreie a proteinelor efector se realizeaz la dou nivele:
transcrierea genelor sistemului T3SS care este controlat de proteina reglatoare ExsA, membru al
familiei de reglatori transcripionali AraC/XylS i iniierea procesului de secreie realizat prin
interaciunea celor 4 proteine reglatoare ExsA, ExsC, ExsD i ExsE. Atunci cnd secreia este
dezactivat, proteina ExsE se acumuleaz n citoplasma bacterian i leag proteina ExsC,
determinnd astfel legarea proteinei ExsD de proteina ExsA i blocnd transcrierea genelor
sistemului T3SS. Atunci cnd secreia este activat, proteina reglatoare ExsE este secretat n afara
celulei bacteriene, determinnd astfel legarea proteinei ExsD de ctre proteina ExsC. Legarea
proteinei ExsD elibereaz activatorul transcripional ExsA i are loc transcrierea genelor sistemului
T3SS (Hauser, 2009).
Sistemul T3SS este codificat de 36 de gene distribuite n 5 operoni organizai n clustere, iar
proteinele efector i proteinele chaperon sunt codificate de alte 6 gene distribuite la nivelul
cromozomului bacterian (Gellatly i Hancock, 2013).
Un numr mare de gene hrp codific pentru sistemul de secreie de tip 3. Au fost identificai 2
tipuri de factori secretai prin intermediul acestui aparat: harpine i factori aviruleni. Harpinele sunt
codificate de hrpN i hrpW, fiind similare la E. amylovora cu alte specii de fitopatogeni. Ele sunt
capabile s induc schimbri n metabolismul celular, ducnd astfel la moartea plantei. Factorii de
avirulen fac acelai lucru, oferind plantei gazd o gen de rezisten complementar. Mai multe
gene pentru aceti factori au fost identificate, dar de un interes deosebit sunt genele dspEF.
Sistemul T3SS al bacteriilor fitopatogene este alctuit din proteine Hrc codificate de gene
conservate hrp care induc rspunsul de hipersensibilitate i de patogenitate. La E. amylovora,
genele Hrp sunt grupate n clustere de aproximativ 20 de gene, una dintre ele codific un
constituent al membranei exterioare, n timp ce celelalte codific pentru sisteme de secreie de baz,
pentru gene de reglare, pentru harpins, pentru Hrp-pilina, care n unele bacterii este necesar pentru
funcia tipului III de secreie, pentru gene de avirulen (AVR) etc. Practic, ele sunt grupate ntr-o
insul care conine patru regiuni: o regiune hrc/hrp, un efector hrc, o regiune hrp pentru enzimele
asociate i o regiune de transfer [24,38].
16
Fig. 6. Reprezentare schematica a sistemului T3SS din bacteriile fitopatogene (Bttner i colab., 2009)
18
zinc, nalt conservt, confirmat ca fiind proteaza de 48 kDa pe geluri prin secven ierea
fragmentelor peptidice triptice derivate din proteine [50].
Pompa de eflux multidrog AcrAB
n timpul patogenezei, E. amylovora este expus la o varietate de compui antimicrobieni
toxiinfecioi pentru plante, care, n cazul Rosaceaelor, sunt sintetizate ca isoflavonoizi constitutivi
(Burse, A., 2004).
Apoi, transportorii pompei de eflux bacteriene, care mediaz rezistena structural pot
conferi toleran la unii compui antimicrobieni numiti fitoalexine. n aceast privin , s-a observat
c clonarea locusului AcrAB din E. amylovora, care codific modularea rezistenei sistemului de
transport n E. coli confer rezisten la hidrofobicitate i la toxinele amfifile. Unei tulpini de de E.
amylovora cu o mutaie n gena punctiorm acrB i-a fost afectat virulena pe mr portaltoi i a fost
susceptibil fa de extracte din frunze de mr, precum i la fitoalexine, floretin, naringenin,
quercetin, i (+) - catechin. Aceste rezultate sugereaz cu trie c sistemul de transport AcrAB
joac un rol important n complexul de proteine necesare pentru virulen. (Burse A., 2004)
1.3.2. Suportul genetic al factorilor de virulen
Genomul E. amylovora const dintr-un cromozom circular 3805874 bp i dou plasmide:
AMYP1 (28243 bp), raportat ca PEA29, iar plasmida AMYP2 mai mare (71487 bp) numit
pEA72. Dimensiunea mic a genomului E. amylovora (3.8 Mb) n comparaie cu celelalte
enterobacterii, inclusiv agenii patogeni ai plantelor, cu genomurile de 4,5-5,5 Mb i preponderent
pseudogenele, reducerea genomului poate fi produs prin inactivarea mutaional i tergerea
ulterioar i conduce la pierderea celor mai multe gene implicate n respiraia anaerob i
fermentaie gsite n enterobacteriile tipice, legate, cu reducerea consecvent a capacit ii de a tri
n medii anaerobe. Secvena genomului E. amylovora a scos la iveal semne clare de patoadaptare
la mediul plantelor Rosaceae. De exemplu, proteinele T3SS legate sunt mai asemntoare cu
proteinele altor ageni patogeni ai plantelor dect proteinele de enterobacterii strns nrudite
(Sebaihia, M., 2010)
n comparaie cu ali ageni patogeni de plante, cu toate acestea, E. amylovora are o
diversitate genetic relativ sczut, cu o recombinare genetic limitat, aceasta fiind asociat cu
expunerea limitat la presiunile de selecie din cauza fructelor, favoriznd strategic soiuri nalt
apreciate, care sunt adesea foarte sensibile la focul bacterian [20,61,62].
Interesant este c secvenierea genomului a trei tulpini mexicane de E. amylovora au relevat
o mutaie rpsL care confer la nivel cromozomal un grad ridicat de rezisten la streptomicin [63].
Aceast mutaie cromozomal este mecanismul predominant care apare n mod obinuit dup ani de
aplicare intensiv cu persisten ndelungat n populaiile de E. amylovora [10,63], explicnd
19
Small RNA
Recent, diferite cantiti mici ARNs reglatoare care necesit un ARN nsoitor att pentru
stabilitate ct i pentru activarea funcionalitii au fost identificate n E. amylovora, unele dintre ele
fiind implicate n reglarea diverselor caractere de virulen. Dei au fost recunoscute multe ARNs
ca mediatori n bacterii, identificarea genomului pe scar larg a acestui ARN a fost realizat ntr-un
numr limitat de bacterii (Zeng, Q., 2014).
20
Quorum Sensing
Sistemele de quorum sensing au fost descrise la E. amylovora, att QS-1 ct i QS-2
bazndu-se pe un semnal autoinductor lactone N-homoserina 1 (AI-1) iar QS-2 pe enzima luxS (AI2) responsabil pentru semnal. Dei luxS nu afecteaz quorum sensing-ul la E. amylovora, unele
tulpini au activitate dependent de AI-2 i inactivarea ei determin inactivarea unor fenotipuri,
inclusiv a virulenei (Gao, Y., 2009).
Folosirea analizelor genomice comparative pentru a cuta gene omoloage implicate, au fost
identificate gene care corespund sistemului de semnalizare Epinefrina/Norepinefrina la E.coli. n
mod deosebit, omologii sistemului cu dou componente QseEFEa i reglatorul transcripional QseA
sunt bine conservate la E. amylovora. Experimentele au artat c sistemul QseEFEa este implicat n
reglarea motilitaii de roire, biosinteza amilovorinei i formarea biofilmelor (Castiblanco, L.F.,
2011).
Mecanisme de patogenitate
Armele chimice ofensive utilizate de patogenii plantelor includ enzime, factori de cretere i
toxine. Att plantele ct i agenii patogeni pot produce toate cele 3 tipuri de chimicale. Uneori,
enzimele i factorii de cretere produc efecte toxice.
I.
Enzime
21
Enzimele bacteriene pot fi clasificate dup compoziia chimic, dup procesul chimic catalizat
i dup modalitatea de apariie. Dup compoziia chimic, enzimele pot fi holoproteice,
metaloproteice i heteroproteice. Din punct de vedere al procesului biochimic pe care l catalizeaz,
la bacteriile fitopatogene au fost cercetate mai mult hidrolazele, dintre care glicozidazele, proteazele
i enzimele oxidante. Glicozidazele ntlnite frecvent la fitopatogeni sunt amilaza, pectinaza i
celulaza. n cazul Erwiniei, se ntlnesc pectinazele care hidrolizeaz diverse pectine,
descompunnd lamelele mediane pectice ale membranelor celulelor plantelor gazd, fapt ce duce la
apariia de putregaiuri moi i macerri. (Severin V., 1996)
Glucozidaza este o enzim interesant deoarece rezult din formarea glucozei i hidrochinonei
din arbutin, un compus comun n mr. Formarea hidrochinonei este semnificativ fiindc este
toxic pentru bacterie (Hildebrand and Schroth, 1979). Hidrochinona acioneaz prin inhibarea
succinatului, D-lactat, DL-malonat i NADH (n prezena oxigenului), inhibnd astfel creterea
bacterian. S-a artat ca E. amylovora are o activitate glucozidazic slab dependent de mediul de
cretere.
Expresia genelor care codific la E. amylovora enzimele pectice i izoenzimele este
secvenial. Acest lucru sugereaz c genele sunt reglate separat. n plus, exist sisteme globale de
reglare, cum ar fi sistemul de detectare quorum, astfel nct se maximizeaz activitatea enzimatic
principal. Din cauza numrului mare de pectinaze implicat, mutaia genei care codific una din
enzime nu este suficient pentru a opri macerarea celulei.
Simptomele se dezvolt atunci cand o populaie de Erwinia ajunge la o densitate celular
dependent de reglare sau de sistemul de detectare quorum (sistem de enzime extracelulare).
Producia de enzime este activat atunci cnd numrul bacteriilor i homoserin inductor bacterii
secretoare de lactoz (HSL) au atins un nivel critic. Perturbarea genei hsl sau adugarea unei gene
care codific enzima ce descompune hls conduce la producerea mutanilor cu patogenitate redus.
Probabil, detectarea prin quorum permite bacteriilor s se multiplice n cadrul esutului gazd fr a
declana rspunsuri de rezisten, cum ar fi producia de fitoalexine. n general, enzimele de
degradare ale peretelui sunt considerate a juca un rol n patogenez prin facilitarea invadrii
esutului de colonizare, dar ele sunt factori de virulen responsabili pentru dezvoltarea simptomelor
o dat ce creterea bacteriei a fost iniiat.
Pentru a degrada structuri complexe cum sunt pereii celulelor necesit o baterie enzimatic care
acioneaz fie secvenial, fie constant. Metodele imbuntaite pentru separea amestecurilor de
enzime au avut ca rezultat preparate rafinate capabile de solubilizarea componentelor individuale
ale pereilor celulari ai plantelor.
Degradarea complet a pereilor celulari necesit enzime celulozolitice, hemicelulozolitice,
pectolitice i proteolitice capabile s atace fiecare dintre componentele polimerice majore. Cu toate
c fiecare enzim atac substratul, numai cele pectolitice apar efectiv n iniierea degrdarii
22
pereilor celulari iar unele au fost asociate cu efecte letale n timpul patogenezei. Enzimele pectice
sunt de 2 tipuri:
-
pectic-metilesteraze, care ndeprteaz gruprile metoxil din pectin i se obine acid pectic
enzime care taie lanurile, clivnd legturile ex-I, 4-glicozidice care leag uniti de acid
uronic de polimerii pectici. Aceste enzime sunt imprite n: hidrolaze (scindeaz legturi
prin hidroliz) i liaze/trans-eliminaze (cliveaz legturile prin trans-eliminare).
II.
Factorii de cretere
Simptomele brute singure implic activitatea anormal a reglatorilor de cretere n multe boli
ale plantelor. Extracte de esuturi care prezint astfel de modele de cretere anormale sunt de 10 ori
mai active la testele pentru substanele de reglare a creterii dect sunt extractele din plante
sntoase. Toate tipurile majore de reglatori de cretere pentru plante (auxine, gibereline, citokine,
etilena) sunt produse de diveri ageni patogeni bacterieni sau fungici, evidenind astfel rolul lor n
boli dar nu i in debutul bolii.
III.
Toxine
Focul bacterian la mere i alte specii de Rosaceae este o boal extrem de distructiv cauzat de
E. amylovora. S-a demonstrat c exsudatul din feliile de mere verzi inoculate cu tulpini virulente
ale acestui patogen este toxic n mod selectiv pentru plantele susceptibile imbolnvirii. (Goodman i
colab. 1974). Un preparat rafinat al toxinei conine 98% galactoz n form polimeric i ~ 0,4%
proteine. Toxina, considerat a fi un produs al interaciunii dintre plant i patogen, a fost denumit
amilovorin. Cu toate c a fost inclus n categoria patotoxinelor, toxicitatea sa selectiv se bazeaz
exclusiv pe efectul de ofilire care nu poate fi considerat un semn distinctiv al boli.
23
Decoct
Macerat
Tinctur
Ulei volatil
Metoda de extracie
Infuzare 50 g plant/ 100mL ap
distilat
50 g plant/ 100 mL ap distilat la
fierbere
Extracie etanolic (etanol 60%) 50 g
plant/ 100 mL etanol
Extracie etanolic (etanol 80%) 50 g
plant/ 100 mL etanol
Hidrodistilare (aparat Neo-Clevenger)
100 g plant
24
6
Nr.
Eucaliptol
Tulpina
crt.
1
2
3
4
E. amylovora 48/1
E. amylovora 45/4
E. amylovora 42/2
E. amylovora P15/1
forming unit microbial adherence to hydrocarbons assay and evaluated cell surface hydrophobicity
and biofilm production of Vibrio scophthalmi, Bacteriology & Parasitology, 3(1): 130
doi:10.4172/2155-9597.1000130;Gora A.B., Yao J., Sandy E.H., Zheng S., Zaray G., Koroma
B.M., Hui Z., 2010, Cell surface hydrophobicity (CSH) of Escherichia coli, Staphylococcus
aureus and Aspergillus niger and the biodegradation of Diethyl Phthalate (DEP) via
microcalorimetry, Journal of American Science, 6(7): 78-88;
s-au realizat concentraii corespunztoare valorilor CMI/4 de amestec
Tehnica s-a executat comparativ pentru celule planctonice i celule tratate cu extracte vegetale.
Hidrofobicitatea suprafeei celulelor bacteriene a fost exprimat ca aderen procentual (%Adh)
folosind formula:
26
27
28
Fig. Erwinia amylovora 45/4, determinarea calitativ a activitii antimicrobiene (3) 60% etanol macerat; (4)
80% etanol tinctur; (5) 60% etanol macerat US; (6) 80% etanol tinctur US
Extracie
cu US
29
E. amylovora 15/1
14
12
10
8
6
4
2
0
diametrul zonelor de inhibiie (mm)
variante experimentale
E. amylovora 48/1
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
diametrul zonelor de inhibiie (mm)
variante experimentale
30
E. amylovora 42/2
25
20
15
10
5
0
Extracie
cu US
variante experimentale
E. amylovora 45/4
16
14
12
10
8
6
4
2
0
Extracie
cu US
variante experimentale
Fig. 8. Evidentierea concentratiei minime inhibitorii prin metoda microdilutiilor la tulpinile studiate
Determinarea CMI a relevat valori minime ale CMI pentru extractele de tipul UV i eucaliptol, iar
extractele alcoolice cu etanol 80% au confirmat superioritatea capacitii de extracie a compuilor,
comparativ cu etanolul de 60% (valori CMI mai mici) (figura).
32
80
60
CMI (L/mL)
2 - 80% etanol
tinctura US
40
3 - ulei volatil de
rozmarin
20
4 - eucaliptol
0
15/1 42/2 45/4
48/1
tulpini bacteriene
7
Pentru UV i eucaliptol intervalul MIC a fost 0,12 3,9 L/mL, iar la extractele etanolice
6,25 100 L/mL.
Determinarea FIC concentraia inhibitorie fracionat
Valorile FIC sunt cuprinse n intervalul 0,12-1 pentru tulpinile studiate. Valoarea maxim s-a
nregistrat n cazul tulpinii 15/1, ponderea activitii antimicrobiene a eucaliptolului n amestecul
ulei volatil de rozmarin fiind de 100% pentru aceast tulpin. Celelalte tulpini au fost inhibate de
activitatea concertat/ sinergic a tuturor componentelor uleiului.
FIC
1.2
1
0.8
valori FIC (adimensional)
0.6
FIC
0.4
0.2
0
15/1
42/2
45/4
48/1
tulpini bacteriene
intensitilor semnalelor fluorescente provenite n urma marcrii probelor cu doi fluorocromi, la doi
timpi de citire: iodura de propidiu (PI - fluorocrom ce marcheaz direct componentele celulare prin
legare de acizii nucleici i care ptrunde n celule dup deteriorarea nveliurilor acestora) i
bromura de etidiu (EB - fluorocrom ce marcheaz direct componente celulare prin legare de acizii
nucleici i a crui legare este direct influenat de activitatea pompelor de eflux, fiind o molecul
care este scoas din celule prin transport activ). Marcarea nu s-a putut realiza concomitent, datorit
suprapunerii spectrelor de emisie ale celor dou molecule fluorescente.
variante experimentale
5
0
variante experimentale
a.
b.
c.
V. Concluzii
Datele obtinute sugereaz c extractele etanolice de rozmarin, uleiul volatil i eucaliptolul
au un mare potential antimicrobian i pot fi utilizate pentru dezvoltarea unor formule de pesticide
botanice, alternative pentru nlocuirea pesticidelor de sintez.
Pentru UV i eucaliptol intervalul MIC a fost 0,12 3,9 L/mL, iar la extractele etanolice
6,25 100 L/mL.
Valorile FIC sunt cuprinse n intervalul 0,12-1 pentru tulpinile studiate. Ponderea activit ii
antimicrobiene a eucaliptolului n amestecul ulei volatil de rozmarin a fost dependent de amestecul
de componente cu excepia tulpinii 15/1 asupra creia a avut efect maxim.
Tehnica citometriei n flux a confirmat efectul inhibitor asupra activitii pompelor de eflux
la toate variantele analitice testate.
VI. Bibliografie
1. Zeng, Q.; Sundin, G.W. Genome-wide identification of Hfq-regulated small RNAs in the fire
blight pathogen Erwinia amylovora discovered small RNAs with virulence regulatory function.
BMC Genomics 2014, 15, doi:10.1186/1471-2164-15-414.
2. Dellagi, A.; Brisset, M.N.; Paulin, J.P.; Expert, D. Dual role of desferrioxamine in Erwinia
amylovorapathogenicity. Mol. Plant Microbe Interact. 1998, 11, 734742.
Int. J. Mol. Sci. 2015, 16 12850
3. Koczan, J.M.; Lenneman, B.R.; McGrath, M.J.; Sundin, G.W. Cell surface attachment
35
more susceptible to polymyxin B and more resistant to excess iron. Res. Microbiol. 2010, 161,
153157.
19. Molina, L.; Rezzonico, F.; Dfago, G.; Duffy, B. Autoinduction in Erwinia amylovora:
Evidence of an acyl-homoserine lactone signal in the fire blight pathogen.J. Bacteriol. 2005, 187,
32063213.
20. Venturi, V.; Venuti, C.; Devescovi, G.; Lucchese, C.; Friscina, A.; Degrassi, G.; Aguilar, C.;
Mazzucchi, U. The plant pathogen Erwinia amylovora produces acyl-homoserine lactone signal
moleculesin vitro and in planta. FEMS Microbiol.Lett.2004, 241, 179183.
21. Rezzonico, F.; Duffy, B. The role of luxS in the fire blight pathogen Erwinia amylovora is
limited to metabolism and does not involve quorum sensing. Mol. Plant Microbe Interact. 2007,
20, 12841297.
22. Gao, Y.; Song, J.; Hu, B.; Zhang, L.; Liu, Q.; Liu, F. The luxS gene is involved in AI-2
production, pathogenicity, and some phenotypes in Erwinia amylovora. Curr.Microbiol.2009,
58, 110.
23. Castiblanco, L.F.; Edmunds, A.C.; Waters, C.M.; Sundin, G.W. Characterization of quorum
sensing and cyclic-di-GMP signaling systems in Erwinia amylovora. Phytopathology 2011, 101, S2.
24. Agrios G., 2005, Plant pathology 5th edition, 620-646
25. Van der Zwet, T., Zoller, B. G., and Thompson, S. V. (1988). Controlling fire blight of pear and
apple by accurate prediction of the blossom blight phase. Plant Dis. 72, 464472.
26. Vanneste, J. L., ed. (2000). Fire Blight: The Disease and its Causative Agent, Erwinia
amylovora.
27, Hildebrand, M., Dickler, E., and Geider, K. (2000). Occurrence of Erwinia amylovora on
insects in a fire blight orchard. J. Phytopathol.148, 251256.
29. Baicu T., esan T. E. 1996, Fitopatologie agricol, Ed. Ceres, Buc., 316 pp.
30. Severin V., Iliescu H.C., 2006, Bolile bacteriene ale plantelor, GEEA, Buc., 324 pp.
31. Severin V., Kupferberg S. Zurini I. 1986. Bacteriozele plantelor cultivate, Ed. Ceres, Buc., 219
pp.
32. Severin V., 1996, Focul bacterian al rozaceelor [Erwinia amylovora]
33. Geider, K. Variations in the molecular masses of the capsular exopolysaccharides amylovoran,
pyrifolan and stewartan. Int. J. Biol. Macromol. 2012, 50, 518522.
34. Beer. S. V., and J. L. Norelli, 1971, Fire blight epidemiology: factors affecting release
of Erwinia amylovora by cankers.
37