Sunteți pe pagina 1din 37

Universitatea din Bucureti

Facultatea de Biologie

LUCRARE DE LICEN

Studiul efectelor unor extracte vegetale naturale asupra unor


bacterii fitopatogene

Coordonator tiinific: Conf. Dr.Chifiriuc Carmen Mariana


ndrumator: Dr.Ing.Chim. Crina Maria Kamerzan
Student: Martinescu Beatrice-Elena

Cuprins
Introducere...........................................................................................................................................3
Caractere de cultur i morfofiziologice..........................................................................................4
Patogeneza la plante.........................................................................................................................6
Protecia pomilor mpotriva focului bacterian................................................................................12
1.3. Descrierea mecanismelor de patogenitate i virulen ale speciei E. amylovora........................13
1.3.1 Factorii de virulen...............................................................................................................13
Proprietile amilovorinei i levanului...........................................................................................14
Formarea biofilmelor......................................................................................................................18
Motilitatea.......................................................................................................................................18
BUCURETI 2016

1.3.3.Reglarea factorilor de virulen.................................................................................................21


Patogenitatea enzimelor bacteriene care degradeaz pereii celulari.................................................22
II. PARTE PRACTIC - Studiul efectelor unor extracte vegetale naturale asupra bacteriilor
fitopatogene apartinand speciei E. amylovora...................................................................................25
II.1. Materiale i metode.................................................................................................................25
II.1.1. Tulpini bacteriene.............................................................................................................25
n studiul de fa s-au utilizat 4 tulpini de......................................................................................25
II.1.2. Obinerea extractelor vegetale..........................................................................................25
II.1.3. Screening-ul calitativ al sensibilitii bacteriene fa de extractele vegetale cu potenial
aciune antimicrobian................................................................................................................26
II.1.4. Analiza cantitativ s-a realizat cu ajutorul diluiilor seriale binare n mediu lichid.........26
II.1.5. Determinarea concentraiei inhibitorii fracionate...........................................................27
II.1.6. Determinarea influenei extractelor vegetale asupra hidrofobicitii la celulele
planctonice..................................................................................................................................27
II. 1. 7. Evaluarea influenei uleiurilor volatile i a standardelor analitice asupra activitii
pompelor de eflux bacteriene......................................................................................................28
II.2. Rezultate i discuii.................................................................................................................30
V. Concluzii........................................................................................................................................37
VI. Bibliografie..................................................................................................................................38

Introducere
Focul bacterian este o boal devastatoare pentru culturile pomilor fructiferi din familia
Rosaceae, cum sunt Malus, Pyrus, Cydonia, Crategus i Spiraea. Aceasta boal a fost prima dat
menionat n America de Nord dar s-a rspndit n nordul Europei ncepnd cu anii 1950 i a
cucerit pn n 1980-1990 aproape toat Europa i zona Mediteranean. n ara noastr a fost
semnalat n 1992-1993 la o cultur de peri din Brila iar analizele au confirmat prezena
patogenului. Cu timpul, s-a urmrit nlocuirea speciilor susceptibile din culturi cu unele mai
rezistente.
Erwinia amylovora, agentul patogen al focului bacterian, provoac daune considerabile din
punct de vedere economic i fitosanitar. Nu distruge doar recolta din anul curent dar scade i

productivitatea recoltei din anul urmtor, iar copacii din jur, n caz de contaminare, se ard mpreun
cu pomii infectai, cei predispui la infecie i tufele de Crategus din mprejurimi.
De asemenea, exportul este afectat, contaminarea cu E. amylovora fiind supus carantinei
fitosanitare, toate organele plantei cu excepia seminelor sunt poteniale surse de rspndire a
infeciei. Erwinia amylovora este un fitopatogen care semnaleaz o situaie de carantin, ocupnd
un loc important pe lista EPPO A2 (Organizaia European i Mediteranean pentru Protecia
Plantelor).
Plantele produc o serie de compui fr importan pentru metabolismul lor primar, dar care
sunt implicai n capacitatea de adaptare a plantei la condiiile severe de mediu. Aceti compui
organici reprezint n general metabolii secundari ai plantelor i sunt substane biologic active cu
un efect remarcabil asupra altor plante, microorganisme sau animale prezente n imediata lor
vecintate (Stefanovi i colab., 2012). Astfel de compui sunt i uleiurile volatile. De-a lungul
timpului au fost propuse diverse mecanisme de aciune ale uleiurilor volatile asupra celulelor
bacteriene. Uleiurile volatile pot afecta, ntr-un mod dependent de doz i de timpul de aciune,
integritatea i funcionarea membranei celulare bacteriene prin creterea permeabilitii acesteia,
determinnd dereglarea pompelor ionice de H, K sau Na, scderea potenialului membranar i al
pH-ului intracelular i dereglarea producerii intracelulare i extracelulare de ATP (Faleiro i Miguel,
2013).
Rezistena mai mare a bacteriilor Gram-negative la uleiurile volatile ar putea fi atribuit
complexitii nveliului lor dublu membranar, fiind asociat cu rolul protector al proteinelor
membranei externe i al lipopolizaharidelor peretelui celular, care limiteaz viteza de difuzie a
compuilor hidrofobi (Tongnuanchan, i Benjakul 2014).
Rozmarinul (Rosmarinus officinalis) este o plant aromatic, lemnoas, peren, care face
parte din familia Lamiaceae. Este originar din zona mediteranean, dar este ntlnit i n restul
Europei, n Asia i n Africa (Pintore i colab., 2001).
Uleiul volatil de rozmarin este un lichid incolor sau galben deschis, ce pstreaz parfumul
caracteristic al plantei (Raskovic i colab., 2014). Compoziia chimic a uleiului poate varia i este
dependent n special de climat, de compoziia solului, de organul plantei din care este extras, de
vrsta plantei i de stadiul ciclului vegetativ (Faixova i Faix, 2008). Au fost identificai
aproximativ 50 de compui, dar cei mai numeroi sunt monoterpenele i sesquiterpenele, care
variaz n funcie de regiunea geografic. n general, uleiurile sunt bogate n -pinen (11%), 1,8cineol (eucaliptol 46,4%) i camfor (11,4%), n timp ce uleiurile din Frana conin -pinen, 1,8cineol i acetat de bornil. Ali compui ntlnii sunt -pinen (9,2%), -cariofilen, camfen (5,2%),
limonen, mircen, borneol, aterpineol i 4-terpinenol (Offord, 2004).
Datorit toxicitii reduse comparativ cu pesticidele de sintez, biopesticidele, i ntre
acestea uleiurile volatile, sunt alternative valoroase de biocontrol.
3

Scopul acestei lucrri a fost evaluarea comparativ a activitii antimicrobiene al uleiului


volatil i extractelor de Rosmarinus officinalis, asupra unor tulpini fitopatogene din specia Erwinia
amylovora.

I. Erwinia amylowora caractere generele i patogenez


Caractere de cultur i morfofiziologice
Erwinia

amylovora,

agentul

etiologic

al

focului

bacterian,

aparine

familiei

Enterobacteriaceae. Din punct de vedere taxonomic se nregistreaz descrierea unor noi specii de
Erwinia i reclasificarea altora considerate ca aparinnd acestui gen. E. amylovora a fost primul
agent etiologic identificat la plante, la finalul secolului al XIX-lea, odat cu descoperiri similare n
domeniul patogenezei infeciilor umane sau animale.
Descrierea speciei conform Lelliott i Dickey (1984) este n prezent astfel: Erwinia
amylovora este Gram negativ (Fig. 1.), nesporulat, cu form de bastona cu capete rotunjite,
formeaz colonii albe pe agar nutritiv 5% , cupuliforme, strlucitoare, mucoide, cu striuri radiale i
un inel central ce se formeaz la 27C. Din aglutinarea Erwiniei cu antiser putem spune ca specia
este omogen i, serologic, are puine aglutinogene n comun cu specii nrudite sau cu saprofitele
gsite n esutul bolnav. Cauzeaz o boal necrotic (focul bacterian) la majoritatea Pomoideaelor i
unele subfamilii de Rosaceae, o form special fiind descris la zmeur. Procentul molar de G + C
al ADN-ului este cuprins ntre 53,6 54,1. Este facultativ anaerob, iar tulpinile hidrolizeaz
esculina. Toate tulpinile produc acid din sorbitol pe care il folosesc ca surs de carbon mpreun cu
acidul aspartic, acidul glutamic, asparagina, glutamina i -alanina pe cnd izoleucina, metionina i
treonina sunt utilizate ca surs de azot. Toate tulpinile sunt sensibile la furazolidon.

Fig. 1. Aspectul celulei de Erwinia amylovora la MO, imagine proprie

Caracterizarea biochimic permite o difereniere ntre speciile de Erwinia i anume:


motilitatea (datorit cililor peritrihi), creterea mucoidelor, cretere anaerob slab, amidonul este
hidrolizat rar, indolul este produs rar, nu reduce nitrai, nu degradeaz lactoza, reduc substane din
sucroz de care au nevoie n concentraii ridicate n mediul de cultur, produc acetoin (n culturi
agitate) i lichefiaz gelatina. n ceea ce privete producia de acid din comui organici, din 24 de
compui testai numai riboza i trehaloza au avut o reacie pozitiv constant n timp ce arabinoza i
sorbitolul au avut un rspuns pozitiv frecvent. Pentru o cretere ntr-un mediu minimal, E.
amylovora prezint o cerina obligatorie pentru acidul nicotinic.
S-au identificat 2 forme de tulpini: unele cu celule mici, mai virulente i unele cu celule
lungi, filamentoase, virulente, fagosensibile i produc mini-celule. Pe mediu nutritiv agarizat, cresc
colonii de tip S, mici, rotunde i albe. Bacteria produce un EPS acid i unul neutru. Cel neutru este
reprezentat preponderant de fructoz dar i levan-sucroz, cu rol n multiplicarea bacteriilor.
Formarea capsulei nu este un determinant al virulenei, existnd situaii n care o tulpin avirulent
capsulat rmne avirulent.
nveliul celulei prezint un nivel de sensibilitate atipic la o concentraie sczut de ageni
surfactani (novobicina, SDS) (Chatterjee et al., 1977). n acelai timp, o eliberare spontan a
enzimelor din spaiul periplasmatic n mediul extern sugereaz un defect n membrana extern a
bacteriilor, fiind presupus o legtur cu patogenitatea fr a putea fi dovedit.
Morfologia coloniei depinde de condiiile i mediul de cretere. Cel mai frecvent utilizat
este (Cct) fiindc are un nivel bun de selectivitate (Fig..)

Este compus din zaharoz i sorbitol ca surse de carbon i din ciclohexamid, violet cristal
i nitrat de taliu ca inhibitori. Coloniile crescute pe acest mediu prezint o morfologie distinct
5

(colonii netede, mari, pulvinate, albastru opalescent, cu cratere). Pe mediu pentru diagnostic,
Synthetic Nutrient Deficient Agar, formeaz colonii mucoide, rotunde, bombate. Deci dezvolt
caractere net diferite de ale altor specii prezente alturi de aceasta la nivelul leziunilor la plante
afectate de focul bacterian (Pseudomonas spp., E. herbicola).
Patogeneza la plante
O plant este sntoas sau normal atunci cnd ii poate efectua funciile fiziologice la cel
mai nalt nivel al potenialului su genetic (Agrios, 1978). Aceste funcii includ diviziunea celular,
diferenierea i dezvoltarea, absorbia apei i a substanelor minerale din sol i mobilizarea acestora
prin plant, fotosinteza i transportul produilor fotosintetizai n zonele de utilizare i stocare,
metabolismul compuilor sintetizai, reproducerea. Cnd ntre plant i un alt organism se stabilete
o relaie care duneaz gazdei este vorba despre o relaie de patogenez, manifestat prin simptome
de boal ce tulbur echilibrul fiziologic i structural al plantei. (Severin V., 1996)
nsuirile caracteristice ale unui organism patogen sunt: virulena, patogenitatea i
agresivitatea. Patogenitatea este capacitatea de a provoca boala, fiind o calitate intrinsec i
continu ce poate fi doar apreciat, nu i msurat (Grente, 1973). Virulena este expresia care
definete cantitativ gradul de patogenitate iar agresivitatea este nsuirea de a infecta un numr mai
mare sau mai mic de specii.
Bolile plantelor includ toate afeciunile care conduc la performane sczute ale plantelor sau
care reduc capacitatea plantei de a supravieui i de a se menine ntr-o ni ecologic.
Au fost identificate dou clase de factori care provoac boli la plante: biotici i abiotici.
Termenul de patogen se aplic agenilor biotici (bacterii, virusuri, fungi) care provoac cele mai
multe boli ale plantelor. Anomaliile genetice sunt eliminate prin selecie natural.
Reaciile plantelor la agenii patogeni pot fi descrise prin diferite grade de rezisten sau
sensibilitate.
Intensitatea rspunsului celular la un agent patogen este de obicei invers proporional cu
gradul de severitate al bolii suferite de ntreaga plant. Reaciile n care un numr limitat de celule
gazd sunt omorte rapid iar patogenul este cuprins ntr-o leziune necrotic localizat sunt denumite
hipersensibile. Aceasta poate fi privit ca o reacie celular extrem care poate conferi un grad
ridicat de rezisten la boli ntregii plante. Deoarece reaciile de hipersensibiliate reflect
incapacitatea de coexistare dintre plant i patogen sunt numite i reacii de incompatibilitate.
Reaciile n care patogenul se rspandete n interiorul plantei fr a omor celulele gazd sunt
denumite reacii compatibile, avnd ca rezultat susceptibilitatea ntregii plante. (Severin. V., 2011)
Conceptul de toleran definit ca fiind un tip de rezisten a plantelor la boli a fost enunat
de Scafer (1971). Plantele tolerante au capacitatea de a supravieui i de a se descurca la diferite
grade de infectare care la alte plante din aceeai specie provoac pierderi semnificative. Spre
6

deosebire de hipersensibilitate, tolerana nu depinde de capacitatea de a limita creterea i


dezvoltarea agentului patogen.
Patogeneza poate fi vzut ca o lupt ntre o plant i un agent patogen arbitrar din mediu
care poate fi influenat de o schimbare ct de mic ntr-un factor de mediu. n natur, aceti factori
sunt n principal condiiile climatice, proprietile fizico-chimice ale solurilor i microbiota de
suprafa a plantelor iar ei interacioneaz constant ntre ei i cu planta pentru a determina cursul
patogenezei. Bacteria Erwinia amylovora poate ataca toate organele aeriene ale plantelor. Boala
avanseaz rapid i spre frunzele vecine. Pe lstarul afectat apare frecvent cte o ulceraie. Frunzele
se vetejesc, inflorescenele infectate pot s cad sau s rman ataate de pom. Lstarii i
rmurelele sunt cele mai sensibile organe. Lstarii se ndoaie adesea de la vrf sub form de carj i
pot apare picturi de exsudat. Acesta poate avea culoare variat, de la alb pan la rou nchis, cu
nuane brun portocalii. Invazia bacteriilor se realizeaz direct prin lenticele n scoar, prin rni
sau prin vase. (Severin. V., 2011)

Fig. 2. Simptome ale fitopatogenului Erwinia amylovora (Agrios, 2004)

Evoluia bolii cuprinde 3 faze, fiecare cu simptome caracteristice: arsura inflorescenelor,


arsura lstarilor i dezvoltarea ulceraiilor (nu toate fazele apar n fiecare an).
1. arsura inflorescenelor este simptomul care apare primvara devreme prin infectarea direct a
florilor deschise. La nceput, floarea apare hidrozat apoi se ofilete i capt o nuan brun spre
negru, progresnd spre peduncul care pe vreme calduroas i umed exsudeaz picturi de lichid.
Exsudatul poate avea culoare variat, de la albicios pan la brun, rou nchis.

Fig. Infectia fructului, pedicelului si a ramurii, (Agrios, 2005)

2. arsura lstarilor. Fiind organe sensibile, infecia progreseaz rapid cnd condiiile sunt favorabile.
Lstarii pot fi infectai sistemic (intern, sunt pigmentai galben la vrf sau portocaliu nainte de
ofilire) sau extern (infectarea vrfului lstarilor vegetativi care se ofilesc i se ndoaie). Lstarii
bolnavi au frunzele moarte, persistente care apar prlite de foc, de unde i denumirea de foc
bacterian. Din esuturile bolnave se exsudeaz filamente cu aspect de reea incolor, de dimensiuni
variabile care pot fi desprinse de vrf i s disemineze patogenul.

Fig. Mar infectat cu picaturi de exsudat, (Agrios, 2005)

3. ulcere. Pomii care prezint sensibilitate la focul bacterian pot fi infectai pn la ramuri mai vechi
sau trunchi. Infecia coletului se produce prin rni iar arsura acestuia i a rdcinii duce adesea la
moartea pomilor. (Severin. V., 2011)
Focul bacterian prezint simptome care pot fi confundate cu semnele altor boli. Cea mai
frecvent confuzie se produce ntre focul bacterian i arsura bacterian provocat de Pseudomonas
syringae pv. syringae. Infeciile produse de E. amylovora asupra florilor ncep de la esuturile
nectarifere i se extinde la peduncul i ramuri iar vrfurile lstarilor se ncovoaie sub form de
carj, avnd loc exsudri dese. n cazul arsurii comune, aceasta rar se extinde spre peduncul sau
ramura dar apare o delimitare transparent ntre partea vie i cea necrozat a lstarilor, ulceraiile
ramurilor sunt mai deschise la culoare iar scoara se despic des. Cea mai important este ns
absena carjei la lstari. (Severin. V., 2011)

Fig. 3 Procesul de infectare i dezvoltare al focului bacteria cauzat de Erwinia amylovora (Agrios, 2005)

Cele mai multe studii de patogenez implic inocularea bacteriei n plant crend condiii
favorabile pentru dezvoltarea acesteia.

Stadiile patogenezei
1. Contaminarea
Patogeneza cauzat de ageni infecioi ncepe atunci cnd patogenul intr n contact cu o zon
sensibil, infectant, a plantei. Majoritatea infeciilor fungice i cele mai multe infecii bacteriene
iau contact cu planta prin intermediul sporilor din vnt sau din ap.
9

2. Invazia - prin rni sau deschideri naturale


Patogenii bacterieni colonizeaz i invadeaz esuturile plantei prinzone lezate, sau ci de acces
naturale, stomate, hidatode, lenticele sau nectarii. n general, bacteriile nu invadeaz celulele vii, ci
colonizeaz spaiile intercelulare i elementele sistemului vascular (excepie Rhizobium spp la care
infecteaz rdcinile leguminoaselor, penetrnd celulele gazdei i eliberndu-se n protoplasm).
(Severin. V., 2011)
3. Rezistena plantelor
Fiecare specie este susceptibil la atacul numeroilor parazii, iar o plant poate fi infectat
de mii de indivizi ai aceleiai specii patogene. Ca urmare a infeciei, plantele sunt prejudiciate ntr-o
anumit msur, dar uneori pot supravieui atacurilor i s i continue normal ciclul de dezvoltare
i reproducere. Acest fapt se datoreaz fenomenului de rezisten reprezentat de capacitatea plantei
de a preveni sau diminua procesul infecios, prin bariere fizice reprezentate de dverse caracteristici
structurale i prin iniierea rspunsului imun la contactul cu diveri patogeni (Daly 1976).
Prima linie de aprare fa de infecie este reprezentat de elementele de la suprafaa plantei. Factorii
structurali care contribuie la prevenirea infeciilor sunt:
-

Cantitatea i calitatea cerurilor care formeaz un strat hidrorepelent mpiedicnd formarea

unui film de ap n care bacteriile se pot multiplica;


Perii foliari, care n numr mare au acelai efect hidrorepelent;
Tipul structurii stomatelor poate s confere rezisten;
Grosimea i soliditatea pereilor celulari precum i prezena fasciculelor ntinse de celule
sclerenchimatice.

Chiar dac patogenii au reuit s nving barierele structurale preformate, plantele pot s
manifeste diferite grade de rezisten, opunndu-se mai mult sau mai puin invaziei patogenului.
(Severin. V., 2011)
4. Mecanisme de rezisten
Rezistena plantelor la boli depinde de capacitatea de a tolera un agent patogen sau s
restricioneze dezvoltarea acestuia. n unele cazuri, bariere fizice sau chimice impiedic potenialii
ageni patogeni s se stabileasc. De asemenea, este posibil ca modificrile papilare sau ale
peretelui celular ca rspuns la infecia trzie s previn unii patogeni din penetrarea sau stabilirea
lor n interiorul plantei. Uneori, un deficit n nutrienii necesari patogenului poate conferi rezistenta
la boala, dar foarte des penetrarea i dezvoltarea iniial a patogenului se produce la fel de repede n

10

organismele rezistente ca i n cele sensibile. n aceste cazuri, reaciile la boal depind de tipul
rspunsului indus de patogen. (Severin. V., 2011)

5. Modificri induse n reaciile la boal


Modificrile care apar ca reacie la boal att la plantele sensibile ct i la cele rezistente pot
fi induse printr-o tratare prealabil a plantelor cu o varietate de ageni biologici, fizici sau chimici.
Direcia schimbrii indus de acetia variaz n funcie de combinaia plant-patogen folosit. Au
fost realizate experimente cu plante inoculate nti cu un potenial patogen la care sunt rezistente iar
ulterior au fost inoculate cu un patogen la care sunt sensibile. Rezultatele au indicat c inocularea
iniial face planta rezistent unei provocri ulterioare la o form virulent n mod normal.
6. Inducerea rezistenei la bacterii
Interaciunile dintre bacteriile epifite patogene i nepatogene au fost cercetate att in vitro
ct i in vivo la E.amylovora i E. herbicola (bacterie nepatogen pigmentat galben ce se poate
izola de pe esuturile afectate). Dintre -glicozizii predominani n esuturile mrului i prului fac
parte arbutina i floridzina. Hidrochinona, care este un inhibitor al metabolismului oxidativ al E.
amylovora, poate fi eliberat rapid din arbutina prin aciunea -glucozidazei. Multe tulpini de E.
herbicola sunt capabile s exercite aceeai conversiune i manifest o remarcabil rezisten la
concentraii mari de hidrochinon, fapt ce nseamn c epifitul nepatogen poate contribui la
rezistena gazdei n faa focului bacterian (Zwet van i Keil, 1979).
Inocularea plantelor cu tulpini care nu sunt virulente a artat c planta poate dobndi o
rezisten mpotriva bolilor bacteriene. O protecie reistent similar a fost obinut cu bacterii
omorte termic (cldur) i cu extracte de celule infectate cu patogeni dar i prin etiolarea lstarilor
de peri care au artat c preparatele fr celule obinute prin tratament sonic a celulelor virulente i
nevirulente de E. amylovora ofer protecie mpotriva bolii. Cnd ADN-ul a fost extras, aceste
preparate i-au pierdut eficacitatea i activitatea artat nainte de extracie a putut fi justificat ntro fraciune de ADN bacterian purificat.
Goodman i colab (1974) au artat c procesul de patogenez la mr generat de E.
amylovora a fost, cel putin parial, o reflectare a toxigenitii acestui patogen. Ei au izolat de la
fructe verzi de mr, anterior inoculate cu un izolat virulent de E. amylovora, o toxin gazdspecific pe care au numit-o amilovorin. Aceasta este format din 98% galactoz polimerizat i
0,375% proteine, avnd un maximum de activitate la pH 7,8. Stoffl i col (1976) au separat
amilovorina n trei fraciuni, fiecare avnd o component proteic i una glucidic. Testele cu lstari
de mr au artat c numai partea zaharidic a indus ofilirea. S-a constatat o corelaie pozitiv ntre
11

toxigenitate i viruen deoarece un izolat avirulent nu a produs amilovorina n nici un fel de


condiii de cultivare.
La culturile sensibile, n cazul n care condiiile sunt favorabile (inclusiv cele climatice i
fiziologia copacului), boala poate avansa de la o floare infectat pn la rizom, omornd copacul
ntr-un sezon. Focul bacterian este o boal evolutiv, necrotic. Aceast capacitate de a avansa pe
distane lungi prin parenchimul cortical fr a produce nici o enzim care ar ajuta la dizolvarea
esuturilor este remarcabil, precum i capacitatea de a se rspndi i a supravieui n interiorul
esuturilor gazd dar neputina de a supravieui ca epifit. (Severin. V., 1996)

Protecia pomilor mpotriva focului bacterian


Protecia plantelor faa de E. amylovora este mai dificil datorit vitezei cu care se propag
bacteria i a agresivitii acesteia. Prevenirea are un rol deosebit, iar detectarea prematur a bolii
ofer anse pentru distrugerea total a focarelor (Corvi i colab., 1991). Astfel, cel puin dou
controale trebuie efectuate plantelor susceptibile a fi infectate. Este important s se cultive soiuri
rezistente sau cel puin tolerante. n general, eradicarea focarelor se realizeaz prin distrugerea
pomilor. Cnd nu este afectat tot pomul, se extirp organele cu simptome astfel fiind ndeprtate
inflorescenele bolnave, lstarii infectai, ulcerele hibernale i orice esut infectat n timpul
vegetaiei. Rnile rezultate la tiere vor fi dezinfectate (Sobiezewski i Suski 1988). Dac
ndeprtarea esuturilor ulceroase de pe trunchi este dificil sau necesit mult timp, suprafaa lor se
vopsete cu clorur de zinc sau sulfat de cadmiu.
O protecie eficient a fost obinut prin tratarea arsurii florilor cu oxiclorur de cupru dar i
hidroxid de cupru utilizat n timpul infloritului asupra puieilor de mr. Folosirea hidroxidului de
cupru 0,15% mpreun cu streptomicina a dat rezultate i mai bune, fiind principalul tratament
efectuat (Deckers i colab., 1990). Riscul este apariia de tulpini rezistente la antibiotice i gsirea
unor reziduuri n fructe, fiind potenial nocive pentru sntatea oamenilor, principalii consumatori.
Ulceraia i exsudatul
Ulceraia din anul precedent este cel mai bun autoinocul peste iarn (Beer i Norelli, 1977),
fapt confirmat cnd se gsete pe suprafa un exsudat bacterian. Acesta se scurge ncet, fiind
compus dintr-o matrice polizaharidic higroscopic, avnd un aspect vscos i lipicios sau se poate
usca precum o glazur tare i lucioas de culoarea chilimbarului. Sub umiditate relativ sczut,
bacteria poate supravieui n exsudatul uscat mai mult de un an. Aceste ulcera ii pot fi nedelimitate,
adic nu este o limit clar ntre esutul sntos i esutul bolnav, fiind mai susceptibile i
predispuse la producerea unei cantiti de exsudat mai mare dect n cazul leziunilor distincte. (Beer

12

i Norelli, 1977). Ulceraiile nedelimitate se dezvolt frecvent atunci cnd infeciile au loc cu
ntrziere, pe plantele tinere sau pe anumite soiuri.

1.3. Descrierea mecanismelor de patogenitate i virulen ale speciei E.


amylovora
Factorii de virulen asociai celulei bacteriene sunt implicai n procesele de aderen
bacterian i de colonizare. Aderena bacterian la esuturile gazdei este mediat de interaciunea
dintre molecule de tip adezine (factori de aderen) i receptori de adezine, interaciune bazat pe
principiul complementaritii spaiale (Chifiriuc i colab., 2007).
Muli factori de virulen ai E. amylovora au fost descrii, cei mai importani fiind:
sistemul secretor de tip 3 (T3SS), exopolizaharidele (EPS) amilovorina, formarea biofilmului i
motilitatea.
1.3.1 Factorii de virulen
E. amylovora este extrem de virulent i capabil de micare sistemic rapid n interiorul
gazdei vegetale, dar i de diseminarea rapid ntre specii de Rosaceae, inclusiv meri i peri, atunci
cnd condiiile de mediu sunt favorabile. Micarea intern a agentului patogen prin sistemul
vascular al plantelor precum i capacitatea de a infecta flori, muguri i portaltoii face ca gestionarea
focului bacterian s fie dificil (14, Koczan, J.M., 2011).
n anii 1980, dezvoltarea unor tehnici de biologie molecular au permis identificarea factorilor
implicai n patogenitate. (Vanneste, 1995) i s-a demonstrat c doar doi factori de virulen sunt
necesari pentru ca E. amylovora s infecteze i s declaneze boala asupra plantelor gazd:
amilovorina EPS i sistemul de secreie de tip III (T3SS) [20].
Polizaharidele extracelulare (EPS) joac un rol important n patogeneza multor bacterii prin
interacia direct cu celulele gazd, ocolind aprarea plantei i perturbarea i obstrucionarea
sistemului vascular al gazdei. (Koczan, J.M., 2011;).
Componenta principal din EPS la Erwinia amylovora este amilovorina, care este biosintetizat
i reglementat de mai multe grupuri de gene. Perturbarea produc iei de amilovorin elimin
patogenitatea n mutani.
Amilovorina s-a dovedit a fi principalul factor necesar pentru formarea biofilmului, levanul
fiind un factor ajutator [,24], cantitatea de amilovorin produs de tulpinile de E. amylovora fiind
corelat cu gradul de virulen [24,].
Mutanii care i-au pierdut capacitatea de a induce boli au fost sortai pe baza transpozonilor i
s-au identificat 3 grupe de gene: ams (implicate n sinteza amilovorinei), hrp (implicate n
patogenitate i n inducerea reaciilor hipersensibile n plantele care nu sunt gazde) i dsp (implicate
doar n progresia bolii). Amilovorina este un exopolizaharid complex format dintr-un numr mare
13

de uniti repetitive (Geider K., 2012). Compoziia n zahar i legturile dintre reziduurile de zahr
fac aceste uniti unice.
Amilovorina produs de E. amylovora este activ numai fa de plantele speciilor i soiurilor
sensibile la bacteria producatoare (Hsu i Goodman 1978). Toxinele pot fi grupate dup simptomele
pe care le produc n toxine care produc ofiliri, toxine necrozante i toxine care induc hipertrofii.
Proprietile amilovorinei i levanului

Fig. 4. Sinteza levanului prin levansucroz (Lsc) din sucroz n mediul bacterian. Enzima constitutiv secretat se
ataaz lanului de polimeri. Levanul poate proteja celulele i glucoza eliberat poate fi folosit ca i surs de carbon.
(Joel Vanneste, 2000)

Legturile intermoleculare i greutatea molecular a amilovorinei i levanului au fost


determinate prin mai multe tehnici (Fig. 4). Mrimea moleculelor a fost testat prin size exclusion
chromatography (SEC), multiangle light scattering (MALS) i pentru amilovorina i prin
ultracentrifugare analitic (Jumel i colab., 1997). SEC se bazeaz pe profilul de eluare a
moleculelor de mari dimensiuni ale porilor coloanei de permeaie n gel. MALS depinde de
capacitatea de molecule mari pentru a reflecta uor lumina. Ultracentrifugarea analitic a fost
folosit timp de muli ani pentru sedimentarea macromoleculelor de mari dimensiuni. Cu aceste trei
metode, greutatea molecular a amilovorinei a fost determinat ca fiind de aproximativ 1.0106 Da
(dimensiunea este dependent de condiiile de cretere) (Langlotz i colab., 1999). Creterea
E.amylovora pe plci de agar la 18C pare s mreasc greutatea molecular a amilovorinei,
comparativ cu o cretere la 28C, probabil din cauza ratelor diferite de determinare a lan ului
polizaharidic pentru aceste condiii. Stresul mecanic asupra culturii elibereaz EPS ata ate celulelor
ca o capsul, care ar putea determina scindarea moleculei.
Clusterul de gene implicat n sinteza amilovorinei produce 12 gene codificate ams. AmsC,
AmsH i AmsL se presupune c sunt implicate n transportul oligozaharidelor i n asamblare n timp
ce AmsA are o activitate tirozin-kinazic. Proteinele AmsB, AmsD, AmsE, AmsG, AmsJ i AmsK
joac un rol n reglarea diferitelor subuniti de galactoz, acid glucuronic i piruvil ctre purttorul
lipidic pentru a forma o unitate de amilovorin. AmsF poate procesa uniti repetitive nou
sintetizate (fig.5) i/sau pot fi implicai n polimerizare prin adugarea lor la un lan preexistent de
amilovorin. AmsI are o funcie distinct, n reciclarea transportului defosforilat dup eliberarea
unitii repetitive nou sintetizate. (24-31-33)

14

Fig. 5. Structura unittilor repetitive ale amilovorinei (Joel Vanneste, 2000)

Structura exact a unitii repetitive a amilovorinei - comanda i legturile de reziduuri de


zahar - a fost determinat prin mai multe metode, cum ar fi compoziia de zaharuri, analiza
metilrilor i rezonana magnetic nuclear (RMN) (Nimtz i colab., 1996).
Levanul este un alt EPS produs de E. amylovora, considerat ca fiind un cofactor de
virulen [Koczan, J.M., 2011; ,34]. S-a demonstrat c lipsa sintezei levanului poate duce la o
dezvoltare lent a simptomelor n planta gazd [24,35]. Interesant ns, n studii recente s-a
demonstrat c depolimeraza (DpoL1) codificat de fagul T7-like E. amylovora L1 degradeaz n
mod eficient amilovorina. Expunerea bacteriilor la oricare fag L1 sau DpoL1 recombinant a condus
la degradarea EPS i la un fenotip similar cu cel observat la mutani.
Analiza necesar izolarii monomerilor i dimerilor ale unitilor repetitive a fost realizat cu
EPS virale depolimerizate i separarea prin gel permeabil de cromatografie. Levanul a fost
identificat prin rezonan magnetic nuclear (Gross i colab., 1992), iar greutatea molecular a
levanului s-a determinat a fi aproximativ 5x106 Da (M. Schollmeyer, A. Huber i K. Geider,
nepublicat).
Sistemul de secreie III (T3SS) reprezint un determinant major de virulen i exprimarea lui este
asociat cu infecii invazive acute, cu citotoxicitate i cu mortalitate crescut la organismele
infectae, datorit translocrii directe a exotoxinelor bacteriene, numite i proteine efector, n
citoplasma celulelor gazd eucariote prin intermediul porilor formai la nivelul membranelor
plasmatice ale acestora (Gellatly i Hancock, 2013).
T3SS este un sistem cu mecanism one-step, care a fost descoperit la Pseudomonas aeruginosa
n 1996 (Filloux, 2011).
Sistemul de secretie de tip 3 (T3SS) (fig.6) este unul dintre cei mai importani factori de
virulen utilizai de E. amylovora pentru a infecta cu succes gazdele sale [24,36]. Ca i n cazul
15

alor bacterii Gram-negative fitopatogene, E. amylovora folosete acest sistem conservat evolutiv
pentru a exporta i livra proteine efectoare n citoplasma celulelor vegetale gazd printr-o structur
similar pilului care formeaz elementul central al T3SS. Pe parcursul livrrii, o protein chaperon
este legat la fiecare protein efector care protejeaz proteina efector de interaciunile premature cu
alte proteine. [24] Prin translocarea acestor proteine efector n celulele gazd, T3SS interfereaz cu
un semnal de transducie al celulei gazd i cu alte procese celulare, sporind astfel virulena
bacteriilor n celulele gazd sensibile.
Reglarea procesului de secreie a proteinelor efector se realizeaz la dou nivele:
transcrierea genelor sistemului T3SS care este controlat de proteina reglatoare ExsA, membru al
familiei de reglatori transcripionali AraC/XylS i iniierea procesului de secreie realizat prin
interaciunea celor 4 proteine reglatoare ExsA, ExsC, ExsD i ExsE. Atunci cnd secreia este
dezactivat, proteina ExsE se acumuleaz n citoplasma bacterian i leag proteina ExsC,
determinnd astfel legarea proteinei ExsD de proteina ExsA i blocnd transcrierea genelor
sistemului T3SS. Atunci cnd secreia este activat, proteina reglatoare ExsE este secretat n afara
celulei bacteriene, determinnd astfel legarea proteinei ExsD de ctre proteina ExsC. Legarea
proteinei ExsD elibereaz activatorul transcripional ExsA i are loc transcrierea genelor sistemului
T3SS (Hauser, 2009).
Sistemul T3SS este codificat de 36 de gene distribuite n 5 operoni organizai n clustere, iar
proteinele efector i proteinele chaperon sunt codificate de alte 6 gene distribuite la nivelul
cromozomului bacterian (Gellatly i Hancock, 2013).
Un numr mare de gene hrp codific pentru sistemul de secreie de tip 3. Au fost identificai 2
tipuri de factori secretai prin intermediul acestui aparat: harpine i factori aviruleni. Harpinele sunt
codificate de hrpN i hrpW, fiind similare la E. amylovora cu alte specii de fitopatogeni. Ele sunt
capabile s induc schimbri n metabolismul celular, ducnd astfel la moartea plantei. Factorii de
avirulen fac acelai lucru, oferind plantei gazd o gen de rezisten complementar. Mai multe
gene pentru aceti factori au fost identificate, dar de un interes deosebit sunt genele dspEF.
Sistemul T3SS al bacteriilor fitopatogene este alctuit din proteine Hrc codificate de gene
conservate hrp care induc rspunsul de hipersensibilitate i de patogenitate. La E. amylovora,
genele Hrp sunt grupate n clustere de aproximativ 20 de gene, una dintre ele codific un
constituent al membranei exterioare, n timp ce celelalte codific pentru sisteme de secreie de baz,
pentru gene de reglare, pentru harpins, pentru Hrp-pilina, care n unele bacterii este necesar pentru
funcia tipului III de secreie, pentru gene de avirulen (AVR) etc. Practic, ele sunt grupate ntr-o
insul care conine patru regiuni: o regiune hrc/hrp, un efector hrc, o regiune hrp pentru enzimele
asociate i o regiune de transfer [24,38].

16

Fig. 6. Reprezentare schematica a sistemului T3SS din bacteriile fitopatogene (Bttner i colab., 2009)

Astfel, patogenitatea E. amylovora se bazeaz pe acest sistem de secreie i pe un singur


efector DSPA/E care aparine familiei AVRE [37]. T3SS este compus dintr-un complex
macromolecular de form cilindric organizat ntr-o serie de structuri inelare interioare, exterioare
i o structur gt. Acesta este incorporat n membrana interioar i exterioar a bacteriilor n timp ce
ntind membrana periplasmic i se extinde n mediul extracelular cu un filament pilus [24,37].
Curli este componenta proteic major a matricei extracelulare produs de multe
Enterobacteriaceae, inclusiv E. amylovora. Fibrele Curli sunt cunoscute pentru implicarea n
aderena la suprafee biotice sau abiotice, agregarea celulelor i formarea biofilmelor. Ele pot media
aderena la celulele gazd, invazia lor i stimuleaz rspunsurile inflamatorii ale acesteia [19,40,41].
Fibrele Curli au un diametru de 4-6 nm i la fel ca alte fibre amiloid sunt bogate n structuri -pliate
care se autoasambleaz n polimeri de proteine rezistente la ageni chimici, temperatur i la
aciunea proteinazelor [41]. Studii recente au artat reducerea virulenei prin tergerea unui reglator
al genelor curli, crl, demonstrnd c nu numai ataamentul funcional ci i formarea biofilmelor
mature este necesar pentru infecia gazdelor [Koczan, J.M., 2011].
Formarea biofilmelor
n plus fa de rolul specific al amilovorinei i al levanului n formarea biofilmului de E.
amylovora, s-a descoperit c i fimbriile de tipul I, flagelii i pilii de tip IV pot contribui la formarea
biofilmului iar mutaiile aprute la genele care codific aceste anexe duc la o virulen sczut n
plant [Koczan, J.M., 2011].
Rezultate anterioare au artat c E. amylovora formeaz biofilme att in vitro ct i in
planta (Koczan, J.M., 2011,21). Patogenitatea i formarea biofilmelor sunt legate i s-a observat c
mutanii cu capacitate redus de formare a biofilmului nu pot stabili cu succes populaii mari n
xilemul mrului. Colonizarea xilemului este critic pentru micarea sistemic a patogenului prin
plant (Koczan, J.M., 2011, Burse, A., 2004).
17

ntr-un studiu n care s-a folosit o abordare a bioinformaticii i genomul secveniat al E.


amylovora (Koczan, J.M., 2011, Sebaihia, M., 2010; Smits, T.H., 2010), s-au identificat genele care
codific structurile de ataare la suprafaa celulei (Koczan, J.M., 2011). Un test de evoluie n timp a
indicat faptul c fimbriile de tip I funcioneaz n ataarea timpurie n timp ce pilii de tip IV par s
funcioneze ntr-un stadiu tardiv al atarii. Reducerea fimbriilor de tip I conduc la o scdere
semnificativ a virulenei la E. amylovora. Prin tergerea genelor individuale i a clusterelor
folosind o combinaie de teste in vitro a virulenei i atarii s-a demonstrat existena mai multor
structuri prezente la E. amylovora care joac un rol important n formarea biofilmului matur. n
schimb, nu este necesar un biofilm matur pentru supravieuirea i creterea plantei. (Koczan, J.M.,
2011).
Motilitatea
E. amylovora este un agent patogen capabil s supravieuiasc n afara gazdei n condiii de
nfometare, reuind s se rspndeasc prin diferite mijloace, cum ar fi apa de ploaie [46]. De fapt,
mecanismele de motilitate s-au dovedit a fi relevante pentru supravieuirea bacteriilor n exteriorul
gazdei [46] i, de asemenea, pentru ataarea la suprafeele celulei gazd, mpreun cu al i factori de
virulen ca pilii de tip IV, fimbriile de tip I i curli prin formarea biofilmului (Koczan, J.M., 2011).
ntr-un studiu n care dou dintre cele patru grupuri de gene care codific producerea i
reglarea flagelilor n E. amylovora au fost terse, s-au descoperit diferite efecte ale flagelului asupra
formrii biofilmelor i virulenei. Rezultatele obinute, de asemenea, au artat c producia flagelilor
pare s fie controlat de mai multe clustere de gene care pot func iona independent. n consecin ,
s-a sugerat c flagelii E. amylovora au funcii multiple n procesul de formare a biofilmului
(Koczan, J.M., 2011).
Rspunsurile E. amylovora la nfometare au relevat faptul c celulele au pierdut motilitatea,
dar cele mai multe dintre ele expun flageli peritrichi lungi ataati la suprafaa bacterian. Inactivarea
motilittii n timpul foametei ar fi reversibil, deoarece flagelii ar putea permite o recuperare rapid
a motilitii n condiii favorabile [46].
Metaloproteaza PrtA
Metaloproteaza PrtA cu mas molecular de 48 kDa, este secretat de E. amylovora n
mediul extern prin calea de secreie tip I prin PrtD, PrtE i PrtF, care mprt esc mai mult de 90%
identitate cu aparatul secretor pentru lipaz din S. marcescens [50].
Organizarea cluster-ului genelor de proteaze n E. amylovora este diferit de cea n alte bacterii
Gram-negative, cum ar fi Erwinia chrysanthemi, Pseudomonas aeruginosa i Serratia marcescens.
PrtA a fost identificat ca fiind un membru al subfamiliei metzincin metaloproteazelor-legate de

18

zinc, nalt conservt, confirmat ca fiind proteaza de 48 kDa pe geluri prin secven ierea
fragmentelor peptidice triptice derivate din proteine [50].
Pompa de eflux multidrog AcrAB
n timpul patogenezei, E. amylovora este expus la o varietate de compui antimicrobieni
toxiinfecioi pentru plante, care, n cazul Rosaceaelor, sunt sintetizate ca isoflavonoizi constitutivi
(Burse, A., 2004).
Apoi, transportorii pompei de eflux bacteriene, care mediaz rezistena structural pot
conferi toleran la unii compui antimicrobieni numiti fitoalexine. n aceast privin , s-a observat
c clonarea locusului AcrAB din E. amylovora, care codific modularea rezistenei sistemului de
transport n E. coli confer rezisten la hidrofobicitate i la toxinele amfifile. Unei tulpini de de E.
amylovora cu o mutaie n gena punctiorm acrB i-a fost afectat virulena pe mr portaltoi i a fost
susceptibil fa de extracte din frunze de mr, precum i la fitoalexine, floretin, naringenin,
quercetin, i (+) - catechin. Aceste rezultate sugereaz cu trie c sistemul de transport AcrAB
joac un rol important n complexul de proteine necesare pentru virulen. (Burse A., 2004)
1.3.2. Suportul genetic al factorilor de virulen
Genomul E. amylovora const dintr-un cromozom circular 3805874 bp i dou plasmide:
AMYP1 (28243 bp), raportat ca PEA29, iar plasmida AMYP2 mai mare (71487 bp) numit
pEA72. Dimensiunea mic a genomului E. amylovora (3.8 Mb) n comparaie cu celelalte
enterobacterii, inclusiv agenii patogeni ai plantelor, cu genomurile de 4,5-5,5 Mb i preponderent
pseudogenele, reducerea genomului poate fi produs prin inactivarea mutaional i tergerea
ulterioar i conduce la pierderea celor mai multe gene implicate n respiraia anaerob i
fermentaie gsite n enterobacteriile tipice, legate, cu reducerea consecvent a capacit ii de a tri
n medii anaerobe. Secvena genomului E. amylovora a scos la iveal semne clare de patoadaptare
la mediul plantelor Rosaceae. De exemplu, proteinele T3SS legate sunt mai asemntoare cu
proteinele altor ageni patogeni ai plantelor dect proteinele de enterobacterii strns nrudite
(Sebaihia, M., 2010)
n comparaie cu ali ageni patogeni de plante, cu toate acestea, E. amylovora are o
diversitate genetic relativ sczut, cu o recombinare genetic limitat, aceasta fiind asociat cu
expunerea limitat la presiunile de selecie din cauza fructelor, favoriznd strategic soiuri nalt
apreciate, care sunt adesea foarte sensibile la focul bacterian [20,61,62].
Interesant este c secvenierea genomului a trei tulpini mexicane de E. amylovora au relevat
o mutaie rpsL care confer la nivel cromozomal un grad ridicat de rezisten la streptomicin [63].
Aceast mutaie cromozomal este mecanismul predominant care apare n mod obinuit dup ani de
aplicare intensiv cu persisten ndelungat n populaiile de E. amylovora [10,63], explicnd
19

ineficacitatea observat de streptomicin n Mexic [63,64] i subliniind necesitatea revizuirii


strategiilor de utilizare a pesticidelor, pentru a evita evoluii similare ale rezisten ei fa de alte
medicamente antimicrobiene ca oxitetraciclin sau gentamicin [63].
Expresia genelor legate, stres oxidativ, motilitate, patogenitate i virulen au fost detectate
pe ntreaga perioad experimental, cu modele diferite de reglare observate n timpul primelor 24 de
ore. Mai mult, celulele nfometate au rmas la fel de virulente ca celulele nestresate. n general,
aceste rezultatele ofer noi cunotiine privind biologia E. amylovora n condiii naturale, care ar
putea contribui la o mai bun nelegere a ciclului de via al acestui agent patogen [46].
Trei clustere de gene legate de sistemul secretor de tip 6 (T6SS), au fost de asemenea
identificate n E. amylovora [20,43], cu toate c rolul lor exact n aceast specie nu este cunoscut
[20]. n alte bacterii, T6SS s-a dovedit a juca un rol semnificativ n interaciunile bacterie-bacterie i
interaciunile bacterie-gazd, sugernd un rol pentru specializarea de ni [67].
Pentru a stabili cu succes o infecie, E. amylovora folosete o reea de reglare complex
pentru a sesiza semnalele din mediu i s coordoneze expresia stadiilor precoce i tardive ale
factorilor de virulen prin implicarea a dou sisteme de transducie a semnalelor, bis-(3-5)- diGMP ciclic (c-di-GMP) i quorum sensing.

1.3.3.Reglarea factorilor de virulen


Sistemul de transducie din dou componente
Sistemul de transducie din dou componente (phoPQ) a fost caracterizat genetic n E.
amylovora i s-a demonstrat c are un rol major n virulena asupra perelor care nu au ajuns la
maturitate, n reglarea biosintezei de amilovorin i n motilitate. Mutanii phoPQ s-au artat mai
rezisteni la condiii de aciditate puternic (pH 4,5 5) fa de cei de tip slbatic, sugernd c acest
sistem regleaz negativ expresia genei de rezisten la acid. Sistemul phoPQ poate aciona ca o
parte a unei reele de reglare care controleaz E. amylovora ntr-o mare varietate de funcii celulare
i sporindu-i supravieuirea n timpul schimbrilor din mediu (Nakka, S., 2010).

Small RNA
Recent, diferite cantiti mici ARNs reglatoare care necesit un ARN nsoitor att pentru
stabilitate ct i pentru activarea funcionalitii au fost identificate n E. amylovora, unele dintre ele
fiind implicate n reglarea diverselor caractere de virulen. Dei au fost recunoscute multe ARNs
ca mediatori n bacterii, identificarea genomului pe scar larg a acestui ARN a fost realizat ntr-un
numr limitat de bacterii (Zeng, Q., 2014).

20

Quorum Sensing
Sistemele de quorum sensing au fost descrise la E. amylovora, att QS-1 ct i QS-2
bazndu-se pe un semnal autoinductor lactone N-homoserina 1 (AI-1) iar QS-2 pe enzima luxS (AI2) responsabil pentru semnal. Dei luxS nu afecteaz quorum sensing-ul la E. amylovora, unele
tulpini au activitate dependent de AI-2 i inactivarea ei determin inactivarea unor fenotipuri,
inclusiv a virulenei (Gao, Y., 2009).
Folosirea analizelor genomice comparative pentru a cuta gene omoloage implicate, au fost
identificate gene care corespund sistemului de semnalizare Epinefrina/Norepinefrina la E.coli. n
mod deosebit, omologii sistemului cu dou componente QseEFEa i reglatorul transcripional QseA
sunt bine conservate la E. amylovora. Experimentele au artat c sistemul QseEFEa este implicat n
reglarea motilitaii de roire, biosinteza amilovorinei i formarea biofilmelor (Castiblanco, L.F.,
2011).

Patogenitatea enzimelor bacteriene care degradeaz pereii celulari


Pereii celulelor sunt compui din trei polizaharide majore: celuloz, hemiceluloz, pectine
i, n unele lemnoase, lignin. Numrul genelor care codific enzime celulare ce degradeaz
peretele variaz foarte mult n unele bacterii fitopatogene: erwiniile produc o gam mai larg de
enzime capabile pentru a degrada componentele peretelui celular dect oricare alte bacterii
patogene din plante. Enzimele includ pectinaze, celulaze, proteaze i xilanaze. Pectinaze sunt
considerate a fi cele mai importante n patogenez, deoarece acestea sunt responsabile pentru
macerarea esuturilor prin degradarea substanelor pectice din lamela mijlocie i, n mod indirect,
pentru moartea celulelor. Patru tipuri principale de pectine degradatoare sunt 3 enzime
produseliaz pectat(Pel), pectinliaz (Pnl), i pectin de metil esteraza.Pme)), cu un nivel ridicat al
pH-ul optim (~ 8,0) i poligalacturonaz, cu un pH optim de ~ 6. Toi sunt prezeni n multe forme
sau izoenzime, fiecare codificate de gene independente.
Activitatea enzimatic joac un rol important n penetrarea peretelui celular. Apsarea
intern a cuticulei este adesea observat dar poate apare cu greu dac straturile inferioare ale
peretelui celular nu au fost supuse dedurizrii sau degradrii pariale.

Mecanisme de patogenitate
Armele chimice ofensive utilizate de patogenii plantelor includ enzime, factori de cretere i
toxine. Att plantele ct i agenii patogeni pot produce toate cele 3 tipuri de chimicale. Uneori,
enzimele i factorii de cretere produc efecte toxice.
I.

Enzime
21

Enzimele bacteriene pot fi clasificate dup compoziia chimic, dup procesul chimic catalizat
i dup modalitatea de apariie. Dup compoziia chimic, enzimele pot fi holoproteice,
metaloproteice i heteroproteice. Din punct de vedere al procesului biochimic pe care l catalizeaz,
la bacteriile fitopatogene au fost cercetate mai mult hidrolazele, dintre care glicozidazele, proteazele
i enzimele oxidante. Glicozidazele ntlnite frecvent la fitopatogeni sunt amilaza, pectinaza i
celulaza. n cazul Erwiniei, se ntlnesc pectinazele care hidrolizeaz diverse pectine,
descompunnd lamelele mediane pectice ale membranelor celulelor plantelor gazd, fapt ce duce la
apariia de putregaiuri moi i macerri. (Severin V., 1996)
Glucozidaza este o enzim interesant deoarece rezult din formarea glucozei i hidrochinonei
din arbutin, un compus comun n mr. Formarea hidrochinonei este semnificativ fiindc este
toxic pentru bacterie (Hildebrand and Schroth, 1979). Hidrochinona acioneaz prin inhibarea
succinatului, D-lactat, DL-malonat i NADH (n prezena oxigenului), inhibnd astfel creterea
bacterian. S-a artat ca E. amylovora are o activitate glucozidazic slab dependent de mediul de
cretere.
Expresia genelor care codific la E. amylovora enzimele pectice i izoenzimele este
secvenial. Acest lucru sugereaz c genele sunt reglate separat. n plus, exist sisteme globale de
reglare, cum ar fi sistemul de detectare quorum, astfel nct se maximizeaz activitatea enzimatic
principal. Din cauza numrului mare de pectinaze implicat, mutaia genei care codific una din
enzime nu este suficient pentru a opri macerarea celulei.
Simptomele se dezvolt atunci cand o populaie de Erwinia ajunge la o densitate celular
dependent de reglare sau de sistemul de detectare quorum (sistem de enzime extracelulare).
Producia de enzime este activat atunci cnd numrul bacteriilor i homoserin inductor bacterii
secretoare de lactoz (HSL) au atins un nivel critic. Perturbarea genei hsl sau adugarea unei gene
care codific enzima ce descompune hls conduce la producerea mutanilor cu patogenitate redus.
Probabil, detectarea prin quorum permite bacteriilor s se multiplice n cadrul esutului gazd fr a
declana rspunsuri de rezisten, cum ar fi producia de fitoalexine. n general, enzimele de
degradare ale peretelui sunt considerate a juca un rol n patogenez prin facilitarea invadrii
esutului de colonizare, dar ele sunt factori de virulen responsabili pentru dezvoltarea simptomelor
o dat ce creterea bacteriei a fost iniiat.
Pentru a degrada structuri complexe cum sunt pereii celulelor necesit o baterie enzimatic care
acioneaz fie secvenial, fie constant. Metodele imbuntaite pentru separea amestecurilor de
enzime au avut ca rezultat preparate rafinate capabile de solubilizarea componentelor individuale
ale pereilor celulari ai plantelor.
Degradarea complet a pereilor celulari necesit enzime celulozolitice, hemicelulozolitice,
pectolitice i proteolitice capabile s atace fiecare dintre componentele polimerice majore. Cu toate
c fiecare enzim atac substratul, numai cele pectolitice apar efectiv n iniierea degrdarii
22

pereilor celulari iar unele au fost asociate cu efecte letale n timpul patogenezei. Enzimele pectice
sunt de 2 tipuri:
-

pectic-metilesteraze, care ndeprteaz gruprile metoxil din pectin i se obine acid pectic
enzime care taie lanurile, clivnd legturile ex-I, 4-glicozidice care leag uniti de acid
uronic de polimerii pectici. Aceste enzime sunt imprite n: hidrolaze (scindeaz legturi
prin hidroliz) i liaze/trans-eliminaze (cliveaz legturile prin trans-eliminare).

II.

Factorii de cretere

Simptomele brute singure implic activitatea anormal a reglatorilor de cretere n multe boli
ale plantelor. Extracte de esuturi care prezint astfel de modele de cretere anormale sunt de 10 ori
mai active la testele pentru substanele de reglare a creterii dect sunt extractele din plante
sntoase. Toate tipurile majore de reglatori de cretere pentru plante (auxine, gibereline, citokine,
etilena) sunt produse de diveri ageni patogeni bacterieni sau fungici, evidenind astfel rolul lor n
boli dar nu i in debutul bolii.
III.

Toxine

Focul bacterian la mere i alte specii de Rosaceae este o boal extrem de distructiv cauzat de
E. amylovora. S-a demonstrat c exsudatul din feliile de mere verzi inoculate cu tulpini virulente
ale acestui patogen este toxic n mod selectiv pentru plantele susceptibile imbolnvirii. (Goodman i
colab. 1974). Un preparat rafinat al toxinei conine 98% galactoz n form polimeric i ~ 0,4%
proteine. Toxina, considerat a fi un produs al interaciunii dintre plant i patogen, a fost denumit
amilovorin. Cu toate c a fost inclus n categoria patotoxinelor, toxicitatea sa selectiv se bazeaz
exclusiv pe efectul de ofilire care nu poate fi considerat un semn distinctiv al boli.

Compoziia lipidic a nveliurilor celulare


Membrana extern a bacteriilor Gram-negative constituie o interfa ntre celul i mediul
extern, astfel lipopolizaharidelor (LPS) care sunt situsuri pentru recunoaterea specific a factorilor
externi. Fracia de lipide este compus din glucozamin, fosfat i 3 acizi grai (comuni
enterobacteriilor). Fracia carbohidrailor este compus dintr-un lan scurt de zaharuri (fucoz n
configuraie D, glucoz, galactoz), un miez care conine oligozaharide (heptoz, glucoz i acid
uronic), compui amino i acid 3-deoxi-2-octulosonic (KDO) i glucofuranoz. S-a constatat
absena unui lan lateral pentru mutantele rezistente la fagi.

23

II. PARTE PRACTIC - Studiul efectelor unor extracte vegetale naturale


asupra bacteriilor fitopatogene apartinand speciei E. amylovora
Scopul acestei lucrri a fost evaluarea comparativ a activitii antimicrobiene al uleiului
volatil i extractelor de Rosmarinus officinalis, asupra unor tulpini fitopatogene din specia Erwinia
amylovora.
Pentru atingerea acestui scop au fost propuse urmtoarele obiective specifice:
caracterizarea fenotipic a bacteriei
evaluarea prin citometrie n flux a mecanismelor de virulen i patogenitate

screening-ul calitativ al sensibilitii bacteriene fa de extractele vegetale cu

potenial aciune antimicrobian


Analiza cantitativ a activitii antimicrobiene a uleiului volatil i a unor extracte
alcoolice i apoase din R. officinalis prin metoda microdiluiilor i determinarea

concentraiei inhibitorii fracionate (FIC)


Determinarea influenei extractelor vegetale asupra hidrofobicitii nveliurilor
celulare

II.1. Materiale i metode


Lucrarea a fost realizat n cadrul Institutului de Cercetri al Universitii din Bucureti.
II.1.1. Tulpini bacteriene
n studiul de fa s-au utilizat 4 tulpini de E.
amylovora din colecia Laboratorului de Microbiologie, Catedra Botanic-Microbiologie a
Universitii din Bucureti.
II.1.2. Obinerea extractelor vegetale
Extractele vegetale testate s-au obinut din herba R. officinalis, material vegetal uscat.
Nr. crt. Tipul de extract
1
Infuzie
2

Decoct

Macerat

Tinctur

Ulei volatil

Metoda de extracie
Infuzare 50 g plant/ 100mL ap
distilat
50 g plant/ 100 mL ap distilat la
fierbere
Extracie etanolic (etanol 60%) 50 g
plant/ 100 mL etanol
Extracie etanolic (etanol 80%) 50 g
plant/ 100 mL etanol
Hidrodistilare (aparat Neo-Clevenger)
100 g plant
24

6
Nr.

Eucaliptol
Tulpina

crt.
1
2
3
4

E. amylovora 48/1
E. amylovora 45/4
E. amylovora 42/2
E. amylovora P15/1

Furnizor: Sigma - Aldrich

II.1.3. Screening-ul calitativ al sensibilitii bacteriene fa de extractele vegetale cu poten ial


aciune antimicrobian s-a realizat prin metoda difuzimetric adaptat. Suspensiile bacteriene au
fost realizate din culturi tinere de 18-24 h, cultivate pe mediu Mller-Hinton i ajustate la o
densitate de 1,5*108 UFC/mL, utiliznd standardul (nefelometric) de turbiditate 0,5 McFarland.
Dispunerea uleiului volatil i a standardelor analitice s-a realizat folosind tehnica n spot. Spoturile
au avut volum de 10L i au fost realizate din soluii diluate 1:1 ulei volatil/ standard
analitic:DMSO (pentru facilitarea difuziei n mediul de cultur a componentelor nepolare),
respectiv extract alcoolic/ apos nediluat.
II.1.4. Analiza cantitativ s-a realizat cu ajutorul diluiilor seriale binare n mediu lichid
(bulion Mller-Hinton), folosindu-se plci pentru microtitrare cu 96 de godeuri, n vederea
determinrii concentraiei minime inhibitorii (CMI). CMI este concentraia minim de ulei volatil
capabil s inhibe creterea microbian, apreciat macroscopic prin absena turbiditii mediului de
cultur cu coninut de ulei volatil, nsmnat i incubat 24h.
Uleiul volatil i standardul analitic solubilizate n DMSO s-au diluat serial binar n
intervalul de concentraii 0,03-62,5L/mL, iar extractele alcoolice n intervalul 0,04-100 L/mL.
II.1.5. Determinarea concentraiei inhibitorii fracionate
Determinarea concentraiei inhibitorii fracionate (FIC) s-a realizat prin raportarea CMI ulei
volatil/ CMI standard analitic. FIC este un parametru important n aprecierea cantitativ a
sinergismelor de aciune ntre diversele combinaii de substane cu activitate antimicrobian, care
poate fi utilizat pentru determinarea sinergismului de aciune n amestecuri complexe cum sunt
uleiurile volatile [Essential oils with microbicidal and antibiofilm activity. Saviuc CM, Drumea V,
Olariu L, Chifiriuc MC, Bezirtzoglou E, Lazr V. Curr Pharm Biotechnol. 2015;16(2):137-51].

II.1.6. Determinarea influenei extractelor vegetale asupra hidrofobicitii la celulele


planctonice
Pentru aprecierea comparativ a hidrofobicitii nveliului celular pentru celule
planctonice n prezena amestecurilor fitochimice (protocol adaptat dup Gora, 2010; Qiao, 2012)
s-au realizat urmatoarele etape: Qiao G., Li H., Xu D.-H., Il Park S., 2012, Modified a colony
25

forming unit microbial adherence to hydrocarbons assay and evaluated cell surface hydrophobicity
and biofilm production of Vibrio scophthalmi, Bacteriology & Parasitology, 3(1): 130
doi:10.4172/2155-9597.1000130;Gora A.B., Yao J., Sandy E.H., Zheng S., Zaray G., Koroma
B.M., Hui Z., 2010, Cell surface hydrophobicity (CSH) of Escherichia coli, Staphylococcus
aureus and Aspergillus niger and the biodegradation of Diethyl Phthalate (DEP) via
microcalorimetry, Journal of American Science, 6(7): 78-88;
s-au realizat concentraii corespunztoare valorilor CMI/4 de amestec

fitochimic cu mediul la un volum final de 1mL;


s-au nsmnat toate tuburile Eppendorf cu 200 L inocul microbian
de densitate standard 0.5 McFarland (pentru realizarea experimentului

s-au utilizat controale negative, pozitive) i s-au incubat 1h la 37oC;


dup incubare celulele bacteriene au fost splate cu AFS (program
centrifug: 10 min, 10000 rot/min), sedimentele au fost reluate n

AFS i vortexate 120 sec.;


s-a citit spectrofotometric absorbana la =620 nm (A0);
peste suspensia microbian rmas s-au adugat 0.5 mL izooctan i sa vortexat 120 sec.; probele au fost lsate n repaus 60 min (moment
n care cele dou faze se separ complet), se preia cu o pipet Pasteur
faza organic i se citete abosrbana la =600 nm (A1) a fazei apoase.

Tehnica s-a executat comparativ pentru celule planctonice i celule tratate cu extracte vegetale.
Hidrofobicitatea suprafeei celulelor bacteriene a fost exprimat ca aderen procentual (%Adh)
folosind formula:

%Adh = [1-(A1/A0)] x 100.

II. 1. 7. Evaluarea influenei uleiurilor volatile i a standardelor analitice asupra activitii


pompelor de eflux bacteriene
Evaluarea influenei extractelor vegetale i a standardului analitic asupra activitii
pompelor de eflux bacteriene s-a realizat prin tehnica citometriei n flux: determinarea viabilitii
celulare prin marcare cu iodur de propidiu i evaluarea activitii pompelor de eflux bacteriene
prin marcare cu bromur de etidiu.
Citometria n flux reprezint o metod analitic de msurare simultan a caracteristicilor
fizice i moleculare ale diferitelor celule i n acelai timp de sortare a celulelor. Metoda se bazeaz
pe msurarea dispersiei luminii fa de radiaia laser incident - FSC forward scatter la unghiuri
mici (210), corelat cu dimensiunea celulelor i SSC side scatter la unghiuri de 90, corelat cu

26

complexitatea celular i granularitatea citoplasmatic - i a parametrilor de fluorescen, atunci


cnd un flux laminar liniar de celule trece prin dreptul unui fascicul laser la un unghi drept.
Fluorocromii sunt substane chimice care au proprietatea de a absorbi lumin la o anumit
lungime de und i de a emite lumin la o lungime de und mai mare (cu o energie mai joas).
Iodura de propidiu i bromura de etidiu sunt fluorocromi cu specificitate pentru ADN, care se
intercaleaz n structura dublu-helical a acestuia, determinnd o cretere a fluorescenei (Davey i
Kell, 1996).
Iodura de propidiu este un fluorocrom intercalant cu formula chimic diiodur de 3,8diamino-5-dietilmetilamino-propil-6-fenilfenantridium (figura ...) i cu un spectru de absorbie la
(300 650) nm i un spectru de emisie la (550 724) nm (figura ). Este folosit pentru
determinarea viabilitii celulare, deoarece celulele vii sunt impermeabile pentru acest colorant
datorit integritii membranelor.

Fig. 7. Iodura de propidiu i bromura de etidiu formule chimice (adaptat dup


www.wikipedia.org)
Bromura de etidiu este un fluorocrom cu formula chimic bromur de 2,7-diamino-9-fenil10-etilfenantridinium (figura ...) i cu un spectru de absorbie in intervalul 400 nm 625 i un
spectru de emisie 525 750 nm (figura ...). Este folosit pentru detectarea i cuantificarea activitii
pompelor de eflux bacteriene, datorit proprietii sale de a emite o fluorescen slab n afara
celulelor i o fluorescen puternic prin acumularea intracelular. Intensitatea fluorescenei
reprezint astfel o msur a coninutului celular de bromur de etidiu i un raport net ntre influxul
de bromur de etidiu datorit permeabilizrii peretelui celular bacterian i eliminarea extracelular a
acesteia datorit activitii pompelor de eflux (Martins i colab., 2013).

27

Fig. 8. Iodura de propidiu i bromura de etidiu spectre de absorbie i de emisie


(adaptat dup www.lifetechnologies.com)

Cultura microbian dezvoltat n plac cu 96 de godeuri se recolteaz n tuburi Eppendorf,


din godeurile CMI/8. Tuburile au fost centrifugate la 13.000 rpm timp de 3 minute. Se ndeprteaz
supernatantul i sedimentul se spal cu 300 L AFS. Tuburile au fost din nou centrifugate la 13.000
rpm timp de 3 minute. Supernatantul este ndeprtat, iar sedimentul se resuspend n 300L AFS i
se mparte n dou probe, pentru marcarea cu cei doi fluorocromi: 5 L iodur de propidiu pentru a
obine o concentraie final de 0,5 g/mL, sau cu 10 L bromur de etidiu, pentru a ob ine o
concentraie final de 1 g/mL. Apoi tuburile au fost incubate timp de 10 minute la 4 oC i la
ntuneric. Probele marcate s-au diluat cu 100 L AFS filtrat i s-au citit la citometrul n flux.
Martorii pozitivi pentru celule viabile au fost realizai din suspensii microbiene de 1,5 x 10 8
CFU/mL marcate cu iodur de propidiu sau bromur de etidiu.
Martorii negativi au fost realizai din suspensii bacteriene de 1,5 x 10 8 CFU/mL tratate
termic (termobloc QBD1 Grant, 100C timp de 30 de minute). Probele s-au marcat cu iodur de
propidiu sau bromur de etidiu.
Achiziia de date s-a realizat cu citometrul FACS Calibur. Pentru analiza statistic a fost
utilizat software-ul de analiz al citometrului BD CellQuest Pro v.4.0.2.

28

Fig. 9. Citometru n flux FACS Calibur

II.2. Rezultate i discuii


Determinarea activitii antimicrobiene.
Screening-ul calitativ al activitii antimicrobiene prin metoda difuzimetric nu poate fi considerat
metod semicantitativ, datorit absenei studiilor care s ateste profilul de difuzie al compu ilor
prin mediu i stabilirea concentraiilor descresctoare, invers proporional cu diametrul de difuzie.
Efectul bactericid, adic inhibiia creterii bacteriene, a fost cuantificat prin msurarea diametrului
zonelor lipsite de cretere microbian n jurul spotului (fig. ...) i s-au reprezentat grafic.

Fig. Erwinia amylovora 45/4, determinarea calitativ a activitii antimicrobiene (3) 60% etanol macerat; (4)
80% etanol tinctur; (5) 60% etanol macerat US; (6) 80% etanol tinctur US

Extracie
cu US

29

E. amylovora 15/1
14
12
10
8
6
4
2
0
diametrul zonelor de inhibiie (mm)

variante experimentale

E. amylovora 48/1
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
diametrul zonelor de inhibiie (mm)

variante experimentale

30

E. amylovora 42/2
25
20
15
10
5
0

Extracie
cu US

diametrul zonelor de inhibiie (mm)

variante experimentale

E. amylovora 45/4
16
14
12
10
8
6
4
2
0

Extracie
cu US

diametrul zonelor de inhibiie (mm)

variante experimentale

Extractele apoase nu au avut activitate antimicrobian asupra tulpinilor testate. Extractele


vegetale etanolice i uleiul volatil/ eucaliptolul au avut activitate antimicrobian cuantificabil
asupra tulpinii E. amylovora 15/1. Tulpina E. amylovora 48/1 a fost sensibil doar la uleiul volatil/
standardul analitic. Aciunea extractelor s-a dovedit a fi dependent de tipul de extract/ extracie, cu
excepia tulpinii rezistente 48/1. Activitate antimicrobian superioar au avut uleiul volatil i
standardul eucaliptol, iar pentru extractele etanolice s-a observat un efect superior n cazul extraciei
cu etanol 80%. La extractele etanolice a fost favorizat extracia compuilor bioactivi prin utilizarea
US n procedeul de extracie, activitatea antimicrobian fiind mbuntit.
31

n ceea ce privete influena asupra capacitii de aderen la substrat inert a tulpinilor de E.


amylovora, nu s-a demonstrat influena concentraiilor subinhibitorii ale extractelor (CMI/2). Se
poate presupune c efectul antimicrobian a fost un efect microbicid direct, probabil prin
permeabilizarea nveliurilor celulare.

Fig. 8. Evidentierea concentratiei minime inhibitorii prin metoda microdilutiilor la tulpinile studiate

Determinarea CMI a relevat valori minime ale CMI pentru extractele de tipul UV i eucaliptol, iar
extractele alcoolice cu etanol 80% au confirmat superioritatea capacitii de extracie a compuilor,
comparativ cu etanolul de 60% (valori CMI mai mici) (figura).

32

Determinarea cantitativ a activitii antimicrobiene


100
1 - 60% etanol
macerat US

80
60
CMI (L/mL)

2 - 80% etanol
tinctura US

40

3 - ulei volatil de
rozmarin

20

4 - eucaliptol

0
15/1 42/2 45/4

48/1

tulpini bacteriene

7
Pentru UV i eucaliptol intervalul MIC a fost 0,12 3,9 L/mL, iar la extractele etanolice
6,25 100 L/mL.
Determinarea FIC concentraia inhibitorie fracionat
Valorile FIC sunt cuprinse n intervalul 0,12-1 pentru tulpinile studiate. Valoarea maxim s-a
nregistrat n cazul tulpinii 15/1, ponderea activitii antimicrobiene a eucaliptolului n amestecul
ulei volatil de rozmarin fiind de 100% pentru aceast tulpin. Celelalte tulpini au fost inhibate de
activitatea concertat/ sinergic a tuturor componentelor uleiului.

FIC
1.2
1
0.8
valori FIC (adimensional)

0.6

FIC

0.4
0.2
0
15/1

42/2

45/4

48/1

tulpini bacteriene

Abilitatea compuilor naturali cu rol de inhibitori de pompe este reprezentat de acumularea


substratului de eflux i anume acumularea bromurii de etidiu, care este pus n eviden prin
creterea procentual a fluorescenei.
Rezultatele care au permis emiterea unor ipoteze legate de mecanismul de aciune al uleiului
volatil de Rosmarinus officinalis i al standardului eucaliptol s-au obinut prin corelarea
33

intensitilor semnalelor fluorescente provenite n urma marcrii probelor cu doi fluorocromi, la doi
timpi de citire: iodura de propidiu (PI - fluorocrom ce marcheaz direct componentele celulare prin
legare de acizii nucleici i care ptrunde n celule dup deteriorarea nveliurilor acestora) i
bromura de etidiu (EB - fluorocrom ce marcheaz direct componente celulare prin legare de acizii
nucleici i a crui legare este direct influenat de activitatea pompelor de eflux, fiind o molecul
care este scoas din celule prin transport activ). Marcarea nu s-a putut realiza concomitent, datorit
suprapunerii spectrelor de emisie ale celor dou molecule fluorescente.

MFI - celule marcate cu iodur de propidiu


20
15
10
5
MFI - uniti arbitrare

variante experimentale

MFI - celule marcate cu bromur de etidiu


20
15
10
MFI - valori arbitrare

5
0

variante experimentale

Mediana de fluorescen a celulelor marcate cu PI arat viabilitatea celulelor n probe,


putnd fi astfel cuantificat efectul concentraiilor subinhibitorii de extracte asupra activitii
pompelor de eflux bacteriene. Probele: E. amylovora 42/2, 45/4, /48/1 n prezen de ulei volatil,
15/1 n prezen de eucaliptol i 45/4, 48/1 n prezen de etanol 80% la CMI + 3 au manifestat o
34

reducere drastic a populaiei, sub sensibilitatea de detecie a citometrului, la marcarea cu iodur de


propidiu. Aceste probe s-au exclus din experiment.
Mediana de fluorescena a probelor marcate cu bromur de etidiu a permis identificarea
influenei eucaliptolului asupra activitii pompelor de eflux la toate variantele experimentale (fig.
), cu efecte semnificative la probele 45/4, 48/1 tratate cu eucaliptol i etanol 60% i probele 42/2
i 45/4 tratate cu etanol 80%.

a.

b.

c.

Aspectul histogramelor suprapuse, marcare cu EB (a), respectiv PI (a).

V. Concluzii
Datele obtinute sugereaz c extractele etanolice de rozmarin, uleiul volatil i eucaliptolul
au un mare potential antimicrobian i pot fi utilizate pentru dezvoltarea unor formule de pesticide
botanice, alternative pentru nlocuirea pesticidelor de sintez.
Pentru UV i eucaliptol intervalul MIC a fost 0,12 3,9 L/mL, iar la extractele etanolice
6,25 100 L/mL.
Valorile FIC sunt cuprinse n intervalul 0,12-1 pentru tulpinile studiate. Ponderea activit ii
antimicrobiene a eucaliptolului n amestecul ulei volatil de rozmarin a fost dependent de amestecul
de componente cu excepia tulpinii 15/1 asupra creia a avut efect maxim.
Tehnica citometriei n flux a confirmat efectul inhibitor asupra activitii pompelor de eflux
la toate variantele analitice testate.

VI. Bibliografie
1. Zeng, Q.; Sundin, G.W. Genome-wide identification of Hfq-regulated small RNAs in the fire
blight pathogen Erwinia amylovora discovered small RNAs with virulence regulatory function.
BMC Genomics 2014, 15, doi:10.1186/1471-2164-15-414.
2. Dellagi, A.; Brisset, M.N.; Paulin, J.P.; Expert, D. Dual role of desferrioxamine in Erwinia
amylovorapathogenicity. Mol. Plant Microbe Interact. 1998, 11, 734742.
Int. J. Mol. Sci. 2015, 16 12850
3. Koczan, J.M.; Lenneman, B.R.; McGrath, M.J.; Sundin, G.W. Cell surface attachment
35

structures contribute to biofilm formation and xylem colonization by Erwinia amylovora.


Appl. Environ. Microbiol.2011, 77, 70317039.
4. Koczan, J.M.; McGrath, M.J.; Zhao, Y.; Sundin, G.W. Contribution of Erwinia amylovora
exopolysaccharidesamilovorina and levan to biofilm formation: Implications in pathogenicity.
Phytopathology 2009, 99, 12371244.
5. Burse, A.; Weingart, H.; Ullrich, M.S. NorM, an Erwinia amylovora multidrug efflux pump
involved in in vitro competition with other epiphytic bacteria. Appl. Environ. Microbiol.2004, 70,
693703.
6. Vrancken, K.; Holtappels, M.; Schoofs, H.; Deckers, T.; Valcke, R. Pathogenicity and infection
strategies of the fire blight pathogen Erwinia amylovora in Rosaceae: State of the art.
Microbiology 2013, 159, 823832.
7. Maes, M.; Orye, K.; Bobev, S.; Devreese, B.; van Beeumen, J.; de Bruyn, A.; Busson, R.;
Herdewijn, P.; Morreel, K.; Messens, E. Influence of amilovorina production on virulence of
Erwinia amylovora and a different amylovoran structure in E. amylovoraisolates from Rubus.
Eur. J. Plant Pathol.2001, 107, 839844.
8. Khokhani, D.; Zhang, C.; Li, Y.; Wang, Q.; Zeng, Q.; Yamazaki, A.; Hutchins, W.; Zhou,
S.S.;Chen, X.; Yang, C.H. Discovery of plant phenolic compounds that act as type III secretion
system inhibitors orinducers of the fire blight pathogen, Erwinia amylovora. Appl. Environ.
Microbiol.2013, 79, 54245436.
9. Jin, Q.; Hu, W.; Brown, I.; McGhee, G.; Hart, P.; Jones, A.L.; He, S.Y. Visualization of secreted
Hrp and Avr proteins along the Hrp pilus during type III secretion in Erwinia amylovora and
Pseudomonas syringae. Mol. Microbiol. 2001, 40, 11291139.
10. Oh, C.-S.; Beer, S.V. Molecular genetics of Erwinia amylovora involved in the development of
fire blight. FEMS Microbiol.Lett.2005, 253, 185192.
11. Barnhart, M.M.; Chapman, M.R. Curli biogenesis and function. Annu. Rev. Microbiol. 2006,
60, 131147.
12. Epstein, E.A.; Chapman, M.R. Polymerizing the fibre between bacteria and host cells: The
biogenesis of functional amyloid fibres. Cell Microbiol.2008, 10, 14131420.
13. Sebaihia, M.; Bocsanczy, A.M.; Biehl, B.S.; Quail, M.A.; Perna, N.T.; Glasner, J.D.;
DeClerck, G.A.; Cartinhour, S.; Schneider, D.J.; Bentley, S.D.; et al. Complete genome
sequence of the plant pathogen Erwinia amylovora strain ATCC 49946. J. Bacteriol. 2010, 192,
20202021.
14. Smits, T.H.; Rezzonico, F.; Kamber, T.; Blom, J.; Goesmann, A.; Frey, J.E.; Duffy, B.
Complete genome sequence of the fire blight pathogen Erwinia amylovora CFBP 1430 and
comparison to other Erwinia spp. Mol. Plant Microbe Interact. 2010, 23, 384393.
15. Davey, M.E.; OToole, G.A. Microbial biofilms: From ecology to molecular genetics.
Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000, 64, 847867.
16. Sauer, K.; Camper, A.K.; Ehrlich, G.D.; Costerton, J.W.; Davies, D.G. Pseudomonas aeruginosa
displays multiple phenotypes during development as a biofilm. J. Bacteriol. 2002, 184, 11401154.
17. Zhao, Y.; Wang, D.; Nakka, S.; Sundin, G.W.; Korban, S.S. Systems level analysis of twocomponent signal transduction systems in Erwinia amylovora: Role in virulence, regulation of
amylovoran biosynthesis and swarming motility. BMC Genomics 2009, 10, doi:10.1186/14712164-10-245.
18. Nakka, S.; Qi, M.; Zhao, Y. The PmrAB system in Erwinia amylovora renders the pathogen
36

more susceptible to polymyxin B and more resistant to excess iron. Res. Microbiol. 2010, 161,
153157.
19. Molina, L.; Rezzonico, F.; Dfago, G.; Duffy, B. Autoinduction in Erwinia amylovora:
Evidence of an acyl-homoserine lactone signal in the fire blight pathogen.J. Bacteriol. 2005, 187,
32063213.
20. Venturi, V.; Venuti, C.; Devescovi, G.; Lucchese, C.; Friscina, A.; Degrassi, G.; Aguilar, C.;
Mazzucchi, U. The plant pathogen Erwinia amylovora produces acyl-homoserine lactone signal
moleculesin vitro and in planta. FEMS Microbiol.Lett.2004, 241, 179183.
21. Rezzonico, F.; Duffy, B. The role of luxS in the fire blight pathogen Erwinia amylovora is
limited to metabolism and does not involve quorum sensing. Mol. Plant Microbe Interact. 2007,
20, 12841297.
22. Gao, Y.; Song, J.; Hu, B.; Zhang, L.; Liu, Q.; Liu, F. The luxS gene is involved in AI-2
production, pathogenicity, and some phenotypes in Erwinia amylovora. Curr.Microbiol.2009,
58, 110.
23. Castiblanco, L.F.; Edmunds, A.C.; Waters, C.M.; Sundin, G.W. Characterization of quorum
sensing and cyclic-di-GMP signaling systems in Erwinia amylovora. Phytopathology 2011, 101, S2.
24. Agrios G., 2005, Plant pathology 5th edition, 620-646
25. Van der Zwet, T., Zoller, B. G., and Thompson, S. V. (1988). Controlling fire blight of pear and
apple by accurate prediction of the blossom blight phase. Plant Dis. 72, 464472.
26. Vanneste, J. L., ed. (2000). Fire Blight: The Disease and its Causative Agent, Erwinia
amylovora.
27, Hildebrand, M., Dickler, E., and Geider, K. (2000). Occurrence of Erwinia amylovora on
insects in a fire blight orchard. J. Phytopathol.148, 251256.
29. Baicu T., esan T. E. 1996, Fitopatologie agricol, Ed. Ceres, Buc., 316 pp.
30. Severin V., Iliescu H.C., 2006, Bolile bacteriene ale plantelor, GEEA, Buc., 324 pp.
31. Severin V., Kupferberg S. Zurini I. 1986. Bacteriozele plantelor cultivate, Ed. Ceres, Buc., 219
pp.
32. Severin V., 1996, Focul bacterian al rozaceelor [Erwinia amylovora]
33. Geider, K. Variations in the molecular masses of the capsular exopolysaccharides amylovoran,
pyrifolan and stewartan. Int. J. Biol. Macromol. 2012, 50, 518522.
34. Beer. S. V., and J. L. Norelli, 1971, Fire blight epidemiology: factors affecting release
of Erwinia amylovora by cankers.

37