Potenialul tehnicilor spectrale i hiperspectrale de imagistic

pentru detectarea bacteriilor n produsele alimentare:

Un studiu de caz asupra bacteriilor productoare de acid lactic
(LAB)

Abstract
Metodele oficiale pentru detectarea bacteriilor se bazeaz pe tehnici de cultur. Aceste
metode au, ins, limitri cum ar fi consumul de timp, costuri ridicate, limite de detecie i
imposibilitatea de a analiz un numr mare de probe. Din aceste motive, dezvoltarea rapid a
metodelor analitice non-distructive si ce necesit un pre sczut, este o sarcin de interes tot mai
mare.
n studiul de fa, capacitatea tehnicilor spectrale i hiperspectrale pentru a detecta contaminarea
suprafeei cu bacterii a fost investigat preliminar pe culturi de gel , iar apoi pe felii de unc
fiart. Mai precis, au fost luate n considerare dou specii de bacterii lactice (LAB), i anume
Lactobacillus curvatus i Lactobacillus sakei, ambele fiind responsabile de modificri comune n
felii de unc fiart.
Trei tehnici au fost investigate, cu echipamente diferite, respectiv: un scanner
macroscopic hyperspectral care funcioneaz n domeniul NIR (10,470-5880 cm-1) , un
spectrofotometru FT-NIR echipat cu un bra de transmisie ca instrument de prelevare a probelor,
care lucreaz n domeniul 12,500-5800 cm-1, si un FT-MIR microscopic care opereaz n
domeniul 4000-675 cm-1.
Analiza multivariat a datelor, n special, analiza componentelor principale (PCA), a fost
aplicat n scopul de a extrage informaii utile din datele originale i hiperspectrale. Rezultatele
obinute demonstreaz c tehnicile spectroscopice i imagistice investigate pot reprezenta un
instrument eficient i sensibil pentru a detecta contaminarea bacterian de suprafa n probe i,
n special, s recunoasc speciile din care bacteriile fac part

1. Introducere
Reglementrile privind etichetarea alimentelor au evideniat importana de a furniza
consumatorului informaii exacte cu privire la ingredientele i aditivii prezeni n produsele
alimentare. O astfel de preocupare cheie este raportat, de asemenea, n recenta reglementare
UE, care se aplic ncepnd cu 2014. n special, regulamentele Comisiei, de asemenea stabileasc
criterii microbiologice pentru produsele alimentare, limitele maxime de contaminare bacterian,

toxine i amine biogene. O consecin direct este cerina pentru noi metodologii analitice care
vizeaz simplificarea utilizrii i mbuntirea eficienei instrumentelor de control existente.
Perioada de valabilitate a produselor din carne fierte i tiate, cum ar fi mezelurile, este
limitat n principal din cauza siguranei microbiologice i a problemelor de alterare. Acest lucru
se datoreaz manipulrii, cum ar fi felierea i ambalarea prin care se reintroduc, n mod inevitabil
contaminani bacterieni dup procesul de gtire, dar i din cauz c produsul are un pH aproape
neutru (n jur de 6) i activitatea apei mai mare de 0,945.
Alterarea mezelurilor feliate ambalate este n mare parte nsoit de acrirea produsului, de
prezena unui suc lipicios i umflarea ambalajului din cauza producerii de gaze i este de obicei
cauzat de bacterii lactice (LAB), mpreun cu Pseudomonas. Alterarea produselor din carne
fierte are ca rezultat defecte de calitate senzorial, cum ar fi gustul acru, modificri de culoare,
producerea de gaze, i formarea unui strat de mzg vscoas.
Metodele oficiale pentru detectarea acestor specii bacteriene (ISO 15214: 1998, ISO
13720: 2010) se bazeaz pe tehnici de cultur. Aceste metode au limitri, cum ar fi consumul de
timp , costul ridicat, limite de detecie i imposibilitatea de a analiza un numr mare de probe.
Din aceste motive, dezvoltarea metodelor analitice rapide, low-cost i nedistructive este o sarcin
de interes tot mai mare.
Metode bazate pe spectroscopie clasic i pe analiza imaginilor convenionale (RGB) au
fost studiate pe larg timp de mai muli ani. Dei aplicate n numeroase probleme alimentare,
aceste abordri convenionale au o capacitate limitat de obinere a informaiilor din probele
alimentare. n ultimii ani, imagistica hiperspectral (HSI) a aprut ca o soluie foarte eficient
pentru controlul calitatii i siguranei produselor alimentare, fiind n msur s caracterizeze
temeinic componentelor individuale din cadrul unei matrici complexe, care s permit att
identificare chimic ct i localizarea. Mai exact dac analiza imaginilor convenionale ofer un
rspuns la intrebarea unde iar spectroscopia convenional poate da rspunsuri la intrebrile
ce i ct, HSI ofer un rspuns la aceste intrebri combinate unde, ce i n ce cantitate,
oferind astfel o caracterizare cuprinztoare, util n special n scopuri de identificare i de
control. n plus, colectarea de profile spectrale din mai multe puncte ntr-o anumit zon crete
reprezentativitatea informaiilor obinute.
HSI poate fi utilizat fie la scar macroscopic sau microscopic i n diferite domenii
spectrale, n funcie de nivelul de investigare i rezoluia spaial necesar, informaiile chimice

de interes i tipul implementare necesar. Infrarou cu lungime de und scurt i mijlocie sunt
printre cele mai utile pentru a extrage informaii chimice i pentru a oferi amprente spectrale
informative ale probelor studiate. n cazul probelor de produse alimentare, pentru care culoarea
reprezint o caracteristic important ce trebuie evaluat, de asemenea, regiunea IR vizibil este
adesea considerabil informativ.
Metodele HSI furnizeaz, de obicei, o cantitate considerabil de date structurat n trei
dimensiuni (dou spaiale i una spectral) i sunt adesea extrem de complexe, mai ales atunci
cnd se lucreaz n domeniul infrarosu apropiat.
n ultimele decenii, o mare atenie a fost dedicat aplicrii spectroscopiei FT-IR n
domeniul siguranei microbiene, datorit att capacitatii tehnicii de a descompune amestecuri
complexe, n ceea ce privete compoziia ct i progresului tehnologic al instrumentelor moderne.
n particular, cuplarea dispozitivelor microscopice i spectroscopiei MIR ofer avantaje
semnificative pentru determinarea compuilor prezentai ntr-o concentraie mic n matrici
eterogene. Potenialul tehnicilor FT-IR de a identifica bacteriile contaminante din produsele
alimentare a fost investigat n mod sistematic ncepnd cu anii '90 ai secolului al XX- lea, cuplat
cu tehnici chemometricie, i s-au dovedit a fi capabil de a efectua nu numai specii, ci i tulpinile
difereniale.
Studiile recente au cuplat n mod eficient spectroscopia FT-IR i microscopia pentru
caracterizarea bacteriilor n sucurile de fructe, lactate i produse din carne. Este de remarcat
faptul c cele mai multe dintre abordrile descrise n literatura de specialitate includ o etap de
separare, cu scopul de a extrage celulele bacteriene din matricea alimentar complex nainte de
analiz. Aceast etap are rolul de a perfeciona analiza n ceea ce priveste eficiena i costul.
n studiul de fa, capacitatea tehnicilor spectrale i hiperspectrale pentru a detecta
contaminarea suprafeei bacteriane a fost investigat pe culturi de gel preliminar i, ulterior, pe
felii de unc fiart. Mai precis, au fost luate n considerare dou specii de LAB, i anume
Lactobacillus curvatus i Lactobacillus sakei, ambele fiind responsabile de modificri comune n
mezelurile feliate.
LAB au fost studiate cu succes prin metode FT-IR n NIR i n regiunile spectrale MIR.
n particular, spectroscopia FT-IR n intervalul MIR a permis deosebirea bacteriilor pure
analizate n modul de transmisie. n studiul de fa, potenialul a trei tehnici a fost
investigat, cu diferite echipamente, respectiv: un scaner hiperspectral macroscopic care

funcioneaz n regiunea NIR (10,470-5880 cm-1), un spectrometru FT-NIR echipat cu

braul de transmisie ca instrument de prelevare a probelor, care lucreaz n regiunea 12,500-5800
cm-1, precum i un microscop FT-MIR care opereaz n regiunea 4000 -675 cm-1.
Analiza multivariat a datelor de explorare a fost aplicat pentru a extrage informaii utile
din datele analizate, pentru a verifica capacitatea de a distinge tulpinile bacteriene att n cultur
ct i n matricea alimentar.
2. Materiale i metode
2.1. Tulpini bacteriene i condiiile culturii
Studiul a fost realizat cu ajutorul L. curvatus VZ22 i L. sakei VZ35 tulpini izolate din salam
Varzi DOP, i care aparin coleciei bacteriene a Institutului de tiine a Produciei Alimentare a
Consiliului Naional de Cercetare din Italia (CNR-ISPA). Tulpinile au fost identificate prin
parial secveniere ARNr 16S n conformitate cu McCabe i co-lucrtorilor.
naintea fiecrui experiment, culturile au fost incubate peste noapte la 37C, n bulion MRS
(Scharlau Microbiologie, Barcelona, Spania). Tulpinile Lactobacillus au fost brzdate n trei
exemplare, pe agar MRS (Scharlau Microbiology), incubate la 37C timp de 72 de ore n condiii
anaerobe (Anaerocult A, Merck Millipore, Darmstadt, Germania) i supuse analizei spectrale i
hiperspectrale.
O unc feliat comercial (aproximativ 2 mm grosime), achiziionat de la un supermarket
italian, a fost utilizat pentru a studia contaminarea superficial de LAB. ncrcarea total a
bacteriilor din feliile de unc nainte de inoculare a fost < 103 cfu/g. O cantitate cntarit (10g)
de prob a fost diluat progresiv n soluie Ringer, de concentraie 25% i placat pe Aerobic
Count Plates (AC) Petrifilm (3M Canada, London, Ontario, Canada). Ulterior, 1 mL de culturi de
lactobacili produi peste noapte (aproximativ 108 ufc /mL) au fost centrifugai i spalai de dou
ori cu 1 mL de soluie tampon fosfat salin (PBS), i apoi resuspendat n 1 mL de soluie Ringer.
Locuri diferite definite pe suprafea de unc au fost contaminate artificial prin depunerea de
suspensii LAB 100 mL (circa 107 cfu/spot). Dup contaminare, suspensia a fost lsat s se usuce
la temperatura camerei, iar probele au fost supuse imediat analizei spectroscopice.