CAPITOLUL V

EVOLUIA BIOINDUSTRIEI-ARC PESTE TIMP

Nu cu muli ani n urm, cnd descoperirile senzaionale n lumea atomului ocupau primele
pagini ale tuturor ziarelor, dorina de informaii i cunotine n domeniu atinsese cotele cele mai
nalte. ntre timp interesul pentru atom a trecut parc ntr-un plan secund, n schimb informatica i
biotehnologiile in capul de afi. De aceea sperm c sumara i incitanta incursiune n lumea
misterioas a celulei vii, ce a constituit subiectul prezentrilor anterioare, a reuit s aduc
rspunsuri adecvate la multe ntrebri. Acum cunoatem potenialitile ieite din comun ale
organismelor din natur i nelegem tehnicile genetice folosite pentru a conferi acestora proprieti
noi sau pentru a amplifica caracteristicilor existente. n continuare este interesant s prezentm
evoluia bioindustriei, s nelegem cum se realizeaz biotehnologiile industriale performante din
zilele noastre, ce pun n valoare uriaa capacitate a celulelor vii de a produce bunuri eseniale pentru
viaa omului. Se poate spune c bioindustria a nregistrat un magnific salt n timp. Alturi de
biotehnologiile agroalimentare i farmaceutice devenite clasice (obinerea berii, prepararea
produselor lactate fermentate, fermentaia vinului i a ampaniei, prepararea antibioticelor dup
tehnologii consacrate), care folosesc de decenii microorganismele cele mai diverse, sunt n
producie instalaii de obinerea proteinelor terapeutice cu celule animale sau cu microorganisme
transgenice. Ca s nu mai vorbim despre proiectele de viitor, ce nu se vor dovedi probabil doar
rodul unei fantezii debordante i care imagineaz fabrici integrate pentru obinerea concomitent a
unui ansamblu de produse alimentare i farmaceutice.
Pentru ca minunatele realizri de laborator s devin aplicaii industriale de succes, ingineria
biochimic i bioinformatica cunosc o evoluie fr precedent, care solicit eforturi de creativitate la
nivelul unei adevrate revoluii tiinifice i tehnologice.

Bioprocese i reactoare

Centrul vital al unei biotehnologii industriale este bioreactorul i bioprocesul asociat,

ntruct la aceast etap trebuie stpnite procese ale viului, de o deosebit complexitate i avnd
loc n condiii artificiale de via i la scar mare. Pentru a nelege cum reuete inginerul
biochimist s realizeze n bioreactor dirijarea optimal a bioprocesului productiv este nevoie
s pornim de la ideea c celulele vii efectueaz n mediul lor natural n orice moment o uria
multitudine de biotransformri, n condiii bune sau mai puin bune, n funcie de ceea ce le
asigur mediul: substratele necesare n cantiti suficiente, dar nu excesive, cci cantitile
prea mari inhib activitatea enzimelor ce intervin; parametrii fizici la nivele mcar
acceptabile (temperatur, presiune, lumin cnd este cazul i altele). Cnd se are n vedere
reproducerea unei asemenea biotransformri n condiii artificiale n scopuri productive sunt
studiate n prealabil n laborator toate necesitile celulelor de cultur, care determin
avansarea cu vitez maxim a bioprocesului i se efectueaz inclusiv nlturarea prin tehnici
genetice a acelor bariere constitutive, care pot ncetini sau limita biosinteza. Odat ce au fost
stabilite celulele productive, modificate sau nu genetic i studiat metabolismul acestora,
specialistul responsabil cu tehnologia nu mai intervine cu nimic n intimitatea proceselor
celulare. Inginerul biochimist urmrete s influeneze indirect desfurarea biotransformrii
prin asigurarea celor mai bune condiii de mediu fizic i chimic. Aceasta nseamn alegerea i
dotarea corespunztoare a bioreactorului i conceperea unui mod optim de operare i de
conducere a bioprocesului, respectnd n cea mai mare msur posibil toate cerinele
organismului productiv ales.
n primul rnd este nevoie ca celulele de cultur s fie aprovizionate n permanen cu
nutrienii necesari, iar produsele de metabolism eliberate n mediu s nu rmn numai n
vecintatea celulelor, mpiedicnd alte fenomene, ci s fie rspndite uniform n mediu. De aceea n
bioreactor se efectueaz o amestecare (omogenizare) corespunztoare a fazelor prezente: faza
solid-celulele i eventual unii nutrieni insolubili n ap, faza lichid-mediul de cultur (apa i
substanele nutritive dizolvate), faza gazoas-aerul (n cazul proceselor aerobe) i alte gaze-ca
substrate sau produi de metabolism. Amestecarea mediului se realizeaz n principal cu dispozitive
mecanice (module de amestecare) sau folosind sisteme pneumatice. ntruct omogenizarea este o
cerin de prim ordin, n permanen sunt studiate i oferite pe pia sisteme de amestecare tot mai
performante, cu consumuri energetice acceptabile. Dar rezultatele trebuie mereu mbuntite, cci
un biosistem productiv (unitatea celor trei faze) are un grad ridicat de eterogenitate, ce trebuie
diminuat ct mai mult pentru a asigura avansarea optim a procesului.
n cazul proceselor aerobe bioreactorul trebuie s fie prevzut cu dispozitivele interioare
necesare pentru a asigura transferul cantitii de oxigen cerute de celulele de cultur din aer pn
n mediul lichid din vecintatea acestora. Este o problem de mare importan, cci n unele cazuri,
acolo unde multiplicarea celular este foarte rapid, se pot nregistra chiar consumuri de oxigen
deosebit de ridicate. Celulele nu pot prelua acest gaz vital direct din aer, ci dizolvat n mediu, deci
n reactor are loc dispersarea ct mai uniform a bulelor de aer n interiorul fazei lichide.
 ntruct n aceste culturi artificiale doar faza de lag (de adaptare a celulelor la noile condiii
de via) este consumatoare de energie, celelalte faze fiind exoterme, iar cultura se dezvolt
corespunztor numai ntr-un domeniu ngust de temperatur, bioreactorul trebuie s asigure i
preluarea cldurii produse pe aproape toat durata cultivrii cu ajutorul instalaiilor proprii de
termostatare.
Bioprocesul se desfoar numai n condiii de sterilitate. Aceasta nseamn c n afara
celulelor de cultur nu mai este permis intrarea i existena altor celule vii. De aceea se sterilizeaz
mai nti cu abur tehnologic instalaia fr mediu i n paralel, tot termic sau prin filtrare prin
membrane, mediul de cultur nainte de inoculare. Conductele de intrare-ieire din reactor sunt
protejate prin purjare cu abur tehnologic, iar aerul folosit n cazul bioproceselor aerobe i alimentat
n flux continuu este introdus numai dup o prealabil i permanent filtrare sterilizant. Este
meninut de asemenea o relativ suprapresiune n bioreactor n timpul cultivrii.
n numeroase cazuri (procese aerobe, folosirea unor nutrieni de natur proteic) n unele
faze ale bioprocesului i n special cnd are loc creterea exponenial a celulelor apare spumarea,
cu consecine duntoare, ntruct face imposibil meninerea unor parametri de operare n
domeniile prescrise i poate chiar determina eliminarea mediului cu celule din vas. Combaterea i
mult mai bine, prevenirea acestui fenomen se realizeaz prin dotarea reactorului cu dispozitive
mecanice adecvate (agitatoare de mare turaie, separatoare centrifugale montate n zona de deasupra
mediului), sau introducnd antispumani chimici; acionarea sistemelor alese de combatere a
spumrii are loc eventual n funcie de semnalul emis de senzorii de spum montai n vas.
Dar preteniile fa de bioreactor, deja sofisticate, nu se opresc aici. Parametrii de cultivare
trebuie meninui n domeniile optime recomandate, altfel bioprocesul nu atinge randamente
deosebite, sau este chiar compromis. De aceea un bioreactor este dotat cu numeroase i avansate
sisteme de automatizare, astfel nct s se asigure, de obicei la scar mare, toate condiiile de
mediu impuse de evoluia optimal a metabolismului celulelor de cultur.
Evoluia optimal nseamn, pe lng selectarea cu prioritate a cilor metabolice de interes
(n condiii de consumuri energetice reduse), i parcurgerea ciclului de dezvoltare cu vitezele
maxime posibile (ceea ce se numete n acest caz asigurarea cineticilor optime de consum de
substrat-n mod deosebit sursa de carbon, de cretere a culturii i de formare a
produsului/produilor). n aceste condiii monitorizarea avansrii optime a unui proces biologic n
timp real i in situ este un deziderat insuficient rezolvat la ora actual, cnd nu se cunosc sisteme
nedestructive, suficient de sofisticate, care s ofere informaii continue, n afara celulei, despre cum
funcioneaz mecanismele intime ale acesteia.

Foto reactor
 De aceea, ne mulumim adesea cu monitorizarea indirect a creterii celulare prin
determinarea evoluiei unor fenomene fizice/biologice nsoitoare i cu nregistrarea, pe baza unor
sisteme similare, dac se cunosc, a consumului sursei de carbon i al altor nutrieni; la fel se
procedeaz i pentru a monitoriza formarea produsului. n funcie de informaiile obinute sunt
modificai parametrii de cultivare sau se comand introducerea unor componente de mediu/soluii
de corectare a pH-ului i chiar evacuarea unei cantiti de mediu.
Pentru a face o util parantez, dirijarea unui proces al viului pstreaz nc, ca efect al
maximei complexiti, destule aspecte nedemonstrabile tiinific la ora actual, care in mai mult de
art, dect de cunoatere. Aa se explic faptul c sunt rezolvate uneori prin intuiie (?!), dar cu
succes, aspecte de fapt incomplet nelese. De aceea, acolo unde condiiile de cultivare au fost
perfect standardizate (ca n cazul procedeelor actuale aplicate la prepararea ampaniei, vinului,
berii), produsul este bun, cu caracteristici reproductibile, dar lipsit de unele caliti deosebite n
privina gustului, pe care anumii productori-artizani tiu s le asigure.
Revenind la practicile industriale moderne, sunt de reinut nc cteva aspecte importante. n
primul rnd, datorit specificitii unui bioproces, este necesar introducerea n mediul steril, la
debutul oricrei cultivri, a unei cantiti nsemnate de celule de cultur, (operaie cunoscut sub
denumirea de inoculare). n acelai timp obinerea unei cantiti ridicate de produs util la terminarea
bioprocesului impune utilizarea unui reactor destul de mare, fapt cu att mai valabil n cazul
culturilor microbiene, unde se folosesc adesea reactoare cu capaciti de zeci i sute de m 3. Dar este
greu, dac nu imposibil, de a procura direct cantitatea necesara de inocul pentru un mare reactor
industrial pornind de la baloanele folosite n laborator. De aceea, ntr-o linie de fabricaie cu vase
mari de producie, ntre balonul cu inocul de laborator i reactorul industrial se interpun unul sau
mai multe reactoare de preparare n trepte a inoculului industrial, cu volume cresctoare de mediu.
Conducerea unor astfel de instalaii de fabricaie impune probleme deosebite, nu uor de rezolvat
ntotdeauna. Ea se realizeaz totui cu destul succes n marile instalaii bioindustriale din rile
dezvoltate.
Productivitatea unui procedeu depinde n cea mai mare msur i de modul de operare
adoptat. Cel mai simplu mod de lucru, nc cel mai folosit, este sistemul discontinuu de operare. n
acest caz dup inocularea mediului de cultur steril, ce conine de la nceput toi nutrienii necesari
pentru consumul celulelor un timp determinat, bioprocesul evolueaz pn la epuizarea sursei de
carbon i energie sau/i a altor substrate, moment n care cultivarea este stopat. Se efectueaz n
continuare recoltarea mediului final cu celule, ce este apoi transferat n instalaia de separare-
purificare a produsului util. n afara substanelor ce menin pH-ul n domeniul optim i al
eventualilor produi antispumani nu se mai introduce pe parcurs nici un fel de substrat. Volumul de
mediu, dac se neglijeaz pierderile prin evaporare i recoltrile de probe pentru analize chimice,
biochimice i biologice (inclusiv testele de sterilitate), rmne constant. Concentraia masei celulare
evolueaz conform curbei de cretere caracteristice culturilor discontinui in vitro.
Productivitatea bioprocedeului se evalueaz determinnd cantitatea de produs util obinut n
volumul considerat de mediu i lund n calcul durata bioprocesului propriu-zis, la care se adaug
timpul necesar pregtirii bioreactorului (golire, curare, umplere, sterilizare). Procedeele
discontinui au productiviti destul de sczute.
Pentru a obine o cretere a acesteia, cu efect major asupra scderii costurilor de fabricaie,
au fost dezvoltate alte moduri de operare, dintre care cele mai importante sunt:
-Bioprocesul discontinuu alimentat. n acest caz se ncepe cu o fraciune din volumul posibil
de mediu coninnd de obicei inoculul i majoritatea nutrienilor n cantitile necesare ntregului
volum de mediu. Un singur nutrient, sursa de carbon este introdus n cantitatea corespunztoare
fraciunii iniiale de volum. n momentul cnd cultura i ncepe creterea masiv se introduce sursa
de carbon n continuare, avndu-se n vedere meninerea constant pe parcurs a concentraiei ei n
mediu. n acest mod se prelungete mult timp etapa de cretere exponenial, pn cnd se atinge
volumul final i eventual se acumuleaz i prea muli produi toxici de metabolism. Aceasta tehnic
de cultivare permite obinerea unor cantiti crescute de masa celular i evident i de produs util,
de unde rezult mrirea productivitii (timpul de pregtire a procesului rmnnd constant). Ea este
din ce n ce mai larg utilizat i pentru c sursele uzuale de carbon, chiar zaharurile, nu pot fi
introduse n cantiti prea mari la debutul cultivrii, ntruct determin concentraii inhibitoare
pentru cretere (a se vedea cazul gemurilor i dulceurilor, unde excesul de zahr, nu numai
sterilizarea mpiedic infectarea ulterioar cu mucegaiuri). Aceast tehnic a devenit important n
special pentru prepararea unor produi utili de tipul proteinelor recombinante, care sunt
biosintetizai n mod normal de celula vie n concentraii reduse. Aplicnd modul discontinuu
alimentat de operare se obin concentraii celulare ridicate, ceea ce implic i acumularea unor
cantiti finale acceptabile de produs.
-Bioprocesul continuu. Maximum de productivitate poate fi realizat, atunci cnd odat atins
o stare optim n cultura discontinu/discontinu alimentat (caracterizat prin concentraii optime
de substrat i concentraii maxime de masa celular i de produs, dar i prin vitez maxim de
formare a produsului util), ea este prelungit n timp prin alimentarea continu a sursei de carbon
nsoit i de ali nutrieni i evacuarea concomitent cu acelai debit a mediului de bioproces. Dei
cea mai rentabil economic, ea este nc puin folosit n industrie i aplicat mai ales n scopul
cercetrilor de genetic i biochimie. Limitarea aplicaiilor industriale deriv din numeroasele
constrngeri implicate: fiabilitatea timp ndelungat (sptmni i luni) a instalaiilor i aparaturii de
msur i control funcionnd ncontinuu; meninerea strict a sterilitii n aceste lungi perioade de
timp; asigurarea stabilitii biosistemului, att de sensibil prin complexitatea lui, la numeroasele
perturbaii posibile.
 Pentru a concepe reactorul de producie adecvat bioprocesului avut n vedere, inginerul
biochimist trebuie s integreze cunotinele specifice profesiunii sale cu informaiile existente
despre stabilitatea genetic a celulelor, rezistena acestora la forele mecanice prezente, conexiunile
posibile ntre cile metabolice de interes i efectele unor parametri de operare, mecanismele
energeticii celulare, conexiunile ntre modelul hidrodinamic i transferul de mas n raport cu
mecanismele i vitezele proceselor celulare.
Instalaia industrial de bioprocesare (cunoscut i sub denumirea improprie, dar uzual, de
instalaie de fermentaie), de o deosebit complexitate, cuprinde deci, pe lng bioreactorul de
producie:
-bioreactoare pentru obinerea n mai multe trepte a inoculului industrial;
-vase de preparare medii i soluii de adaos (soluii de corecie pH, soluii cu produi
antispumani);
-instalaii de sterilizare continu a mediilor de cultur;
-instalaii de comprimare a aerului, de distribuie a acestuia i de filtrare sterilizant;
-pompe speciale n circuite aseptice.
Pentru a rezista la sterilizri repetate ntreaga instalaie este realizat din oeluri inoxidabile
speciale i atunci cnd este cazul, mase plastice biocompatibile, rezistente la temperatur. Condiiile
drastice de igien i de disciplin a muncii completeaz imaginea unei asemenea instalaii, la care se
adaug instruirea deosebit i calificarea special a personalului la toate nivelele.
Funcionarea unei asemenea instalaii i mai ales evoluia optimal a bioprocesului n
reactorul industrial sau n inoculatoare nu pot fi concepute fr asocierea unor sisteme de
monitorizare i conducere cu grad nalt de automatizare, asistate de calculatoare de proces.

Monitorizarea i conducerea bioproceselor.

Tehnologiile biochimice, ca tehnologii de vrf, nu pot fi realizate actualmente fr a apela la

ajutorul automatizrilor celor mai performante i al informaticii. Nu este vorba doar de
automatizrile necesare fluxului de fabricaie n ansamblul su, ceea ce implic programarea
sterilizrilor, a transvazrilor de medii, desfurarea ciclurilor de pregtire a instalaiei. Nu se pune
doar problema gestionrii asistate de calculator a unei instalaii de mare complexitate. Despre aceste
cerine este necesar doar s spunem c se rezolv la nivelul unor exigene deosebite, impuse de
condiiile stricte de lucru, dar existente i n cazul altor industrii.
Avem n vedere n mod special faptul c n bioreactoarele liniei industriale de fabricaie sunt
de monitorizat i de condus procese ale viului, o provocare cu totul nou pentru automatist,
informatician i inginerul biochimist tehnolog. Alturi de evoluia optimal i reproductibilitatea
acestui tip de proces constituie unul dintre scopurile finale ale aciunii lor, ceea ce necesit
cunotine aprofundate i integrate din numeroase domenii interdisciplinare i remarcabile eforturi
de creativitate.
n aceast situaie calea aleas de rezolvare este construirea unui sistem ierarhizat de
monitorizare i control a bioprocesului.
La un prim nivel este necesar obinerea n sistem continuu a datelor necesare caracterizrii
biotransformrii. Aceasta nseamn determinarea continu in-line/on-line a variabilelor
(parametrilor) de proces. Este cazul s reamintim cu att mai mult cu aceast ocazie c posibilitatea
actual de caracterizare direct a evoluiei fenomenelor complexe ale viului este limitat. Aparatura
existent de msur surprinde ntotdeauna indirect ceea ce se ntmpl n interiorul celulei,
neexistnd metode automate de analiz, care s determine variaia unor activiti enzimatice, sau
concentraii ale componentelor celulare de baz.
Evoluia metabolismului poate fi stabilit doar cu metode de analiz de laborator, ce implic
adesea dezintegrarea celulei, mult timp de lucru i tehnici laborioase, complicate. Sunt prea puine
metode nedestructive, neinvazive n raport cu integritatea celular. Chiar i acestea sunt specifice
doar pentru anumii metabolii (produse de metabolism) i au la baz corelaii ntre concentraia
substanei i mrimea unor efecte fizice/chimice. Aceasta situaie diminueaz mult capacitatea de
conducere optimal a unui bioproces.
n plus, muli dintre senzorii existeni, ce determin nivelele unor variabile fizice sau
chimice de bioproces, nu sunt nc sterilizabili i nu pot fi introdui direct n reactor n mediul de
cultur.
Totui s-a reuit pn la ora actual s se msoare continuu in-line/on-line:
mrimi fizice: temperatura, presiunea, viteza agitatorului mecanic i puterea consumat
pentru agitarea mecanic, debitul de aer i de alte gaze, debite de medii, nivelul mediului
n vas, greutatea biosistemului, nivelul spumei.
mrimi chimice: pH, potenial redox, concentraia oxigenului dizolvat n mediu,
concentraia oxigenului i bioxidului de carbon n gazul de ieire.
Pentru unele substrate, n special surse de carbon, s-a reuit de asemenea determinarea
continu/intermitent, n afara reactorului a concentraiei acestora cu senzori enzimatici specifici
(senzori pentru glucoz, senzori pentru metanol i etanol, etc.) Concentraia masei celulare, o
mrime de maxim importan pentru determinarea vitezei de cretere a culturii, poate fi
determinat continuu n reactor, dar indirect, cu senzori de turbiditate, de fluorescen i altele, prin
corelarea acestei concentraii cu variaia unor fenomene electrice sau evoluia unor proprieti ale
luminii.
 i mai dificil este de obicei determinarea continu a concentraiei produsului util,
apelndu-se cel mai adesea la metode specifice, discontinui, de analiz de laborator.
Bioinformatica a fcut de aceea substaniale eforturi pentru a furniza informaii continui,
eseniale despre bioproces, n lipsa senzorilor adecvai. Pornind de la monitorizarea unor variabile
au fost creai algoritmi evoluai de evaluare, cu ajutorul crora calculatorul de proces stabilete
predicii ale nivelelor unor variabile biochimice importante. Aceti algoritmi, denumii senzori-soft,
sunt folosii tot mai mult la construirea unor structuri de conducere n timp real a bioprocesului. De
exemplu, cunoscnd datele despre cantitatea de cldur degajat din biosistem (efect termic
exoterm) furnizate de aparatura de msur special instalat n bucla de termostatare, se pot face
evaluri asupra vitezei de cretere a culturii, cnd nu apar sau se cunosc interferenele cu efectul
termic de la formarea produsului util. Senzorii soft por fi concepui i pornind de la bilanul de gaze
n circulaie n biosistem.
Deci, la un prim nivel sunt monitorizate ct mai multe variabile de bioproces i construii
senzorii soft pentru alte variabile complexe.
La un al doilea nivel se realizeaz prin tehnici convenionale sau neconvenionale reglarea
variabilelor de bioproces n bucle simple, independente sau interconectate. De exemplu, reglarea
concentraiei oxigenului dizolvat n mediu, se poate face ntr-o bucl de control destul de sofisticat,
care acioneaz pentru creterea vitezei de transfer a oxigenului din bulele de aer n mediul lichid
mrind n trepte viteza agitatorului mecanic sau/i debitul de aer introdus i chiar suprapresiunea n
vas n anumite limite. De asemenea, folosind datele din cultivrile anterioare i uneori i senzori
soft pentru evaluarea vitezei de consum a sursei de carbon, se poate controla debitul de alimentare
cu acest nutrient n cazul bioprocesului discontinuu alimentat.
La un al treilea nivel intervine deja calculatorul de bioproces pentru conducerea global a
evoluiei optimale a biosistemului. i acesta este deja obiectivul cel mai ndrzne. Buclele de
reglare trebuie s transmit ncontinuu datele de msur sub form digitalizat unui sistem de
achiziie de date al calculatorului, ce construiete astfel o baz de date ulterior filtrrii lor (cu
ajutorul unor algoritmi specializai sunt eliminate datele eronate). Pe baza unor algoritmi mai simpli
de reglare, calculatorul nsui poate comanda modificrile de efectuat n buclele independente de
control al unor variabile. Se pot astfel controla: termostatarea, variaia pH-ului, a oxigenului
dizolvat sau nivelul debitelor de adaosuri nutrieni i altele.
Dar nu ne putem mulumi numai cu att. Interesul este de a realiza un sistem global de
conducere, asistat de calculator, unica posibilitate de a sigura reproductibilitatea i optimalitatea
cultivrilor productive. n acest sens soluia cea mai bun ar fi construirea unor algoritmi de
control global, pe baza unor modele matematice deterministe, care s integreze cinetica de
bioproces, bilanul de mas i de energie, dar i cinetica fenomenelor fizice implicate. Acest lucru
nu este nc posibil la ora actual din cauza informaiilor cantitative limitate despre biosistem.
 De aceea se cunosc modele cinetice mult prea simple pentru creterea masei celulare i
formarea produsului. Ele nu pot fi integrate ntr-un tot unitar, suficient de cuprinztor, care s
permit o descriere cantitativ global a evoluiei bioprocesului, chiar dac au fost realizate pentru
unele cazuri modelele cinetice structurate metabolic, care integreaz ntr-o oarecare msur
metabolismul cu mecanismele lui de reglare.
i atunci, deocamdat la nivelul cercetrii i prea puin la nivelul implementrii n structuri
de conducere a bioprocesului industrial, se lucreaz la o alternativ. S-a apelat n primul rnd la
cunotinele despre reglarea adaptiv, ncercndu-se o autoadaptare pe intervale de timp a
algoritmilor de conducere la avansarea complex a biosistemului i au fost nregistrate, ce-i drept
unele succese, dar tot pariale.
O alt cale de rezolvare a fost folosirea cunotinelor calitative despre bioproces, pe care
expertul uman le deine din practica experimental. Ele sunt valabile i chiar valoroase, dar ntruct
nu pot fi transpuse n determinisme cantitative i precise, pot fi redate doar sub forma unor
exprimri lingvistice i nu matematic. Ideea utilizrii acestui tip de cunotine n conducerea
bioprocesului poate fi aplicat apelnd la tehnicile neconvenionale de conducere ce au la baz
inteligena artificial. Au fost astfel create sisteme expert de conducere, conform crora calculatorul
analizeaz evoluia unor mrimi i fenomene pornind de la baza de date construit cu determinrile
efectuate n bioprocese anterioare similare, compar aceste evoluii cu situaiile-tip redate ntr-o
baz de cunotine introdus a priori n memoria lui, reuind n consecin alegerea i execuia unei
instruciuni lingvistice de tip cauz-efect/unui set de astfel de instruciuni. Se poate obine astfel
realizarea i meninerea unor stri optimale ale bioprocesului tot pe intervale de timp.
Folosind logica fuzzy, care transform exprimri verbale calitative n structuri matematice,
au fost propui i algoritmi de control fuzzy pentru unele bioprocese. De asemenea, cu ajutorul
reelelor neuronale, conexiuni de un anumit tip de neuroni artificiali (concepui ca elemente
neliniare de procesare a informaiei, cu un grad limitat de altfel, de similitudine cu funcionarea
neuronilor din creier), pot fi elaborate predicii asupra strii unor variabile de ieire din biosistem,
pornind de la modificrile pe intervale scurte i determinate de timp ale unor variabile considerate
de intrare n biosistem. Reelele neuronale nva mai nti cum evolueaz biosistemul, folosind
un numr mare de seturi de date, ordonate n structuri de coresponden cauz-efect. Dei acest
proces de nvare ignor cunoaterea determinist implicat, aplicarea acestei tehnici de inteligen
artificial poate conduce la obinerea unor predicii acceptabile n msura neapariiei unor
perturbaii majore i necuantificate.
Pentru a mbunti performana sistemelor de conducere global se lucreaz acum la
realizarea unor structuri hibride de control, care integreaz folosirea modelrii matematice
deterministe pentru perioadele de timp i condiiile de lucru, unde poate fi aplicat, cu utilizarea
tehnicilor de inteligen artificial. Rezult un sistem de aciune bazat pe principiul: acolo unde
este posibil, apelez la elaborarea unor comenzi de intervenie n bioproces aplicnd ecuaiile
matematice existente cu valabilitate restrns; acolo unde nu am cunotine cantitative suficiente,
folosesc predicii din reele neuronale i tehnici fuzzy de control pentru a elabora comenzile
adecvate de intervenie.
Integrarea celor dou tipuri de tehnici de conducere ntr-un sistem coerent i suficient de
cuprinztor n raport cu complexitatea fenomenelor implicate este, evident, un obiectiv greu de
realizat i de aceea rezultatele practice sunt nc un deziderat de viitor.
Se poate spera c n viitor vor continua s evolueze i cunotinele despre fiziologia
culturilor celulare i despre procesele intracelulare de reglare metabolic. Lipsa acestora constituie
actualmente principala frn n dezvoltarea unor modele de cuantificare a proceselor biologice i
fizice limitatoare (este vorba despre acele fenomene care au o influen preponderent asupra
avansrii transformrii biologice).

Separarea i purificarea produilor utili

n instalaia de fabricare pe ci biotehnologice a unui produs util linia industrial de

bioprocesare este ntotdeauna cuplat cu o linie industrial de separare-purificare. De altfel
concepia modern despre dezvoltarea unor procese eficiente impune o integrare coordonat a
operaiilor unitare n scopul comercializrii cu succes a noilor produse i tehnologii. Sinteza acestei
concepii aplicat n cazul unei biotehnologii poate fi ilustrat prin schema din figura urmtoare.

Schema. Flux tehnologic tipic pentru biotehnologiile industriale

Este de precizat de la nceput, ceea ce era de altfel evident, c procedeele de separare-

purificare sunt specifice produsului util avut n vedere. i cum la ora actual se obin prin
biotehnologii o gam foarte larg de produse, iar numrul lor nu face dect sa creasc, au fost
realizate numeroase sisteme specifice de separare-purificare, care prezint din fericire destule
operaii comune.
Totui puine procedee de separare au fost concepute numai pentru produsele obinute prin
biotehnologii. Aceste procedee se regsesc i n alte industrii, n special n industria chimic, dar n
cazul de fa tehnicile au fost adaptate att la specificul culturilor celulare ct i n funcie de
proprietile structurilor chimice biosintetizate de celula vie. Aceasta situaie este valabil i pentru
procedeele de purificare, dei o serie de tehnici de purificare avansat, de conservare i protejare au
fost elaborate special pentru un anumit tip de bioprodus. n acelai timp este onest s recunoatem
la aceasta etap c ideea destul de general rspndit despre consumurile energetice reduse, care ar
constitui un element de atracie al biotehnologiilor, este n mare parte eronat. Este probabil
adevrat cnd comparm o biotehnologie cu obinerea unui produs prin electroliz, dar n destule
alte cazuri nu e valabil.
De multe ori se ia n consideraie doar faptul ca bioprocesul are loc la temperaturi i presiuni
uzuale, impuse de condiiile specifice de existen ale celulei vii. Se neglijeaz n schimb
consumurile energetice deloc minore, legate de sterilizarea mediilor i sunt ignorate consumurile
energetice nsemnate necesare n etapele de separare-purificare. Trebuie s avem ntotdeauna n
vedere faptul c produsele biologice se regsesc n mediile finale de bioproces n concentraii mai
degrab modeste i a pleca de la aceast situaie i a ajunge la produse nalt purificate (terapeutice,
de exemplu) implic n ultima instan importante consumuri energetice.
De asemenea produsul util se poate afla la sfritul bioprocesului fie excretat de celul prin
peretele celular (exoprodus) n mediul lichid de cultur, fie n interiorul celulei (endoprodus).
ntotdeauna va fi mai uor i mai ieftin de separat un exoprodus, dar tot mai multe produse, n
special noile proteine terapeutice obinute prin tehnici de ADN recombinant, sunt biosintetizate n
concentraii limitate i rmn n celule, de unde trebuie extrase cu cele mai ridicate randamente cu
putin. Exist i cazul mai fericit, cnd produsul util este nsi masa celular (drojdia de
panificaie, drojdiile furajere) i atunci procedeele de separare sunt mult simplificate.
Oricare ar fi ns produsul util este evident c prima operaie care se efectueaz dup
terminarea procesului este separarea mediului de cultur de celule. Cu sau fr o sedimentare
prealabil la rece, separarea celor dou faze se realizeaz de obicei prin centrifugare.
Separatorul centrifugal cu operare continu a fost inventat n 1878 de inginerul suedez
Gustav de Laval, el fiind deja folosit la sfritul secolului trecut la recuperarea drojdiei de
panificaie. De atunci nu a ncetat s fie utilizat n noile industrii fermentative dup repetate
perfecionri.
n termeni de valoare a produciei, cea mai important component a bioindustriei de azi, ce
utilizeaz separarea centrifugal, este industria berii i a drojdiei de panificaie. Dar procedeul este
prezent n toate biotehnologiile industriale, impunndu-i-se cerine noi de asepsie avansat i
eficien n cazul folosirii unor celule transgenice de cultur. Cnd produsul este intracelular
(proteine terapeutice), centrifugarea intervine n mai multe etape, ceea ce conduce la o multiplicare
de circa 3 ori a costurilor echipamentului de centrifugare, fa de cazul bioproceselor cu produs util
reprezentat de masa celular.
n cazul endoproduilor (unele enzime, proteine terapeutice, acizi nucleici) o alt operaie
obligatorie de separare este dezintegrarea celular, efectuat cu omogenizatoare de nalt presiune
i cu mori cu bile de vitez mare. Aceste utilaje sunt n general scumpe i greu de realizat la scar
mare, iar operaiile au loc cu consum ridicat de energie, elemente ce conduc la preuri ridicate ale
produilor astfel separai.
n diferite etape de separare , inclusiv dup sau eventual n locul centrifugrii, mediul de
biosintez este filtrat pentru a reine toate particulele solide-celulele, nutrienii insolubili din mediul
apos sau resturile celulare rmase n urma dezintegrrii. Dezvoltarea tehnicilor de filtrare prin
membrane a creat chiar o competiie ntre centrifugare i filtrare. Filtrarea prin membrane a devenit
important nu att pentru concentrarea masei celulare, ct pentru concentrarea soluiilor proteice,
avnd meritul, spre deosebire de centrifugare, unei eficiene sporite din punctul de vedere al
consumurilor energetice. Filtrul rotativ cu vid a fost cel mai uzual utilaj pentru aplicaiile industriale
n biotehnologie. Actualmente introducerea membranelor de filtrare din polimeri sintetici a deschis
un cmp larg de utilizare pentru aceast tehnic, datorit avantajelor de versatilitate, vitez mare de
lucru, costuri energetice reduse, operare continu i prelucrarea unor volume mari de mediu.
Au fost deja dezvoltate diferite tipuri de aplicaii ale filtrrii prin membrane: filtrarea n
flux tangenial, filtrarea prin cartuuri cu filtre-lumen, ultrafiltrarea (cu membrane semipermeabile
de acetat de celuloz, policarbonai, polisulfone). Dintre acestea o atenie deosebit merit
ultrafiltrarea, n continu expansiune ca arie de folosire n biotehnologii. Este o metod att de
concentrare ct i de purificare a produilor biologici, fiind aplicat pentru purificarea unor enzime,
proteine din plasm, virui, hormoni, peptide, interferoni, dar i a alcoolului i a unor antibiotice.
n acelai timp tehnic de concentrare i purificare a produsului util este i extracia lichid-
lichid, utilizat pentru antibiotice. n acest caz diferii solveni organici extrag peniciline,
eritromicin, tetracicline din mediul de cultur n contactoare centrifugale de mare vitez. Pe baza
proprietilor de nemiscibilitate a dou soluii de biopolimeri se pot obine chiar sisteme apoase
bifazice aplicate la separarea selectiv a proteinelor ntre dou faze. Astfel cele mai moderne
aplicaii ale metodei sunt la prepararea industrial a proteinelor terapeutice de mare puritate.
O alt operaie utilizat pentru purificarea bioproduselor este cromatografia cu gama sa
actual de variante. n primul rnd cromatografia cu schimbtori de ioni este folosit pentru
separarea i purificarea antibioticelor dar i a proteinelor, iar cromatografia cu site moleculare sau
bazat pe recunoatere molecular (de afinitate), cromatografia hidrofob (pentru proteine,
peptide, fragmente proteice) i mai ales cromatografia de lichide de nalt performan (HPLC)
sunt tot attea aplicaii interesante, care mai pun nc probleme la realizarea instalaiilor la scar
industrial.
 Amintim n final problemele specifice ridicate de alegerea metodelor de separare-purificare
aplicate n biotehnologii:
(a)-sunt nerecomandate metodele ce pot afecta structurile labile termic i mecanic ale
produilor biologici;
(b)-sunt utile metodele eficiente, care se pot folosi cu rezultate deosebite n concentrarea-
purificarea unor produse aflate n concentraie redus n soluiile de lucru;
(c)-se pune ntotdeauna problema operrii n condiii sterile, la volume mari i cu consumuri
energetice ct mai reduse;
(d)-contribuie enorm adaptarea la specificul domeniului a unor metode utilizate i n alte
industrii, urmrindu-se n special creterea selectivitii i a randamentelor.

Bioindustrie i comercializare

n completarea imaginii conturate despre instalaia bioindustrial este necesar s amintim

faptul c, dac compartimentele de bioprocesare i separare-purificare constituie componentele
principale, o uzin biochimic nu poate funciona fr a avea n completare i instalaii de
pretratarea unor materii prime i fr importantele sale laboratoare-microbiologic, biochimic,
analitic.
n diverse biotehnologii se folosesc frecvent materii prime complexe de origine vegetal i
animal (extracte, hidrolizate, produse secundare de la industrii alimentare, preparate din organe
recoltate de la abatoare/spitale/cresctorii), care conin nutrieni importani pentru mediile specifice
de bioproces. Aceste materii prime nu se prezint cel mai adesea n forma apt pentru a fi preluate
de celulele de cultur n metabolismul lor. De aceea ele trebuie supuse n prealabil la o serie de
pretratamente fizice (mecanice, termice, cu radiaii, cu presiuni nalte) sau chimice n instalaii
special realizate n aceste scopuri.
n funcionarea optim a instalaiei de fabricaie laboratoarele ndeplinesc un rol esenial,
asigurnd o serie de activiti de prim ordin. Astfel n laboratorul de microbiologie se efectueaz
conservarea i ntreinerea potenialului productiv al celulelor de cultur, pregtirea inoculului de
laborator, monitorizarea sterilitii n instalaia industrial i a evoluiei culturii, inclusiv studiile
specifice de genetic. De asemenea n laboratorul de biochimie i enzimologie se deruleaz studiile
de metabolism, controlul analitic biochimic ale bioprocesului i chiar al unor etape de separare-
purificare, ca i monitorizarea bioconversiilor (transformri biochimice preparative catalizate de
una sau mai multe enzime). Evident c nu poate lipsi un laborator specializat de chimie analitic,
care efectueaz analize de flux tehnologic off-line (neautomatizate) la bioprocesare, dar i la
separare-purificare, ca i analizele de caracterizare a produsului finit (produsul util n forma lui
comercial).
Datorit necesitii de a folosi complexele procese ale viului n scopuri productive,
biotehnologiile reprezint tehnologii de vrf, caracterizate prin costisitoare etape de cercetare-
dezvoltare, dar i implicnd investiii scumpe. De aceea este cazul s amintim c pe lng obinerea
bioproduselor uzuale, destul de ieftine, la care producia este rentabil numai cnd se realizeaz la
capaciti mari (aa numitele bioprocese de mare tonaj pentru drojdia de panificaie, drojdia
furajer, alcool, bere i altele), este tot mai des aplicat industrial prepararea produselor terapeutice
scumpe. n cazul acestora din urm biotehnologiile sunt eficiente n instalaii de mult mai mic
capacitate. Dei aceste instalaii mai mici au costuri de investiie mai modeste, n schimb costurile
de exploatare raportate la cantitatea de produs sunt destul de nsemnate, deoarece obinerea
metaboliilor folosii ca medicamente oblig la condiii speciale de sterilitate i la controlul cel mai
strict al parametrilor de bioproces.
Vorbind acum despre etapele de cercetare-dezvoltare ale biotehnologiilor, este important de
reinut c studiile de laborator, inclusiv modificarea genetic a tulpinii productive, nu reprezint
dect o prim faz a cercetrilor. Mai mult dect att, n destule cazuri complexitatea ridicat a
proceselor impune necesare faze de pilotare urmate de numeroase testri solicitate de severa
legislaie existent n rile dezvoltate pentru medicamente, produse alimentare sau cosmetice,
produse pentru hrana animalelor i altele, ceea ce constituie aplicaiile tipice ale produselor
biotehnologice.
n aceste condiii cele mai scumpe bioproduse cu referire la costurile de cercetare-
dezvoltare, dar i de testare n vederea comercializrii, sunt antibioticele i proteinele terapeutice.
Sunt necesare de obicei cteva zeci de milioane de dolari i o perioad de circa 8-10 ani pentru
studii de cercetare-dezvoltare i testare n scopul acceptrii acestora ca medicamente.
Studiile propriu-zise de cercetare-dezvoltare sunt dedicate realizrii biotehnologiei,
cuprinznd inclusiv transformarea genetic a celulei productive, dar i ridicarea la scar a
proceselor pn la volumele de lucru ce asigur eficiena economic. Este interesant ns de
prezentat n ce constau studiile n vederea comercializrii. Dac considerm cazul lansrii pe pia a
unui nou antibiotic, unde activitile de efectuat sunt deja bine cunoscute, este vorba despre:
studii farmacologice (activitate antibacterian/antifungic/eventual antitumoral;
toxicitate acut/cronic pe animal; terapeutica infeciilor experimentale pe animale;
testele de efect mutagen i cancerigen; testele pe grupuri de subieci umani cunoscute
drept teste clinice).
studiile de producie (dezvoltarea tehnicilor de bioprocesare, de izolare-purificare) sunt
combinate cu fabricarea cantitilor de produs necesare testelor clinice.
 studii speciale, ce cuprind: teste de rezisten, studii de efecte sinergetice/efecte
negative; studii de stabilitate i de determinare a structurii chimice a antibioticului.
studii farmacocinetice (modul de aciune n organism).
studii economico-comerciale, inclusiv marketing i reclam.
Toate acestea alctuiesc un tablou destul de impresionant de activiti, cu costuri ridicate, pe
care n general numai marile companii i le permit.
n ultima perioad necesitatea de a cultiva n bioreactoare celule recombinante sau de a
separa produsele obinute cu astfel de tipuri de celule au constituit cele mai recente provocri,
crora a trebuit s le gseasc rezolvri pe msur inginerul biochimist. A fost nevoie ca acesta s-i
adapteze cunotinele despre bioprocesare i separare la noile constrngeri impuse de caracteristicile
modificate ale celulelor recombinante. Celulele transformate prin tehnici rADN pot prezenta
proprieti deosebite legate de form i mrime, rezisten structural i comportament diferit la
transportul prin membrane i peretele celular, tolerane modificate fa de evoluiile mediului de
cultur. Toi aceti factori pot influena semnificativ concepia despre realizarea bioreactorului i
performana lui, dar i stabilirea procedeelor de separare-purificare.
Stresul hidrodinamic de forfecare, care afecteaz de obicei unele celule de mucegaiuri sau
animale n timpul cultivrii n bioreactoare, poate avea efecte nc mai puternice asupra integritii
celulelor recombinante. Pentru a minimaliza pericolul de liz celular se cerceteaz geometrii
modificate n cazul bioreactoarelor i n aceeai msur-noi domenii de optim ale variabilelor de
operare (n special nivelele aerrii i agitrii mecanice). Sunt studiai de asemenea ageni chimici de
protecie celular, stabilindu-se dozele de adaos n mediu.
n ultim instan biotehnologia industrial este opera activitii n echip a unui
grup larg de specialiti. Astfel n cazul biotehnologiilor de ultim generaie numai prin
colaborarea ntre inginerul biochimist, enzimolog i genetician poate fi conceput
recombinantul genetic cel mai productiv pe baza studiilor de inginerie metabolic: cunoscnd
ciclul metabolic de obinerea unui produs util caracteristic unei tulpini industriale se
construiete modelul cinetic de formare a metabolitului i se studiaz dinamica biosintezei
avute n vedere; apoi prin analiza controlului metabolic se stabilete etapa cea mai lent, care
ncetinete transformarea n ansamblul ei. n continuare se poate realiza prin inginerie
genetic amplificarea activitii enzimei implicate n cataliza etapei lente, ceea ce conduce la
creterea nsemnat a vitezei globale de biosintez. n acest mod a fost elaborat o modalitate
raional de a crea tulpini recombinante nalt productive: creterea productivitii unui ciclu
metabolic este asigurat prin identificarea etapelor de lente de metabolism, urmat de eliminarea
constrngerilor cinetice cu ajutorul ingineriei genetice.
 Multe din studiile de ultim or, ce pot valorifica reuitele ingineriei genetice pn la nivelul
bioindustriei, chiar dac n prezent parcurg adesea doar primele stagii ale cercetrii, vor ajunge
probabil n cel mai scurt timp la certe dezvoltri comerciale.