Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Analiza chimic cromatografic este un domeniu mai recent al analizei instrumentale care
include mai multe metode de separare i totodat de analiz a componenilor amestecului din
prob. n toate variantele, separarea precede analiza i se realizeaz prin repetarea, de un numr
mare de ori, a echilibrului de distribuie ntre dou faze. Una dintre faze este imobil i poart
denumirea de faz staionar (aflat de regul ntr-un tub numit coloan) iar cealalt - faza mobil
- aflat n micare, se deplaseaz prin golurile primei faze. Separarea se petrece n coloana
cromatografic, piesa cheie a ntregii metode. Faza mobil, denumit i eluent - scurgndu-se
continuu (deci cu vitez constant) prin interstiiile fazei staionare, adeseori poroase, poate
provoca migrarea, cu viteze diferite, a celor n componeni ai amestecului de separat de-a lungul
coloanei. Amestecul supus separrii se introduce sub form de soluie la nceputul coloanei,
folosindu-se un dispozitiv de introducere a probei (de exemplu o microsering), i se afl iniial
fixat ntr-o zon ngust de la nceputul coloanei. Splai de eluent, o parte din componenii probei
migreaz apoi prin coloan cu viteze diferite. Acest lucru se datoreaz interaciunilor fizice
specifice, dintre moleculele probei i faza staionar (desigur, nu orice molecul poate migra pe
orice faz staionar). Efectul, este numit retenie i aceasta provoac o aa-numit migrare
difereniat. Adic moleculele migreaz n grupri, n fiecare grup existnd doar molecule de
acelai fel. Aceasta face posibil sesizarea componenilor, pe rnd, la prsirea coloanei, de ctre
un instrument, n grupurile respective - denumite uneori zone. Instrumentul amintit este un analizor
fizico-chimic, sensibil la mai muli (n mod ideal la oricare) dintre componeni ce ies din coloan i
care este plasat n eluent, imediat dup ieirea din coloan. Acest analizor, denumit detector este
capabil s dea un semnal proporional cu masa sau cu concentraia soluiei de component n faza
mobil. n consecin, dispozitivul, "marcheaz" trecerea fiecreia din substanele ce formeaz
iniial proba, similar cu o fotocelul care nregistreaz trecerea concurenilor la sosire n atletism.
Reprezentarea grafic a semnalului detectorului n funcie de timp poart numele de
cromatogram
Clasificarea metodelor cromatografice
S-au imaginat i realizat numeroase variante ale metodei cromatografice, diferind unele
de altele n primul rnd prin natura fazei mobile, dar i a celei staionare. Astfel se distinge
cromatografia de lichide (LC) cnd faza mobil este un lichid, cromatografia de gaze
(GC) cnd aceasta este un gaz sau cromatografia cu fluide supracritice la care faza
mobil este un lichid aflat peste temperatura critic. n cadrul cromatografiei de lichide se
mai face distincie ntre cromatografia pe coloan deschis i cea pe coloan nchis Pe
de alt parte, n cadrul fiecreia dintre acestea, distingem mai multe variante.
n cadrul LC se disting, n funcie de mecanismele de separare:
Cromatografia de adsorbie, una dintre primele tehnici utilizate, veche de mai bine un
secol (vet, 1903), utilizat pentru separarea substanelor organice cu molecule de
dimensiuni mici i medii pe adsorbeni, ca silicagel i alumin, folosindu-se, ca faze
mobile, diferite amestecuri de solveni organici.
Cromatografia ionic (de schimb ionic), care se petrece pe o faz staionar solid,
poroas, format din materiale specifice - schimbtorii de ioni - substane cu o reea
solid afnat, de natur organic sau anorganic, pe care se gsesc grefate, prin procesul
de obinere, nite centre de schimb ionic. Cele mai rspndite sunt rinile schimbtoare
de ioni - organice - la care scheletul-suport este unul organic - un polimer poros. Pe
aceste centre are loc o reacie ionic sau o interaciune ntre substana din soluie
(electrolit sau neelectrolit) i funciunea legat chimic de suportul solid, numit reacie de
schimb ionic.
Cromatografia de excluziune steric se desfoar pe faze staionare poroase dar cu
porozitatea selecionat astfel nct s corespund dimensiunilor moleculelor supuse
separrii. O parte dintre molecule intr prin pori, reuind s interacioneze cu suportul
solid, prin fore de adsorbie foarte slabe, iar altele sunt excluse deplasndu-se practic
nereinute odat cu faza mobil. Se obine astfel un soi de sit la scar molecular
separarea moleculelor fcndu-se n funcie de dimensiune. Tehnica se mai ntlnete i
sub denumirea de filtrare prin geluri sau permeaie prin geluri n funcie de natura
apoas sau organic a fazei mobile.
Cromatografia lichid-lichid (LLC), n care faza staionar este o faz lichid,
nemiscibil cu cea mobil i imobilizat pe un suport solid, ntr-o coloan. Aici suportul
solid este, cel puin principial, inert fa de componentele din prob. ntruct simpla
impregnare a unui suport poros cu un lichid permitea splarea acestuia n timp, s-a recurs
la legarea pe cale chimic a acestora de suport, obinndu-se nite faze cu totul specifice -
faze staionare legate chimic. Molecule organice de dimensiuni mici sunt, prin sintez,
legate de suportul poros, fenomenul de pierdere prin splare de ctre faza mobil, fiind
practic anulat. Acest tehnic este cea mai rspndit devenind aproape sinonim cu
cromatografia de lichide.
Cromatografia pe coloan deschis sau cromatografia planar (PC), se refer la un
grup de tehnici nrudite cu cele din LC, care au toate n comun faptul c faza mobil
circul printr-un material poros dispus ntr-un plan i formnd un strat relativ subire, dar
de compoziie asemntoare cu cele menionate la cromatografia pe coloan. Se disting:
Cromatogafia pe hrtie, tehnic n care faza staionar este o hrtie poroas din
celuloz (iniial o hrtie de filtru) care este irigat de solvent prin fore capilare - o
tehnic, azi, de importn istoric.
Cromatografia pe strat subire (TLC), n care faza staionar pulverulent este fixat de
suportul plan (sticl, aluminiu, material plastic) cu un liant, formnd un strat subire (0.1-
0.5mm) de asemenea irigat prin capilaritate.
Cromatografia pe strat subire de nalt performan (HPTLC), n care faza staionar
are granulaie extrem de fin ridicndu-se astfel eficiena separrilor dar i viteza
acestora. Toate acestea se caracterizeaz prin simplitate, accesibilitate i pre de cost
cobort, dar totodat prin performane ceva mai slabe dect cromatografia de lichide pe
coloan sub presiune ridicat (HPLC) varianta modern a LC.
n mod analog, n cazul cromatografiei de gaze (sau mai pretenios cromatografiei n
faz gazoas), denumit prescurtat GC se disting urmtoarele tehnici:
Cromatografia gaz-lichid n care faza staionar este un lichid nevolatil imobilizat pe
un
suport solid. Aici suportul poate fi unul granular, poros, situat ntr-o coloan n aa-
numita cromatografie de gaze convenional sau chiar pe pereii coloanei, confecionat
de dimensiuni capilare, n cromatografia pe coloan capilar.
Cromatografia gaz-solid este analog cu cele discutate la cromatografia de adsorbie i
la cea de excluziune steric cu deosebirea c schimbarea gazului nu modific
selectivitatea.
Faza staionar o constituie tot silicagelul sau alumina, respectiv sitele moleculare
(nite silicai naturali sau sintetici) respectiv granulele de carbon poros. Metoda este
extrem de important pentru separarea gazelor permanente (CO, CO2, O2, N2, gaze
nobile etc.) Din punct de vedere istoric, evoluia cromatografiei a cunoscut o suit de
progrese, care au adus-o din situaia iniial de metod de separare i purificare de
laborator la o tehnic de separare i analiz chimic cu o arie de aplicare aproape
universal. Iniial rusul vet, a introdus n 1903 cromatografia de lichide pe coloan
(LC). Aceast metod a fost uitat mult vreme i abia dup 1930, anul descoperirii
cromatografiei n strat subire pe alumin, s-a perfecionat metoda utiliznd coloana, o
dat cu nevoile de separare i purificare a compuilor organici naturali sau sintetici
implicai n biochimie. n 1941 enlezii Martin i Synge descoper cromatografia de
repartiie pe hrtie, reuind s separe cu ajutorul unui amestec de solveni care irig o
band de hrtie de filtru (coninnd o pictur de prob) aproape toi aminoacizii,
descoperire extrem de important pentru dezvoltarea ulterior a biochimiei. Doar
n 1952 aceiai A. J. P. Martin and R. L. M. Synge [102] au nlocuit faza mobil lichid
cu un gaz, realiznd pentru prima oar cromatografia de repartiie gaz-lichid. n aceast
variant, detecia a fost realizat fizico-chimic, n efluentul gazos, dup ieirea din
coloan, reuind astfel s mbunteasc marcant separrile. Din acest moment asistm
la demarajul extraordinar al acestor tehnici, devenite azi cteva din principalele mijloace
de analiz n chimia organic i biochimie, dar i n criminalistic, igien, controlul
alimentelor, industria metalurgic etc. Din 1968 Halazs, (profesor la Franckfurt/Main), a
pus la punct LC folosind un solvent sub presiune n calitate de faz mobil i detecie
fizico-chimic n efluentul lichid, acesta fiind nceputul dezvoltrii cromatografiei de
lichide sub presiune nalt (200 atm). Din 1980 s-a reuit i obinerea unor separri
analitice performante bazate pe schimb ionic prin introducerea eluenilor diluai i a
supresorului ionic - datorate americanilor Hamisch i Schmall, tehnic care de atunci a
primit denumirea de cromatografie ionic (IC). Azi se lucreaz nu numai cu
cromatografe de laborator, analitice, ci i cromatografe de proces, dedicate analizelor
automate ale proceselor industriale sau cromatografe preparative, destinate obinerii de
substane pure n industria farmaceutic sau n biotehnologii.
Cromatografia de gaze (GC)
Aceast tehnic cromatografic este printre cele mai rspndite i totodat este
prima dintre metodele de analiz cromatografic aplicat pe scar larg n analizele
chimice.
Compuii amestecului supus separrii nu trebuie s fie neaprat gaze, ci pot s fie
i lichide sau chiar solide volatile. Substanele de analizat se introduc n coloana de
separare, la o temperatur potrivit, prin intermediul unui dispozitiv de introducere a
probei. Singura restricie este temperatura de vaporizare care uneori poate fi mai mare
dect temperatura de descompunere a substanelor de analizat. n aceste cazuri se poate
recurge la alte tehnici cromatografice care au ca eluent un lichid sau fluid supracritic. De
asemenea, se mai pot realiza, nainte de introducerea probei n cromatograf, nite derivai
(compui noi), volatili, utiliznd anumite reacii chimice specifice, procedeu denumit
derivatizare. Uurina cu care se pune la punct o analiz nou, sensibilitatea sa,
posibilitatea de automatizare precum i largile posibiliti de aplicare sunt avantajele
principale ale acestei metode. Printre domeniile n care GC i-a cucerit un loc de prim
rang sunt: petrochimia, industria farmaceutic, protecia mediului, analiza aromelor,
igiena i criminalistica.
Cromatograful de gaze
Pentru coloane capilare, care au debitele mult mai mici iar volumele introduse n
coloane deosebit de mici, introducerea cu o sering a probelor, direct, ar compromite
coloana definitiv. De aceea se folosesc nite dispozitive speciale cu ajutorul crora doar o
mic fraciune din prob, cunoscut, intr n coloan iar restul este evacuat n
atmosfer. Dispozitivele se numesc split/splitless iar fraciunea de prob introdus efectiv
n coloan reprezint 1/20 pn la 1/500 din volumul injectat cu seringa. Incinta
termostatat n care se afl coloana, numit etuv-termostat, are temperature reglabil
ntr-un domeniu larg (40-450C) fiind foarte precis stabilizat (0.1C) i totodat
ventilat, pentru o egalizare rapid a temperaturii. La anumite cromatografe, se pot
executa i programe de temperatur, adic nclziri controlate ale coloanei, n timp, pe
parcursul efecturii analizei. Are loc n acest fel o volatilizare treptat a compuilor - la
nceput ies cei volatili care migreaz rapid i la urm, cei mai puin volatili care migreaz
foarte lent mrind mult durata analizei. Programele se stabilesc prin ncercri
experimentale.
Detectorii sunt instrumentele analitice propriu zise din gaz cromatografe, avnd
rolul de a sesiza n mod continuu, rapid i cu o mare sensibilitate, componentele din
proba supus analizei. n corpul detectorului zonele cromatografice care ies separate din
coloan, coninnd de preferin moleculele unei singure substane, se transform n
semnale electrice (picuri). Pentru a se putea compara, ca performane, fiecare detector
este caracterizat de nite mrimi fizice: specificitate, sensibilitate, zgomot de fond, drift,
limit de detecie, constant de timp, reactivitate, efect asupra probei i altele, comune
multor metode analitice. De asemenea, unii detectori distrug proba iar alii o las
nealterat, permind separarea fizic a acesteia. Despre sensibilitate i limita de detecie
am amintit n cursurile introductive cteva lucruri eseniale valabile i aici. n orice gaz
cromatograf trebuie s existe cel puin un detector universal care s permit nregistrarea
sigur a tuturor componenilor. n afar de acesta mai pot exista i ali detectori specifici,
care mresc sigurana analizei componenilor de interes practic, deoarece rspund doar la
anumite tipuri de molecule.
Zgomotul de fond (fig. 4) apare din cauz c urmrindu-se ca metoda s fie ct
mai sensibil, lucreaz la limita unde interfer zgomotul electronic cu cel dat de detector.
Att zgomotul de fond ct i driftul, de regul exprimat n variaia semnalului, timp de o
or, sunt prezentate schematic pe fig. 4. Se observ c zgomotul de fond const n
perturbaii minuscule ale liniei de baz avnd cauze multiple iar driftul este devierea
liniei de baz ntr - un timp dat (1 or) exprimat n unitile de msur uzuale ale
semnalului nregistrat (mV, mA).
Domeniul dinamic liniar al detectorului reprezint domeniul n care semnalul
variaz liniar cu concentraia (sau alteori cu debitul masei de component) ce trece prin
detector. Acesta se msoar de la limita de detecie pn la nivelul superior de
concentraie la care apar abateri de la liniaritate de peste 5%. Domeniul dinamic liniar se
stabilete experimental prin construirea curbei de etalonare n urma injeciei unor cantiti
cresctoare de component.
Exist mari diferene ntre metodele de detecie (tabelul 1) dar toate au domeniul
liniar mai ridicat dect multe dintre metodele de analiz optice. Cei mai utilizai detectori
sunt n practica curent detectorii cu un domeniu liniar larg, anume: detectorul bazat pe
conductibilitate termic (TCD), detectorul cu ionizare n flacr (FID), detectorul cu
fotoionizare (PID) i cel cu captur de electroni (ECD). Se observ de asemenea c cei
patru detectori acoper mpreun un larg domeniu de concentraii motiv pentru care gaz
cromatografele comerciale au n dotare cel puin doi din aceti detectori.
Constanta de timp reprezint viteza de rspuns a instrumentului din momentul
intrrii componentului n detector. Mai riguros, acesta reprezint timpul necesar
rspunsului detectorului pentru a atinge 90% din valoarea limit final. Acest parametru
include i ntrzierea datorat electronicii.
Reactivitatea include i posibilitatea reinerii de componente ale probei sau
provenite din aceasta prin degradare, prin adsorbie sau prin reacii chimice.
Efectul aspra probei poate fi distructiv sau nedistructiv. n ultimul caz proba
separat poate fi izolat. De exemplu, FID este un detector distructiv pe cnd TCD este
nedistructiv.
Acesta este unul din cei mai folosii detectori, n special datorit sensibilitii sale
ridicate la compuii cu carbon, practic nelipsii din orice tip de gaz-cromatograf dedicat
analizei substanele organice. Dei distruge proba, a fost detectorul care a consacrat
definitive cromatografia de gaze. Funcionarea sa are la baz modificarea
conductibilitii electrice a gazelor n prezena unor particule ncrcate (de regul
molecule ionizate). Dac la presiunea i temperatura ambiant un gaz aflat ntre doi
conductori este un izolator foarte bun, n momentul cnd ntre cei doi electrozi apar
particule ncrcate electric, n urma deplasrii acestora n cmpul electric creat, apare un
curent electric. Ionizarea moleculelor probei este intensificat de prezena unei flcri de
hidrogen, care arde n aer ntr-o incint, flacr ce atinge temperaturi ridicate (2000-
2200C).
Cele mai slabe semnale, care nu pot servi unei analize chimice, le dau substanele
alctuite din moleculele covalente simple: N2, O2, CO, CO2, H2O, CS2, NH3, CCl4,
SiCl4,oxizi de azot, He i alte gaze rare. De aceea gazul purttor n cromatografia de
gaze este N2, He sau Ar, condiii n care detectorul d un semnal de baz minim, foarte
stabil. Schia simplificat este prezentat n fig. 6.
Gazul purttor este n acest caz azotul. La ptrunderea n detector, acesta este
ionizat de ctre o surs - radioactiv (sunt suficieni civa mCi furnizai de o surs
coninnd 63Ni). Gazul, trece apoi printre doi electrozi, ntre care se asigur o cdere de
tensiune de o sut de voli (fig. 7), de regul ntre un electrod central, pozitiv i corpul
electrodului - negativ. n lipsa oricrei molecule organice n gazul purttor, exist un
curent de baz redus datorat moleculelor de diazot (N2) - ionizate negativ. La apariia n
detector a unei molecule organice M, care conine elemente electronegative (ca Cl sau F)
- cu mare afinitate pentru electroni, aceasta va capta o parte dintre electronii radiaiei -.
Va aprea, n consecin, o diminuare a curentului de recombinare a ionilor de semne
contrare. Au loc aadar transformrile:
Ali detectori
Suportul poros (i totodat inert) este format dintr-un material solid, elaborat
industrial, de form preferat sferic i cu o granulaie ct mai uniform (de exemplu 60-
80 mesh sau 80-100 mesh [109]). n raport cu suportul poros, faza staionar constituie
doar 3- 25%. Cele mai rspndite sunt confecionate din pmnturi diatomitice (de ex.
diversele tipuri de Chromosorb) dar multe sunt fabricate din silice (de ex. Spherosil).
Acestea se modific chimic prin silanizare pentru a deveni inerte.
Coloanele capilare sunt, la rndul lor, de cel puin dou tipuri:
faz staionar depuse chiar pe peretele coloanei capilare (WCOT)
faza staionar depus pe un suport solid, poros, aderent, format n prealabil pe
peretele acesteia (SCOT).
Au diametre 0.1-0.35mm i lungimi ntre 5-100m, separarea durnd ceva mai mult dect
la cele cu umplutur. Cu ct coloana este mai lung durata analizei crete. Coloanele
capilare se confecioneaz n ultimul timp mai ales din sticl de cuar. n exterior acestea
sunt mbrcate ntr-un polimer - poliamid - pentru a rezista mai bine la ocuri mecanice
respectiv la coroziune (n acelai scop se mai folosete aluminiul). Coloanele sunt
bobinate pe suporturi metalice avnd o form circular (fig. 10).
Coloanele WCOT conin faza staionar sub form de film subire n interiorul
capilarei, grosimea acestuia variind ntre 0.05-5m. Faza staionar poate fi depus fizic
sau chiar legat chimic de grupele -OH ale silicei hidratate. Si aceste coloane sunt
disponibile deja comercial pentru majoritatea aplicaiilor curente. Eficacitatea unei astfel
de coloane poate atinge 150mii talere teoretice. nlimea echivalent a unui taler teoretic,
H, n cazul acestor tipuri de coloane, are o expresie deosebit de ecuaia lui Van Deemter
i a fost descoperit de Golay, anume:
unde termenul A lipsete iar CG este coeficientul de difuzie al speciei moleculare
separate n faza gazoas, CL, fiind acelai coeficient pentru faza lichid. Coloanele
530m sau wide bore sunt confecionate tot din silice (SiO2) avnd lungimi cuprinse ntre
5-50m. Le-am putea denumi coloane semicapilare deoarece pstreaz caracteristicile
coloanelor capilare dar dimensiunile nu mai sunt apropiate de dimensiunea
firelor de pr. Debitul prin aceste coloane atinge 15mLmin-1 (adic intr n domeniul
celor cu umplutur), dar au performane superioare acestora.
Fazele staionare sunt i ele de mai multe feluri: polare, de exemplu
polietilenglicoli, nepolare de exemplu cauciucuri siliconice, intermediare i n sfrit cele
cu puni de hidrogen sau cele specifice (de exemplu cele destinate separrii amestecurilor
racemice). Fazele staionare sunt lichide sau solide.
Fazele staionare lichide sunt formate din lichide nevolatile avnd o compoziie
chimic foarte variat (peste 100 de tipuri). Pentru a se putea lega chimic numrul
acestora a fost restrns la cele care pot, prin sintez, s duc la un film grefat pe partea
intern a coloanei. La ora actual se pot distinge dou tipuri de compui preferai:
polisiloxanii i polietilenglicolii fiecare ntr-o varietate care s permit modificarea
polaritii acestora. Formulele acestora sunt ilustrate pe fig. 11.
Analiza calitativ
n care cu p s-a simbolizat raportul presiunilor, iniial (pi) respectiv final (pf), adic p =
pi/pf.
Cu ajutorul acestei mrimi semnale de retenie din diverse condiii experimentale se pot
face comparabile n analiza calitativ prin CG.
Volumul de retenie corectat, VR definit prin produsul:
VR0 = jVR
unde j este factorul de corecie de mai sus iar VR - volumul de retenie.
Volumul de retenie net, VN, este volumul de retenie ajustat dar corectat i pentru
cderea de presiune
VN = jVR'
Aceste volume sunt utilizate cu precdere n analiza calitativ fiind mai sigure dect
volumul de retenie simplu mai ales cnd nu se mai recurge la alte tehnici.
Volumul de retenie specific, Vg. Prin mrirea cantitii de faz lichid staionar,
fie prin utilizarea unei cantiti (grosimi) mai mari fie prin utilizarea unei coloane mai
lungi, crete volumul de retenie. Pentru a se lua n considerare i acest factor se definete
volumul de retenie specific (exprimat de regul n mL/g) cu ecuaia de definiie:
Vg = 273VN/(TcmL)
Dar pentru c toi aceti parametri depind, n mare msur, de o serie de condiii
experimentale ca temperatura, debitul gazului purttor, cantitatea de faz lichid etc,
pentru identificarea substanelor se recurge n ultimul timp la utilizarea indicilor de
retenie Kovts. Aceti indici, notai n continuare cu I, sunt practic independeni de
factorii amintii. Astfel, pentru orice substan de analizat calitativ se caut o pereche de
n-alcani care dau picuri situate ca timp de retenie unul nainte, altul dup substana
amintit. Din cele trei valori tR' msurate se calculeaz valorile I. Indicii de retenie
Kovts exprim retenia relativ a unei substane oarecare, fie cunoscut, fie
necunoscut, raportat la cea a unor alcani normali, luai drept substane de referin
(sau etalon). Formula de calcul, propus de autorul metodei, pentru indicii amintii este:
unde tR,X', tR,n' i tR,n+1' sunt timpii de retenie ajustai pentru substana necunoscut X
respectiv alcanii cu n respectiv n+1 atomi de carbon. Valoarea n se alege astfel ca tR,n' <
tR,X' < tR,n+1' adic, n aa fel ca timpul de retenie al substanei necunoscute s fie cuprins
ntre timpii de retenie ai celor doi alcani. De exemplu, benzenul are timpul de retenie
cuprins ntre cel al n-hexanului i al n-heptanului (ca i cum ar avea cam 6,5 atomi de
carbon). Schimbnd condiiile experimentale se schimb tR', respectiv VR', dar niciodat
valoarea indicilor de retenie I. Metoda se bazeaz pe faptul c practic nu exist substan
chimic separat prin GC creia s nu i se poat asocia o pereche de n-alcani care au
timpul de retenie, unul mai mare i altul mai mic dect substana respectiv. Pentru seria
omoloag a alcanilor este respectat ecuaia:
log(tR') = an + b
unde a i b sunt nite constante numerice gsite pe cale experimental, care sunt aceleai
pentru o coloan i condiii fizico-chimice date. Se observ c n formula valorii I,
termenul b se va reduce i factorul a se va simplific. Astfel, indicele Kovts, I, va
depinde doar de numrul aparent de atomi de carbon ai substanei respective - constant.
Experimental se procedeaz astfel: dup cteva ncercri preliminare se injecteaz
mpreun cei doi alcani, cu Cn respectiv Cn+1 mpreun cu substana de analizat, X iar
dup msurarea pe cromatogram a valorilor tR' pentru toate trei picurile componentelor
amestecului, prin nlocuirea acestora n formula precedent sau pe cale grafic, se obine
indicele Kovats, I (v. fig. 12).
Analiza cantitativ