Capitolul 12

12
TEHNICI DE ANALIZ A
GENELOR

Genele reprezint substratul molecular al ereditii.

Structura i localizarea genelor n genom controleaz
proprietile organismului. Ca rezultat al interaciunii
genomului cu diveri factori ai mediului, n ADN se pot
produce mutaii. Mutaia poate modifica metabolismul celular
i tisular, ceea ce conduce la dezvoltarea strilor patologice
(boli genetice). Tehnologia ADN recombinant a creat
premisele dezvoltrii unor metode de diagnostic molecular
dotate cu capacitate de rezoluie, grad de precizie i nivel
informativ net mai superioare celor ale metodelor
convenionale. Superioritatea absolut a abordrii moleculare
rezult ns din faptul c spre deosebire de toate celelalte
metode de diagnostic, limitate la determinarea exclusiv a
trsturilor fenotipice, - analiza ADN, destinat nemijlocit
studiului genotipului este singura n msur s obiectiveze
alterrile primare (mutaiile) care se fac direct responsabile
pentru starea de boal.
Tehnicile ADN recombinant permit identificarea
genelor normale i/sau a variantelor lor mutante, stabilirea
purttorilor de gene mutante, diagnosticul prenatal sau
presimptomatic al patologiilor genetice, iar n viitorul apropiat
apare posibilitatea terapiei genice.
193
Capitolul 12
Studiul molecular al genelor poate fi realizat
pe mai ci n dependen de scopul propus:
1. secvenierea ADN pentru determinarea structurii
primare a genei;
2. tehnica Southern-blot pentru identificarea poziiei
genei n genom.
3. tehnica Northen-blot pentru determinarea expresiei
genelor (analiza ARNm);
4. tehnica Western-blot pentru determinarea
produsului proteic al genei;
5. tehnica PCR pentru identificarea genei normale sau
mutante.
n laboratoarele de biologie molecular se utilizeaz diverse
variante ale metodelor menionate.
Pentru separarea fragmentelor de acizi nucleici se utilizeaz
electroforeza macromoleculelor n gel de agaroz sau de poliacrilamid.
Purtnd sarcin negativ, moleculele acizilor nucleici migreaz n cmpul
electric cu viteze diferite, n dependen de greutatea molecular.
Fragmentele mai scurte migreaz mai rapid, n timp ce fragmentele lungi
migreaz mai lent. Pentru determinarea dimensiunilor fragmentelor din gel,
concomitent cu fragmentele de interes sunt supuse electroforezei n trecuri
vecine i fragmente-marker ai lungimii. Moleculele acizilor nucleici pot fi
vizualizate n gel prin colorare cu ageni fluoresceni chimici, sau sunt
marcate radioactiv. n cazul marcrii radioactive fragmentele se identific
cu ajutorul autoradiografiei care const n suprapunerea gelului cu un film
fotosensibil.

Secvenierea ADN
Analiza secvenei bazelor azotate din structura
primar a ADN poate fi realizat prin dou ci: 1)
calea chimic (Maxam-Gilbert), n care se folosesc
reaciile chimice de clivare a ADN-ului n baze
individuale (fig. 12.1), dar fiind o metod complicat i
laborioas, n ultimii ani nu se mai utilizeaz; 2) calea
enzimatic (Sanger) n care ADN-ul este sintetizat in
194
 Capitolul 12
vitro pe baza matriei ADN studiat, n aa fel
nct reacia se termin specific n poziia care
corespunde unei baze anumite. Pentru a determina o
secven de nucleotide pe una din cile menionate,
ADN-ul este supus seriei de patru reacii separate,
fiecare reacie fiind specific pentru una din baze. Prin
electroforez produii de reacie vor migra n patru
curse paralele, pe acelai gel. Urmrind band cu
band, poate fi identificat ordinea nucleotidelor n

Fig. 12.1. Secvenierea ADN prin clivarea chimic

(Maxam-Gilbert)
ADN (fig. 12.2).

Tehnica SANGER (dideoxi)

195
Capitolul 12
Tehnica Sanger (dideoxi) utilizeaz
sinteza enzimatic a unei catene, complementar cu o
matri clonat. n cadrul acestei proceduri sinteza
este stopat prin ncorporarea unui di- deoxinucleozid
trifosfat - un analog al dezoxiribonucleotidelor.
Dideoxinucleozidtrifosfaii conin n poziia 3' grupa
H, dar nu grupa OH care mpiedic polimerizarea
nucleotidelor (fig. 12.2).
Folosind patru analogi dedeoxi diferii n timpul
sintezei catenei noi de ADN, se poate de identificat
fiecare nucleotid normal din catena matri.
Electroforeza fragmentelor obinute permite stabilirea
ordinii nucleotidelor n molecula de ADN.
n ultimii ani se utilizeaz o metod automat
de secveniere, bazat pe metoda dideoxi.

Fig. 12.2. Secvenierea ADN prin metoda dideoxi (Singer)

196
 Capitolul 12
n scopuri de diagnostic al purttorilor
de gene normale sau mutante se compar rezultatele
secvenierii cu datele structurii primare normale a
genei din bibliotecile de ADN. Spre regret, nu se
cunoate nc secvena tuturor genelor umane, de
aceea n diagnostic se utilizeaz metode indirecte:
nlnuirea cu markeri genetici apropiai (repetiii
hipervariabile de ADN mini- i microsatelitic),
determinarea situsurilor de restricie caracteristice
genei date, hibridarea cu sonde specifice etc.

Tehnica Southern-blot

Pentru analiza unor gene e necesar s se

determine localizarea specific a situsurilor de
restricie. Aceast informaie e utila pentru
compararea genelor omoloage ale diferitelor specii,
analiza organizrii intronilor, clonarea ntr-un vector a
prilor unei gene. Succesiunea situsurilor de
restricie ntr-o gena poate fi determinat fr a fi
necesar clonarea genei, folosind sonde moleculare
(secvene scurte de ADN monocatenar, marcate
radioactiv sau cu ageni fluoresceni i care sunt
complementare secvenei de interes).
Analiza const din urmtoarele etape:
(1) extragerea ADN genomic cu greutate molecular
mare din celule;
(2) digestia enzimatic a ADN-ului cu diferite ER,
fiecare producnd fragmente de lungime diferit;
(3) separarea fragmentelor de restricie prin
electroforez n gel de agaroz;

197
Capitolul 12
(4) denaturarea fragmentelor bicatenare cu
o soluie alcalin;
(5) neutralizarea gelului cu o soluie tampon;
(6) transferul capilar al fragmentelor de ADN pe
filtre de nailon sau nitroceluloz;
(7) hibridarea cu sondele monocatenare radioactive;
(8) autoradiografia pentru vizualizarea hibrizilor
ADN cercetat / ADN sond.
Transferul pe filtru de nitroceluloz se realizeaz
prin tehnica Southern-blot (de la numele
inventatorului Edward Southern) (fig. 12.3).
Analiza poate determina prezena sau lipsa unor situsuri
de restricie caracteristice genei analizate care se asociaz cu
anumite mutaii. Diferenele dintre hrile de restricie obinute

198
 Capitolul 12

Fig. 12.3. Principiile transferului acizilor nucleici pe filtru

i hibridarea cu sonde radioactive
(Southern-blot i Northern-blot)

de la doi indivizi este numit Polimorfismul Lungimii

Fragmentelor de Restricie (RFLP Restriction Fragment
Lenght Polimorphism). Acest polimorfism poate fi folosit ca
marker genetic n evaluarea genotipului.

Tehnica Northern-blot

Metoda Northern-blot const n transferul moleculelor

denaturate de ARN pe filtre de nailon sau nitroceluloz, urmat
de hibridarea cu sonde marcate. Aceast metod este similar
tehnicii Southern-blot cu deosebirea c ARNm extras i

199
Capitolul 12
purificat nu este supus scindrii cu enzime, iar
electroforeza decurge n condiii de denaturare.
Tehnica Northern-blot permite identificarea
transcripilor genelor analizate, stabilirea lungimii lor.

Tehnica Western-blot

Aceast metod const n identificarea unei proteine specifice din

amestecul de proteine celulare. Pentru aceasta, proteinele sunt separate prin
electroforez n condiii de denaturare n prezena SDS (Dodecil Sulfat de
Sodiu). Proteinele fracionate dup greutatea molecular sunt transferate pe
filtre de nailon sau nitroceluloz i supuse tratrii cu anticorpi specifici
marcai radioactiv sau fluorescent. Prin aceast metod se poate identifica
prezena/lipsa proteinei, dimensiunile ei, rata de expresie a genei.

Tehnica PCR n analiza genelor

Tehnica PCR poate fi utilizat pentru multiplicarea

selectiv a unei secvene dintr-o gen. Ca rezultat, se obin
populaii omogene de fragmente care pot fi utilizate n studiile
de n genetic molecular sau diagnostic (fig. 12.4, fig. 12.5).
Pentru a realiza amplificarea unei secvene este necesar
cunoaterea structurii genei normale sau mutante i sinteza
primerilor specifici complementari capetelor fragmentului de
interes. Primerii reprezint secvene oligonucleotidice
monocatenare de 20-30 baze care sunt obinute prin sintez
artificial. PCR se bazeaz pe hibridarea ADN cercetat - primer
i replicarea semiconservativ a ADN (Vezi cap. 11).
Avantajele tehnicii PCR sunt urmtoarele: suficiena
cantitilor mici de ADN, rapiditatea ei (n cteva ore se obin
milioane copii de ADN), specificitatea primerului permite
amplificarea selectiv a ADN, produsele de amplificare pot fi
utilizate n calitate de sonde pentru hibridri n alte tehnici.

200
 Capitolul 12

Fig. 12.5. Utilizarea tehnicii PCR pentru

identificarea deleiilor

Fig. 12.4. Utilizarea tehnicii PCR pentru identificarea

mutaiilor punctiforme cu primeri specifici
pentru gena normal

201
Capitolul 12
Aplicaiile practice ale tehnicii PCR:
- detectarea mutaiilor cunoscute la bolnavi i purttori;
- diagnosticul prenatal i presimptomatic al bolilor ereditare;
- determinarea genelor de predispoziie la bolile comune
(coronaropatii, boala hipertonic, tulburri psihice etc.);
- diagnosticul precoce i evaluarea pronosticului bolilor
canceroase;
- determinarea prenatal a sexului;
- identificarea agenilor patogeni (virui, bacterii);
- dactiloscopia genomic (identificarea persoanelor);
- analiza filiaiei (paternitate, maternitate);
- tipizarea HLA.

Hibridarea in situ

Hibridarea in situ reprezint o tehnic molecular , n

care o sond specific marcat poate identifica direct pe
preparatele celulare:
(1) un ARNm ntr-o celul particular sau esut;
(2) o gen pe un anumit cromozom sau fragment de
cromozom;
(3) numrul moleculelor de ARNm n dependen de perioada
ontogenetic sau tip tisular;
(4) ADN viral;
(5) deleiile cromozomiale submicroscopice;
(6) genele responsabile de producerea cancerului, localizarea
i nivelul lor de expresie.
Din motiv c sondele marcate radioactiv au unele
dezavantaje (tehnic laborioas, pericol pentru sntate) n
ultimii ani se utilizeaz metoda FISH (Fluorescence In Situ
Hibridization) care utilizeaz sonde fluorescent marcate (fig.
12.6). Metoda FISH este simpl, poate fi aplicat pe preparate
celulare arhivate, este rapid, nu modific morfologia celulelor.

202
 Capitolul 12

Fig. 12.6. Tehnica FISH

Verificarea cunotinelor:
1. Definii noiunile: secvenierea ADN, hibridarea acizilor
nucleici, Southern-blot, Northern-blot, hibridarea in situ,
autoradiografie, primeri, sonde moleculare.
2. Ce tehnici moleculare se utilizeaz pentru studiul acizilor
nucleici?
3. Care sunt aplicaiile practice ale acestor tehnici?
4. Care sunt principiile secvenierii ADN?
5. Care sunt etapele tehnicii Southern-blot?
6. Care sunt avantajele i dezavantajele tehnicii Southern-
blot?
7. n ce constau aplicaiile practice ale tehnicii PCR?

203