Utilizarea Medical i Biologic

a Gans-ului de CO2 i cupru

Noua stare a materiei "GANS" este explicat de

ctre Fizicianul Nuclear Mehran Keshe n
articolul lui din 01.06.2010 intitulat "Absorbia
direct a gazelor dioxid de carbon CO2 i metan
CH4 din mediu i conversia lor n soluie i
materii solide nano, precum i producerea de
energie i oxigen prin utilizarea amestecului
nano la temperatur i presiune ambiental".

Kt
GANS de CO2 GANS de cupru
 Decontaminarea apei prin utilizarea
apei energizate de pe Gans-ul de Cupru

1. Reduce Cererea Biochimic de Oxigen

2. ndeprteaz Solidele Aflate n Suspensie
3. ndeprteaz Nitraii Toxici

Gans de Cupru
Kt
 Decontaminarea apei prin utilizarea
apei energizate de pe Gans-ul de Cupru
Configurare Experiment

Kt
 Decontaminarea apei prin utilizarea
apei energizate de pe Gans-ul de Cupru
Rezultate

Start Dup 6 ore Dup 12 ore Dup 24 ore

Originea eantionului BOD Solide n suspensie Nitrai NO3

Lacul Inokashira mg/litru mg/litru mg/litru
Tokyo de Veste, Japonia
nainte 6782 19013 0,9
Dup 406,9 760,5 0,41
Curare % 94 96 55
Kt
 Utilizrile Medicale ale Gans-ului

Kt
 Cum se prepar pudr de Gans
la calitate farmaceutic
Preparare pudr de Gans de CO2 pentru administrare pe cale oral

1 - Punei o plac de cupru nano acoperit i una de zinc ntr-un vas de plastic.
2 - Conectai-le mpreun aa cum spune D-ul Keshe.
3 - Pregtii o soluie de 0,5M NaOH (sod caustic) i nclzii-o la 60C.
4 - Turnai soluia n vasul de plastic (reactor).
5 - Punei reactorul ntr-o baie de ap i stabilii temperatura de 60C (soluia n interiorul
reactorului).
6 - Dup 24 de ore, luai reactorul din baia de ap i lsai-l s se rceasc la temperatura camerei.
7 - Transferai precipitatul n sticle de centrifugare de 50mL, i centrifugai-l la 10000 rpm pentru
10 minute.
8 - Dup centrifugare nlocuii mediul de reacie cu aceiai cantitate de MilliQ.
9 - Vibrai sonic mediul de reacie (volum = 3L, puterea maxim 320W, frecvena = 35KHz). Energia
aplicat pe volumul (greutate) materialului de nano particule aflate n suspensie a fost estimat a fi
de aproximativ 4,8 Kj per 50 ml de particule (0,4 g). Repetai paii 7,8 i 9 de patru ori.
10 - dup patru cicluri de curare, uscai particulele la 80C (cu aer) i presiune atmosferic. 11 -
Pisai manual cu un pistil i un mojar pn obinei o pudr fin.
12 - Uscai n continuare pudra (PUDRA DE GANS) ntr-un cuptor cu vacuum la 60C i 20kPa
pentru dou ore.
Kt
 Cum se prepar nano particule de Gans
la calitate farmaceutic
Preparare nano particulelor (NP) de Gans de CO2 n H2O

1 - Punei o plac de cupru nano acoperit i una de zinc ntr-un vas de plastic.
2 - Conectai-le mpreun aa cum spune D-ul Keshe.
3 - Pregtii o soluie de 0,5M NaOH (sod caustic) i nclzii-o la 60C.
4 - Turnai soluia n vasul de plastic (reactor)
5 - Punei reactorul ntr-o baie de ap i stabilii temperatura de 60C (soluia n interiorul
reactorului)
6 - Dup 24 de ore, luai reactorul din baia de ap i lsai-l s se rceasc la temperatura camerei.
7 - Transferai precipitatul n sticle de centrifugare de 50mL, i centrifugai-l la 10000 rpm pentru
10 minute.
8 - Dup centrifugare nlocuii mediul de reacie cu aceiai cantitate de MilliQ.
9 - Vibrai sonic mediul de reacie (volum = 3L, puterea maxim 320W, frecvena = 35KHz). Energia
aplicat pe volumul (greutate) materialului de nano particule aflate n suspensie a fost estimat a fi
de aproximativ 4,8 Kj per 50 ml de particule (0,4 g). Repetai paii 7,8 i 9 de patru ori.
10 - dup patru cicluri de curare, filtrai mediul utiliznd filtru de hrtie fr cenu, de 8-10
microni.
11 - n continuare filtrai mediul utiliznd membran pentru ultra filtrare (HFU-2020N), cu
mrimea nominal a porilor de 100nm, i reglai concentraia conform dorinei.
Kt
 Apa de Gans de CO2 mpotriva H2O2
Distrugerea Indus a *mtADN-ului din Fibroblastele Umane
Testul (nucleoizi) cometei

Control, fr H2O2 H2O2

Distrugerile ADN-ului mitocondrial generate de

tratarea cu H2O2, formeaz nucleoizi ca i
cometele, n condiii electroforetice. Adugarea
de ap de Gans de CO2 (250M) furnizeaz
protecie complet mpotriva distrugerii ADN-ului
mitocondrial, generat de H2O2 (10M) n celulele
fibroblaste (HDFn).

* ADN mitocondrial
Ap de Gans de CO2, H2O2
Kt
 Gans-ul de CO2 mpotriva Cancerului
primul test necontrolat
Test pe o singur roztoare
Moned de 100 de yeni
pentru comparaie

TUMOR

26/10/2015 27/11/2015

Doz: 5mg/Kg de Gans aflat

oricel purttor n suspensie in ap,
al tumorii particule cu mrimea de oricelul vindecat
maxim 160nm.

1ml de injecie subcutanat n seciunea canceroas per zi

Hrnit cu mncare standard de laborator pentru roztoare

Kt
 Testarea in Vivo a Toxicitii Gans-ului de CO2
TOXICITATEA NANO PARTICULELOR DE GANS DE CO2
PRIN ADMINISTRARE INTRAVENOAS LA ORICEI.
Perioada experimentului: 14 Noiembrie 2016 5 Decembrie 2016
Gans-ul de CO2 a fost administrat intravenos la un numr de 65 de oricei, mprii n 13 grupe de cte 5 oricei fiecare.

Materialul testat: Nano particule dispersate de pudr de Gans de CO2, mrimea particulelor
<100nm (DLS), mrimea medie <35nm (APS) n H2O (tipul de modificare: cationic 3 Aminopropil
trietoxisilan). nainte de administrarea intravenoas, dispersia a fost diluat cu ap distilat pentru
a preveni agregarea.
Animalele de test: oricei femele de 8 sptmni (G.C. 27,0-34,2g) au fost cumprai de la CLEA
(Tokyo, Japonia). oriceii au fost pui doi ntr-o cuc, i supui ciclului de 12 ore de
lumin/ntuneric i cu acces nelimitat la hran i ap. Li s-a permis aclimatizarea cu mediul pentru
o perioad de o sptmn, nainte de tratament. ntr-un experiment preliminar, nu au fost
observate diferene sexuale legate de nano particulele de Gans.
Estimare LD50: estimarea LD50 a fost realizat utiliznd metoda Litchfield-Wilcoxon. Un total de
65 de oricei au fost expui la 1400, 1300, 1200, 1100, 1000, 500, 250, 100, 50, 5, 1, 0,5 i 0,1
mg/Kg de nano particule de Gans de CO2, injectate prin vena din coad. Dup injectare, au fost
observate simptomele i mortalitatea.
Acumularea n esut: O singur doz intravenoas (0,1, 1000mg/Kg) a fost fixat n 10% formol
pentru procesarea histologic de rutin. oriceii au primit o singur doz intravenoas prin vena
din coad i sacrificai la momentul necesar (1 or, 1 zi, 3 zile, 6 zile i 16 zile). Au fost colectate
eantioane de esut (ficat, rinichi i splin).
Kt
 Testarea in Vivo a Toxicitii Gans-ului de CO2
TOXICITATEA NANO PARTICULELOR DE GANS DE CO2
PRIN ADMINISTRARE INTRAVENOAS LA ORICEI.
Perioada experimentului: 14 Noiembrie 2016 5 Decembrie 2016

REZULTATE:
Estimarea LD50: Pentru a obine LD50 pentru oricei, 1400, 1300, 1200, 1100, 1000, 500, 250,
100, 50, 5, 1, 0,5 i 0,1 mg/Kg de nano particule de Gans de CO2, au fost injectate oriceilor
prin vena din coad. LD50 la oricei a fost determinat ca fiind 1400mg/kg prin injecie.
Dinamica sngelui: Conform LD50, a fost utilizat o doz de 1000mg/Kg de nano particule de
Gans de CO2. Concentraia de Gans n snge a crescut la maxim n primele 5 minute i a sczut
rapid dup 15 minute, apoi s-a schimbat moderat pn la final. Pe durata experimentului nu a
fost observat o hemoliza pronunat.

Schimbarea n timp a nivelelor de Gans din

Concentraia de Gans mg/ml

snge, n urma administrrii intravenoase

(1000 mg/Kg) la oricei. Datele prezint
creterea nivelelor de Gans dup scderea
nivelului Gans-ului la grupul de control. Datele
exprim media +/-S.D. (n=5)

Kt
Timp (min)
 Testarea in Vivo a Toxicitii Gans-ului de CO2
TOXICITATEA NANO PARTICULELOR DE GANS DE CO2
PRIN ADMINISTRARE INTRAVENOAS LA ORICEI.
Perioada experimentului: 14 Noiembrie 2016 5 Decembrie 2016

Distribuia de termen scurt a nano particulelor de Gans de CO2 n esut: distribuia pe

termen scurt a Gans-ului n esut a fost investigat la 4 momente (5 min, 15 min, 30 min i 1
or) de la injectarea intravenoas a nano particulelor de Gans de CO2 (1000mg/Kg)
(Fig.A,B,C). n general, o substan injectat intravenos este prima dat distribuit n plmni
iar apoi distribuit n ntreg corpul prin circulaia sngelui. Nivelul din ficat (Fig.A) a atins
maximul la 5 minute, apoi n rinichi (Fig.B) i n splin (Fig.C) la 10 minute. Ficatul a artat cea
mai mic concentraie pe 3 esuturi (Fig.A), iar nivelul n rinichi a sczut rapid dup 10 minute
la acelai nivel ca i grupul de control. Datele de mai jos exprim media +/-S.D.(n=5).
Concentraia Gans mg/g

Concentraia Gans mg/g

Ficat Rinichi Splin

Control Control Control

Timp (min) Timp (min) Timp (min)
Kt
 Testarea in Vivo a Toxicitii Gans-ului de CO2
TOXICITATEA NANO PARTICULELOR DE GANS DE CO2
PRIN ADMINISTRARE INTRAVENOAS LA ORICEI.
Perioada experimentului: 14 Noiembrie 2016 5 Decembrie 2016

Examinare Patologic: Nu au fost observate schimbri patologice n ficat, rinichi i splina

oriceilor. 1000mg/Kg o singur doz.

Control 16 zile 6 zile 3 zile 1 zi

FICAT
RINICHI
SPLIN
Kt
 Testarea in Vivo a Toxicitii Gans-ului de CO2
TOXICITATEA NANO PARTICULELOR DE GANS DE CO2
PRIN ADMINISTRARE INTRAVENOAS LA ORICEI.
Perioada experimentului: 14 Noiembrie 2016 5 Decembrie 2016

CONCLUZIE:

Dinamica sngelui i distribuia n esut a unei doze toxice de nano particule de Gans de CO2
a fost investigat prin expunere intravenoas la oricei.

Imediat dup injectare, nano particulele de Gans de CO2 au fost rapid ndeprtate din snge
i distribuite la diferite organe.

Distribuia pe termen scurt n esut a artat c splina, ficatul i rinichii au fost organele int
ale nano particulelor de Gans de CO2, i nu au fost observate distrugeri patologice la oricei
tratai.

LD50 la oricei a fost de 1400mg/Kg prin injectare, aceasta nsemnnd c nano particulele
de Gans de CO2 sunt practic netoxice.

Kt
 Eficacitatea Nano Particulelor de Gans
de CO2 i ZnO mpotriva Cancerului n Vitro
Perioada experimentului: 12 Decembrie 2016 30 Decembrie 2016
Proprietile anticancerigene ale nano particulelor de Gans asupra celulelor canceroase umane (HepG2, A5549 i BEAS-2B)

Materialul testat: Nano particule de Gans i Amino=CH3 "coninut n ap"

Reactivi: Ser fetal bovin, penicilin-streptomicin, mediul DMEM/F-12, mediul RPMI1640 i soluia
salin tamponat cu fosfat Dulbecco, au fost cumprate de la Nacalai Tesque (Kyoto, Japonia). Anticorpii
anti-p53, anti-bcl2 i anti--actin au fost obinui de la IBL (Takasaki, Japonia). Anticorpii secundari RIPA
i dodecil sulfat de sodiu (SDS) au fost cumprate de la Wako Pure Chemical Industry (Osaka, Japonia).
MTT (3-(4,5-Dimethiltiazol-2-yl)-2,5-Bromur de difeniltetrazoliu), GSH, (acidul 5,5-ditio-bis-2-
nitrobenzoic) (DTNB), acid tiobarbituric (TBA), 2,7-diacetat de diclorofluorescin (DCFH-DA) au fost
cumprate de la Sigma-Aldrich. Toate celelalte chimicale utilizate au fost de cea mai mare puritate
disponibil din surse comerciale.

Analiza mrimii nano particulelor de Gans de CO2 i ZnO: Mrimea medie hidrodinamic i potenialul
zeta al nano particulelor de Gans n ap i n mediul de cultur celular complet, au fost determinate
prin mprtierea dinamic a luminii (DLS) (Horiba LB 550, Horiba, Japonia). Ambele nano particule de
Gans de CO2 i ZnO au fost dispersate n ap i n mediul de cultur celular complet (DMEM) la o
concentraie de 15 g/ml i respectiv 0,1g/ml, pentru 24 de ore. Apoi, suspensia a fost vibrat utiliznd
o baie vibratoare la temperatura camerei pentru 15 minute, la 40W i apoi a fost realizat experimentul
DLS.
Kt
 Eficacitatea Nano Particulelor de Gans
de CO2 i ZnO mpotriva Cancerului n Vitro
Perioada experimentului: 12 Decembrie 2016 30 Decembrie 2016

Expunerea culturii de celule la nano particulele de Gans de CO2 i ZnO: Au fost utilizate trei tipuri de
celule canceroase (HepG2, A549 i BEAS-2B) i dou tipuri de celule de la obolani(astrocite i hepatocite)
pentru a determina rezistena celulelor mpotriva expunerii la nano particulele Gans-ului de CO2 i ZnO.
Carcinomul hepatocelular uman (HepG2) i celulele epiteliale bronhiale umane (BEAS-2B) au fost obinute
de la "American Type Culture Collection" (Rockville, MD, USA), iar adenocarcinomul pulmonar uman
(A549) a fost cumprat de la Banc Japonez de Resurse Canceroase (JCRB, Tokyo, Japonia). Astrocitele i
hepatocitele de obolan au fost izolate prin tehnica de perfuzie cu colagenaz.

Celulele au fost cultivate mediul n DMEM/F-12 sau RPMI 1640 suplimentat cu 10% ser fetal de bovine i
100 U/ml penicilin-streptomicin la 5% CO2 i 37C. La confluena de 85% celulele au fost recoltate
utiliznd 0,25% tripsin i au fost sub-cultivate n vase de 75cm2 i microplci cu 6 sau 96 de godeuri,
conform experimentului. Celulelor li s-a permis ataarea la suprafa pentru 24 de ore nainte de
tratament. Nano particulele de Gans de CO2 i ZnO au fost suspendate n mediul de cultur celular i
diluate fie cu ap sau cu Amino "coninut n ap" la concentraii adecvate (5g/ml, 10g/ml, 15g/ml de
nano particule de CO2 i 0,025g/ml, 0,05g/ml, 0,1g/ml de nano particule de ZnO). Diluiile de nano
particule de Gans au fost apoi vibrate utiliznd o baie vibratoare la temperatura camerei, pentru 10
minute la 40W, pentru a evita aglomerarea nano particulelor nainte de expunerea pe celule. n
continuare, celulele au fost recoltate pentru determinarea citotoxicitii, stresului oxidativ i a markerilor
de apoptoz. Celule neexpuse nano particulelor de Gans au servit ca i grup de control n fiecare
experiment.
Kt
 Eficacitatea Nano Particulelor de Gans
de CO2 i ZnO mpotriva Cancerului n Vitro
Perioada experimentului: 12 Decembrie 2016 30 Decembrie 2016

Test de rezisten a celulelor: Rezistena celulelor HepG2, A549, BEAS-2B i a celulelor primare de obolan
(hepatocite i astrocite) a fost obinut prin testul MTT. Pe scurt, s-a pus 1x104 celule/godeu ntr-o
microplac cu 96 de godeuri i expuse la 5g/ml, 10g/ml, 15g/ml i respectiv la 0,025g/ml, 0,05g/ml,
0,1g/ml, pentru 24 de ore. La finalul expunerii, mediul de cultur a fost ndeprtat din fiecare godeu
pentru a evita interferena nano particulelor de Gans i nlocuit cu un nou mediu coninnd soluie MTT
(0,5g/ml) ntr-o cantitate egal cu 10% din volumul culturii i incubat pentru 3 ore la 37 Celsius, pn
cnd s-a dezvoltat un produs formazan colorat n violet. Produsul formazan rezultat a fost dizolvat n
izopropanol acidifiat. Mai departe, microplaca cu 96 de godeuri a fost centrifugat la 2300xg pentru 5
minute, pentru depunerea nano particulelor de Gans rmase. Apoi, 100ul din lichidul supernatant a fost
transferat n alte godeuri noi de pe o microplac cu 96 de godeuri, i a fost msurat absorbia la 570nm
cu un cititor de microplci (MTP-900, Corona Electric, Japonia).

Imunoamprenta: Celulele hepatocancerigere umane HepG2 au fost cultivate ntr-o micropl cu cu 6

godeuri i expuse la nano particule de Gans de CO2 i ZnO, la concentraii de 15g/ml i respectiv
0,1g/ml, fiecare diluate pentru 24 de ore cu ap sau Amino "coninut n ap". Celulele recoltate au fost
dizolvate ntr-un buffer de dizolvare RIPA (1xTBS[0,5MTris-HCl i 1,5MNaCl] cu pH de 7,4, 1% NP-40, 0,5%
deoxicolat de sodiu, 0,1% SDS, 0,004% azid de sodiu) i n prezena unui inhibitor de proteaz. Celulele
dizolvate au fost analizate pentru coninutul proteic utiliznd un imunoamprentator SDS-Page. membrana
a fost apoi probat cu anticorpii p53, bax, bcl-2 i -actin pentru determinarea valorii proteice.

Kt
 Eficacitatea Nano Particulelor de Gans
de CO2 i ZnO mpotriva Cancerului n Vitro
Perioada experimentului: 12 Decembrie 2016 30 Decembrie 2016

Izolarea ARN-ului total i analiza cantitativ n timp real a PCR-ului pentru markerii apoptotici:
Celulele hepatocancerigene umane HepG2 au fost cultivate ntr-o microplac cu cu 6 godeuri i
expuse la nano particule de Gans de CO2 i ZnO, la concentraii de 15g/ml i respectiv 0,1g/ml,
fiecare diluate pentru 24 de ore cu ap sau Amino "coninut n ap". La finalul expunerii, ARN-ul
total a fost extras folosind aparatul SP kit RNA Tissue (Kurabo, Japonia) conform cu instruciunile
productorului. Concentraia RNA-ului extras a fost determinat utiliznd Spectrofotometrul UV-
1800 (Shimadzu, Japonia), iar integritatea RNA-ului a fost vizualizat folosind 1% gel de agaroz i
documentaia sistemului (AE-6933FXES, Atto, Japonia). Prima caten cADN a fost sintetizat din 1g
din ARN-ul total prin transcriptaz invers, utiliznd M-MLV (ReverTra Ace- -a, Toyobo Life Sciences,
Japonia) i oligoprimeri (dT) conform protocolului productorului. Analiza cantitativ PCR n timp
real a fost realizat folosind SYBR Green Tealtime PCR Master Mix (Toyobo Life Sciences, Japonia) i
utiliznd sistemul de detecie a secvenei ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems, CA, USA). Doi
microlitri de cAND au fost adugai la volumul final de 20l de amestec reactiv. Parametrii ciclului
PCR n timp real a inclus 10 minute la 95 C urmate de 40 de cicluri de denaturare la 95 de grade
Celsius pentru 15 secunde, recoacere la 60 de grade Celsius pentru 20 de secunde i elongate la 72
C pentru 20 de secunde. Toate experimentele PCR n timp real au fost realizate n trei copii, iar
datele au fost exprimate ca i o medie a cel puin trei experimente independente.

Kt
 Eficacitatea Nano Particulelor de Gans
de CO2 i ZnO mpotriva Cancerului n Vitro
Perioada experimentului: 12 Decembrie 2016 30 Decembrie 2016

Testul Caspase-3: Activitatea enzimei caspase-3 a fost determinat prin utilizarea testului standard cu
microplac fluorometric. Pe scurt, s-a pus 1x104 HepG2 celule/godeu ntr-o microplac cu 96 de godeuri
i expuse la nano particule de Gans de CO2 i ZnO cu concentraiile de 15g/ml i respectiv la 0,1g/ml,
diluate fie cu ap sau cu Amino "coninut n ap", pentru 24 de ore. Dup ce expunerea a fost complet,
celulele au fost recoltate ntr-un tampon de fosfat salin rece i s-a preparat dizolvatul de celule. Mai
departe, un amestec de reacie, coninnd 30l de celule dizolvate (50mM Hepes, 1mM EDTA i 1mM
DTT) (pH 7,2) a fost incubat pentru 15 minute. Fluorescena amestecului de reacie a fost msurat la
intervale de 5 minute pentru 15 minute la o lungime de und emis de 430/435nm, utiliznd un cititor de
microplci (MTP-900, Corona Electric, Japonia). A fost pregtit standardul (AFC) 7-amino-4-
trifluormetilcumarin n domeniul 5M la 15M, iar fluorescena acestuia a fost nregistrat pentru
calcularea activitii enzimei caspase-3 n termeni de pmoli AFC ai proteinei eliberate/minut/mg.

Testul de fragmentare apoptotic a ADN-ului: testul de fragmentare apoptotic a ADN-ului a fost realizat
pentru celulele HepG2 expuse la 15g/ml de nano particule de Gans de CO2 i la 0,1g/ml de nano
particule de Gans de ZnO diluate fie cu ap sau cu Amino "coninut n ap", pentru 24 de ore. La finalul
expunerii, ADN-ul a fost extras utiliznd Kitul de Detectare a Fragmentrii Apoptotice Wako (Wako
Chemical Industries, Japonia, Cat.No.297-71401). ADN-ul extras a fost evaluat pe 1% gel de agaroz
folosind bromur de etidiu. Modelul fragmentrii ADN-ului a fost documentat de un sistem de imagistic
cu gel.

Kt
 Eficacitatea Nano Particulelor de Gans
de CO2 i ZnO mpotriva Cancerului n Vitro
Perioada experimentului: 12 Decembrie 2016 30 Decembrie 2016

Testele parametrilor de stres oxidativ: Celulele HepG2 au fost cultivate ntr-un vas de cultur de 75cm2 i
expuse la nano particulele de Gans de CO2 i ZnO, la concentraiile de 15g/ml i respectiv la 0,1g/ml,
diluate fie cu ap sau cu Amino "coninut n ap", pentru 24 de ore. Dup tratament, celulele au fost
splate i recoltate ntr-un tampon de fosfat salin rece la 4C. Celulele recoltate au fost apoi dizolvate ntr-
un tampon de dizolvare celular (20 mM Tris-HCl [pH 7,5], 150mM NaCl, 1mM Na2EDTA, 1% Triton i
2,5mM pirofosfat de sodiu). n urma centrifugrii (10000xg pentru 10 minute la 4C), lichidul supernatant
(extractul de celule) a fost meninut pe ghea pn cnd au fost analizai markerii de stres oxidativ.

Extinderea membranei LPO a fost estimat prin msurarea formrii malondialdehidei (MDA) utiliznd
metoda OhKawa (OhKawa H, Ohishi N, Yagi K, Analiza peroxidrii lipidelor n esuturile animale prin
reacia acidului tiobarbituric. Anal Biochem. 1979; 95:351-358). MDA este unul din produsele membranei
LPO. Un amestec de 0,1ml de extract de celule i 1,9ml din 0,1M de tampon de fosfat de sodiu (pH 7,4) a
fost incubat la 37C pentru o or. Amestecul incubat, dup precipitare cu 5% TCA a fost centrifugat
(2300xg pentru 15 minute la temperatura camerei) i apoi colectat lichidul supertanant. Apoi 1,9ml din 1%
TBA a fost adugat n lichidul supernatant i pus n ap fiart pentru 15 minute. Dup rcire la
temperatura camerei, a fost msurat absorbia amestecului pentru 532nm i exprimat apoi n nmol/mg
protein, utiliznd coeficientul de extindere molar de 1,56 x 105 M-1cm-1. Nivelul GSH a fost cuantificat
utiliznd reactivul Ellman.

Kt
 Eficacitatea Nano Particulelor de Gans
de CO2 i ZnO mpotriva Cancerului n Vitro
Perioada experimentului: 12 Decembrie 2016 30 Decembrie 2016

Testele perametrilor de stres oxidativ - continuare: Amestecul de test const n tamponul fosfat,
DTNB i extractul de celule. Reacia a fost monitorizat la 412nm, iar cantitatea de GSH a fost
exprimat n termeni de nmol/mg protein. Activitatea enzimei superoxid disutaza (SOD) a fost
estimat prin angajarea metodei descrise mai devreme. Amestecul de test a coninut tamponul de
pirofosfat de sodiu, tetrazoliu nitroblue (NBT), metosulfat de fenazin (PMS), nicotinamida dinin
dinucleotid (NADH) i volumul necesar de extract de celule. O unitate a activitii enzimei SOD este
definit ca i cantitatea de enzime necesare pentru inhibarea producuie de cromogen (densitate
optic la 560nm) cu 50% ntr-un minut n condiii de test, i este exprimat ca activitate specific n
uniti/mg protein. Activitatea catalazei (CAT) a fost msurat prin abilitatea ei de a mpri
peroxidul de hidrogen (H2O2) ntr-un minut din timpul de incubaie. Reacia a fost apoi oprit prin
adugare reactivilor dicromat/acid acetic, iar ce a rmas (H2O2) a fost determinat prin msurarea
acetatului cromic la 570nm, care este format prin reducerea dicromatului/acid acetic n prezena
H2O2, aa cum a fost descris mai devreme. Activitatea specific a CAT a fost exprimat ca i
uniti/mg protein. Activitatea reductazei GSH (GR) a fost msurat urmrind oxidarea NADPH n
NADP+ pe durata reduceri GHS-ului (GSSG) oxidat. Activitatea GR a fost exprimat ca i nmol de
NADPH/minut/mg protein. Activitatea peroxidazei GHS (GPx) a fost examinat prin cuplarea
reducerii peroxidului cu GHS-ul i reciclarea GSSG de ctre GR n exces, utiliznd NADPH ca i
cofactor. Activitatea GPx a fost exprimat ca i nmol de NADPH/minut/mg protein.

Kt
 Eficacitatea Nano Particulelor de Gans
de CO2 i ZnO mpotriva Cancerului n Vitro
Perioada experimentului: 12 Decembrie 2016 30 Decembrie 2016

Msurarea nivelului ROS intracelular: Producerea intracelular de ROS a fost msurat utiliznd
2,7-diacetat de diclorofluorescin (DCFH-DA). DCFH-DA intr pasiv n celul, unde reacioneaz cu
ROS pentru a forma compusul puternic fluorescent diclorofluorescin (DCF). Pe scurt, 10nM de
soluie de DCFH-DA (n metanol) a fost diluat n mediul de cultur fr ser sau ali aditivi, pentru a
produce 100 M de soluie. Celulele HepG2 au fost tratate cu nano particule de Gans de CO2 la o
concentraie de 15g/ml i cu nano particule de Gans de ZnO la o concentraie de 0,1g/ml diluate
fie cu ap sau cu Amino "coninut n ap", pentru 24 de ore. La finalul expunerii, celulele au fost
splate de dou ori cu HBSS i apoi incubate ntr-un ml de soluie de DCFH-DA la 37C pentru 30 de
minute. Celulele au fost dizolvate n soluie alcalin i centrifugate la 2300xg pentru 10 minute. 200
l de lichid supernatant a fost transferat ntr-o microplac cu 96 de godeuri, i a fost msurat
fluorescena la 485nm i 520nm utiliznd un cititor de microplci (MTP-900, Corona Electric,
Japonia). Valorile au fost exprimate ca i procent din intensitatea fluorescenei relativ la godeurile
de control.

Estimarea proteinei: Coninutul total de protein a fost msurat prin utilizarea Kitului de Testare
Proteic Rapid Wako (Wako Chemical Industrie, Japonia, Cat.No.299-56103) i albumina serului
bovin ca i standard.

Kt
 Eficacitatea Nano Particulelor de Gans
de CO2 i ZnO mpotriva Cancerului n Vitro
Perioada experimentului: 12 Decembrie 2016 30 Decembrie 2016

REZULTATE:

Analiza mrimii nano particulelor de Gans de CO2 i ZnO: Mrimea medie hidrodinamic a
nano particulelor de CO2 n ap i n mediul de cultur a celulelor, determinate prin DLS a fost
de 69nm i respectiv 65nm, iar mrimea medie hidrodinamic a nano particulelor de ZnO n
ap i n mediul de cultur a celulelor a fost de 188nm i respectiv 115nm. Mai departe,
potenialul zeta al nano particulelor de CO2 n ap i n mediul de cultur a celulelor a fost de -
39,2mV i respectiv de -43mV, iar potenialul zeta al nano particulelor de ZnO n ap i n
mediul de cultur a celulelor a fost de -31,3mV i respectiv 33,8mV.

Ap Mediu de cultur
NP de CO2 NP de ZnO NP de CO2 NP de ZnO
Mrime hidrodinamic (nm) 69 118 65 115
Potenial zeta (-mV) 39,2 31,3 43 33,8

Kt
 Eficacitatea Nano Particulelor de Gans
de CO2 i ZnO mpotriva Cancerului n Vitro
Perioada experimentului: 12 Decembrie 2016 30 Decembrie 2016

REZULTATE:
Distrugerea selectiv a celulelor canceroase de ctre nano particulele de Gans: Pentru 24 de ore, trei
tipuri de celule canceroase (HepG2, A549 i BEAS-2B) i dou tipuri de celule normale de la obolani
(astrocite i hepatocite), au fost expuse la nano particulele de Gans de CO2 diluate n ap la o concentraie
de 5g/ml, 10g/ml, 15g/ml i diluate cu Amino "coninut n ap" la o concentraie de 15g/ml, i de
asemenea la nano particulele de Gans de ZnO diluate cu ap la o concentraie de 0,025g/ml, 0,05g/ml,
0,1g/ml i diluate cu Amino "coninut n ap" la o concentraie de 0,1g/ml. Dup 24 de ore, a fost
determinat citotoxicitatea acestora, utiliznd testul MTT. Rezultatele au artat c nano particulele de
Gans de CO2 i ZnO sub concentraia de 15g/ml i respectiv 0,1g/ml, nu au produs o reducere
important a rezistenei acestor trei tipuri de celule canceroase (P<0,05 pentru fiecare). Dac concentraia
de nano particule de Gans de CO2 i ZnO este mrit la 15g/ml i respectiv 0,1g/ml, a fost observat o
reducere important n rezistena celulelor pentru toate celulele canceroase, ntr-o manier dependent
de doz (P<0,05 pentru fiecare), n timp ce nano particulele de Gans de CO2 i ZnO nu au indus nici o
reducere semnificativ a rezistenei astrocitelor i hepatocitelor obolanilor, la nici o concentraie utilizat
n acest experiment. Pe de alt parte, concentraia de 15g/ml pentru nano particulele de Gans de CO2 i
de 0,1g/ml pentru nano particulele de Gans de ZnO diluate cu Amino "coninut n ap", nu au produs nici
o reducere semnificativ a rezistenei celulelor pentru toate celulele canceroase sau rezistenei
astrocitelor i hepatocitelor obolanilor (P<0,05 pentru fiecare).

Kt
 Eficacitatea Nano Particulelor de Gans
de CO2 i ZnO mpotriva Cancerului n Vitro
Perioada experimentului: 12 Decembrie 2016 30 Decembrie 2016

REZULTATE:
Distrugerea selectiv a celulelor canceroase de ctre nano particulele de Gans - continuare: La mrirea
concentraiei nano particulelor de Gans de CO2 la valoarea de 15g/ml, rezistena celulelor a fost
semnificativ redus la 93%, 99% i 97% pentru celulele BEAS-2B, Hep-G2 i A549 (P<0,05 pentru fiecare),
iar la mrirea concentraiei nano particulelor de Gans de ZnO la valoarea de 0,1g/ml, rezistena celulelor
a fost semnificativ redus la 98%, 99% i 99% pentru celulele BEAS-B2, Hep-G2 i A549 (P<0,05 pentru
fiecare). Totui, au fost observate praguri de concentraie interesante. Nici nano particulele de Gans de
CO2 nici cele de ZnO nu au indus nici o reducere n rezistena celulelor BEAS-2B, HepG2 i A549 pn la
concentraia maxim (15g/ml pentru nano particulele de Gans de CO2 i 0,1g/ml pentru nano
particulele de Gans de ZnO.)

Kt
 Eficacitatea Nano Particulelor de Gans
de CO2 i ZnO mpotriva Cancerului n Vitro
Perioada experimentului: 12 Decembrie 2016 30 Decembrie 2016

Distrugerea selectiv a celulelor canceroase de ctre nano particulele de Gans de ZnO:

Rezistena celulelor (% din control)

HepG2 A549 BEAS-2B Astrocite Hepatocite

primare primare
Efectul nano particulelor de Gans de ZnO asupra rezistenei a trei tipuri de celule canceroase (HepG2,
A549 i BEAS-2B) i asupra a dou tipuri de celule normale (astrocite i hepatocite de la obolani). Celulele
au fost tratate cu nano particule de Gans de ZnO i diluate cu ap la o concentraie de 0,025g/ml,
0,05g/ml, 0,1g/ml i cu Amino "coninut n ap" la o concentraie de 0,1g/ml pentru 24 de ore. La
finalul expunerii, a fost determinat rezistena celulelor utiliznd testul MTT. Datele reprezentate sunt
Kt
media +/- deviaia standard a trei experimente identice realizate de cte trei ori fiecare.
 Eficacitatea Nano Particulelor de Gans
de CO2 i ZnO mpotriva Cancerului n Vitro
Perioada experimentului: 12 Decembrie 2016 30 Decembrie 2016

Distrugerea selectiv a celulelor canceroase de ctre nano particulele de Gans de CO2:

Rezistena celulelor (% din control)

HepG2 A549 BEAS-2B Astrocite Hepatocite

primare primare
Efectul nano particulelor de Gans de CO2 asupra rezistenei a trei tipuri de celule canceroase (HepG2,
A549 i BEAS-2B) i asupra a dou tipuri de celule normale (astrocite i hepatocite de la obolani). Celulele
au fost tratate cu nano particule de Gans de CO2 i diluate cu ap la o concentraie de 5g/ml, 10g/ml,
15g/ml i cu Amino "coninut n ap" la o concentraie de 15g/ml pentru 24 de ore. La finalul expunerii,
a fost determinat rezistena celulelor utiliznd testul MTT. Datele reprezentate sunt media +/- deviaia
Kt
standard a trei experimente identice realizate de cte trei ori fiecare.
 Eficacitatea Nano Particulelor de Gans
de CO2 i ZnO mpotriva Cancerului n Vitro
Perioada experimentului: 12 Decembrie 2016 30 Decembrie 2016

Nano particulele de Gans de CO2 i de ZnO au modificat exprimarea nivelelor mARN-ului genelor
apoptotice din celulele canceroase HepG2 ale ficatului uman: PCR-ul cantitativ n timp real a fost utilizat
pentru analiza nivelelor mARN-ului genelor apoptotice (p53, bax, bcl-2 i caspase-3) din celulele HepG2,
expuse la nano particulele de Gans de CO2 i ZnO la concentraiile de 15g/ml i respectiv la 0,1g/ml,
diluate fie cu ap sau cu Amino "coninut n ap", pentru 24 de ore. Rezultatele arat c nano particulele
ambelor Gans-uri de CO2 i ZnO au modificat semnificativ nivelele de exprimare ale mARN-ului acestor
gene n celulele HepG2. Nivelul de exprimare a mARN-ului a genei tumorale p53 (Fig.A) i a genei
proapoptotice bax (Fig.B) a fost semnificativ mrit (P<0,05 pentru fiecare).
A B
Control Control
Gans Gans
Gans+Amino Gans+Amino
Modificare

Kt Control CO2 ZnO Control CO2 ZnO

 Eficacitatea Nano Particulelor de Gans
de CO2 i ZnO mpotriva Cancerului n Vitro
Perioada experimentului: 12 Decembrie 2016 30 Decembrie 2016

Nano particulele de Gans de CO2 i de ZnO au modificat exprimarea nivelelor mARN-ului genelor
apoptotice din celulele canceroase HepG2 ale ficatului uman: PCR-ul cantitativ n timp real a fost utilizat
pentru analiza nivelelor mARN-ului genelor apoptotice (p53, bax, bcl-2 i caspase-3) din celulele HepG2,
expuse la nano particulele de Gans de CO2 i ZnO la concentraiile de 15g/ml i respectiv la 0,1g/ml,
diluate fie cu ap sau cu Amino "coninut n ap", pentru 24 de ore. Rezultatele arat c nano particulele
ambelor Gans-uri de CO2 i ZnO au modificat semnificativ nivelele de exprimare ale mARN-ului acestor
gene n celulele HepG2. Nivelul de exprimare a genei apoptotice bcl-2 (Fig.C) a fost semnificativ redus iar
exprimarea mARN-ului enzimei caspase-3 a fost semnificativ mrit la celulele tratate cu ambele nano
particule de CO2 i ZnO, fa de celulele de control netratate (Fig.D)(P<0,05 pentru fiecare).
C D
Control Gans+Amino Control
Gans Gans
Modificare

Gans+Amino

Kt Control CO2 ZnO Control CO2 ZnO

 Eficacitatea Nano Particulelor de Gans
de CO2 i ZnO mpotriva Cancerului n Vitro
Perioada experimentului: 12 Decembrie 2016 30 Decembrie 2016

Nano particulele de Gans de CO2 i de ZnO au modificat exprimarea nivelelor proteice ala genelor
apoptotice din celulele canceroase HepG2 ale ficatului uman: Pentru a confirma rezultatele cantitative
ale PCR-ului n timp real, noi am examinat n continuare exprimarea nivelelor proteice ale celulelor HepG2
expuse nano particulelor de Gans de CO2 i ZnO, utiliznd imunoamprentarea. Similar cu rezultatele
mARN-ului, nivelul proteic al p53 a fost semnificativ mrit (P<0,05 pentru fiecare).

p53 p53
Control
bax
Gans
bcl-2
Gans+Amino

Modificare
-actin

Control CO2 ZnO

Kt
 Eficacitatea Nano Particulelor de Gans
de CO2 i ZnO mpotriva Cancerului n Vitro
Perioada experimentului: 12 Decembrie 2016 30 Decembrie 2016

Nano particulele de Gans de CO2 i de ZnO au modificat exprimarea nivelelor proteice ala genelor
apoptotice din celulele canceroase HepG2 ale ficatului uman: Pentru a confirma rezultatele cantitative
ale PCR-ului n timp real, noi am examinat n continuare exprimarea nivelelor proteice ale celulelor HepG2
expuse nano particulelor de Gans de CO2 i ZnO, utiliznd imunoamprentarea. Similar cu rezultatele
mARN-ului, nivelul proteic al bax a fost semnificativ mrit n timp ce exprimarea bcl-2 a fost semnificativ
redus la celulele tratate cu ambele nano particule de Gans de CO2 i ZnO (P<0,05 pentru fiecare).

bax bcl-2
Control Control
Gans Gans

Gans+Amino Gans+Amino
Modificare

Control CO2 ZnO Control CO2 ZnO

Kt
 Eficacitatea Nano Particulelor de Gans
de CO2 i ZnO mpotriva Cancerului n Vitro
Perioada experimentului: 12 Decembrie 2016 30 Decembrie 2016

Nano particulele de Gans de CO2 i de ZnO au modificat exprimarea nivelelor proteice ala genelor
apoptotice din celulele canceroase HepG2 ale ficatului uman: Pentru a confirma rezultatele cantitative
ale PCR-ului n timp real, noi am examinat n continuare exprimarea nivelelor proteice ale celulelor HepG2
expuse nano particulelor de Gans de CO2 i ZnO, utiliznd imunoamprentarea. Activitatea enzimei
caspase-3 a fost de asemenea semnificativ mai mare la celulele expuse ambelor nano particule de Gans
de CO2 i ZnO, n comparaie cu celulele de control (P<0,05).
mol AFC eliberat/min/mg protein

Control

Gans

Gans+Amino

Control CO2 ZnO

Kt
 Eficacitatea Nano Particulelor de Gans
de CO2 i ZnO mpotriva Cancerului n Vitro
Perioada experimentului: 12 Decembrie 2016 30 Decembrie 2016

Nano particulele de Gans de CO2 i de ZnO au indus fragmentarea apoptotic a ADN-ului din celulele
canceroase HepG2 ale ficatului uman: Au fost analizate profilele ADN ale celulelor tratate cu 15g/ml de
nano particule de Gans de CO2 i 0,1g/ml de nano particule de Gans de ZnO pentru 24 de ore, mpreun
cu celulele de control netratate. La celulele de control ADN-ul nu a fost fragmentat, n timp ce celulele
tratate cu nano particulele ambelor Gans-uri de CO2 i ZnO diluate cu ap, au pornit procesul apoptotic
aa dup cum a fost evideniat de fragmentarea ADN-ului. Pe de alt parte celulele tratate cu nano
particulele ambelor Gans-uri de CO2 i ZnO diluate cu Amino "coninut n ap", nu au indus fragmentarea
apoptotic a ADN-ului.

Kt
 Eficacitatea Nano Particulelor de Gans
de CO2 i ZnO mpotriva Cancerului n Vitro
Perioada experimentului: 12 Decembrie 2016 30 Decembrie 2016

Nano particulele de Gans de CO2 i de ZnO au modificat echilibrul oxidant/antioxidant din celulele
canceroase HepG2 ale ficatului uman: Starea oxidanilor i antioxidanilor a fost examinat n celulele
canceroase HepG2 ale ficatului uman, tratate cu 15g/ml de nano particule de Gans de CO2 i 0,1g/ml de
nano particule de Gans de ZnO, diluate fie cu ap sau cu Amino "coninut n ap", pentru 24 de ore.
Nivelele ROS i LPO au fost msurate ca i markeri ai oxidanilor. Rezultatele arat c nivelele oxidanilor
(ROS i LPO) au fost semnificativ mai mari la celulele tratate, n timp ce nano particulele de Gans diluate
cu Amino "coninut n ap" nu au mrit nivelele antioxidanilor (P<0,05 pentru fiecare).
ROS MDA
Fluorescena DCF, % din control

Control Control

MDA (nmol/mg protein)

Gans Gans
Gans+Amino Gans+Amino

Control CO2 ZnO Control CO2 ZnO

Kt
 Eficacitatea Nano Particulelor de Gans
de CO2 i ZnO mpotriva Cancerului n Vitro
Perioada experimentului: 12 Decembrie 2016 30 Decembrie 2016

Nano particulele de Gans de CO2 i de ZnO au modificat echilibrul oxidant/antioxidant din celulele
canceroase HepG2 ale ficatului uman: Starea oxidanilor i antioxidanilor a fost examinat n celulele
canceroase HepG2 ale ficatului uman, tratate cu 15g/ml de nano particule de Gans de CO2 i 0,1g/ml de
nano particule de Gans de ZnO, diluate fie cu ap sau cu Amino "coninut n ap", pentru 24 de ore. Starea
antioxidanilor a fost examinat prin determinarea GSH, SOD, CAT, GPx i GR. Nano particulele de Gans de
CO2 i ZnO care au fost diluate cu ap la concentraiile de 15g/ml i respectiv 0,1g/ml, au indus golirea
enzimei GSH mpreun cu activitatea redus a enzimei antioxidant GPx (P<0,05 pentru fiecare).
GSH GPx
Gans+Amino Gans+Amino
GSH (nmol/mg protein)

Gans Gans

GPx (nmol NADPH/min/mg

Control Control

protein)

Control CO2 ZnO Control CO2 ZnO

Kt
 Eficacitatea Nano Particulelor de Gans
de CO2 i ZnO mpotriva Cancerului n Vitro
Perioada experimentului: 12 Decembrie 2016 30 Decembrie 2016

Nano particulele de Gans de CO2 i de ZnO au modificat echilibrul oxidant/antioxidant din celulele
canceroase HepG2 ale ficatului uman: Starea oxidanilor i antioxidanilor a fost examinat n celulele
canceroase HepG2 ale ficatului uman, tratate cu 15g/ml de nano particule de Gans de CO2 i 0,1g/ml de
nano particule de Gans de ZnO, diluate fie cu ap sau cu Amino "coninut n ap", pentru 24 de ore. Starea
antioxidanilor a fost examinat prin determinarea GSH, SOD, CAT, GPx i GR. Nano particulele de Gans de
CO2 i ZnO care au fost diluate cu ap la concentraiile de 15g/ml i respectiv 0,1g/ml, au indus
epuizarea micii activiti a enzimelor antioxidante GR, SOD i CAT, n celulele HepG2 (P<0,05 pentru
fiecare).
GR (nmol NADPH/min/mg protein)

Control Gans+Amino Gans+Amino Control Gans+Amino

Gans Gans
SOD (uniti/mg protein)

CAT (uniti/mg protein)

Gans
Control

Control CO2 ZnO Control CO2 ZnO Control CO2 ZnO

Kt
 Eficacitatea Nano Particulelor de Gans
de CO2 i ZnO mpotriva Cancerului n Vitro
Perioada experimentului: 12 Decembrie 2016 30 Decembrie 2016

CONCLUZIE:
Am observat c nano particulele ambelor Gans-uri de CO2 i ZnO au efecte distincte asupra rezistenei
celulelor mamiferelor mpotriva celulelor canceroase (HepG2, A549 i BEAS-2B), n timp ce nu prezint nici
un efect asupra celulelor normale (astrocite i hepatocite de obolan). Diferena evident n citotoxicitatea
dintre celulele canceroase i celulele normale sugereaz un potenial interesant pentru nano particulele
de Gans de CO2 i ZnO ca i noi alternative n terapia cancerului.

Datele noastre moleculare arat c nivelele mARN i ale proteinelor genei tumorale p53 i genei
apoptetice bax au fost mrite n timp ce cele ale genei antiapoptetic bcl-2 au fost sczute la celulele
cancerigene HepG2 ale ficatului uman, tratate cu nano particulele ambelor Gans-uri de CO2 i ZnO. Nano
particulele ambelor Gans-uri de CO2 i ZnO s-a descoperit c induc activitate enzimei caspase-3 i
fragmentarea ADN-ului n celulele HepG2. Mai mult de att, nano particulele ambelor Gans-uri au indus
nivele mrite ale oxidanilor (ROS i LPO) i au redus capacitatea antoixidant a celulelor HepG2. Acest
experiment sugereaz ca nano particulele de Gans induc apoptoza n celulele canceroase, care este
mediat de ROS via p53, bax/bcl-2 i caspase prin care cele mai multe din medicamentele anti cancer
activeaz apoptoza, n timp ce nu posed nici o toxicitate pentru celulele sntoase. Pe de alt parte,
adugarea nano particulelor de Gans diluate cu Amino "din coninutul de ap", au redus activitatea nano
particulelor.

Kt
 Eficacitatea Nano Particulelor de Gans
de CO2 i ZnO mpotriva Cancerului n Vivo Test preliminar
Perioada experimentului: 20 Februarie 2017 Continu

Test preliminar necontrolat: 3 grame de nano particule de Gans de CO2 au fost combinate ntr-un litru de
ap distilat pentru a forma o soluie. 1ml de nano particule de Gans de CO2 au fost injectate (subcutanat)
n fiecare tumor zilnic.

Rezultate

nainte Dup injectarea tratamentului 20 de zile

Kt
 Eficacitatea Nano Particulelor de Gans
de CO2 i ZnO mpotriva Cancerului n Vivo
Perioada experimentului: 20 Februarie 2017 Continu

Materialul de test: Pudr de nano particule de Gans de CO2 i ZnO cu mrimea mai mic de 100nm (n
H2O) au fost sintetizate conform tehnicii Keshe. nainte de administrarea oral sau intravenoas, dispersia
a fost diluat cu ap distilat pentru a preveni agregarea.

Animalele de test: Soricei Balb-c masculi i femele de la 8 la 16 sptmni (B.W. 28,1-33,6 g) au fost
cumprai de le CLEA Japonia, Incorporated (Tokyo, Japonia). oriceii au fost inui ntr-o cuc ntr-un
ciclu de lumin/ntuneric de 12 ore cu acces nelimitat la hran i ap, ntr-o camer cu temperatur
controlat. Li s-a permis s se aclimatizeze cu mediul pentru o sptmn nainte de tratament.

Metoda experimentului: Patruzeci din cincizeci de oricei masculi i femele, cu greutatea corporal ntre
28,1 i 33,6 g i vrsta ntre 8 la 16 sptmni vor fi implantai cu seciunea medular a unei tumori de
colon uman de la un oricel donator. Zece oricei vor fi pstrai ca i grup de control, iar patruzeci vor fi
tratai oral sau intravenos cu Gans de CO2 sau un amestec de nano particule de Gans de CO2 i ZnO (1:3) n
patru grupe, cte zece oricei n fiecare grup.

Tumorile extirpate de la oricelul donator au fost prima dat puse ntr-o soluie Ringers, pentru a asigura
rezistena dup extragerea de la oricelul donator. Seciunea umezit de 2x2mm a fost apoi injectat n
abdomen, sub epiderm, utiliznd un ac de 1,8mm.

Kt
 Eficacitatea Nano Particulelor de Gans
de CO2 i ZnO mpotriva Cancerului n Vivo
Perioada experimentului: 20 Februarie 2017 Continu

REZULTATE PRELIMINARE: 2 din 10 oricei din grupul administrat cu CO2 (B.I) au fost sacrificai, i 1 din 10
oricei din grupul administrat cu CO2 + ZnO (B.II) au fost sacrificai. Grupurile injectate C.I i C.II sunt n
desfurare.

nainte Dup injectarea tratamentului 20 de zile

Kt
 Eficacitatea Nano Particulelor de Gans
de CO2 i ZnO mpotriva Cancerului n Vivo

Metoda de tratament cu nano particule de Gans de CO2 i ZnO: 3 grame de nano particule de Gans de
CO2 i ZnO, au fost combinate individual cu un litru de ap distilat pentru a forma o soluie. Soluia de
nano particule de Gans de CO2 i ZnO a fost preparat prin amestecarea a 3 pri de soluie de Gans de
CO2 i o parte de soluie de Gans de ZnO, pentru a produce soluii de 0,3mg/ml. 1ml din aceste soluii sunt
administrate zilnic oral utiliznd o pipet nclinat din plastic, sau prin doz intravenoas prin vena din
coad (sau subcutanat direct n tumor. Se va decide). Dozarea oral i intravenoas ncepe n prima zi de
palpare i nceteaz dup 20 de zile.

oriceii sunt divizai ntr-un grup de control i de test dup cum urmeaz:
A. Animalele de control vor primi 1ml de ap distilat (n=10)
B. oriceii de test (administrare oral)
I. 1ml de soluie de Gans de CO2
II. 1ml de soluie de Gans de CO2 i ZnO (amestec n proporie de 3:1)
C. oricei de test (administrare intravenoas sau subcutanat. Se va decide)
I. 1ml de soluie de Gans de CO2
II. Soluie de Gans de CO2 i ZnO (amestec n proporie de 3:1) fixat n 10% formol

Kt
 Eficacitatea Nano Particulelor de Gans
de CO2 i ZnO mpotriva Cancerului n Vivo

REZULTATE PRELIMINARE: 2 din 10 oricei din grupul administrat cu CO2 (B.I) au fost sacrificai, i 1 din 10
oricei din grupul administrat cu CO2 + ZnO (B.II) au fost sacrificai. Grupurile injectate C.I i C.II sunt n
desfurare.
Grupul B.I, doar CO2, administrare oral
Greutate Tumor Mrime Tumor
n Doz Grame SD [%] cm2 SD [%]

10 Control 2,27 0,44 3,34 0,72

2 0,3mg/zi 0,00 0,00 -100% 0,00 0,00 -100%

Grupul B.II, CO2 + ZnO, administrare oral

Greutate Tumor Mrime Tumor
n Doz Grame SD [%] cm2 SD [%]

10 Control 2,27 0,44 3,34 0,72

2 0,025mg CO2/zi 0,00 0,00 -100% 0,00 0,00 -100%

0,025 mg ZnO/zi
Kt