SUPORT DE CURS

1. Refractometria i polarimetria

1.1. Refractometria

Indicele de refracie notat n la o temperatur dat i lucrnd cu lumin de lungime de und,

, fixat este o constant fizic important care caracterizeaz cu precizie o substan chimic
deoarece mici cantiti de impuriti modific valoarea acestui indice. Msurtorile de indici de
refracie se pot realiza rapid i cu cantiti mici de substan, aparatura fiind relativ ieftin. Se tie din
fizic ce este refracia i indicele de refracie. Pe figura alaturat (vezi fig. 1) am reprezentat trecerea
energiei radiante dintr-un mediu 1 ntr-un mediu 2. Fenomenul de schimbare a direciei de propagare
caracterizat prin unghiul i, respectiv r, se numete refracie.

Fig. 1. Fenomenul refraciei i legea dup care se petrece

Conform legilor refraciei empirice sin i/sin r = n reprezint indicele de refracie al mediului
2 n raport cu primul i este egal cu raportul vitezelor de propagare n cele dou medii (n mediul
mai dens cu vitez mai mic). Dac r = 90 raza se propag n mediul 2 perpendicular pe interfaa
celor dou medii i se poate scrie: n2,1 = sin i. Aceast valoare i este denumit unghi limit sau unghi
critic. Dac r > 90 asistm la o reflexie total adic raza nu trece n mediul 2.
Dac mediul 1 este chiar vidul, n reprezint indicele de refracie absolut i:

n practica de laborator se determin indicele de refracie fa de aer. Indicele de refracie al

unei substane fa de vid se numete indice de refracie absolut. Acesta se obine din cel msurat n
aer prin nmulire cu 1.00027. Indicele de refracie variaz deci cu densitatea, temperatura i presiunea
mediului.
Pentru a elimina influena temperaturii i presiunii, deci a densitaii, d s-a introdus o nou
constant de material refracia specific:

O relaie mai adecvat pentru aceeai constant de material a fost dedus din teoria
electromagnetic a luminii (Maxwell) avnd expresia:

1
numit tot refracie specific. Produsul dintre aceasta i masa molar a primit denumirea de refracia
molar - tot o constant de material - fiind utilizat astzi n caracterizarea fizico- chimic a
substanelor chimice (Lorenz-Lorenz):

Aceasta este o funcie liniar de compoziia materialului (exprimat prin fracii molare) i, de
exemplu, pentru o soluie coninnd n substane, se poate exprima: R = x1R1 + x2R2 + ... + xnRn.
Pentru molecule organice exist o importan deosebit, diferitele poriuni structurale ale aceleiai
molecule permind, pentru o anumit clas de substane, obinerea prin calcul din refraciile atomice,
a refraciei molare. De asemenea pentru materiale sau soluii refracia molar poate fi suma
produselor fraciilor molare cu refraciilor molare ale componenilor materialelor (soluiilor).
Indicele de refracie se determin cu refractometre i interferometre. Interferometrele sunt
ns mult mai precise dect refractometrele. Astfel n timp ce refractometrele dau indicii de refracie
cu erori de 10-5 interferometrele msoar cu erori de 10-8.
Metoda se aplic la determinarea gradului de puritate, pentru stabilirea compoziiei sistemelor
binare i ternare (de exemplu 3 solveni organici) precum i la stabilirea unor structuri. Civa indici
de refracie ai unor lichide sunt prezentai n tabelul 1.
Pentru amestecuri binare [96] de lichide, curbele de etalonare servesc frecvent la analize
cantitative.
Refracia fiind un fenomen legat de polarizabilitate, ntre indicele de refracie n i constanta
dielectric, , exista o relaie simpl : n2 = important n determinrile structurale.
Determinrile indicilor de refracie se fac la linii de lungimi de und bine determinate notate
uneori n literature de specialitate: D, d, F sau c fiecare liter reprezentnd o linie a unui element (linii
Fraunhofer). De exemplu D este linia galben a sodiului cu = 589.3nm.

Fig. 2. Schema refractometrului Pulffrich

n fig. 2. se d principiul de funcionare al celui mai folosit refractometru: refractometrul

Pulfrich. n acesta (vezi fig. 2), se poate scrie relaia: sin 90/sin = N/n, unde N este indicele de
refracie al sticlei, n - indicele de refracie al lichidului i - unghiul de refracie la un unghi de

2
inciden de 90. Se observ c n = N sin . Cum + ' = 90 avem, innd cont de valoarea din fig.
2:

relaie cu care se poate calcula indicele de refracie msurat cu acest instrument.

Un alt refractometru foarte rspndit este refractometrul Abbe.

1.2. Polarimetria

Studiul fenomenelor optice n lumin polarizat poart numele de polarimetrie. Practic se

determin rotaia planului luminii polarizate n plan, ceea ce se numete unghi de rotaie. Unele
substane optic active au proprietatea de a roti sau modifica planul de polarizare a luminii la
trecerea luminii prin acestea. De exemplu n fig. 3c s-a ilustrat rotaia cu un unghi a planului unei
raze ce vine spre noi dinspre planul hrtiei - fig. 3b - comparativ cu o raz de lumin nepolarizat -
fig. 3a.

Fig. 3. Semnificaia unghiului de rotaie:

a - raz de lumin nepolarizat, b - raz polarizat, c - rotaia optic cu unghiurile i -

Activitatea optic a substanelor cristaline este strns legat de structura lor cristalin.
Alteori la baza rotaiei stau asimetriile moleculare. Astfel, prin topire sau dizolvare disprnd
structura dispare i activitatea optic a substanelor cristaline. La alte substane activitatea optic
este legat de structura lor molecular (chiral) i la acestea activitatea se pstreaz i n soluie (de
exemplu la zaharoz). Dac rotaia are loc n sensul acelor de ceasornic substana o numim
dextrogir iar unghiul de rotaie se consider pozitiv. La rotaia n sens opus denumirea substanei
este de substan levogir iar unghiul se consider negativ. n afar de natura substanei unghiul de
rotaie depinde i de lungimea de und a radiaiei, lungimea parcursului optic, de concentraie i
temperatur. n cazuri excepionale variaz i cu timpul, caz n care vorbim de mutarotaie. Pentru
face comparabile msurtorile de rotaie pentru diferite substane se fac raporturi ale unghiului
msurat la lungimea drumului optic, la densitatea soluiei i se fac referiri la o concentraie
convenional de 1g per ml solvent. Rotaia se numete n acest caz specific, se noteaz cu []t i
are relaia de definiie:

unde este unghiul de rotaie msurat, - lungimea de und, l - lungimea celulei, d - densitatea
soluiei.
De exemplu, la o concentraie de Cg/100ml solvent expresia rotaiei specifice devine:

3
 Aceasta este o constant caracteristic a lichidelor i solidelor pure aflate n soluie.
Valoarea , pentru o soluie (material) optic activ, este legat de concentraie printr-o ecuaie de
forma:
= a + bC + cC2
unde a, b, c sunt constante empirice. Aceasta face posibil analiza cantitativ a unui component sau
amestec de componente optic active.
Determinarea unghiului de rotaie se face cu ajutorul polarimetrelor (de exemplu de tip
Mitscherlich) a cror reprezentare schematic este prezentat n fig. 4.

Fig. 4. Componentele unui polarimetru

Polarimetria se utilizeaz ca mijloc de analiz cantitativ a substanelor optic active, zahr,

uleiuri eterice, dar i pentru studii n domenii ca acoperiri metalice, coroziune, metalografie,
mineralogie etc. Unele substane neoptic active reacionnd cu parteneri optic activi, pot fi analizai
indirect din consumul ultimilor.

4
 2. Spectrometria de absorbie n UV-VIS

2.1 Principii generale

Una dintre primele metode instrumentale aprute i utilizate frecvent n practica

laboratoarelor de analize chimice din zilele noastre este metoda bazat pe absorbia luminii din
domeniul vizibil (domeniu notat n literatura internaionala VIS). Se cunosc mai multe variante
importante pentru aceast metod: colorimetria, fotometria i spectrofotometria.
Colorimetria, una dintre tehnicile extrem de mult utilizate n practica analitic, reprezint
varianta n care intensitatea culorii probei se compar vizual sau instrumental, n lumin alb, cu
un set de soluii etalon - preparate n condiii absolut identice cu proba. Aceasta este o metod
subiectiv i mai puin selectiv, pentru c rezultatele depind mult de persoana care execut
analiza. Se remarc faptul c sensibilitatea maxim a ochiului omenesc atinge maximul pentru
domeniul 550-560nm (domeniul culorii verzi), lucru important cnd compararea probei cu
etalonul se face vizual. n aceast tehnic se pot realiza msurtori, prin comparaie vizual, chiar
n eprubet la lumina zilei, rezultnd analize chimice cu exactiti mai slabe dect 1%. Cu ct
exist mai multe soluii etalon, pentru comparaie, cu att metoda este mai exact. Exist, dup
cum am amintit i metode colorimetrice instrumentale, obiective, dar acestea sunt tot mai puin
folosite. n schimb se folosesc aparate ieftine care utilizeaz metode colorimetrice bazate pe
reacii executate pe hrtie de filtru, pe substane aflate n stare adsorbit pe suporturi granulare
- n cazul gazelor - i chiar pe reacii de culoare n soluii.
Fotometria i spectrofotometria msoar instrumental lumina transmis de o soluie
colorat lucrnd cu o surs de lumin monocromatic. Cnd lumina incident este filtrat,
prin filtre optice, avnd un spectru mai larg, avem de a face cu o fotometrie iar cnd domeniul
filtrat este mai ngust (utiliznd monocromatoare) vorbim de spectrofotometrie. n ultima
variant, este posibil fixarea mai precis a lungimii de und la care se lucreaz. Cu ambele
variante se poate chiar trasa un spectru de absorbie, adic o curb, obinut prin msurarea
semnalului n funcie de lungimea de und a radiaiei incidente. n literatura de specialitate
uneori se folosete pentru ambele metode i denumirea de metod colorimetric (sau chiar
spectrocolorimetric), ceea ce uneori poate crea confuzii. n domeniul UV, ochiul omenesc
nepercepnd lumina, se utilizeaz doar spectrofotometria. ntruct principiile sunt identice iar
aparatele sunt n multe privine similare n cele dou domenii, n ultimul timp, n afar de aparatele
dedicate domeniului VIS sau a celor pentru UV, de multe ori se utilizeaz un singur instrument
pentru ambele intervale de lungimi de und, ceea ce a dus la denumirea din titlu. Construcia
instrumentelor are n general dou variante anume spectrofotometrele monocanal, cu un singur
drum optic i cele comparative, prevzute cu dou canale. n spectrometrele comparative printr-
o singur msurtoare, proba etalon cu cea de analizat se compar utiliznd dou radiaii care-i
au originea n aceeai surs (coerente). Schematic, un spectrometru de absorbie este redat n fig. 1:
sursa de radiaie (S),
monocromatorul (M),
cuveta cu prob (P),
detectorul (D),
amplificatorul (A),
nregistratorul (I).
Fig. 1. Pri componente ale spectrofotometrului de absorbie (vezi textul)
5
 Se observ (fig. 1) c radiaia incident, monocromatic, realizat cu ajutorul
monocromatorului M, trece prin cuveta cu prob, C, unde intensitatea scade fa de situaia n care
n locul probei de analizat se pune o aa-numit prob martor (sau prob oarb) - o prob de
referin de concentraie zero. Apoi fascicolul cade pe detectorul D, unde semnalul optic este
transformat n semnal electric. Semnalul rezultat, dup o amplificare, poate fi n final msurat
i nregistrat. nregistrat nu mai nseamn astzi ntotdeauna preluarea semnalului cu un
nregistrator ci mai degrab introducerea acestuia n memoria unui calculator urmnd de regul
prelucrarea automat a datelor.
Materialele din care se confecioneaz diferitele pri componente ale spectrofotometrelor
sunt prezentate n tabelul 1.

Tabelul 1. Componentele unui spectrofotometru de absorbie n vizibil i n ultraviolet

Domeniu Surs (lamp, bec) Monocromator (prisma) Cuv Detector
spectral
UV cu H sau D cuar/NaCl, reea dens cuar celul fotoelectric
VIS filament: W sticl/cuar, reea medie sticl/cuar / fotomultiplicator

Se poate remarca faptul c detectorii sunt identici iar cuva de cuar permite lucrul n ambele
domenii. Doar sursele difer. Prin nglobarea ambelor surse - lampa cu deuteriu i cea cu
wolfram - n acelai instrument, funcionnd consecutiv, s-a reuit realizarea spectrofotometrelor
UV-VIS.

2.2. Legea Lambert - Beer

Aceast lege reprezint legea de baz folosit n analizele sau determinrile

spectrofotometrice. S considerm o radiaie incident monocromatic, Io, care cade pe o
celul coninnd proba. Celula are lungimea l iar concentraia substanei ce absoarbe lumina,
C. Conform schiei din fig. 2, intensitatea final, I, este mai mic dect cea iniial, Io n
urma absorbiei luminii, la trecerea prin celul.
I0 I

l solvent + solut
Fig. 2. Absorbia luminii n cazul legii Lambert-Beer

Dac lungimea l provoac o reducere cu un anumit procent a intensitii iniiale, Io, de

exemplu cu 50%, un nou strat de lungime l, egal cu primul, va aciona, conform legii Lamber
- Beer, n acelai mod, adic va diminua tot la jumtate noua radiaie incident. Se observ pe
diagrama din fig. 3 c graficul punctelor corespunztoare dimensiunilor celulei 1l, 2l, 3l, se
distribuie pe o curb exponenial. Aceast curb poate fi scris algebric ca o funcie:

unde k este o constant. Ecuaia precedent reprezint una din formele legii lui Lambert - Beer.
Prin convenie, se numete transmitan fracia transmis, I a intensitii, raportat la I0, prin cuva
cu soluie, T, adic:
6
iar legea Lambert - Beer mai poate fi scris i:

sau, schimbnd semnul:

Convenim de asemenea s numim absorban, notat A, logaritmul natural, cu semn

schimbat al transmitanei:

Introducnd absorbana [75], A, n ecuaia precedent, legea Lambert-Beer mai poate fi

scris:

unde A este absorbana, k - coeficientul de absorbie iar l - lungimea parcurs de lumin prin
mediul colorat sau lungimea celulei.

Fig. 3. Forma exponenial a legii Lambert-Beer

Coeficientul de absorbie, k, s-a gsit c este proporional cu concentraia substanei care

absoarbe lumina, C adic k = const.C. n funcie de diversele moduri de exprimare ale
concentraiei, constanta k are valori diferite. n cazul exprimrii concentraiei n molL-1,
aceast constant se numete coeficient molar de extincie (sau de absorban), simbolizat . n
consecin forma cea mai utilizat dar i cea mai simpl a legii Lambert - Beer este:

Din examinarea ecuaiei precedente se poate observa c dac l=1cm i C=1molL-1,

atunci avem: = A. Aadar, coeficientul molar de extincie reprezint absorbana unei soluii de
concentraie 1 mol/l dac lungimea celulei cu prob este 1 cm. Legea este riguros respectat doar
pentru o radiaie monocromatic. Deci, cu ct filtrul optic este mai ngust, ca domeniu spectral,
cu att liniaritatea dreptei se respect pe un domeniu mai larg de concentraii. Dar un filtru cu
domeniu spectral ngust las s treac puin lumin i performanele metodei sunt condiionate
i de performanele detectorului.
Domeniul de concentraii al metodei, pentru care se respect liniaritatea funciei A = f(C),
de fapt al valabilitii legii Lambert-Beer, din nefericire nu este prea larg. n general, peste
7
nivele de concentraie de 10-2 molL-1 curba de etalonare i modific panta (de regul aceasta
scade). De aceea, metoda este adecvat mai ales pentru soluii diluate i nu este o metod
potrivit pentru analize de componente majore (adic substane aflate n concentraii de peste
10%) din orice fel de probe.

2.3. Spectre de absorbie

Spectrele de absorbie reprezint dependena semnalului de lungimea de und, .

Exist mai multe variante de prezentare dar cea mai utilizat este varianta reprezentrii
absorbanei n funcie de lungimea de und: A = f(). Celelalte variante, mai puin utilizate -
numite toate spectre de absorbie - sunt T = f(), log A = f(), = f() sau log = f().
Ultimele dou servesc n special pentru caracterizarea speciilor moleculare ntruct nu mai
depind de condiiile experimentale n care se fac determinrile acestor spectre.
Fiecare substan are un spectru de absorbie caracteristic, ca form general, ca domeniu
spectral, ca numr de maxime (denumite picuri) precum i ca raporturi ntre intensitile diverselor
picuri. Caracteristicile unui spectru sunt redate pe fig. 4. Poziia picului este caracterizat de
valoarea sa maxim, max . Se numete maxim de absorbie att vrful ca atare ct i lungimea
de und care corespunde maximului. Pot exista unul sau mai multe maxime de absorbie.
Numrul de maxime precum i forma general a curbei, reprezint caracteristica calitativ
dup care se pot identifica substanele. De exemplu, n fig. 5 se afl spectrul de absorbie n UV
al benzenului, aflat n soluie. Maximele acestuia sunt inconfundabile i acesta poate servi, la
nevoie, pentru identificarea sau analiza benzenului din soluii.

Fig. 4. Caracteristicile maximului de Fig. 5. Spectrul de absorbie al benzenului n
absorbie soluie

nlimea curbei i suprafaa ncadrat de curb reprezint caracteristici cantitative care
servesc la determinarea concentraiei substanelor din probe. Pentru a se nelege modul de
utilizare, pe fig. 6 se gsesc reprezentate spectrele de absorbie pentru mai multe concentraii
(C1, C2, ... , C5) ale aceleiai substane n soluie, Co(NO3)2. Pentru lungimea de und max =
610nm, valorile absorbanei s-au notat A1, A2, ..., A5. Acestea au fost reprezentate n coordonate
A, C i n conformitate cu legea Lambert-Beer, toate se nscriu pe o dreapt. Aceasta este curba
de etalonare i servete la analiza cantitativ. Nu ntotdeauna punctele se situeaz toate, n mod
riguros, pe o dreapt deoarece intervin erori experimentale i din acelai motiv, n practic,
dreapta nu trece exact prin origine.
8
 Fig. 6. Utilizarea Legii Lamber-Beer n practica analitic. n dreapta - curba de absorbie la
diferite concentraii ale soluiei apoase de Co(NO3)2. n stnga - curba de etalonare avnd un
maxim de absorbie la lungimea de und, max = 610 nm

Selectivitatea unui maxim de absorbie este dat de limea picului la baz (sau benzii
spectrale), notat X pe fig. 4, deoarece cu ct picurile sunt mai nguste se pot mai bine deosebi dou
substane cu spectre avnd aspecte apropiate. Tot pentru a se evita suprapunerile, n cazul
existenei mai multor maxime de absorbie, se prefer lucrul la maximele de absorbie cu
lungimile de und cele mai mari.

2.4. Analiza chimic cantitativ

Analiza chimic cantitativ n spectrofotometria de absorbie se bazeaz pe legea

Lambert-Beer. Se utilizeaz o curb de calibrare (etalonare): A = f(C), trasat pentru probe de
concentraii cunoscute, n aceleai condiii cu cele de analizat, evident lucrndu-se cu aceeai celul
i la o lungime de und ct mai riguros monocromatic. Se alege un domeniu de concentraii,
pe care se pregtesc 5-8 probe cunoscute i, dup trasarea dependenei A = f(C), grafic (fig 7) sau
analitic, se poate trece la analiza cantitativ. Domeniul pe care curba de etalonare este perfect
liniar nu este foarte larg (de cel mult o decad de concentraii). De aceea metoda nu poate
funciona dect strict pe domeniul pentru care a fost trasat i, cel mai corect, pe poriunea de la
jumtatea dreptei. Se fac mai multe citiri. Cu ct eroarea la determinarea absorbanei este mai mic
cu att eroarea de determinare a concentraiei va fi mai cobort. Panta curbei este decisiv n
mrimea erorii. Dac aceasta este foarte mic, eroarea la determinarea concentraiei va crete. De
aceea, soluiile foarte colorate duc automat la erori, datorit aplatizrii curbei la concentraii ridicate
i ca urmare coninuturile nu pot fi determinate exact, recurgndu-se la diluri. Dac diluia este
prea mare apare o cretere a erorii tocmai datorit dilurii, mai precis datorit limitelor
determinrilor exacte ale volumelor, lucru ce trebuie avut n vedere. n concluzie, concentraiile
soluiilor msurate trebuie s fie relativ joase.
n afar de condiiile de mai sus mai trebuie inut cont de urmtoarele reguli practice, foarte
importante pentru respectarea legii lui Lambert-Beer i totodat pentru obinerea de rezultate
analitice corecte:
soluiile trebuie s fie limpezi (fr suspensii) i s nu fie fluorescente;
n soluiile supuse msurtorilor nu trebuie s se petreac transformri fotochimice sau reacii
cu oxigenul din aer;
9
 substana de analizat nu trebuie s dea asociaii, cu compoziii variabile, cu solventul;
punctele trebuie s se situeze ct mai riguros pe aceeai dreapt i prelungirea dreptei s treac
ct mai aproape punctul de coordonate (0,0);
absorbana msurat pentru proba necunoscut, Ax, trebuie, pe ct posibil, s se situeze pe
poriunea din mijloc a domeniului punctelor de etalonare.

Fig. 7. Analiza cantitativ: pe baza valorii Ax, msurate, se calculeaz valoarea Cx

Se mai poate utiliza legea lui Lambert-Beer i pentru determinarea concentraiei a dou
specii diferite, de exemplu M i N, din aceeai soluie. n mod obinuit se utilizeaz dou lungimi
de und diferite, 1 i 2 dar pentru oricare dintre acestea: Atotal = AM + AN. Cu alte cuvinte
msurnd la 1 absorbana amestecului, notat A1 i la 2, absorbana A2, se obine:
A1 = M1CMl + N1CNl respectiv, A2 = A2CMl + B2CNl

adic un sistem de dou ecuaii cu dou necunoscute - concentraiile CM i CM. Prin

rezolvarea algebric a sistemului de ecuaii aprut, se pot obine valorile acestora, deci se pot calcula
concentraiile necunoscute.
Analiza chimic calitativ se bazeaz pe compararea spectrelor de absorbie ale substanelor
sau materialelor n domeniul UV-VIS, adic 180-1100nm cu spectre cunoscute. Acest procedeu
permite identificarea unui anumit numr de specii chimice, dar numai pentru acele substane care
absorb n acest domeniu. n chimia organic, de exemplu, absorb n acest domeniu perechile de
electroni de valen angajai n legturi i precum i perechile de electroni neparticipani.
Pentru c n cursul acestor tranziii apar modificri ale polaritii legturii respective, aceste
spectre au primit numele de spectre cu transfer de sarcin. Fiecare tranziie are asociat o lungime
de und caracteristic (unde va aprea un maxim) i un coeficient molar de absorbie, ,
corespunztor. Acestea se datoreaz unor salturi ale electronilor de valen, adic a electronilor
situai pe straturile exterioare ale atomilor angajai n legturi chimice. n fig. 8 s-au reprezentat
schematic acele salturi ale electronilor de valen care dau spectrele electronice, comparativ cu
nivelele implicate n spectrele de rotaie sau de vibraie. Scara energiilor este logaritmic,
diferenele ntre valorile numerice ale tranziiilor electronice i celelalte tranziii fiind mult mai mari
dect cele reprezentate pe figur.
n substanele formate din molecule covalente se cunosc aa-numitele grupri cromofore
sau auxocrome, care sunt grupri de atomi care dau ntregii molecule calitatea de a absorbi lumina -
n cazul de fa, n domeniul UV-VIS. Legat de cele amintite anterior, o grupare cromofor
reprezint locul din molecul unde-i au originea tranziiile electronice. S- a mai introdus i termenul
de cromogen care constituie ansamblul dintr-un schelet molecular pe care se gsesc grefai mai
muli cromofori. Pentru o serie de molecule, toate avnd legate acelai cromofor, poziia i
10
intensitatea benzilor de absorbie rmn n mare aceleai (tabelul 2). Mai mult, dac o molecul
conine mai multe grupe cromofore izolate, mai exact separate ntre ele prin cel puin dou
legturi simple, se poate observa suprapunerea efectelor individuale.

Legend: 0, 1, 2, ... - reprezint nivele de rotaie; , +1 - reprezint nivele de vibraie; Ramura

P conine toate tranziiile cu J = -1: P(J) = S(+1,J-1)-S(,J) = - 2BJ; Ramura R conine
toate tranziiile cu J =
+1: R(J) = S(+1,J+1)-S(,J) = + 2BJ; Ramura Q conine toate tranziiile cu J = 0: Q(J) =
S(+1,J)- S(,J) = ; Ramura Q este permis doar pentru tranziii electronice n unele molecule
diatomice (ex. NO) i molecule poliatomice neliniare.
Fig. 8. Diagram energetic corespunznd variantelor tranziiilor de rotaie, vibraie i electronice
posibile pentru o molecul dat

Tabelul 2. Cteva dintre cele mai intense grupri cromofore caracteristice moleculelor covalente
coninnd azot:lungimea de und a absorbanei maxime i coeficientul de extrincie
Denumirea Amin Oxim Nitro Azotit
Cromoforul -NH2 =N-OH -NO2 -O-NO
max (nm) 195 190 210 230
max (Lmol-1cm-1) 3000 5000 3000 1500

Cnd nu este posibil analiza unor specii chimice, direct, din cauza lipsei culorii acestora,
se pot provoca reacii care dau compui colorai, prin apariia unor grupri cromofore, pe baza
crora se pot analiza anumite substane n prezena altora, realizndu-se astfel, pe cale chimic, o
selectivitate metodei.
Dac un anumit compus nu absoarbe n domeniul vizibil, dar n urma unei reacii chimice,
se introduce n molecul o grupare cromofor, n noua substan, aceast grupare va absorbi lumina,
n vizibil sau UV i va putea fi analizat cantitativ. Aceast reacie este o reacie de culoare. Cnd
reacia de culoare este ea nsi una selectiv reacia poate servi i la identificarea calitativ a
compusului incolor.

11
 Fig. 9. Aspectul punctului izobestic n cazul unui indicator acid-bazic

Punctul izobestic, sau de egal absorban (fig. 9) este punctul de intersecie a unei familii
de curbe de absorbie ale aceleiai substane, n condiii fizice sau de mediu diferite (de exemplu la
mai multe valori ale pH-uri diferite) i semnaleaz existena a dou specii chimice diferite, aflate n
echilibru chimic una cu cealalt - indiferent de tipul reaciei chimice ce are loc. Numrul de puncte
izobestice reprezint numrul de specii chimice, aflate n echilibru ntre ele, fiecare absorbind
lumina la lungimi de und diferite. Lungimea de und izobestic este valoarea pentru care
coeficientul molar de extincie, , este egal pentru ambele componente i fie M, respectiv N, aceste
componente. Algebric, acest lucru se reflecta n expresia absorbanei la lungimea de und respectiv
():
A = ([M] + [N])l,
unde l este lungimea celulei; cum concentraia lor global este aceeai, fiind dat de suma:
C = [M] + [N] = const.,

2.5. Instrumentaia

Aa cum s-a artat, orice spectrofotometru reprezint o reuniune de 4 pri

componente distincte: (1) sursa, (2)sistemul dispersiv sau monocromatorul, (3) detectorul i
(4) nregistratorul. Ultimul, poate fi un simplu dispozitiv de citire a rezultatului nregistrarea
fcndu-se manual. Exist o gam foarte larg de spectrofotometre, deosebirea constnd n
domeniul de lungimi de und acoperit, n puterea de dispersie a monocromatorului, n natura
detectorului, n mediul optic traversat sau chiar n principiul de construcie al instrumentului n
ansamblu.

Fig. 10. Schia de principiu a Fig. 11. Curbe reprezentnd Fig. 12. Parcursul luminii
unei lmpi cu deuteriu (D2). spectrele emise de cele doua ntr-un monocromator cu
12
 Pata de culoare cenuie tipuri de lampi utilizate n reea concav i sensul de
indic punctul n care are UV- VIS:1- Lampa cu deplasare a reelei pentru
loc descrcarea filament incandescent de W; selecia lungimii de und. F =
2- Lampa cu deuteriu fante, OP = oglinzi plane, OC
= oglind concav

Sursele luminoase cele mai obinuite utilizate n domeniul UV-VIS, sunt lampa cu
incandescen prevzut de obicei cu filament incandescent de W - deosebindu-se de becurile
electrice obinuite prin aceea c zona de ieire a radiaiei este confecionat din sticl de cuar
- i lampa cu deuteriu prevzut cu arc de descrcare n deuteriu, aflat la o presiune medie (ceea
ce asigur un spectru continuu). O astfel de lamp, a crui punct de descrcare este zona cenuie din
interiorul cutiei mari (fig. 10) permite obinerea unui spectru continuu pe domeniul 160-400nm,
care se completeaz foarte bine cu spectrul becului cu incandescen (fig. 11). Un spectrometru
prevzut cu ambele surse, poate acoperi tot domeniul UV-VIS (fig. 11). Razele de lumin trec prin
aer, dar mai nou dirijarea acestora se face i prin fibre optice.
Sistemul dispersiv sau monocromatorul poate fi, n vizibil, un filtru colorat din sticl sau
material plastic transparent dar i un filtru cu interferen, iar n UV-VIS o prism confecionat
din cuar sau, n ultimul timp, sisteme bazate pe reele plane sau concave cu circa 1200 trsturi
per mm. Aceste reele sunt integrate n monocromatoare care permit extragerea unei zone nguste
din spectrul UV-VIS, printr-o simpl deplasare a oglinzii (fig. 12).
Limea domeniului spectral care trece prin monocromator depinde mult de limea fantelor
de intrare i ieire. Cele mai bune rezoluii se obin prin utilizarea unor oglinzi prevzute cu
distane focale mari (0.2-0.5m).
Detectorul transform semnalul luminos n semnal electric. Acest dispozitiv d aadar un
semnal proporional cu intensitatea care iese din celula de msur. Intensitatea semnalului
recepionat va depinde de lungimea de und - deci de lungimea de und selecionat prin poziia
oglinzii - dar i prin deschiderea fantelor de intrare, respectiv de ieire, din monocromator. Acestea
din urm, limiteaz domeniul spectral dar i intensitatea luminii, n ansamblu. De aceea fiecare
modificare de deschidere a fantelor sau de lungime de und modific i intensitatea msurat de
spectrofotometru.
De-a lungul timpului s-au impus dou tipuri de detectori: tuburile fotomultiplicatoare i
dispozitivele semiconductoare (care pot fi, la rndul lor, detectori cu transfer de sarcin - CCD ,
n l. engl.- sau fotodiode cu siliciu - CID). Fotomultiplicatoarele - nite dispozitive ultrasensibile
al crui domeniu liniar se ntinde pe 7 decade - au fost pn nu demult cele mai utilizate dintre
acestea. Pentru spectrofotometrele de rutin, fotodiodele sunt cele mai utilizate. n ultimul timp
au aprut detectoarele cu reelele de diode care constituie de fapt nite diode de dimensiuni mici
nirate pe aceeai plac. n acest caz nu mai este nevoie de fanta de ieire, ceea ce a simplificat
ntructva instrumentaia (fig. 13).
Spectrometrele monocanal, a cror schem bloc este prezentat n fig. 14, sunt cele mai
utilizate n aplicaiile de rutin. De regul n calea razei incidente se plaseaz succesiv proba
martor sau de referin (care conine solventul plus eventual reactivii necesari pentru analiz) i
proba de analizat. Pentru a se compensa i variaiile sursei luminoase se utilizeaz, la instrumentele
ceva mai sofisticate, sisteme split-beam bazate, de exemplu, pe o oglind semitransparent (v.
fig. 15).

13
 Fig. 13. Reprezentarea schematic a unui spectrofotometru cu reea de diode

Din aceast categorie face parte i spectrometrul cu reea de diode (fig. 13) care are
avantajul c permite recepia simultan a ntregii game spectrale ntr-un interval de timp de cteva
milisecunde. Deosebirea const doar n ordinea prob-monocromator care-i schimb locul ntre
ele. Rezoluia acestor spectrometre este limitat de dimensiunile microdiodelor care in locul
fantelor de ieire.

Fig. 15. Prezentarea schematic a unui spectofotometru UV-VIS, monocanal, cu sistem split- beam;
componentele principale sunt: 1- surs, 2 - monocromator, 3 - prob, 4 - detector

n sistemele cu dispozitive split-beam, raza care iese din monocromator este desprit n
dou i una dintre aceste raze cade pe un detector care preia fondul (de exemplu, o fotodiod
1 pe fig. 15), iar cealalt, dup ce trece prin prob (respectiv prin proba martor), cade pe un al
doilea detector, notat 2 (fig. 15). Semnalul final rezult prin diferena dintre semnalele date de
cele dou detectoare i prelucrat pentru a se msura (sau nregistra) direct absorbana. Pe figura
alturat se poate observa funcionarea alternativ a lmpii pentru domeniul vizibil (VIS) cu cea
pentru domeniul UV.
14
 Spectrometrele bazate pe comparaie (cu dublu canal) sunt cele mai performante
spectrofotometre cunoscute. n acestea, dup desprirea razei incidente, monocromatice n dou
fascicule, una dintre acestea traverseaz proba iar alta, simultan sau secvenial, traverseaz celula
de referin care conine proba martor. Se cunosc cel puin dou variante de astfel de montaje. n una
dintre acestea (fig. 16), montajul folosete pentru desprirea fascicolului metoda amintit anterior,
n cazul spectrometrelor monocanal - oglinda semitransparent - iar detectoarele (dou
fotodiode) sunt montate n opoziie. Avantajul const n faptul c rspunsul detectorului este
meninut constant, n funcie de , prin reglarea automat a intensitii de intrare n monocromator
(printr-un mecanism de feed-back).

Fig. 16. Schema de principiu a spectrofotometrului cu dublu fascicol prevzut cu oglind

semitransparent i fotodiode

O alt variant (fig. 17) folosete pentru desprirea razei incidente, monocromatice, un
disc rotitor prevzut cu o oglind n form de sector de cerc (dispozitiv denumit curent n literatura
de specialitate chopper [76]). O jumtate de perioad oglinda reflect raza incident iar n cealalt
jumtate, o transmite. Aadar, una dintre raze trece prin celula de msur iar cealalt prin cea de
referin, fiind ulterior aduse prin montajul optic pe acelai detector - de ast dat un
fotomultiplicator. Faptul c are loc amplificarea unui singur semnal compenseaz micile variaii
parazite ale intensitii sursei. Circuitul de msur funcioneaz sincron cu rotaia chopper-ului;
o perioad semnalul corespunde celulei de msur iar o alt o perioad, celei de referin.

Fig. 17. Schema de principiu a spectrofotometrului cu dublu fascicol prevzut cu chopper i

fotomultiplicator

Aceste spectrofotometre se caracterizeaz printr-o vitez mare de baleiaj i prin aceea c

pot msura mai mult de dou uniti de absorban.

15
 3. Spectrometria de absorbie atomic

Metoda analizei prin absorbie atomic (AA), introdus n analiza chimic din anul 1952
de ctre australianul A. Walsh [85], se bazeaz pe fenomenul cunoscut cu aproape o sut de ani
nainte (1859) - descoperit de germanul G. R. Kirchhoff - i anume inversia liniilor spectrale.
Principiul, stabilit pe baze experimentale, se poate enuna sub form de lege fizic - legea lui
Kirchhoff - astfel: fiecare element chimic absoarbe acele radiaii pe care le poate emite n
aceleai condiii, bine determinate, de temperatur i presiune. Primul instrument folosit a fost
o improvizaie pentru a se obine absorbia atomic n cadrul unui fotometru cu flacr (un
spectrometru de emisie n care excitarea atomilor se realizeaz ntr-o flacr). Acesta, ca i
celelalte instrumente care au urmat, msoar concentraia unui element dintr-o prob, prin
determinarea absorbiei realizate de ctre atomii probei, adui ntr-o flacr sau, mai general,
n faz gazoas (la o temperatur suficient de ridicat) asupra unei radiaii monocromatice
furnizate de o surs extern. Evident c radiaia respectiv este astfel aleas nct s fie
caracteristic unui anumit atom.
Spectrometrul de absorbie atomic msoar radiaia absorbit de atomii care rmn n
stare fundamental (neexcitai) n stare gazoas. Numrul acestora fiind de obicei mult mai mare
dect a celor excitai, spectrometria de absorbie atomic (AAS [86]) este o metod caracterizat
de o sensibilitate mult mai bun, cel puin pn la temperaturi de 5000K. Remarcm faptul c
aparatura pentru absorbie atomic poate fi utilizat, la nevoie, i pentru lucrul n emisie.

3.1. Principiul metodei

Ionii din soluia de analizat, prin pulverizare (sau nebulizare) ptrund o dat cu gazul
purttor ntr-o zon cu temperatura ridicat (de ex. o flacr) i devin atomi. Acetia trebuie adui
ntr-o stare energetic potrivit n vederea favorizrii absorbiei i reducerii la minim a emisiei.
Acest lucru se realizeaz n flcri cu temperaturi din domeniul 2000-3000K (obinute de exemplu
folosind arztoare cu aer-acetilen).
Modul n care se produc atomii metalici n stare gazoas este descris mai amnunit n
continuare (fig. 1). La aspirarea soluiei ntr-o flacr se petrec, ntr-o succesiune rapid,
urmtoarele etape:
evaporarea solventului pn la un reziduu solid;
vaporizarea solidului i disocierea n atomii componeni, care dau, ntr-o prim etap, atomi
n stare fundamental;
final, o parte din atomii de la punctul b) pot fi adui n stare excitat, prelund cldura din flacr
i devenind atomi excitai, care constituie ei nii surse de radiaii. Spectrul de emisie
rezultant const din linii caracteristice mai ales ale atomilor dar i ale ionilor excitai care
pot aprea (procesul 4 din fig. 1). O parte dintre atomi se pot transforma i n alte specii MO,
MOH (procesul 5 pe fig. 1) cnd nu mai iau parte la procesul de absorbie atomic.

16
 Fig. 1. Transformri posibile ale analitului n dispozitivul de atomizare (flacr) - zona cenuie

Fig. 2. Absorbia de rezonan este una din cele mai utilizate linii n analiza chimic prin absorbie
atomic

De aceea, pentru a se realiza o selectivitate bun, sursa de radiaii ce emite fascicolul care
urmeaz s parcurg celula, trebuie s fie o surs monocromatic avnd o frecven egal cu cea a
liniei de rezonan a atomilor din proba de analizat (vezi fig. 2). O astfel de tranziie are loc la
trecerea unui electron de pe stratul de valen, dintr-un atom n stare fundamental, avnd o energie
E0 (energie prin convenie luat egal cu 0) pn la primul nivel accesibil, de deasupra sa, E1.
Aceast tranziie are loc ca urmare a absorbiei de radiaie electromagnetic monocromatic, adic
corespunztoare unei cuante h = E1-E0. Absorbia, n urma creia apare tranziia de pe starea
fundamental pe primul nivel de energie, se numeste absorbie de rezonan i i corespunde o
linie de rezonan, aceeai att n absorbie ct i n emisie.
Desigur, electronii pot trece prin absorbie i pe alte nivele de energie ns cu o
probabilitate mai mic, adic dau linii mai puin intense. n emisie, tranziiile au loc n sens
invers. Relaia dintre numrul de atomi excitai, N1, i cei aflai n stare fundamental, N0, este
cunoscut din chimia fizic, sub denumirea: ecuaia lui Boltzmann i se poate scrie:
N1/N0 = (g1/g0)exp(-E/kT) (1)
unde N1 este numrul de atomi n stare excitat pe nivelul 1, N0 - numrul de atomi aflai n
stare fundamental, g1/g0 - reprezint raportul ponderilor statistice pentru starea excitat
respectiv fundamental, mrimi ce depind de numerele cuantice ale nivelelor existente n
fiecare atom n parte, E = h - variaia de energie a tranziiei, k - constanta lui Boltzmann, T
17
- temperatura absolut n K. n mod obinuit raportul N1/N0 este subunitar. Se poate observa
c N1/N0 depinde att de E ct i de T. O cretere a temperaturii i o scdere a valorii
intervalului energetic, E, va conduce implicit la o mrire a raportului N1/N0. Calculele
demonstreaz c, n cele mai favorabile condiii, doar o mic parte din atomi se gsesc n
stare excitat, lucru vizibil i din datele prezentate n tabelul 1, pentru cteva linii de rezonan
tipice.

Tabelul 1. Raportul dintre numrul de atomi din strile excitat, N1, respectiv fundamental, N0,
la dou temperaturi, 2000, respectiv 4000 K
Element E Lungime de und N1/N0
(eV) (nm) 2000K 4000K
Na 2.1 589.0 9.86.10- 4.44.10-
K 2.93 422.7 1.91.10 - 6.03.10-
6 3
Zn 5.79 213.9 - -
67.31.10 31.48.10
6 7
Walsh a fost cel care a propus primul, pentru aceast metod, n calitate de surse de
lumin, nite lmpi de construcie special denumite lmpi cu catod cavitar [87] (fig. 3) care emit
un spectru atomic, format din linii, caracteristice materialului (metalului) din care este
confecionat catodul. Cu ajutorul monocromatorului se selecteaz doar linia dorit, de obicei linia
de rezonan a elementului respectiv.

Fig. 3. Lampa cu catod cavitar

n afara sursei, deosebit de toate sursele utilizate n celelalte metode optice, schema bloc
a acestei metode (fig. 4) este cu totul analog spectrofotometriei de absorbie n general.
Deosebirea este aceea c, n cazul absorbiei atomice, n loc de soluii lichide, probele se afla n
stare gazoas ntr-o flacr i nu sunt constituite din molecule ci din atomi n stare fundamental.
Lamp cu catod cavitar (surs) Flacr sau cuptor (celul) Monocromator Detector
Fig. 4. Schema bloc a spectrometrului de absorbie atomic

3.2. Legea absorbiei radiaiilor

Analogia cu metoda spectrofotometriei de absorbie merge mai departe i anume legea

absorbiei radiaiilor n cazul unui fascicol incident, monocromatic este aceeai.
Dac un fascicul incident, de intensitate I0, n urma trecerii prin stratul absorbant, de
grosime l, devine un fascicul de intensitate I, relaia dintre I i I0 este dat tot de legea
Lambert-Beer scris diferit:
I = I0e-KlN (2)
unde: K este coeficientul de absorbie atomic, l - lungimea flacrii, N - numrul de atomi, aflai
n stare fundamental, din unitatea de volum. Analog cu cele nvate la spectrofotometria de
absorbie, dac notm cu A absorbana:
A = ln (I0/I) (3)
ecuaia de mai sus devine prin logaritmarea ambilor membri:
18
 A = KlN (4)
Deci A, pentru un atom dat, pentru parametrii fizici ai sistemului optic constani i o
flacr fix, este proporional cu N. Cum numrul de atomi din unitatea de volum N depinde de
mai muli factori constani (debit, vscozitate etc.) dar mai ales de concentraia C a soluiei
pulverizate n flacr, introducnd concentraia n locul numrului de atomi, N, ecuaia devine:
A = kC (5)
unde k este un coeficient constant, propriu fiecrui element la lungimea de und aleas i n
condiiile unui instrument dat i ale unei flcri stabile. Relaia, liniar n coordonatele A-C, este
util pentru analiza cantitativ propriu-zis i exploatat cu totul analog ca n spectrofotometria
de absorbie UV-VIS.

3.3. Aparatura

Schema de principiu, ilustrat anterior pentru spectrometrul de absorbie atomic (vezi fig.
4), poate fi completat cu mai multe amnunte (fig. 5). ntre electrozii lmpii cu catod cavitar
se aplic 400V i un curent de 10-40mA, foarte bine stabilizat, pentru a emite un flux luminos de
intensitate constant. Soluia coninnd proba etalon, sau cea de analizat, este transformat ntr-
un aerosol fin, n interiorul unei incinte numite sistem de pulverizare, sau pulverizator
(nebulizor). Aerosolul, amestecat intim cu amestecul de gaze, oxidant plus carburant, este condus
apoi n flacr (fig. 5).
Se pot utiliza variate amestecuri carburant - comburant prezentate n tabelul alturat (vezi
tabelul 2). Flacra sau cuptorul tubular din grafit - o variant mai puin frecvent folosit a metodei
- n care se introduce proba, se extinde pe direcia sursei de lumin, respectiv a fantei
monocromatorului. Acesta selecteaz un interval foarte ngust din spectrul luminos.

Fig. 5. Schem ilustrnd principul funcionrii analizorului prin AA

Tabelul 2. Tipuri de flcri n funcie de carburantul i comburantul folosit

Flacr
Aer + propan sau
Aer + oxid de carbon
Aer + acetilen
Aer + hidrogen sau
Oxigen + hidrogen
Elemente de analizat
Li, Na, K, Mg, Ca, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Ga, As, Mo,
Ag, Au, Pb, Bi
Aceleai ca mai sus dar Cr, Co, Au, Fe, Mg se determin
mai bine n flacar aer - acetilen
Ca, Sn

19
 Oxigen + acetilen Be, B, Al, Ti, V, Nb, Y, Sn, La i lantanide
(flacr bogat n acetilen)
Protoxid de azot - Al, Si, B, Zr
Acetilen (N2O +
C2H2)
Atomii unui anumit element absorb doar lumina cu lungimea de und specific elementului
respectiv. Tocmai aceste lungimi de und caracteristice sunt emise de surs i trecute prin
flacr iar diminuarea, exprimat n unitai de absorban, este proporional cu numrul de
atomi ai elementului de analizat, prezeni n flacra. Atomii celorlalte elemente nsoitoare nu
absorb lumina la aceeai lungime de und ci fiecare la alte valori ale acesteia. Acest lucru se
asigur prin selectarea lungimii de und i cunoaterea elementelor nsoitoare. Detectorul, de
regul un foto-multiplicator, msoar intensitatea luminii monocromatice - obinut dup
parcurgerea unui monocromator.
Metoda descris este o metod relativ, adic pentru etalonare se msoar mai nti cel
puin o prob cunoscut (numit prob etalon). Operaia este denumit n mod curent calibrare
sau etalonare. Se lucreaz de cele mai multe ori prin metoda curbei de etalonare sau prin metoda
adaosului standard. Analiza chimic prin absorbie atomic este extrem de specific, lrgimea
benzii de absorbie, fiind foarte ngust - de ordinul a 10-3nm - face aproape imposibile orice
confuzii privind analitul. De aceea cu aceast metod se pot analiza 66 elemente metalice sau
semimetalice, fiind puin recomandat pentru nemetale. Metoda
analizei prin AA este principala metod de analiz a elementelor metalice minore din materiale
sau din mediu, inclusiv poluarea organismelor cu acestea. Liniile specifice cad n domeniul 190-
850nm permind analize de ordinul microgramelor (g) iar n anumite cazuri chiar a
nanogramelor (10-9g) dintr-un mililitru de soluie. Sensibilitatea practic difer de la element la
element i este acea concentraie ce d o crestere de 0.00434 uniti de absorban (aproximativ
1% din intensitatea luminii incidente). Aceasta se exprim n g/ml sau, ceea ce este acelai lucru,
n ppm (pri per milion).

3.4. Probleme speciale

n practic apar totui interferene cu alte elemente din prob, de exemplu are loc
formarea unor combinaii greu disociabile (Mg2P2O7, ZrO2 sau Ca3PO4 etc.) sau efecte legate
de temperatura flcrii cu care se lucreaz - prea mare sau prea mic - ceea ce afecteaz
numrul atomilor n stare fundamental. Acestea, indiferent de natura lor fizic, au cptat
denumirea de efect de matrice. De aceea trebuie luate contramsuri. Toate aceste probleme se
studiaz individual, folosind publicaiile de specialitate. Pentru a se asigura o limit de detecie
ct mai joas, este necesar neutralizarea fluctuaiilor fondului. Pentru acest scop s-au pus la punct
instrumente cu dublu fascicul, ale cror detectoare primesc alternativ semnale de la raza incident
care, odat traverseaz proba (flacra sau cuptorul) i, alternativ, trece nemodificat sub form
de radiaie de referin. n cazul atomizoarelor cu flacr efectul de matrice este mai redus. n
cazul utilizrii cuptoarelor tubulare efectul devine foarte important datorit concentraiei mai
ridicate a acesteia. Cele mai importante mijloace de corecie a fondului sunt cele bazate pe
lmpi cu deuteriu i cele care utilizeaz efectul Zeeman.

20
Fig. 6. Instrument la care corecia fondului se face cu ajutorul unei lmpi cu arc de deuteriu

n cazul dispozitivelor cu lmpi cu deuteriu (fig. 6) flacra este traversat de lumina care
iese din lampa cu catod cavitar amestecat cu raza emis de o lamp cu arc de deuteriu (250-
350nm). Cu ajutorul unei oglinzi semitransparente i a unui chopper, amestecul celor dou raze
este trimis alternativ prin flacr i pe un drum care ocolete flacra, constituind raza de referin.
Detectorul primete, cu frevena dictat de chopper, att semnalul de referin ct i cel de msur,
iar raportul celor dou raze se nregistreaz dup corecia de fond, sub form de absorban.
Un alt mare avantaj al metodei analizei prin AA l constituie posibilitatea de a utiliza
solveni organici pentru concentrarea probei. Acetia, prin posibilitatea lor de a extrage doar
anumii ioni din soluie apoas, ntr-un volum mic, mresc i sensibilitatea i specificitatea
metodei. Cei mai adecvai solveni par a fi esterii i cetonele alifatice.

3.5. Metode evoluate

Varianta denumit metoda cuptorului tubular (sau spectrometria de absorbie atomic fr

flacr) utilizeaz un cuptora tubular (fig. 7), din grafit, nclzit electric, meninut n azot sau alt
atmosfer inert la 2000-3000K dar pornindu-se de la temperatura camerei. Aceast variant
prezint avantajul de a se putea lucra i pe probe solide, fr o dizolvare chimic a probei. Proba,
soluie sau solid, se introduce n cuptor sau intr prin nclzire n drumul razelor din cuptor,
utilizndu-se seringi micrometrice (ce msoar probe de ordinul l). Are loc consecutiv uscarea,
calcinarea, evaporarea i msurarea absorbiei, obinndu-se limite de detecie de 10-10-10-13
g/prob.
n ultimul timp, n afar de achiziia datelor cu calculatorul, au aprut lmpile
multielement, ce permit analize pe grupuri de elemente, nemaifiind necesar schimbarea
lmpii cu catod cavitar, ci doar a lungimii de und din monocromator fiind mai uor de
automatizat. De asemenea au aprut instrumentele cu dou drumuri optice, majoritatea
instrumentelor avnd posibilitatea utilizrii ambelor variante - cu flacr sau cu cuptor tubular (fr
flacr). n sfrit, utilizarea efectului Zeeman - despicarea liniilor spectrale atomice prin plasarea
sursei n cmp magnetic - a mrit i mai mult selectivitatea metodei.

21
 Fig. 7. Cuptorul tubular din grafit, nclzit electric, permite volatilizarea probelor

Metoda vaporilor reci. Elementele volatile, de mare interes n protecia mediului -

mercur, arsen, staniu, stibiu, bismut, seleniu - au dou proprieti importante pentru analiza lor
chimic. Se reduc cu dificultate la elemente n flacr n schimb dau uor hidruri volatile. De
aceea, nainte de introducerea n flacr a probelor coninnd aceste elemente, proba se supune
unui proces chimic necesar transformrii elementelor chimice amintite n hidrurile
volatile respective. Acest lucru se realizeaz n nite accesorii denumite generatoare de
hidruri. n acestea, prin reacia cu borohidrur de sodiu sau cu clorur stanoas, n mediu acid,
se petrece transformarea elementelor amintite n hidruri care, conduse n flacr, la nclzire,
se descompun termic. De exemplu, n cazul arsenului au loc reaciile:

Hidrura volatil este antrenat de gazul purttor ntr-un cuptora din cuar, plasat n
flacr unde de fapt are loc i reacia de descompunere n atomi. n acest fel s-au obinut
sensibiliti de 100 de ori mai bune, n cazul acestor elemente. n cazul particular al mercurului,
care nu d o hidrur stabil, se utilizeaz nite celule speciale din care Hg nu mai are nevoie s
fie transferat n flacr. Metoda, denumit metoda vaporilor reci, se aplic n dispozitive specifice
n care reducerea are loc cu SnCl2.

22
 4. Generaliti privind separarea n chimia analitic

4.1.Rolul separrii n procesul analitic de msur

Probele investigate n diversele domenii sunt de cele mai multe ori foarte complexe, astfel
nct determinarea unor anumite specii (analii) din probe nu este posibil din cauza interferenelor
restului componentelor din prob n procesul de analiz. Metodele de separare au tocmai rolul de a
transfera analiii de interes ntr-un nou mediu, mult mai simplificat din punct de vedere a compoziiei
chimice dect cel al probei iniiale. De asemenea, prin acest transfer se poate realiza, n una sau mai
multe etape, o cretere a concentraiei analiilor din probe, astfel nct valoarea acesteia s se situeze
peste limita de detecie a metodei fizice de analiz, utilizat n final. Proba rezultat prin operaii mai
mult sau mai puin complexe, de separare i concentrare, numit prob final, trebuie s fie
compatibil cu metoda fizic de analiz i s permit obinerea de informaie analitic (calitativ sau
cantitativ) din procesul de msurare a unei proprieti fizice. Aadar, separarea i/sau concentrarea
sunt modaliti de prelucrare a probelor i se includ n schema general a unui proces analitic de
msur.
Prelucrarea probelor prin proceduri de separare este precedat i influenat de prelevarea
acestora i urmat de analiza propriu-zis, aa dup cum se poate observa i din reprezentarea
general dat unui proces analitic n Fig. 1. Un rol important, n dezvoltarea i optimizarea acestui
proces l au dependenele dintre parametrii unei etape i informaia obinut din proces (liniile
punctate).

Fig. 1. Reprezentarea etapelor unui proces analitic de msur.

In general, separarea i concentrarea ca etape importante n prelucrarea probelor, constau

dintr-o serie de operaii analitice, mai mult sau mai puin complexe, avnd unul sau mai multe din
scopurile urmtoare:
- izolarea unuia sau mai multor analii de interes dintr-un mediu (prob) avnd o anumit compoziie
(numit matrice), n vederea eliminrii interferenelor acesteia;
- concentrarea analiilor de interes, astfel nct n proba final obinut, concentraia acestora s fie
peste limita de detecie a procesului de determinare (preferabil n intervalul de linearitate al
msurtorilor);
- eliminarea unei pri grosiere a matricei complexe interferente (etap cunoscut i sub
numele de clean-up);
- modificarea structurii analiilor de interes n vederea mbuntirii unor parametrii analitici
importani (detectabilitate UV-VIZ prin introducerea unor cromofori, inducerea unei proprieti

23
fluorescente, mbuntirea selectivitii unui proces cromatografic, etc); - schimbarea strii de
agregare a analitului sau a matricei n care se gsesc analiii;
- schimbarea solventului probei, proces care are loc de obicei concomitent cu izolarea i
concentrarea analiilor din prob.
De menionat c, de regul, o prob de analizat cu ct este mai complex, cu att i procedura
de prelucrare este mai complex, cu o durat de timp mai mare, iar influena erorilor (sistematice
i/sau ntmpltoare) este mai mare. Astfel, probele biologice, probele legate de controlul poluanilor
din mediul ambiant (aer, ap, sol), probele alimentare, matricile organice complexe, etc., necesit de
cele mai multe ori proceduri de prelucrare, extrem de laborioase i cu o durat mare de timp. In cadrul
procedurilor de prelucrare a acestor probe, concentrarea i/sau izolarea anumitor specii de interes
reprezint principalul scop, iar aceasta se poate realiza convenabil prin una sau mai multe operaii de
extracie.

4.2. Prelevare i implicaii asupra procesului de msur

Recoltarea sau prelevarea probelor dintr-un sistem investigat este esenial pentru calitatea
informaiilor obinute din procesul analitic i, implicit, pentru calitatea deciziilor referitoare la
sistemul din care acestea provin. Aceast etap a procesului analitic de msur poate fi discutat din
mai multe puncte de vedere:
a) dup numrul probelor prelevate astfel nct acestea s fie reprezentative pentru sistemul
investigat;
b) dup cantitatea de prob prelevat care depinde de capacitatea de procesare n etapa urmtoare de
preparare a probelor;
c) funcie de natura fizic a sistemului investigat (care poate fi gazos, lichid sau solid);
d) funcie de natura sistemului investigat din punct de vedere al omogenitii sau heterogenitii sale;
e) funcie de modalitatea de prelevare (n timp i/sau spaiu).
Prelevarea poate fi sistematic sau ntmpltoare, dup cum pot fi luate probele dintr-un
sistem investigat. Prelevarea sistematic presupune respectarea unor reguli de prelevare (n spaiu i
timp), astfel nct informaia analitic s reflecte concentraia (coninutul) de analii n coordonatele
menionate. Prelevarea stratificat este efectuat atunci cnd materialul sau sistemul investigat este
distribuit n zone (straturi) aproximativ omogene. Prelevarea ntmpltoare (aleatoare) se aplic
atunci cnd compoziia sistemului investigat este constant n timp i spaiu, pe o perioad i pe o
ntindere determinate. De asemenea, probele pot fi recoltate ntmpltor, atunci cnd scopul analizei
nu este determinarea exact a coninutului, ci identificarea unor specii chimice.
Prelevarea probelor poate fi uneori nsoit de operaii de modificare a compoziiei acestora.
De exemplu, prelevarea probelor de aer bazat pe reinerea ntr-un mediu lichid reprezint i nceputul
operaiilor de preparare a probelor; adugarea unui reactiv specific n mediul de reinere nltur
aceast etap n procesul de preparare a probelor. De aceea, unele tehnici de prelevare sunt n acelai
timp i tehnici de preparare a probelor. Este cazul, n special, la domeniul prelevrii probelor gazoase,
unde se pun i cele mai dificile probleme legate de reinerea analiilor de interes i msurarea
volumului probelor gazoase.
Prelevarea probelor atmosferice se poate face n dou modaliti: 1) static, atunci cnd
volumul de aer prelevat se aduce ntr-un vas calibrat, n care apoi se introduc reactani dizolvai n
soluie sau adsorbani pentru reinerea fizic a analiilor de interes; 2) dinamic, prin aspirarea cu
ajutorul unei pompe de aspirare avnd debitul controlat i trecerea fluxului gazos printr-un mediu

24
lichid de reinere, sau printr-o trap rcit ori printr-un adsorbant fa de care analiii de interes au o
mare afinitate.
Numrul de probe prelevate dintr-un material (sistem), presupus omogen, depinde de eroarea
introdus n etapa de prelevare (notat cu eprelevare i egal cu diferena Yreal Y ). Conform relaiei
de mai jos mrimea intervalului de ncredere pentru Yreal, dac erorile ar interveni doar n aceast
etap, este dat de expresia:

4.3. Clasificarea metodelor de separare

In primul rnd, metodele de separare pot fi mecanice, cum ar fi filtrarea i centrifugarea, n

care fora motrice de separare este fizic (presiunea, sau fora centrifug). Aceast posibilitate este
aplicabil sistemelor heterogene. Prin urmare, selectivitatea lor ine mai degrab de separarea de faze,
dect de specii analitice din anumite probe dispersate.
Filtrarea este definit ca o operaie analitic prin care se separ o faz solid dispersat ntr-
un mediu lichid, utiliznd n acest scop un material poros. Teoria filtrrii se bazeaz pe un model
teoretic al curgerii unui lichid printr-o capilar, n acord cu legea lui Poiseuville. Relaia care descrie
fluxul () de filtrant (reprezentat de mediul lichid avnd viscozitatea ) ce trece printr-o capilar cu
raza r i lungimea L este urmtoarea:

,
n care: V este volumul de lichid, t este timpul, iar P este presiunea aplicat, care reprezint fora
motrice a acestei separri. Aceasta este necesar avnd n vedere rezistena filtrului, precum i
posibilitatea de acumulare a precipitatului pe filtru, blocnd curgerea lichidului prin porii materialului
filtrant. In plus, pot avea loc anumite efecte de hidratare n porii filtrului, sau fenomene de adsorbie
i electrocinetice, ceea ce nseamn c aceast simpl operaie analitic nu este una pur mecanic n
multe situaii.
Cele mai simple materiale de filtrare sunt pe baz de hrtie de filtru, cu diferite poroziti,
care influeneaz curgerea lichidului, n acord cu relaia de mai sus. Filtre de sticl sau de porelan
sunt de asemenea foarte utilizate n aceste operaii. De regul, dup filtrare se aplic o operaie de
splare, n vederea ndeprtrii complete a prii de matrice lichid din proba filtrat.
In funcie de dimensiunea particulelor solide n suspensie, filtrarea poate fi clasificat n trei grupe:
- filtrarea simpl are loc atunci cnd particulele n suspensie au dimensiunea mai mare dect 10 m;
- se consider microfiltrare atunci cnd particulele reinute au dimensiunile ntre 0,02 i 10 m;
- prin ultrafiltrare se separ particule cu diametrul sub 0,02 m.
In cromatografia de lichide probele care sunt injectate, chiar dac au fost filtrate anterior,
nainte de a intra efectiv n coloana cromatografic, trec n captul coloanei printr-o frit (cu pori
avnd diametrul de pn la 0,2 m), care are rolul de a bloca (filtra) eventualele particule rmase n
suspensie n prob. Odat ajunse n coloan ele s-ar acumula, blocnd spaiul dintre particulele ce
constituie faza staionar, modificnd astfel curgerea prin coloan, precum i interacia analiilor cu
faza staionar.
Centrifugarea este o operaie analitic utilizat la separarea probelor heterogene. In timpul
centrifugrii dou fore acioneaz asupra particulelor disperse din mediul heterogen: fora
25
gravitaional i fora centrifug, datorit rotaiei aplicate. Prima este neglijabil n raport cu cea de a
doua, mai ales cnd se aplic viteze mari de rotaie; acceleraia centrifug (ac) este dat de relaia:

. n care este viteza angular (n radiani per sec); n viteza de turaie (rotaii / min, sau rpm), iar r
este raza n mm. Fora centrifug relativ (RCF) este dat de raportul dintre acceleraia centrifug i
cea gravitaional:

Instrumentele cu care se efectueaz aceast operaie se numesc centrifuge i au fost construite pentru
prima dat de ctre Svedberg. In funcie de valoarea lui RCF, centrifugele pot fi clasificate n trei
grupe:
- centrifuge normale, avnd RCF < 3.000;
- supercentrifuge, avnd RCF > 3.000;
- ultracentrifuge, avnd RCF ntre 106 - 108.
Aplicarea simultan de centrifugare i ultrafiltrare cunoate aplicaii n biochimie, cum ar fi
concentrarea soluiilor de proteine. In acest caz se utilizeaz membrane din materiale cu pori
controlai, cum ar fi din: nitrat de celuloz, acetat de celuloz, policlorur de vinil, poliamide,
polietersulfon, etc.
Procesele fizice bazate pe transfer de faz sunt considerate: distilarea, vaporizarea,
sublimarea, condensarea, uscarea sau cristalizarea. Aceste metode se bazeaz pe proprietile diferite
ale componenilor unei probe de a trece n alt stare de agregare dect cea n care se gsete proba.
Altfel spus, n cadrul acestor metode principiul de separare ale componentelor unei probe se bazeaz
pe punctele lor diferite de topire, evaporare sau chiar sublimare. Chiar dac ele sunt utilizate mai
degrab n scopuri preparative, unele aplicaii cu scopuri analitice pot fi totui ntlnite.
Tot procese de transfer de faz pot fi considerate i solubilizarea sau precipitarea, numai c n
acest caz pe lng intervenia unui parametru fizic (cum este temperatura) au loc i procese de natur
chimic (reacii de precipitare, efecte de hidratare/solvatare sau complexare).
Procesele de separare ntre faze nemiscibile se bazeaz pe transportul diferit al speciilor de
separat n care fora motrice poate fi: potenialul chimic diferit al speciilor de separat, potenialul
electric aplicat asupra probei, reactivitate chimic, etc. Intervenia cu un parametru extern conduce la
clasificarea metodelor de separare n dou mari clase: statice i dinamice. In capitolele urmtoare, o
parte a acestor metode de separare cu cele mai largi aplicaii n chimia analitic vor fi discutate att
din punct de vedere al principiilor teoretice, ct i din punct de vedere al aspectelor instrumentale.

4.4. Noiuni extra-analitice privind procesele de separare

4.4.1. Definiii generale despre solveni i sisteme heterogene

In general, separarea reprezint o modificare a concentraiilor relative a unuia sau mai multor
componeni dintr-o anumit vecintate, ca urmare a unui transfer de mas a unor specii chimice dintr-
o regiune n alta. Acest transfer atinge un echilibru la un moment dat i este caracterizat prin viteza
cu care acesta este atins. Sistemele de separare la echilibru sunt n mod necesar heterogene, implicnd
o repartiie a componenilor ntre dou sau mai multe faze distincte, numite nemiscibile. Din

26
multitudinea de sisteme de separare a componenilor unei probe, extraciile lichid-lichid i lichid-
solid au cele mai multe aplicaii n chimia analitic.
Prin extracie se nelege un proces de distribuie a unei substane ntre dou faze nemiscibile
lichide sau ntre o faz lichid i una solid. Procesul se supune legii fazelor, formulat de Gibbs:
F+N=K+2,
unde: F este numrul de faze; N - numrul gradelor de libertate; K - numrul componentelor.
Pentru un numr de componeni, K, se poate prezice numrul de faze F care pot coexista
pentru un numr dat de grade de libertate N. Gradele de libertate corespund variabilelor independente
ale sistemului (temperatur, presiune i concentraiile componenilor n fazele date). De exemplu,
pentru un sistem cu un singur component (K=1) aflat ntr-o singur faz (F=1) va rezulta c are dou
grade de libertate (N=2): presiunea i temperatura pot fi alese arbitrar pe un anumit domeniu de valori.
Atunci cnd componentul se gsete n dou faze aflate la echilibru (F=2), va rezulta un singur grad
de libertate: presiunea i temperatura sunt interdependente printr-o relaie explicit. Dac
componentul se gsete n trei faze (F=3), atunci N=0, adic starea lui este complet determinat de
aa-numitul punct triplu n care cele trei faze coexist.
Pentru un sistem coninnd doi componeni, va rezulta c F + N = 4. In acest caz avem
situaiile: a) o singur faz (F=1), numit amestec sau soluie, cu trei grade de libertate (concentraia,
temperatura i presiunea); b) dou faze (nemiscibile) cu dou grade de libertate (concentraia i
temperatura sau presiunea); c) trei faze i un singur grad de libertate (concentraia). Un proces de
extracie presupune distribuia unui compus ntre dou faze nemiscibile, K=3 i F=2, de unde va
rezulta c numrul gradelor de libertate sunt 3 (concentraia, presiunea i temperatura).
Procesul de extracie este un proces reversibil ce atinge un echilibru, numit i repartiie sau
distribuie ntre dou faze. Dac cele dou faze sunt lichide, atunci acestea sunt nemiscibile ntre ele,
iar extracia se numete lichid-lichid. Specia chimic asupra creia se acioneaz n acest proces se
numete analit. Dintre aplicaiile analitice ale extraciei lichid-lichid, cele mai importante se refer la
cazul n care unul dintre lichide este apa sau o soluie parial apoas.
Solventul este o substan sau un amestec omogen de substane n stare lichid, care poate fi:
a) miscibil sau nemiscibil cu faza apoas; b) cu afinitate (solubilitate) mai mare sau mai mic fa de
anumii compui de interes (analii). O clasificare general a solvenilor, n funcie de volatilitatea i
miscibilitatea lor cu apa, este dat n tabelul de mai jos.

Tabel 1. Clasificare i exemple de solveni utilizai n procese de solubilizare.

Alcooli alifatici superiori (ncepnd cu C4); Esteri;
Cetone superioare (ncepnd cu C4); Acetali;
Solveni volatili, Eteri;
nemiscibili cu apa Hidrocarburi alifatice i aromatice; Derivai halogenai, alifatici i aromatici;
Nitroalcani;
Sulfur de carbon.
Acizi carboxilici inferiori (formic, acetic, propionic); Baze (piridina i
derivai, piperidina, amine alifatice inferioare);
Solveni volatili,
Alcooli inferiori;
miscibili cu apa
Aldehide inferioare; Cetone inferioare;
Nitrili alifatici inferiori; Hexametilfosfotriamida.

27
 Baze, precum: anilina, N-alchilanilina, chinolina; Amide (ex. formamida).
Cetone (mixte, ciclice sau 1,4-dicetone);
Alcooli (termeni superiori, aromatici);
Eteri (termeni superiori alifatici, eteri ai glicolului); Unii esteri (ex. triacetat
de glicerin);
Solveni nevolatili,
Hidrocarburi alifatice superioare;
nemiscibili cu apa
Hidrocarburi aromatice superioare (ex. tetralin, cumen);
Terpene (ex. pinen);
Nitroderivai aromatici (ex. nitrobenzenul);
Derivai polihalogenai ai hidrocarburilor superioare; Derivai halogenai
aromatici.
Hidroxi-acizi (acid lactic);
Solveni nevolatili,
Baze, precum mono-, di- i trietanolamina; Alcooli polihidroxilici (glicol,
miscibili cu apa
glicerin); Amide (ex. formamida).

Chiar dac iniial au fost utilizate ca solveni n sintezele organice, lichidele ionice i-au gsit
un domeniu de aplicare i n procesele de extracie. Acestea sunt sruri organice, cu puncte de topire
mai mici de 100C. Principalele lor caracteristici: a) sunt nevolatile; b) sunt buni solveni pentru un
numr mare de compui anorganici i organici; c) sunt insolubile fa de unii solveni organici
nepolari; d) lichidele ionice hidrofobe sunt nemiscibile cu apa i, prin urmare, pot fi utilizate n
procese de extracie lichid-lichid.
Cele mai comune lichide ionice sunt derivaii de imidazoliu i piridiniu, dar pot fi utilizai i
derivai tetraalchilamoniu sau fosfoniu. Structurile ctorva exemple de substane din aceast clas
sunt redate n continuare.

Formulele structurale ale unor substane cunoscute ca lichide ionice.

Din punct de vedere experimental procedura extraciei se efectueaz ntr-un dispozitiv numit
extractor, dar de multe ori, n special cnd volumul de prob este mic, aceasta se poate improviza cu
destul succes i n dispozitive simple, precum plnii, baloane, sau recipiente, supuse unei agitri
controlate.
Re-extracia reprezint procesul de extracie invers a analitului din extractul organic ntr-o
faz apoas sau uneori n alt faz organic. Noua faz n care analiii se separ se numete reextract.
Splarea este un proces de reextracie, parial sau total, a unor impuriti din extract sau reextract,
care se face cu o soluie de splare ce poate fi o soluie apoas sau organic.

28
 5. Separarea cromatografic aspecte generale

5.1. Clasificarea metodelor cromatografice

nceputurile separrilor cromatografice se datoreaz lui vet (1903), care a realizat primele
separri de colorani vegetali pe coloan umplut cu carbonat de calciu. Termenul de eluie
cromatografic a fost introdus mai trziu, de ctre Reichstein i van Euw (1938), care s descrie
principial procesul cromatografic de separare a componenilor probei la trecerea printr-o faz
staionar. Tot n acelai an, Izmailov i Shraiber i-au publicat rezultatele privind primele separri
cromatografice pe strat subire.
Separarea cromatografic are la baz interacia difereniat a componenilor unei probe fa
de dou faze, numite: faza staionar i faza mobil (aflat n micare fa de faza staionar). Procesul
se petrece ntr-o coloan cromatografic, sau pe suprafaa plan a unei plci pe care este depus faza
staionar. Analiza cromatografic este un proces cuplat ntre separarea cromatografic i
determinarea (detecia) compuilor separai (proces care se bazeaz pe msurarea unei proprieti
fizice).
Din aceast prezentare, rezult c separrile cromatografice pot fi clasificate fie din punct de
vedere al naturii celor dou faze (staionar i mobil), fie din punct de vedere al mecanismului de
separare, sau fie din punctul de vedere constructiv al ansamblului de faze.
Din punct de vedere al naturii celor dou faze distingem urmtoarele clase de separri
cromatografice:
- cromatografie de gaze (GC) n care faza mobil este un gaz inert; n funcie de natura fazei staionare
se disting urmtoarele tehnici gaz-cromatografice:
a) separarea gaz-lichid n care faza mobil este un gaz inert, iar faza staionar este un lichid, depus
pe un suport inert, sau pe peretele unei coloane cromatografice;
b) separare gaz-solid (SGC), n care faza mobil este un gaz inert, iar faza staionar este un solid;
- separare prin cromatografia de lichide (LC), n care faza mobil este un lichid, iar faza staionar
este de regul un solid;
- cromatografie n fluide supercritice (SFC), n care faza mobil este un fluid supercritic.
Mecanismul care st la baza de separrii cromatografice se poate baza pe: 1) adsorbie; 2)
repartiie; 3) schimb ionic; 4) excluziune steric, etc. Adeseori, procesele cromatografice pot decurge
printr-o combinaie a acestor mecanisme.
In funcie de mecanismul de separare cromatografia de lichide (n care polaritatea i
hidrofobicitatea analiilor, a fazei staionare i a fazei mobile joac un rol determinant) se mparte n
trei variante:
i) cromatografia de lichide n faza normal (denumit aa mai degrab din punctul de vedere istoric),
n care faza staionar este polar, iar faza mobil este nepolar;
ii) cromatografia de lichide n faza invers, n care faza staionar este nepolar i hidrofob, iar faza
mobil este polar.
iii) cromatografie de lichide prin mecanism de schimb ionic, n care faza staionar este un schimbtor
de ioni, iar faza mobil este apoas cu pH controlat.
Din punct de vedere constructiv se disting: cromatografia pe coloan i cromatografia planar
(pe hrtie sau pe strat subire). In prezent, cromatografia pe coloan, n una din clasele menionate

29
anterior reprezint una dintre cele mai importante tehnici de investigare a probelor multicomponent
n chimia analitic. Dup cum spune i denumirea, rolul central n separarea cromatografic l are
coloana cromatografic, n care se gsete faza staionar.

5.2. Parametrii unei separri cromatografice

Cromatograma reprezint dependena n timp a proprietii msurate de detectorul sistemul

cromatografic. Intr-o cromatogram ntlnim picuri cromatografice i o linie de baz (constant sau
variabil). O separare cromatografic a unui amestec de n componeni trebuie s conduc la o
cromatogram cu n picuri cromatografice. De exemplu, n figura 2 este redat cromatograma HPLC
a unei probe coninnd 14 hidrocarburi aromatice polinucleare n acetonitril. Dup cum se poate
observa, numrul de picuri cromatografice este egal cu 14; dintre acestea doar picurile 10 i 11 nu
sunt perfect separate n linia de baz.

Fig. 2. Cromatograma unui amestec de 14 compui.

(amestec de 14 hidrocarburi aromatice polinucleare separate prin HPLC n faz invers i detecie
prin spectrometrie de absorbie molecular UV).

Semnalul cromatografic este numit pic cromatografic, a crui form red de fapt o imagine a
echilibrelor de distribuie ale moleculelor de analit ntre faza mobil i faza staionar, care se petrec
n coloana cromatografic. Parametrii matematici ai unui pic cromatografic ideal (picul 5 din Fig. 2,
apropiat de forma Gauss) sunt dai n figura de mai jos (fig.3.), care la rndul lor sunt utilizai la
determinarea aa-numiilor parametri cromatografici ai unei separri.
Forma ideal a picului cromatografic este descris de ecuaia de tip Gauss, n forma
urmtoare:

,
n care Y0 este nlimea maxim a picului cromatografic, msurat la valoarea timpului, numit timp
de retenie (tR), w1/2 este semi-limea picului (limea picului msurat la jumtatea nlimii);
ln 2 = 0,693.

30
 Fig. 3 Parametrii unui pic cromatografic ideal (de form Gauss).

Forma unui picul cromatografic simetric, dar mai larg n baz poate fi descris la fel de bine
i de funcia Cauchy:

unde, de asemenea: Y0 este nlimea picului pentru t = tR, iar w1/2 este limea picului la jumtatea
nlimii (semi-lime). Forma celor dou funcii nu difer foarte mult, aa dup cum se poate observa
din regresiile respective aplicate unui pic real n figura urmtoare, (fig. 4.) prelucrat din cele redate
n Fig 2

Fig. 4. Modelarea unui pic cromatografic real (punctat gros) prin funcia Gauss, respectiv prin
funcia Cauchy (linie continu).

Pentru un pic simetric de tip Gauss, limea acestuia msurat ntre punctele de inflexiune
este 2. Cum punctele de inflexiune sunt mai dificil de evideniat, se prefer a se msura limea
picului la jumtatea nlimii acestuia, notat mai sus cu w1/2. Intre w1/2 i exista relaia simpl:

Aria picului (A) care este o mrime cantitativ, ce depinde de cantitatea de analit injectat n
coloana cromatografic, se obine din integrarea funciei Gauss:

31
sau a funciei Cauchy:

In practic, integrarea picurilor se face n mod automat cu ajutorul soft-ul sistemului de

achiziie i prelucrare a datelor cu care este dotat sistemul cromatografic. Analistul trebuie s
precizeze aria minim de pic care poate fi msurat. Sub aceast limit picurile cromatografice din
cromatograma nregistrat nu vor fi raportate de ctre soft-ul sistemului de achiziie i prelucrare a
datelor. Integrarea se poate face i manual de ctre analist. Problema alegerii liniei de baz
(baseline), fa de care se va face integrarea, este dificil atunci cnd picurile cromatografice (fig.
5.) se apropie ca mrime de semnalele din linia de baz (analitul se gsete n proba injectat la limita
de detecie a detectorului cromatografic). In acest caz, analistul trebuie ntr-o bun aproximaie
vizual s stabileasc media semnalului de baz fa de care vor alege punctele X i Y n care se va
integra picul cromatografic. Aceast situaie este ilustrat n figura de mai jos, cu alegerea greit i
corect a punctelor de integrare.

Fig. 5 Fereastra unei poriuni dintr-o cromatogram n care picul cromatografic este corect integrat
prin alegerea punctelor X i Y n linia media a semnalului de baz (ales neconstant cu drift).

In general, ntre aria picului (Apic) i cantitatea de analit injectat n coloan ( ,

exprimat n g, sau n ng, sau n pg, etc) exist o relaie de linearitate:

Mrimea Q poate fi substituit i prin concentraia probei injectate, cu condiia ca n procedura

de calibrare i cea de analiz, volumele de soluii standard, respectiv de prob analizat, s fie
identice.
Factorul de rspuns (Fi) al unui detector fa de un anumit analit i detectat la ieirea din
coloana cromatografic este dat de raportul dintre aria picului corespunztor analitului i i cantitatea
de analit (uniti de mas) injectat n coloan:

32
 Atunci cnd picul cromatografic crete ca arie, poriunea de arie rezultat prin integrarea mai
puin corect, ilustrat n figura de mai sus, devine nesemnificativ n raport cu aria acestuia, astfel
c n practic nu se mai mrete imaginea semnalului de fond pentru a gsi punctele corecte de
integrare.
De foarte multe ori, forma picurilor este asimetric. In acest caz, alegerea unei funcii utile n
descrierea formei picului cromatografic este mai dificil. De regul, asimetria se datoreaz unei aa-
zise cozi (tailing) a picului cromatografic, care poate fi n faa picului (pre-tailing) sau n spatele
picului (post-tailing).
Simetria unui pic cromatografic (notat cu Sim) poate fi exprimat n mai multe moduri. Dac
aceasta se msoar n punctele de inflexiune a curbei picului redat n Fig. 3, Sim devine:

Simetria poate fi msurat mai exact la jumtatea nlimii picului cromatografic, atunci cnd
w1/2 este mprit de verticala din maximul picului n dou pri: B n partea dreapt i C n partea
stng. In acest caz simetria devine:

In mod practic, cozile picurilor cromatografice se evideniaz dup jumtatea nlimii

maxime a picului cromatografic. De aceea, se prefer msurarea lui B i C, la o nlime a picului
cromatografic ct mai aproape de linia de baz, dar suficient de mare ca s se evite erorile legate
delimitarea picului (msurarea lui w este afectat de erori). In acest caz, cea mai recomandat
msurare este la 10% din maximul nlimii picului, cnd parametrii B i C sunt notai cu B10%,
respectiv C10%, iar simetria are expresia:

Un parametru important a unei separri cromatografice este timpul mort (notat cu t0). Acesta
semnific durata de timp n care faza mobil parcurge coloana cromatografic. Acest parametru se
poate msura cunoscnd debitul fazei mobile i lungimea coloanei (n cromatografia de gaze) sau
introducnd n proba injectat un component total inert fa de faza staionar (n cromatografia de
lichide), care va elua astfel din coloana cromatografic la timpul de retenie notat cu t0. Cu ajutorul
acestui parametru se pot calcula ali doi parametrii foarte importani ai unei separri cromatografice:
timpul de retenie ajustat, numit i timp de retenie net (tR) i factorul de capacitate (k), definii prin
relaiile:

Din punct de vedere practic, minimul separrii cromatografice a doi compui injectai (notai
n ordinea eluiei cresctoare cu i i j) n coloana cromatografic se obine atunci cnd picurile lor
cromatografice ajung n semnalul liniei de baz. Gradul de separare cromatografic este exprimat
33
prin rezoluia cromatografic (Rs). Pentru picuri simetrice formula de calcul a acestui parametru este
dat de expresia:

In felul acesta se poate deduce c minimul lui Rs pentru ca cele dou picuri cromatografice i
i j s fie separare n linia de baz este 1. Dac picurile nu sunt separate, msurarea pentru wi i wj nu
poate avea loc. innd cont c: wi = 2w1/2,i i wj = 2w1/2,j, formula rezoluiei devine:

O msur a selectivitii cromatografice este dat de factorul de separare (notat cu ij) a doi compui
i i j (elund n aceast ordine), care este definit prin relaia:

Eficiena unei separri cromatografice se reflect n lrgimea picului cromatografic: cu ct

picul cromatografic este mai ngust, cu att mai mare este eficiena separrii cromatografice.
Cantitativ, eficiena unui proces de separare se exprim prin numrul de talere teoretice (notat cu N).
Conceptul de taler teoretic este mprumutat din teoria distilrii, care n cazul unei separri
cromatografice s-ar traduce prin poriunea din coloana cromatografic n care se stabilete echilibrul
de distribuie al analitului ntre faza mobil i faza staionar. Formula de calcul a numrului de talere
teoretice Ni corespunztor unui analit i este urmtoarea:

Formula de calcul a parametrului N devine:

nlimea talerului teoretic (notat cu h) se poate calcula cunoscnd lungimea coloanei

cromatografice L: h = L/N.
Cu aceste ultime noiuni, se poate reveni la formula de calcul a rezoluiei. innd cont de
relaiile anterioare se poate deduce formula de calcul a rezoluiei, pentru picuri cromatografice de arii
aproximativ egale i caracterizate ntr-o bun aproximaie de aceiai eficien (N):

34
 6. Cromatografia de gaze. Generaliti.

6.1. Scurt istoric

Cele dou direcii ale cromatografiei de gaze (GC) s-au dezvoltat aproximativ n acelai timp;
n anul 1951 Erika Cremer punea bazele cromatografiei gaz-solid, iar n 1952 James i Martin
publicau prima lucrare consacrat cromatografiei gaz-lichid. Un salt imens n acest domeniu se
datoreaz lui Golay, cel care n anul 1957 a introdus coloanele capilare n separarea GC. Trebuie
menionat faptul c n prezent, mai mult de 90% din aplicaiile GC se efectueaz utiliznd coloane
capilare, pe peretele crora sunt depuse fazele staionare. De asemenea, trebuie menionate
contribuiile majore aduse de Giddings n teoria optimizrii separrilor cromatografice i corelrii cu
condiiile experimentale de lucru.
Alte contribuii majore la dezvoltarea acestei tehnici sunt legate de introducerea programrii
de temperatur n procesele de separare GC (Stephen Dal Nogare, 1958), realizarea fazelor staionare
de tip polisiloxanic sau dezvoltarea tehnicilor de detecie, universale sau specifice. O dat cu cuplarea
cromatografiei de gaze cu spectrometria de mas, demonstrat pentru prima dat de Holmes i
Morrell (1957), aceast tehnic analitic cunoate un mare succes. Un pionier uitat, din pcate, al
cromatografiei de gaze este Clark Hamilton, cel care a realizat primele microseringi care-i poart
numele i care sunt foarte utilizate i astzi.

6.2. Tipuri de coloane n cromatografia de gaze

Procesul de separare cromatografic se desfoar n coloana cromatografic. Coloanele n

cromatografia de gaze pot fi clasificate n urmtoarele tipuri:
1) Coloane umplute, n care umplutura este reprezentat de ctre faza staionar depus pe un suport
inert, iar materialul astfel rezultat este introdus mecanic ntr-o coloan (metalic sau silice topit, cu
diametrul de ordinul mm i lungimea de pn la 1 m).
2) Coloane capilare (WCOT wall coated open tubular) avnd pe peretele interior un film lichid
imobilizat, cu grosime de strat ntre 0,1 i 5 m (de regul 0,25 m). Coloanele capilare sunt
construite din silice topit sau borosilicat, acoperite la exterior dintr-un strat protector de polimer.
Lungimea acestora este de pn la 100 m, iar diametrul interior ntre 0,05 1 mm. Eficiena acestora
este foarte mare, separrile cromatografice pe astfel de coloane atingnd 5.000-10.000 talere/m
lungime de coloan.
3) Coloane capilare avnd pe peretele interior depus un strat cu grosimea de cel mult 30 m, alctuit
din particule ale unui suport inert (de exemplu, pmnt diatomeic) pe care este depus faza staionar
propriu-zis dat de un film lichid cu grosimea de maximum 1 m (SCOT support-coated open
tubular). Imaginile seciunilor acestor dou tipuri de coloane capilare sunt redate n figura 6.

35
 Fig. 6. Seciunea printr-o coloan de tip WCOT i SCOT.

6.3. Faze staionare n cromatografia gaz-solid (GSC)

Faza staionar este solid i este dat de un adsorbant. De aceea GSC mai este denumit i
cromatografie de adsorbie. O serie de avantaje ale acestor faze staionare fa de cromatografia gaz-
lichid (GLC) pot fi menionate:
- stabilitatea mare peste un interval de temperaturi mai larg;
- mai puin sensibile la aciunea oxigenului;
- fenomenul de degradare a fazei staionare (aa-numitul efect de bleeding) este practic
inexistent;
- selectivitatea mai bun la separarea de izomeri geometrici sau izotopici;
- selectivitatea mai bun fa de compui anorganici, sau organici cu mase moleculare
mici.
Principalii adsorbani utilizai ca faze staionare n cromatografia gaz-solid sunt:
1) SiO2 (silice), tratat termic la temperaturi de 700 - 950C.
2) Alumina (Al2O3), tratat termic.
Aceti doi adsorbani pot fi utilizai la separarea de hidrocarburi saturate i
nesaturate, cu mase moleculare mici, a derivailor halogenai inferiori, sau chiar a unor derivai ai
benzenului.
3) C grafitizat se obine prin nclzirea negrului de fum la temperaturi ridicate (aproximativ
3000C), ntr-o atmosfer de gaz inert. Astfel, n timpul procesului termic are loc formarea unor
microcristalite de tip grafit.
Retenia analiilor pe C grafitizat poate fi explicat pe baza accesibilitii acestora la dou
tipuri de centre active de adsorbie:
a) Marea majoritate a acestora sunt nepolare i corespund unei reele de atomi de C de tip
grafitic. Aceste centre de adsorbie nu arat o preferin pentru analiii coninnd grupri funcionale
polare. Forele de dispersie stau la baza separrilor ntre analii.
b) Centrele de adsorbie polare sunt ntr-o mic proporie n matricea adsorbantului de tip C
grafitizat, dar pot da interacii puternice cu analiii polari. Tratamentul preliminar al acestui adsorbant
poate conduce la o reducere semnificativ a acestora. Astfel, prin nclzirea la 1000C, ntr-un curent
de H2, are loc o dezactivare a centrilor activi alctuii din compleci de suprafa ai oxigenului, n

36
timp ce splarea cu HClO4 sau H3PO4 elimin complecii bazici carbon-oxigen sau sulful sub form
de sulfuri.
4) zeolii, bile polimerice poroase sau ciclodextrine sunt utilizate la separarea de compui
anorganici sau organici gazoi, cu dimensiuni moleculare mici, principiul de separare fiind acela al
excluziunii sterice. De exemplu, componentele aerului (N2, O2, Ar, CO2), dar i unii poluani
anorganici (CO, CH4) pot fi separate pe coloane umplute cu zeolii (faza staionare numite i site
moleculare), cu diametrul porilor de 5. Dac se utilizeaz polimeri poroi, O2, N2, Ar, NO sau CO,
nu pot fi separate, din cauza porilor prea mari.
Cteva exemple din cei mai importani adsorbani, de tip anorganic sau organici, utilizai n
GSC i comercializai sunt redai n tabelul 2

Tabelul 2. Adsorbani anorganici sau organici utilizai n GSC.

Suprafaa specific Diametrul porilor
Tip adsorbant Nume comercial
(m2/g) (nm)
Spherosil XOA 400 300 500 8
Spherosil XOA 200 140 - 230 15
Spherosil XOB 075 75 125 30
Spherosil XOB 030 37 62 60
Silice Spherosil XOB 015 18 - 31 125
Spherosil XOC 005 5 - 15 300
Porasil B 125 250 10 20
Porasil C 50 - 100 20 - 40
Carbopack B 100 -
Carbopack C 12 -
C grafitizat
Carbosieve 1000 1,3
Spherocarb 1200 1,5
Chromosorb 101
< 50 300 - 400
(rini poliaromatice)

Polimeri poroi Porapak P sau Q

(copolimeri ai
> 500 7,5
stirenului cu
etilvinilbenzen)

Ciclodextrinele sunt oligozaharide, coninnd uniti de glucopiranoz, conformaia scaun,

legate ntre ele n poziiile 1,4. -Ciclodextrina conine 6 uniti de glucoz, -ciclodextrina conine
7 astfel de uniti, iar -ciclodextrina conine 8 uniti. Geometria acestor molecule este de trunchi de
con, cu ambele capete deschise. Interiorul cavitii conine doar grupri metilenice sau puntea
glicozidic, structur ce confer compui unele proprieti hidrofobe i o densitate electronic mare
(datorit O), care s participe la formarea de asociaii moleculare cu compuii de separat. Astfel c
separarea componenilor unei probe are la baz stabilitatea acestor asociaii moleculare: cu ct

37
moleculele unui component formeaz asociaii mai stabile cu ciclodextrinele, cu att retenia acestuia
este mai mare. Molecule mari de compui care nu pot ptrunde n cavitatea ciclodextrinei nu vor
interaciona cu ea i astfel vor elua mai rapid din coloan prin comparaie cu unele molecule mici, ce
pot ptrunde n interiorul cavitii. Gruprile hidroxil libere sunt alchilate sau acilate total, astfel nct
nu vor interaciona prea puternic cu eventuale grupri polare ale compuilor separai. Fixarea acestor
faze staionare pe pereii unei capilare se poate face prin dizolvarea lor n polidimetilsiloxan (total
apolar), care ader astfel la pereii coloanei. Domeniul de temperatur n care pot fi folosite
ciclodextrinele ca faze staionare este 30 - 250C. Principala utilizare a acestor faze staionare este n
separarea izomerilor de poziie, geometrici sau optici (enantiomeri sau diasteroizomeri).[96] De
exemplu, -ciclodextrina poate separa izomerul trans- de izomerul cis- ai 2-metilciclohexanolului.

6.4. Faze staionare n cromatografia gaz-lichid (GLC)

Fazele lichide n GC nu sunt lichide propriu-zise; ele au aspect de clei, sau gum (de unde i
denumirea lor n englez de gums). Mobilitatea lor le aseamn cu lichidele, iar aceast proprietate
este utilizat la depunerea lor pe pereii capilarei sau pe particulele unui suport inert. Particulele inerte
pot fi pmnturi diatomeice sau silicagel silanizat (inertizat) prin una din procedurile urmtoare:

Cele mai cunoscute faze staionare n GLC sunt uleiurile polisiloxanice. Acestea sunt utilizate
n cadrul celor dou variante de GLC (WCOT, SCOT). Sinteze uleiurilor polisiloxanice pornete de
la derivatul dietoxi- al R,R-silanului i urmeaz urmtoarele dou procese chimice de transformare:

Funcie de natura radicalului R se cunosc mai multe tipuri de faze staionare din clasa
polimerilor siloxanici, avnd structurile generice date n tabelul 3. Caracteristicile acestor faze
staionare sunt urmtoarele:

38
 i) Masa molecular medie (sau gradul de policondensare, n);
ii) Polaritatea;
iii) Stabilitatea termic;
iv) Domeniul de aplicaii (clasa de compui separai);
v) Selectivitatea separrilor.
Stabilitatea termic a fazei staionare este important, pentru c la temperaturi mai mari ale
regimului de separare, faza staionar s nu se descompun i astfel s induc produi care s interfere
cu analiii din prob. In plus, prin degradare calitile fazei staionare se diminueaz. Domeniul de
temperatur n care pot fi utilizai aceti polimeri este de la temperatura ambiant pn la 300-350
C, exceptnd polietilenglicolul care peste 175-200 C se descompune. Stabilitatea termic depinde
de natura radicalilor R (de exemplu, trifluorpropil este cel mai stabil termic) i de gradul de
policondensare: cu ct n este mai mare, cu att stabilitatea termic a fazei staionare este mai mare.
Se cunosc faze staionare de tip polisiloxanic n care ntre doi atomi de Si sunt intercalate
grupri aromatice, aa cum se poate observa din exemplul urmtor:

Polimerul de tip silfenilen este caracterizat de un domeniu mai larg de stabilitate termic (pn
la 400 C). De asemenea, s-au realizat structuri polisiloxanice coninnd structuri tridimensionale de
tip carboranic, care s-au dovedit a fi utile n separrile GC.

La temperaturi ridicate, peste valorile indicate anterior, fazele staionare de tip polisiloxanic
ncep s se degradeze, fenomen cunoscut sub numele de bleeding. De asemenea, prezena
oxigenului i a vaporilor de ap n gazul purttor utilizat ca faz mobil n GC conduce n timp la
diminuarea performanelor coloanei.
Ca faze staionare n cromatografia de gaze n variantele WCOT sau SCOT, menionate
anterior, mai pot fi utilizate i urmtoarele materiale:
- polietilenglicolsuccinat;
- polietilenglicoladipat (EGA);
- polietilenglicoltereftalat;
- polibutandiolsuccinat;
- acizi grai nemodificai;
- derivai de tip polimeric halogenai; - Triton X-100; X-305;
- polipropilenglicol;
- sorbitol;
- tricrezilfosfat.
39
 Tabelul 3. Tipuri de faze staionare cu caracter lichid utilizate n GC.

Structura chimic Denumire/caracter Aplicaii

Hidrocarburi alifatice cu p.f. jos,
Squalan
amide inferioare, esteri ai
(nepolar)
acizilor grai, terpene, etc,
Polidimetilsiloxan (practic Compui polari; de ex. alcaloizi,
nepolar) derivai volatili ai amino-
Denumirea comercial: OV-1; acizilor, pesticide, fenoli
SE-30 derivatizai, etc

Poli(fenilmetildimetil)siloxan
(slab polar) Unele medicamente, pesticide,
Denumirea comercial: OV-3; PAHs, PCBs,
SE-52

Poli(fenilmetil)siloxan (mediu
Pesticide, medicamente, steroizi,
polar)
etc.
Denumirea comercial: OV-17

Compui halogenai, aldehide i

Polimetiltrifluorpropilsiloxan
cetone, unele medicamente,
(polar)
fenoli derivatizai, aminoacizi
Denumirea comercial: OV-210
derivatizai, etc.

Polimetilcianopropilsiloxan
Nitrili, sisteme aromatice,
(polar)
steroizi
Denumirea comercial: OV-275

Polietilenglicol (Denumirea Aldehide, esteri, eteri, fenoli

comercial: Carbovax 20M) derivatizai

* Structura este urmtoarea:

40
 6.5. Componentele unui sistem GC

Un cromatograf de gaze are trei componente principale: injectorul, camera de termostatare a

coloanei cromatografice i sistemul de detecie (unul sau mai muli detectori). Acestora li se altur
sursa de gaz purttor pentru realizarea fazei mobile a separrii prin GC. Injectorul permite plasarea
probei n captul coloanei, ntr-o zon ct mai ngust cu putin. Proba n GC poate fi gazoas sau
lichid; atunci cnd proba este lichid, componenii probei trebuie s fie volatili i stabili termic la
temperatura injectorului, precum i pe intervalul de temperatur n care se face separarea
cromatografic (domeniul de temperatur obinuit pentru separrile GC este 20 - 400C).
O reprezentare schematic a unui sistem GC este redat n Fig. 7

Figura 7. Reprezentarea schematic a structurii unui cromatograf de gaze + anexe.

Faza mobil n GC trebuie s fie inert din punct de vedere chimic, de puritate nalt (fr
urme de ap sau oxigen), compatibil cu tipul de detecie aplicat i convenabil din punct de vedere
al costului. Faza mobil n GC mai este cunoscut i ca gaz purttor, putnd fi H2, N2, He sau Ar;
gazul purttor poate fi produs de un generator de gaz (H2 sau N2), sau se gsete stocat n cilindri
metalici, de unde este adus cu un debit controlat de un reductor de presiune n sistemul cromatografic.
Uneori debitul gazului purttor este prea mic fa de volumul detectorului (n special cnd se folosesc
coloane capilare), iar n acest caz se suplimenteaz necesarul cu un debit de aa-numit make-up gas.
Incinta termostatat (cuptorul) asigur regimul termic n coloana cromatografic.
Temperatura fiind un parametru esenial n separarea GC trebuie s fie uniform pentru toat
lungimea coloanei; fluctuaii de temperatur influeneaz procesul de retenie cromatografic i astfel
exactitatea timpilor de retenie ai analiilor din prob, conducnd n unele cazuri chiar la splitarea
picurilor cromatografice. Instrumentele GC comercializate asigur ajustarea rapid i controlul
temperaturii ntr-un interval de 50- 450 C. Operarea n regim termic subambiental presupune
utilizarea unui sistem criogenic de rcire, bazat pe N2 sau CO2 lichid.
Sistemul de achiziie i prelucrare a datelor este utilizat i pentru programarea unor parametrii
ai separrii (regimul de temperatura) sau parametrii sistemului de detecie. Cromatograma poate fi
vzut n timp real, iar gradul de prelucrare a acesteia depinde de complexitatea softului cu care este
dotat calculatorul sistemului.

41
 6.6. Sisteme de injecie n GC

Injectorul n GC este un subansamblu integrat sistemului cromatografic avnd rolul de a

realiza transferul exact i reproductibil, selectiv sau neselectiv, al probei luate n analiz, de la
operatorul sistemului ctre coloana cromatografic, fr ns a induce perturbaii majore n raport cu
parametrii procesului de separare cromatografic. Injectorul este o interfa ntre operator i sistemul
cromatografic, care permite introducerea manual sau automat a probei i transferul acesteia ctre
coloan.
Sistemul de injecie poate aciona asupra probei, fie n sensul diluiei, fie n cel al concentrrii
acesteia. Prin diluie nelegem, n acest caz, c doar o fraciune din volumul probei, n integralitatea
ei, este transferat coloanei, prin intermediul injectorului. Prin efect de concentrare nelegem acel
mod de lucru, specific sistemului de injecie, prin care, imediat naintea transferului ctre coloan,
are loc o eliminare (parial sau total) a solventului probei, ceea ce face ca aceasta s ajung n
procesul de separare n integralitatea ei, la concentraii mai mari ale componenilor individuali n
raport cu concentraia probei iniiale.
Sub aspect calitativ, selectivitatea sistemelor de injecie se refer la capacitatea acestora de a
transfera ctre coloan doar acei componeni ai probei care se bucur de o anumit proprietate fizic
sau chimic.
Injectorul are uneori i rolul de a aduce analiii din proba luat n lucru, ntr-o form
analizabil de ctre sistemul cromatografic. El poate aciona, de exemplu, n sensul vaporizrii
compuilor individuali, fapt ce permite analiza acestora prin cromatografie de gaze.
Injectorul nu trebuie, n general, s acioneze asupra analiilor, n sensul modificrii naturii
lor chimice. In cazul n care, totui, modificarea naturii chimice a analitului (analiilor) este dorit,
este absolut necesar ca operarea i construcia injectorului s permit o reproductibilitate nalt a
condiiilor care genereaz transformarea n cauz.
Un exemplu n acest sens l reprezint analiza prin cromatografie de gaze a polimerilor
organici. Deoarece materialele polimere sunt compui nevolatili (datorit masei moleculare nalte),
apare imposibilitatea analizei acestora prin cromatografie de gaze. Dac, ns, sistemul de injecie
permite degradarea termic a analitului (piroliz), produii de descompunere rezultai (substane cu
molecul mic) vor putea fi analizabili prin cromatografie de gaze, genernd o cromatogram
specific tipului de polimer studiat, doar n condiiile reproductibilitii perfecte a procesului de
piroliz.
Este evident necesitatea existenei unei inerii chimice pronunate a materialelor din care sunt
confecionate acele pri ale injectorului aflate n contact direct (permanent sau temporar) cu faza
mobil. De asemenea, construcia sistemului de injecie nu trebuie s afecteze parametrii fizici ai
fazei mobile (debit, vitez, etc.).
In general, volumul de prob este mic (1-10 L). Sistemele de injecie n GC pot fi mprite
n dou clase mari: selective i neselective. Sistemele de injecie neselective pentru cromatografia de
gaze (cu transferul integral, sub aspect calitativ i cantitativ, al probei ctre coloana cromatografic)
sunt cunoscute sub denumirile:
i) Injectoare fr divizarea fluxului de faz mobil (splitless);
ii) Injectoare cu injecie direct n coloan, la rece (cool-on-column);
iii) Injectoare de tip valv rotativ pentru gaze sau lichide;
iv) Injectoare de tip diafragm pentru probe lichide.
Sistemele de injecie selective utilizate n cromatografia de gaze sunt:
i) Injectoare cu divizarea fluxului de faz mobil (split);
42
 ii) Injectoare cu i fr divizarea fluxului de faz mobil (split / splitless);
iii) Injectoare de tip head space;
iv) Injecie de tip purge and trap;
v) Injecie cu piroliz (pirolizoare);
vi) Injectoare cu programare de temperatur (program temperature vaporizer - PTV).
Cazurile i) i ii) se refer la o selectivitate cantitativ a sistemului de injecie, n sensul diluiei
probei (doar o fraciune din proba, n integralitatea ei, va fi transferat n coloana cromatografic).
Cazurile iii) - iv) se refer la o selectivitate calitativ, n sensul c doar analiii volatili din
prob vor fi transferai n coloana cromatografic.
Cazul v) se refer la acele sisteme de injecie destinate analiilor nevolatili, dar care pot suferi
procese de degradare termic reproductibil, n condiii de temperatur strict controlate. In acest caz
injectorul acioneaz asupra naturii chimice a analitului, n coloana cromatografic transferndu-se
doar produii volatili de degradare termic ai analitului.
Injectoarele cu programare de temperatur sunt sistemele de injecie cele mai complexe,
destinate cromatografiei de gaze. Ele permit att diluia sau concentrarea analiilor din prob, ct i
discriminarea n raport cu volatilitatea intrinsec a analiilor.

6.6.1. Injector fr divizarea fluxului de vapori, cu introducere direct

Este un sistem neselectiv, n sensul c proba injectat cantitativ, n integralitatea sa, este
transferat n urma volatilizrii, n coloana cromatografic. Exist, din punct de vedere constructiv,
dou variante: i) prima variant, cunoscut sub denumirea cu vaporizare extra-coloan, presupune
vaporizarea analiilor n tubul de vaporizare i transferul, prin intermediul gazului purttor, a
vaporilor astfel generai n coloana cromatografic; ii) a doua variant, denumit cu vaporizare intra-
coloan, permite generarea vaporilor de analit n chiar captul coloanei cromatografice. Aceast
ultim variant constructiv nu trebuie ns confundat cu injecia n coloan, la rece (cool-on-
column). In cazul injectorului fr divizarea fluxului de vapori, cu introducere direct i vaporizare
intra-coloan, proba de analit este vaporizat cvasi-instantaneu ntr-o poriune bine determinat din
extremitatea coloanei, aflat la o temperatur adecvat acestui proces.
Elementul constructiv care permite, n cazul injectoarelor pentru cromatografia de gaze,
introducerea acului seringii, fr ca operaia n cauz s aib ca rezultat dezetanarea sistemului,
poart denumirea de septum i reprezint un disc de un anumit diametru (corelat cu tipul constructiv
specific i geometria injectorului) i cu o grosime de 2 - 4 mm, confecionat din cauciuc siliconic cu
rezisten termic i elasticitate mecanic nalt.
Durata de via a unui septum este limitat. Datorit proceselor de strpungere multipl de
ctre acul seringii, se pot crea macro-orificii care cu greu mai pot fi obturate prin compresia exterioar
a materialului polimeric elastic i, n consecin, genereaz neetaneiti. In astfel de condiii se
impune schimbarea septumului, operaie care, prin construcia injectorului, trebuie s fie ct mai
simpl i direct cu putin.
Ferula reprezint o pies de etanare extrem de utilizat n construcia sistemelor
cromatografice (att de gaze, ct i de lichide). Prezint o geometrie conic i un orificiu central cu
diametru bine precizat. Ferula poate fi confecionat din materiale dure (oel, alam), atunci cnd este
destinat etanrilor pe metal, sau din materiale moi (grafit, material polimeric - vespel), atunci cnd
este destinat etanrilor pe suprafa de sticl sau cuar.

43
 Prin strngerea cu ajutorul piuliei, geometria conic a ferulei se deformeaz plastic, etannd
coloana sau tubul de transport, introdus prin orificiul central, la nivelul pereilor exteriori, dar i la
nivelul pereilor exteriori ai piesei n care se face strngerea.

6.6.2. Injector cu divizarea fluxului de vapori (split)

Este un sistem de injecie selectiv sub aspect cantitativ. El acioneaz n sensul transferrii
unei fracii bine definite din cantitatea de vapori, generat prin vaporizarea probei, ctre coloana
cromatografic. Transferul fraciei din proba iniial, volatilizat n sistemul de injecie, nu trebuie s
genereze discriminri calitative (n sensul c fraciunea injectat reprezint proba n integralitatea sa
constitutiv), dar reduce n mod semnificativ cantitatea analiilor supui efectiv separrii
cromatografice. Se poate afirma c injectorul cu divizarea fluxului de faz mobil acioneaz asupra
probei prin diluie, limitnd cantitatea absolut de substan transferat n coloan, n raport cu cea
iniial, generat prin volatilizarea probei injectate (Fig. 8).
Cronologic vorbind, sistemul de injecie cu divizarea fluxului de vapori (sau, mai scurt, injector cu
splitare) este primul sistem de injecie dedicat coloanelor capilare. Deoarece fluxurile de gaz purttor
prin injector sunt mari, transferul fraciei de prob ctre coloan este rapid, iar frontul iniial de
injecie este foarte ngust, ceea ce favorizeaz eficiena separrii.

Figura 8. Reprezentare schematic a sistemului de injecie cu splitare.

6.6.3. Injectorul cu sau fr divizarea fluxului de vapori (split/splitless)

Este un sistem de injecie neselectiv sub aspect cantitativ (fig. 9). Construcia sa se bazeaz
pe configuraia injectorului cu divizarea fluxului de vapori, dar este operat pentru o perioad bine
definit, din momentul introducerii probei, ca sistem de injecie fr splitare. Acest tip de injector
este utilizat n cazul separrilor pe coloane capilare. Datorit dimensiunilor mici ale acestora,
cantitatea de prob ncrcat n capul coloanei trebuie s fie foarte mic. Aceasta este practic
imposibil de realizat prin injecia direct. Prin acest tip de injector se realizeaz introducerea unei
cantiti mici din prob injectat: prin volatilizarea acesteia i amestecarea cu un curent de gaz
purttor, proba se dilueaz, iar din amestecul format doar o parte este introdus n coloan, restul
fiind eliminat (splitat) cu ajutorul unei valve. Aceast variant de funcionare a injectorului este
numit split. In situaii n care ntreaga prob trece n coloana cromatografic varianta de
funcionare se numete splitless.
44
 Corpul injectorului este nclzit pentru ca proba s fie volatilizat. In interior se afl un tub de
vaporizare (o capilar de sticl numit liner) pe pereii creia vaporii probei injectate sunt mai
stabili dect pe un perete metalic nclzit. Vaporii probei injectate se amestec cu gazul purttor
nclzit, iar o parte a amestecului format trece n coloana cromatografic, iar cealalt parte este
eliminat.

Figura 9. Reprezentare schematic a sistemului de injecie split/splitless.

Raportul ntre debitul gazului purttor introdus (D1) i debitul fluxului eliminat (D2) din injector d
aa-numitul raport de splitare. Condiiile optime de operare a acestui tip de injector sunt descrise n
tabelul urmtor.

Tabelul 4. Valori optime ale parametrilor de exploatare a injectorului split/spilless.

Parametru Vapoare optim Explicaii

Temperatura injectorului
Volumul tubului de
vaporizare
- asigur volatilizarea instantanee;
- reduce efectul de degradare.
200 - 280 C Observaie: de folosit valori mai mari n
cazul probelor cu efect puternic de
matrice i analii cu p.f. ridicate
> 0,8 mL n cazul injeciei automate
< 0,7 mL n cazul injeciei manuale

fr umplutur numai n cazul injeciei manuale

Tipul tubului de vaporizare pentru autoinjecie, probe cu efect de
cu vat de sticl silanizat
matrice pronunat
Volumul injectat 0,5 - 3 L

45
 Debit n circuitul de purjare
20 - 50 mL/min nu e un parametru critic
a vaporilor
Timpul de splitare 20 - 80 sec n funcie de natura probei
Temperatura intern a
p.f.solv.= 25 C n cazul focusrii prin solvent
coloane
Debitul gazului purttor prin
> 2 mL/min
coloan
Debitul de gaz purttor
utilizat la purjarea 1 - 5 mL/min
septumului

6.6.4. Injector cu introducere direct n coloan, la rece (cool-on-column)

Este un sistem de injecie neselectiv, destinat n special analiilor cu rezisten sczut la oc

termic.
Injecia direct n coloan, la rece, presupune utilizarea unei seringi de injecie special, al crui
ac are un diametru exterior mai mic dect diametrul interior al coloanei cromatografice utilizate.
Atunci cnd coloana cromatografic aleas are un diametru interior cuprins n intervalul 0,2 -
0,3 mm, acul seringii necesare injeciei n coloan la rece este extrem de fin i este confecionat din
cuar. Fragilitatea acului face ca o astfel de tehnic de injecie s nu poat fi condus n regim automat.
Dac diametrul interior al coloanei cromatografice este mai mare de 0,3 mm, acul seringii poate fi
confecionat din oel, iar automatizarea injeciei este posibil.
Introducerea acului seringii direct n interiorul captului rcit al coloanei cromatografice i
ejecia probei n stare lichid trebuie s aib loc n condiiile n care parametrii fizici ce caracterizeaz
faza mobil nu trebuie s fie afectai, iar etaneitatea sistemului n raport cu mediul s fie conservat.
Etanarea la nivelul unor ace de lungimi mari i fragilitatea avansat nu este un proces uor de realizat
tehnic, fapt ce confer injectorului o oarecare complexitate i un cost mai ridicat.
De asemenea, ca o caracteristic general, injectoarele cu introducere direct n coloan, la
rece, sunt lipsite de tub de vaporizare. Captul coloanei cromatografice acioneaz n acest sens, ca
zon de depunere a probei lichide i vaporizare progresiv.

6.7. Detectori n cromatografia de gaze

Detectorii n GC pot fi universali sau specifici, funcie de clasa de compui care dau rspuns.
Lund drept criteriu informaia produs, acetia pot fi detectori de informaie cantitativ i detectori
de informaie cantitativ + structural n acelai timp (detectorul bazat pe spectrometrie de mas -
MS, sau detectorul bazat pe spectrometrie n infrarou cu transformat Fourier - FTIR). Configuraiile
GC comercializate pot cuprinde doi sau mai muli detectori, aranjarea lor n serie fiind determinat
de caracterul distructiv sau nedistructiv al analiilor care elueaz din coloana cromatografic.
Dintre detectorii de informaie cantitativ, cei mai importani sunt prezentai n continuare.
Spectrometria de mas urmeaz a fi tratat ntr-un capitol separat, dat fiind importana sa deosebit
ca sistem de detecie n cromatografia de gaze sau de lichide.

46
 6.7.1. Detectorul de conductivitate termic

Detectorul de conductivitate termic (TCD thermal conductivity detector) este un detector

universal, nedistructiv, bazat pe msurarea conductivitii termice a fluxului gazos care iese din
coloana cromatografic. Atunci cnd fluxul gazos conine compui care elueaz din coloan,
conductivitatea termic se modific, proporional cu concentraia de analit din fluxul gazos ce ajunge
n detector. Sensibilitatea acestor detectori este slab, astfel nct acesta are o utilizare limitat. Gazul
purttor utilizat n funcionarea acestui detector poate fi H2 sau He, deoarece acestea au cea mai mic
conductivitate n raport cu restul compuilor gazoi sau volatili.
Principiul de funcionare are la baz o punte de tip Wheatstone utilizat n compensarea
rezistenei R1 din celula de msurare a efluentului care iese din coloana cromatografic (analit + gaz
purttor) fa de rezistena R2 din celula de referin (prin care trece doar gazul purttor). O schem
a acestui detector este redat n figura 10.

Figura 10. Principiul de funcionare al unui detector de conductivitate termic bazat pe dou celule
(de msur i de referin).

TCD este util n determinarea unor compui gazoi, greu de detectat prin alte metode fizice,
cum ar fi unii compui anorganici separai prin cromatografie gaz-solid: CO, CO2, NO, NO2, SO2,
H2S, COS, CS2.

6.7.2. Detectorul de ionizare n flacr

Detectorul de ionizare n flacr (FID flame ionization detector), este un detector aproape
universal, bazat pe msurarea conductivitii electrice a unei flcri de hidrogen; compuii organici
ce elueaz din coloana cromatografic determin o cretere a conductivitii electrice a flcrii,
proporional cu cantitatea de analit ce ajunge n flacr. Acest detector a fost inventat n 1958 de
dou echipe independente: McWilliam i Dewar (Australia), precum i Harley, Nel i Pretorius
(Africa de Sud).
Mecanismul de formare a speciilor ionice, care s asigure conductivitate electric zonei n
care se desfoar flacra de hidrogen nu este pe deplin neles. S-a propus un mecanism de degradare
a structurii organice la un singur atom de C, proces care are loc n regiunea bogat n hidrogen a
flcrii, dup care o reacie cu atomii de oxigen ar conduce la specii pozitive:

47
 Acest proces are loc aproximativ la 100.000 de atomi ce C adui n flacr. Procesul depinde
de temperatura flcrii i de raportul H2/O2. Speciile ncrcate electric sunt colectate de un electrod
(numit colector), iar curentul electric realizat este amplificat i nregistrat (Fig. 11).

Figura 11. Schema de funcionare a unui detector de ionizare n flacr (FID).

Dintre toii detectorii GC, FID are cel mai larg domeniu linear de rspuns (7 ordine de
mrime). Limita de detecie se situeaz la valoarea 10-13 g C/s.

6.7.3. Detectorul termoionic

Detectorul pentru compui cu azot sau fosfor (NPD nitrogen-phosphorus detector), numit
i detector termoionic, este un detector specific compuilor organici care conin elementele N i P.
Acesta a fost conceput i realizat pentru prima dat de ctre Kolb i Bischoff (1974). Este asemntor
detectorului de ionizare n flacr, cu deosebirea c n zona de formare a flcrii de hidrogen se
plaseaz o pastil coninnd o sare a unui metal alcalin (n special, Rb2SO4). Are o mare sensibilitate
fa de compuii organici coninnd aceste elemente. Schema de funcionare a acestui detector este
redat n figura 12.

Figura 12. Schema unui detector termoionic (NPD) i principiul de obinere a rspunsului acestuia
fa de un compus coninnd (C, H, O, N, P):

48
 Mecanismul dup care doar compuii organici care conin N sau P n molecul dau rspuns
n acest tip de detector nu nu este pe deplin explicat pn n prezent (n figura anterioar se propune
un mecanism de formare a speciilor ioni ce care s explice creterea conductivitii flcrii n prezena
compuilor ce conin aceste elemente). Cteva exemple de aplicaii ale acestui tip de detector este
utilizat la determinarea cantitativ a unor pesticide coninnd N sau P, sau chiar a unor medicamente
de abuz, datorit limitei de detecie foarte sczute pe care o atinge (10-13 g/s). Domeniul de linearitate
al rspunsului acestui detector este de 5 ordine de mrime.

6.7.4. Detectorul cu captur de electroni

Detectorul cu captur de electroni (ECD electron capture detector) este un detector

specific compuilor ce conin elemente electronegative, cu precdere halogeni (X). Cu ct numrul
de atomi de halogeni din molecul este mai mare, cu att i rspunsul detectorului este mai mare
(sensibilitatea detectorului crete). Contribuiile majore n realizarea acestui detector se datoreaz lui
Lovelock (1960).
Principiul de baz este msurarea conductivitii electrice a unei zone dintre doi electrozi,
asigurat de o populaie de electroni primari, notati cu e-p (radiaie ), produs de o surs 63Ni In
momentul n care n zona deteciei ajung molecule ce conin elemente electronegative (halogeni, n
special), electronii sunt captai de acestea. Ca urmare, se nregistreaz o micorare a populaiei de
electroni din zona de detecie i astfel conductivitatea electric a zonei scade, cu att mai mult cu ct
numrul moleculelor captatoare este mai mare.
Gazul purttor n acest tip de detecie poate fi N2 sau Ar, cu un coninut de 5-10% CH4.
Adugarea unui dopant n gazul purttor poate mri sensibilitatea deteciei pn la 1000 de ori. Astfel,
adugarea de cantiti mici de O2 sau N2O poate determina unele reacii ioni molecule n interiorul
camerei detectorului.
Acest detector (reprezentat schematic in Fig. 13) este considerat un detector de tip distructiv,
aa dup cum se poate deduce i din procesele care au loc, reprezentate mai sus. Prin urmare, ntr-o
configuraie n serie de mai muli detectori, acesta este plasat ultimul n configuraie. De cele mai
multe ori, ns, acest detector este plasat ntr-o configuraie paralel cu ali detectori, fiind utilizat
alternativ fa de FID sau NPD.

Figura 13. Shema detectorului cu captur de electroni.

Limita de detecie atins de acest detector este 10-13 10-14, lund lindanul ca analit-test, iar
domeniul de linearitate se situeaz pe 4 ordine de mrime de semnal analitic. Cercetri recente s-au
ndreptat pentru eliminarea sursei radioactive i realizarea unei surse de electroni bazat pe descrcri
electrice. Rspunsul detectorului n acest caz este puternic influenat de variaiile debitului fazei
mobile.
49
 6.7.5. Detectorul de fotonizare

Acest detector a fost introdus de Price i colaboratorii (1968). Detectorul de fotoionizare (PID
photoionization detector) este un detector aproape universal, bazat pe ionizarea moleculelor cu
ajutorul radiaiei UV, cu lungimea de und n domeniul 110- 150 nm (ce corespunde unei energii de
8-12 eV). Ionii rezultai sunt colectai de ctre un electrod de msur, iar curentul electric nregistrat
este proporional cu cantitatea de analit care ajunge n detector. PID prezint sensibilitate mare fa
de compui organici aromatici sau cu heteroatomi n molecul. Este un detector de tip distructiv,
astfel c ntr- o configuraie cu alt detector nedistructiv, PID se plaseaz ultimul.
Fotoionizarea are la baz tranziii electronice n molecula notat cu AB, de pe nivelul de baz
pe nivelele superioare, conducnd la ionizare:

Energia necesar unor astfel de tranziii este de 5-20 eV i pentru aceasta se utilizeaz radiaie
din domeniul ultraviolet ndeprtat.
Sensibilitatea detectorului depinde de randamentele de ionizare ale analiilor care elueaz din
coloan. In general, randamentul de ionizare a unui compus depinde de: natura sa, presiunea din
celula de detecie, intensitatea i mai ales de lungimea de und a radiaiei utilizate. Cele mai utilizate
surse de fotoionizare sunt lmpile cu hidrogen (avnd puterea standard de 10,2 eV) i fereastra optic
confecionat din MgF2.
Sensibilitatea deteciei PID (a crui schem este redat n Fig. 14) crete n general cu
creterea numrului de atomi de carbon din molecul. Pe clase de compui organici aceasta poate fi
ordonat astfel:
1. - hidrocarburi aromatice > alchene > alcani;
2. - cetone > aldehide > esteri > alcooli > alcani;
3. - compui ciclici > compui aciclici;
4. - compui cu catene ramificate > compui fr catene ramificate;
5. - compui cu -I > -Br > -Cl > -F.

Figura 14. Schema simplificat a unui detector bazat pe fotoionizare.

Limita de detecie a acestui detector (10-11 10-12 g/s) este mai slab dect la cei de mai sus,
exceptnd TCD, dar are un domeniu de linearitate mai larg (7 ordine de mrime).

50
 6.7.6. Detectorul de emisie molecular n flacr

Cunoscut i ca detector flame-fotometric (FPD flame-photometric detector), acesta este

un detector specific compuilor organici coninnd atomi de S i P. Acetia ard ntr-o flacr uor
reductoare, formnd specii de S2 sau PO, care au proprietatea de a emite radiaie specific:

Un proces similar l pot da i compuii cu P, cu formarea speciilor PO sau HPO, care emit
radiaie specific. Liniile spectrale specifice sulfului sunt situate la 394 nm, iar n cazul fosforului la
526 nm.
Se cunosc dou variante constructive a acestui detector. Una cu o singur flacr (schema dat
n Fig. 15) i alt variant bazat pe dou flcri, diferind de cea anterioar prin rolul celor dou
flcri: n prima (cea inferioar) are loc combustia probei, iar n cea de a doua flacr (superioar) se
realizeaz procesul de emitere a radiaiei speciilor excitate. In felul acesta, unele probleme legate de
stingerea flcrii la eluia din coloan a solventului probei sunt eliminate.
O variant modern a acestui detector, cunoscut sub numele de detector flame- fotometric n
puls (pulsed-flame photometric detector PFPD), se bazeaz pe realizarea unei flcri discontinue
(pulsat). Hidrogenul, aerul i efluentul din coloan ajung n arztor, unde sunt aprinse, iar flacra
rezultat se propag napoi n camera de combustie producnd auto-stingerea sa, dup ce amestecul
combustibil este ars. Fluxul de gaze aer, H2 i efluent din coloan ndeprteaz produsele de ardere,
iar procesul de aprindere a flcrii este reluat. Acest proces este repetat cu o frecven de aproximativ
4 Hz. Emisia de radiaie datorat arderii carbonului este complet n cca 2-5 ms; n schimb emisia
speciilor excitate menionate anterior poate dura pn la 20 ms.

Figura 15. Schema unui detector bazat pe emisie molecular n flacr (FPD).

Sensibilitatea detecie prin FPD depinde de intensitatea radiaiei emise de speciile excitate,
care crete cu scderea temperaturii flcrii. Acest parametru trebuie bine controlat pentru a avea o
bun reproductibilitate a semnalelor analitice. In cazul compuilor cu fosfor, rspunsul detectorului
este proporional cu concentraia pe un domeniu de 4 ordine de mrime. In schimb, n cazul
compuilor cu sulf, relaia de calibrare este una de tipul log IntensitateSemnal log Concentraie pe
un domeniu de trei ordine de mrime. Limita de detecie este de aproximativ 0,5 pg/s pentru P i 50
pg/s pentru S. In cazul PFPD, acest parametru analitic coboar pan la 0,1 pg/s P i 1 pg/s S, lund
metilparationul ca analit-test.
51
 6.7.7. Detectorul de emisie atomic

Detectorul de emisie atomic (AED atomic emission detector) este un detector universal,
bazat pe trecerea analiilor la eluarea din coloan ntr-o tor de plasm unde sunt descompui n
atomi care emit radiaie specific. Spectrul de emisie poate fi instantaneu nregistrat cu ajutorul unei
reele de fotodiode i a unei reele de difracie (dup principiul DAD).
Elementele componente ale unui detector AED sunt urmtoarele:
- interfaa dintre coloana cromatografic capilar i camera plasmei indus prin microunde
(microwave induced plasma MIP);
camera plasmei;
sistemul de rcire a camerei plasmei;
reeaua de difracie ce separ i focalizeaz spectrul de emisie ctre reeaua de
fotodiode;
sistemul de achiziie i prelucrare a datelor.
Gazul pentru susinere a plasmei este Ar de nalt puritate. Puterea microundelor pentru
susinerea plasmei este de 50 - 450 W.
Prin soft-ul sistemul se pot monitoriza una sau mai multe lungimi de und, n vederea creterii
sensibilitii determinrilor. Sensibilitate bun au compuii organici care conin semimetale, precum
i compuii organo-metalici. Limitele de detecie ating valori de 0,1 pg/s 1 ng/s, depinznd de
elementul a crui linie de emisie este monitorizat.

52
 7. Separarea prin cromatografie de lichide (LC)

7.1. Istoric

nceputul cromatografiei de lichide este atribuit lui vet (1903), care a reuit pentru prima
dat separarea unor compui naturali colorai pe o coloan umplut cu carbonat de calciu, utiliznd o
faz mobil alctuit din solveni organici. Dezvoltarea cromatografiei de lichide ca tehnic analitic
are loc ceva mai trziu i este legat de necesitatea crescnd de separare a compuilor organici din
matrici complexe.
In iunie 1941, Societatea Britanic de Biochimie, i inea cea de-a 214-a edin de
comunicri, la Institutul Naional de Cercetri Medicale. La aceast ntlnire Martin i Synge, doi
tineri chimiti (Martin avea 31 de ani; Synge 26), au prezentat o lucrare despre separarea i
determinarea amino-acizilor N-acilai din probe de ln, printr-o nou metod analitic. Acetia au
separat acetil-prolina de acetil-leucina, utiliznd o coloan umplut cu silicagel impregnat cu ap (un
material foarte polar) i cloroform ca faz mobil. Lua natere astfel cromatografia de partiie,
recunoscut apoi ca separare prin cromatografie de lichide n faz normal. Exact 10 ani mai trziu,
Martin i un alt tnr cercettor (A.James 29 ani) trimiteau spre publicare o lucrare descriind un
proces cromatografic n care faza mobil este un gaz.[108,109] Se puneau bazele cromatografiei de
partiie gaz-lichid. In anul 1948 Martin i grupul su de cercetare ncep cercetri la Institutul
Naional din Londra cu privire la problema separrii cromatografice a acizilor grai, cu caten
hidrocarbonat mare. Aplicarea separrii cromatografice n faz normal nu a dat rezultatele dorite,
deoarece coeficienii de partiie ai acestor compui erau aproape total n favoarea fazei mobile. Deci
retenia i astfel separarea lor pe o coloan polar nu avea loc. Ideea de a schimba rolurile celor dou
faze a venit imediat. Astfel au realizat prima faz staionar nepolar prin tratarea kiselgurului cu
Si(CH3)2Cl2, care devine total neaderent de ctre solveni polari i hidrofili. In anul urmtor au
realizat pentru prima dat separarea acidului lauric (C12) de acidul stearic (C18). Mai trziu, tehnica
bazat pe acest principiu avea s fie cunoscut ca separare prin cromatografie de lichide n faz
invers, dei pn n 1970 chiar i IUPAC considera aceast tehnic analitic doar de interes istoric.
Prin realizarea fazelor staionare chimic legate aceast tehnic ia o mare dezvoltare, n prezent fiind
cea mai important tehnic analitic de separare. Contribuiile eseniale ale lui Martin i Synge la
dezvoltarea cromatografiei au fost rspltite n anul 1952 prin acordarea Premiului Nobel n Chimie.
Prima faz staionar sintetizat este atribuit autorilor Halasz i Sebastian (1969), care au
refluxat silicagelul cu 1-octanol, obinnd eterul avnd la baz o structur destul de instabil n
prezena apei, caraterizat de legturile Si-O-C:

In 1970 Kirkland i DeStefano au ataat lanuri hidrocarbonate la structura silicagelului prin

utilizarea reactivilor de derivatizare de tip silanic, obinnd structuri mult mai stabile pe baz de
legturi Si-O-Si, ca n exemplul urmtor:

53
 Horvath, Knox, Soczewinski, Snyder, Scott, Kirkland, Guiochon sunt doar cteva nume mari
de oameni de tiin care au adus contribuii fundamentale, teoretice sau experimentale, la dezvoltarea
cromatografiei de lichide ca tehnic analitic de mare performan.

7.2. Clasificarea separrilor prin cromatografia de lichide

Retenia n cromatografia de lichide este un proces complex, care implic interacii ale
speciilor din proba injectat att cu faza mobil, ct i cu faza staionar. Cunoaterea mecanismului
dup care se desfoar procesul de retenie are ca prim avantaj pentru analist posibilitatea prediciei
acestuia i mai ales alegerea acelor condiii experimentale pentru atingerea unor selectiviti maxime
ntre analii. Cea mai important clasificare a separrilor LC este bazat pe mecanismul care st la
baza separrii, care la rndul su depinde de natura celor faze (staionar i mobil) participante n
procesul de separare cromatografic. Cele mai importante clase de separri LC sunt urmtoarele:
A) Cromatografia de lichide n faz normal (NP-LC normal-phase liquid
chromatography) n care faza staionar este polar, iar faza mobil este alctuit dintr- un solvent
nepolar cu un coninut mic de modificator polar.
B) Cromatografia de lichide n faz invers (RP-LC reversed-phase liquid
chromatography) n care faza staionar este nepolar i hidrofob, iar faza mobil este alctuit
dintr-un solvent polar.
C) Cromatografia de lichide prin mecanism de schimb ionic (IC ion chromatography), n
care faza staionar este un schimbtor de ioni, iar faza mobil este apoas cu un pH controlat.
D) Cromatografie de lichide prin mecanism de excludere (sau cromatografie pe gel), n care
faza staionar este un gel cu porozitate controlat, iar componenii probei sunt separai n funcie de
forma i dimensiunea molecular.
E) Cromatografie de lichide bazat pe interacia diferit a compuilor asimetrici cu anumite
structuri din faza staionar (numite selectori de chiralitate).
Cele mai importante separri cromatografice se efectueaz n prezent pe o coloan
cromatografic (tab. 5.), confecionat dintr-un metal. In interiorul coloanei se gsete faza staionar,
fixat la capete ntre dou frite. Diametrul i lungimea sunt parametri constructivi, funcie de care
coloanele se mpart n mai multe clase, descrise n tabelul urmtor.
Cromatografia de lichide planar este o tehnic cu aplicaii din ce n ce mai puin utilizate n
practic analitic. Cromatografia pe hrtie sau cromatografia n strat subire n diverse variante
(ascendent sau descendent) pot decurge prin unul din mecanismele de mai sus, iar vizualizarea
compuilor separai sub forma de spoturi se poate face utiliznd proprietatea de absorbie sau de
fluorescen a analiilor separai, cu sau fr reactiv de derivatizare (aa-numita developare). Exist
i posibilitatea ca spoturile rezultate s fie izolate i apoi printr-o procedur de extracie cu un solvent
adecvat, analitul coninut s fie determinat printr-o tehnic spectrometric.

Tabelul 5. Clasificarea coloanelor n LC n funcie de dimensiuni.

Descriere
Coloane deschise
Coloane nanobore
Coloane capilare
Debit optim faz
i.d. (mm) d.p. (m)
mobil
< 0,025 - < 25 nL/min
0,025 0,1 - 25-4000 nL/min
0,1 - 1 - 0,4 200 L/min

54
 Coloane microbore 1-2 3-5 0,05 1 mL/min
Coloane narrow-bore 2-4 3-5 0,3 3 mL/min
Coloane normal-bore 4-5 3-7 1 10 mL/min
Coloane semi-
5 - 10 5 - 12 5 40 mL/min
preparative
Coloane preparative > 10 5 - 20 > 20 mL/min

7.3. Faze mobile n cromatografia de lichide

Faza mobil (nepolar) n cromatografia de lichide n faz normal (NP-LC) este alctuit din
dou componente principale:
a) solventul nepolar, care poate fi unul dintre solvenii: pentan, hexan, ciclohexan;
b) modificator polar (ntr-un procent foarte mic): tetrahidrofuran, 2-propanol, acetonitril, eteri,
esteri, cloroform, etc.
Acetia pot fi clasificai n solveni slabi (cu putere elutropic mic) i solveni tari (putere
elutropic mare).
Faza mobil (polar) n RP-LC este n general alctuit din dou componente principale:
componenta apoas i componenta organic. Parametrii fazei mobile care influeneaz retenia n RP-
LC sunt urmtorii:
Natura modificatorului organic (acetonitril, metanol, etanol, 1-propanol, 2-propanol,
tetrahidrofuran, dioxan, etc); puterea elutropic a modificatorului organic este o msur a capacitii
sale de a micora factorul de capacitate (timpul de retenie) al analiilor: cu ct puterea elutropic
este mai mare, cu att timpul de retenie va fi mai mic.
Coninutul modificatorului organic (% n volume): de regul, cu ct concentraia
modificatorului organic este mai mare, cu att timpul de retenie al analiilor este mai mic (prin
creterea solubilitii analiilor n faza mobil);
pH-ul i componentei apoase din faza mobil influeneaz retenia analiilor cu proprieti
acido-bazice;
Natura acidului (acizi formic, acetic, trifluoracetic, tricloracetic) sau a tamponului utilizat n
componenta apoas (se pot utiliza soluii tampon pe baz de fosfat, borat, acetat, etc, cu amoniac,
trietilamina, dar cu pH-ul cuprins ntre 2 i 8);
Tria ionic a componentei apoase (care depinde de concentraia unor sruri adugate, sau de
concentraia soluiei tampon);
Natura i concentraia agenilor de formare de perechi ionice (R4N+; R-SO3-; R-O-SO3-, etc).
Solvenii folosii n LC trebuie s fie filtrai (pentru a nu conine particule n suspensie), degazai i
de puritate cromatografic. Folosirea unor solveni cu particule solide n suspensie conduce la
colmatarea coloanei cromatografice i a sistemului cromatografic. Prezena unor gaze (N2 sau O2)
dizolvate n faza mobil poate influena detecia, deoarece dup ieirea din coloana cromatografic
fluxul mobil are o presiune mai mic dect n coloan i astfel se pot forma bule gazoase care pot
perturba n procesul de detecie.

55
 7.4. Faze staionare n cromatografia de lichide

7.4.1. Faz normal

Cea mai important faz staionar n cromatografia de lichide n faz normal este silicagelul
(SiO2). Acesta este considerat un adsorbant foarte polar, datorit gruprilor silanol reziduale din
matricea sa. De asemenea, Al2O3, ZrO2, sau TiO2 sunt menionate des ca faze staionare polare n NP-
LC. Fazele staionare polare legate sunt derivate din silicagel; acestea conin grupri funcionale
polare X, precum hidroxil, nitro, cian, sau amino, legate printr-un lan hidrocarbonat scurt R:
Utiliznd tehnica derivatizrii amino-silicagelului cu acidul dodecamolibdofosforic s-au
realizat noi faze staionare polare, utilizate n separarea compuilor aromatici. Retenia puternic a
compuilor aromatici pe astfel de faze staionare polare se explic prin interacia puternic a
orbitalilor din nucleele aromatice cu orbitalii d ai Mo.

7.4.2. Faz invers

In cromatografia de lichide n faz invers (RP-LC) fazele staionare sunt hidrofobe. Acestea
se pot obine prin modificarea chimic a silicagelului (sau chiar aluminei) sau pot fi de natur
polimeric. De aceea, aceste faze staionare se mai numesc i faze chimic legate (bonded phases).
Principiul de sintez a fazelor chimic legate se bazeaz pe reacia gruprilor silanol reziduale din
matricea silicagelului tratat termic cu un agent de silanizare. In figura urmtoare, prin reacia de
derivatizare, n una din cele dou modaliti menionate, s-a introdus radicalul hidrocarbonat octadecil
legat de matricea silicagelului.
In funcie de natura radicalului R grefat prin intermediul reactivului de derivatizare de tip
silanic se disting urmtoarele faze staionare (redate n ordinea descresctoare a hidrofobicitii lor):
-C18H37 (octadecil-silicagel, sau C18);
-C8H17 (octil-, sau C8);
C6, C4, C2
-C6H5 (fenil-);
-C6H4-NO2 (nitrofenil);
-(CH2)3-CN(cianopropil).
Cu toate acestea, n materialul rezultat dup reacia de silanizare o parte nsemnat a gruprilor
silanol rmn intacte. Prezena acestora n compoziia fazei staionare poate influena mecanismul de
separare, datorit interaciunilor dipol-dipol sau prin legturi de hidrogen cu grupri similare din
moleculele de analit. Derivatizarea complet a acestora conduce la faze staionare complet inertizate
(cunoscute n literatura de specialitate ca faze staionare de tip end-capped) i se poate efectua prin
utilizare unui reactiv de derivatizare trifuncional, plus aplicarea n final a unei silanizri cu
trimetilclorsilan, care datorit volumului su mai mic poate accesa restul de grupri silanol, ecranate
steric de gruprile chimic legate deja introduse anterior.
Fazele staionare chimic modificate de tip monolitic, coninnd radicali hidrocarbonai R, se
obin prin procese sol-gel. Aceste materiale au un aspect ceramic, caracterizate de o porozitate nalt,
iar radicalii R sunt orientai n afara matricei solide. Prepararea unor astfel de materiale de tip ceramic
pornete de la reactivul de baz tetrametoxisilan, care prin hidroliz acid (n prezen de HCl)
formeaz compui intermediari cu legturi Si-OH.

56
 Fazele staionare modificate din silicagel au o mare aplicabilitate n cromatografia de lichide,
dar prezint i unele inconveniente. Dou dintre inconvenientele cele mai serioase ale acestor faze
staionare sunt:
- domeniul de pH al componentei apoase utilizate este relativ restrns (2-8); la pH-uri sub 2 are loc
hidroliza gruprilor O-Si(CH3)2-R, iar la pH-uri mai mari de 8 are loc dizolvarea silicagelului;
- acestea nu pot fi utilizate n separri cromatografice pentru concentraii ale componentei apoase n
faza mobil apropiate de 100%. In acest caz lanurile hidrocarbonate legate de structura silicagelului
colapseaz, ele neputnd a reveni la conformaia iniial dup utilizarea de faze mobile total sau
aproape total apoase (mai mari de 98%).
Colapsarea lanurilor hidrocarbonate este similar formrii micelelor, lanurile hidrocarbonate
avnd tendina de a micora suprafaa de contact cu mediul apos.
Acest ultim inconvenient s-a putut rezolva prin realizarea de faze staionare chimic
modificate, coninnd grupri polare intercalate ntre lanul hidrocarbonat i atomul de siliciu. O astfel
de structur este mai flexibil la faze mobile total sau aproape total apoase. Sinteza lor presupune
dou etape, una de introducere a gruprii polare, urmat de introducerea radicalului hidrofob R. Dou
dintre posibilitile aplicate n obinerea fazelor staionare chimic legate cu grupri polare intercalate
sunt prezentate n continuare.
Introducerea gruprii polare influeneaz procesul de retenie cromatografic. Gruparea
polar poate interaciona cu grupri polare din moleculele de analit. In cazul gruprilor polare
intercalate de tip amidic sau carbamic, pot interveni interacii - ntre analit i gruparea polar din
faza staionar. Astfel, ordinea de eluie se poate modifica n cazul perechii de analii trans-stilben i
dibenzil la eluia printr-o coloan umplut cu faz staionar C18 cu grupare polar intercalat,
comparativ cu una C18 clasic. Spre deosebire de dibenzil, molecula de trans-stilben posed n plus
o dubl legtur carbon-carbon, care determin o interacie mai puternic cu legturile din gruprile
polare ale fazei staionare. In schimb, n cazul separrii pe o coloan clasic C18, ordinea de eluie
este dat de ordinea hidrofobicitii; trans-stilbenul este mai puin hidrofob dect dibenzilul, datorit
dublei legturi, astfel c va elua primul din coloana cromatografic.

7.5. Componentele unui sistem HPLC

Componentele de baz ale unui cromatograf de lichide (LC) sunt: sistemul de distribuire a
solvenilor (SDS), care asigur obinerea i transportul fazei mobile n coloana cromatografic,
compartimentul coloanei (termostatate), injectorul i sistemul de detecie. Sistemele HPLC moderne
sunt echipate cu un sistem de achiziie i prelucrare a datelor (calculator), care totodat are rolul de a
controla parametrii implicai n procesul cromatografic.

7.5.1. Sistemul de distribuire a solvenilor

Sistemul de distribuire a solvenilor (SDS) este alctuit din mai multe componente principale, a crui
configuraie i loc n cadrul sistemului general HPLC sunt redate schematic n Fig. 16.

57
 Figura 16. Configuraia unui sistem HPLC, cu dou variante SDS.

Funciile SDS, n una din variantele date n figura de mai sus, sunt urmtoarele:
a) condiionarea componentelor (apoase i organice) din faza mobil;
b) amestecarea acestora n proporia necesar separrii cromatografice;
c) pomparea fazei mobile cu compoziia realizat spre coloana cromatografic, cu un debit stabilit i
fr variaii (pulsuri) ale acestuia;
d) msurarea presiunii n interiorul sistemului cromatografic, care poate da indicaii privitoare la
funcionarea unor elemente ale sale;
e) protejarea coloanei cromatografice de posibile deteriorri cauzate de faza mobil. Recipienii
pentru solveni sunt utilizai pentru stocarea, filtrarea on-line i degazarea solvenilor stocai. De
regul, aceti recipieni sunt vase de sticl, de volume i geometrii variabile. In cazul (mai rar) n care
amestecul de solveni este sensibil la prezena luminii, se recomand vase de sticl brune.
58
 Degazorul are rolul de a ndeprta aerul dizolvat n solvenii utilizai pentru faza
mobil, care poate influena negativ detecia (n special prin fluorescen) sau procesul de retenie.
Degazarea se poate face prin ultrasonare, naintea nceperii experimentelor cromatografice,
sau prin barbotarea de He, care ar antrena cu el componenii aerului, dizolvai n solveni. Cea mai
utilizat metod este aplicarea vidului, la trecerea fazei mobile prin dreptul unei membrane
permeabile, aa dup cum se poate observa din figura 17.

Figura 17. Componentele unui degazor ale unei configuraii HPLC.

Pompele de nalt presiune au rolul de a pune n micare fluxul fazei mobile de la vasele de
stocare, pn la ieirea fazei mobile din sistemul cromatografic. Faza mobil ntmpin o rezisten
mare n coloana cromatografic datorit compactitii fazei staionare i astfel se realizeaz presiuni
mari la intrarea fazei mobile n coloana cromatografic. Se cunosc multe variante constructive de
pompe de nalt presiune pentru sistemele HPLC. In principiu, micarea unui piston n corpul pompei
(de form cilindric) asigur distribuirea fazei mobile n sistemul cromatografic. Pistonul este
confecionat din safir sintetic sau oxid de zirconiu, iar corpul pompei este realizat din titan, oel
inoxidabil sau chiar materiale polimerice rezistente la frecarea pistonului (PEEK).
Rolul damperului este acela de a atenua fluctuaiile de debit ale fazei mobile n sistem.
Principiul de funcionare se bazeaz pe atenuarea fluctuaiilor de debit al fazei mobile cu ajutorul
unei membrane elastice ce separ dou caviti. In una se gsete un lichid avnd o compresibilitate
joas (un ulei), iar prin cealalt trece faza mobil.
Mixerul are rolul de a omogeniza faza mobil constituit din cel puin dou componente (una
apoas i alta organic). Amestecarea se poate face static, prin trecerea solvenilor printr-o coloana
umplut cu bile mici de oel inoxidabil, sau dinamic, prin utilizarea agitrii magnetice.
Precoloana menionat n configuraiile de mai sus este opional, atunci cnd se utilizeaz n
separarea cromatografic mecanismul de separare n faz normal. In acest caz, solvenii organici
trebuie s nu conin urme de ap, care s-ar reine n coloana cromatografic (cu faza staionar -
silicagel) modificnd drastic proprietile sale adsorbante.

7.5.2. Sistemul de injecie

Injectorul n HPLC este o interfa realiznd transferul exact i reproductibil al volumul de

prob ntre sistemul operator i coloana cromatografic ntr-un front (band) ct mai ngust posibil.
Injectorul este poziionat ntre sistemul de pompe i coloana cromatografic. De regul, proba n
analiza prin HPLC este lichid. Tubulatura folosit pentru conectarea injectorului cu coloana
cromatografic trebuie s minimizeze pierderea de eficien (prin lrgirea frontului probei injectate).
Unul dintre cei mai importani parametrii n analiza cromatografic este volumul de injecie. In
funcie de acest parametru, metodele LC pot fi clasificate n urmtoarele clase:
a) micro (cu un volum de injecie n intervalul 2 - 500 nL);
b) analitice (0,5 L 1 mL);
c) preparative (0,1 10 mL).

59
 Solventul probei trebuie s fie n concordan cu mecanismul aplicat n separarea
cromatografic, iar de cele mai multe ori compoziia sa este identic (n special la volume mari de
prob) sau foarte asemntoare cu cea a fazei mobile.
Injectorii n HPLC se mai numesc i valve de comutare (switching valves). Ele sunt
compuse din dou pri principale: statorul i rotorul. Statorul are rolul de a face legtura cu cellalte
componente ale sistemului HPLC, prin intermediul tubulaturii i elementelor de etaneitate (ferule
sau nuturi). Rotorul este o pies mobil care face conexiunea cu diferitele porturi ale statorului. Dup
cum se poate observa din Fig. 18 operaia de injecie cuprinde dou etape: ncrcarea buclei de injecie
(LOAD)i apoi rotirea valvei pentru ca volumul probei s se situeze n direcia fluxului fazei mobile
(INJECT). Acestea pot fi efectuate manual sau automat.

Figura 18. Schema valvei cu 6 porturi (tip Rheodyne), utilizat n injecia HPLC.

7.6. Detectori n cromatografia de lichide

Detectorul n cromatografia de lichide trebuie s ndeplineasc cel puin dou condiii: 1) s

aib un rspuns rapid (n timp real); 2) proprietatea msurat trebuie s fie diferit pentru analiii de
interes care elueaz din coloan i componentele fazei mobile.
Primul detector realizat n cromatografia de lichide a fost cel bazat pe msurarea indicelui de
refracie. Dei este un detector universal, sensibilitatea acestuia este foarte slab, putnd fi utilizat la
determinarea concentraiilor mari de analii din probe (peste 10 ppm).
Cei mai importani detectori n HPLC sunt cei spectrometrici UV-VIZ. Principiul de detecie
poate fi absorbia molecular sau emisie molecular (fluorescena). Detectorii de absorbie
molecular UV-VIZ se bazeaz pe msurarea absorbanei unui fascicul monocromatic n concordan
cu legea Lambert-Beer. Analiii trebuie s conin n structura lor un cromofor. Limita de detecie a
detectorilor bazai pe absorbie molecular este de 0,1 1 ng analit injectat n coloan.
Detectorii bazai pe absorbie molecular n domeniul UV-VIZ sunt n principal de dou
feluri:
1) detectori cu lungime de und variabil, de tip dispersiv:
2) detectori bazai pe reea de diode (diode-array detector DAD).
Detectorul cu lungime variabil utilizeaz o surs de radiaie continu pe domeniul UV/VIZ,
iar selectarea lungimii de und la care are loc detecia se face cu ajutorul unei reele de difracie
(holografic). Alegerea lungimii de und pentru nregistrarea cromatogramei se face cunoscnd
spectrele de absorbie ale analiilor detectai. O schem a acestui detector este redat n figura 19.
60
 Figura 19. Detector n ultraviolet cu lungime de und variabil, n care 1 este fotodioda pentru
detecie, iar 2 este fotodioda de referin.

Sistemele de detecie cu reea de diode sunt cele mai performante n analiza HPLC (tehnica
este abreviat cu HPLC-DAD). Tehnica spectrometric DAD este un caz particular de caracterizare
spectral a interaciei dintre radiaia electromagnetic i prob (n cazul HPLC, fluxul mobil care
ajunge n celul), prin msurarea simultan a intensitii luminii pe intervale de lime spectral egal.
Aceasta se realizeaz prin cteva etape secveniale, dup cum urmeaz:
- interacia probei cu un fascicul policromatic de radiaie;
- dispersia spaial a radiaiei transmise (eventual reflectat sau emis de prob) dup lungime
de und prin utilizarea unui element optic fix;
- focalizarea radiaiei dispersate ntr-un plan focal plat;
- eantionarea simultan a radiaiei dispersate la intervale egale cu ajutorul unor detectori
fotosensibili, poziionai precis n planul focal plat.
Fiecare dintre detectori de tip fotodiod, aranjai unul lng altul, are capacitatea
de msurare a intensitii de radiaie pe intervale spectrale. Rezoluia msurtorilor spectrale depinde
de numrul de fotodiode utilizate. Dac de exemplu, pe domeniul spectral 200 1100 nm rezoluia
msurtorilor spectrale este de 1 nm, numrul de fotodiode plasate n reea este de 900. In felul acesta,
acest detector poate surprinde spectrul de absorbie UV-VIZ n timp real (instantaneu).
Schema unui detector bazat pe reea de diode este redat n figura 20.
Spectrele nregistrate prin DAD pot fi utilizate la identificarea compuilor eluai, prin
compararea spectrelor obinute cu cele din librria spectral.
Detecia de fluorescen (FLD) este utilizat n cazul analiilor fluoresceni (fig. 21).
Abrevierea acestei tehnici analitice este HPLC-FLD. In felul acesta selectivitatea determinrilor este
asigurat i de proprietatea analiilor de a emite radiaie n vizibil, atunci cnd sunt excitai cu radiaie
n ultraviolet. Parametrii deteciei de fluorescen sunt excitaie i emisie. In cazul compuilor fr
proprieti fluorescente se poate aplica o reacie de derivatizare, prin care n structura analiilor s se
introduc o grupare fluorogen (grupare cu proprieti fluorescente).
Detecia de fluorescen este influenat de o serie de factori care in de natura analiilor sau
de condiiile experimentale ale separrilor cromatografice. Aceti ultimi parametri sunt redai i
discutai n tabelul 6.

61
 Figura 20. Detector n ultraviolet cu reea de fotodiode (DAD).

Figura 21. Schema unui detector de fluorescen cu monocromator, utilizat n HPLC.

62
 Tabel 6 Influena unor parametrii experimentali asupra deteciei de fluorescen.
Parametrul fazei
Efectul asupra fluorescenei
mobile
Att lungimea de und a emisiei, ct i intensitatea fluorescenei, n cazul
compuilor aromatici cu grupri funcionale disociabile sunt puternic
pH
dependente de valoarea pH-ului, precum i de interaciile prin legturi de
hidrogen.
Influen cu un ordin de mrime asupra intensitii i deplasarea lungimii de
und de emisie maxim datorit interaciunilor puternice cu solventul. O
deplasare a benzii de emisie ctre lungimea de und mai mare se observ la
Solvent
creterea constantei dielectrice a solventului. Dac solventul absoarbe fie la
lungimea de und de excitaie, fie de emisie, atunci are loc o scdere a
sensibilitii deteciei analiilor din prob.
Randamentul de fluorescen este influenat de temperatur: prin creterea
Temperatura
temperaturii randamentul de fluorescen scade de ordinul 1- 2%/C.
Prezena impuritilor, n special a oxigenului dac solvenii nu sunt
corespunztor degazai, poate produce un efect de stingere (quenching) a
Impuriti
semnalului de fluorescen, n special atunci cnd concentraiile analiilor
sunt mici, la limita domeniului de detecie.
Sursele cu intensitate mare a radiaiei utilizate pentru excitare pot produce n
unele cazuri descompunerea unor analii, proces care depinde de timpul de
Debit
staionare al analiilor n celula de detecie, care, la rndul lui, depinde de
debitul fazei mobile.

Un detector aproape universal, dar cu sensibilitate sczut, este detectorul bazat pe msurarea
radiaiei mprtiate (evaporative light scattering detector ELSD). Acesta este utilizat cu
precdere pentru detecia compuilor organici nevolatili. Este considerat un detector de tip distructiv
i de aceea ntr-o configuraie cu mai muli detectori va fi plasat ultimul n serie. Schema unui astfel
de detector este redat n Fig. 22. Relaia dintre aria picului cromatografic obinut cu un astfel de
detector pentru un compus i (Ai) i cantitatea de analit injectat n coloana cromatografic (mi) este
nelinear, fiind printre puinele relaii de nelinearitate n chimia analitic ntre cantitate de analit i
rspunsul deteciei.

Figura 22. Elementele componente ale unui detector ELSD.

63
 8. Cromatografia n strat subire

Cromatografia n strat subire (thin-layer chromatography TLC) este o variant a

cromatografiei planare, n care faza staionar solid este depus pe o suprafa inert (de regul, o
plac de sticl). Datorit simplitii sale, aceast tehnic este nc utilizat cu destul succes n
laboratoare pentru separarea unor amestecuri de compui organici. Dintre toate tehnicile
cromatografice, aceasta ofer posibilitatea separrii simultane a unui numr foarte mare de probe
(pn la 50-60 de probe). Astfel, Farmacopeile European, Britanic sau American nc prevd
metode TLC pentru determinarea unor impuriti corelate n unele substane active din formulaii
farmaceutice.
Proba este aplicat pe aa-numita linie de start de pe placa cromatografic sub forma unui
spot, ct mai puin ntins cu putin. Captul inferior al plcii este apoi plasat ntr-un tanc ce conine
faza mobil necesar separrii. Aceasta va migra vertical prin stratul de faza staionar. Componenii
probei vor participa la procesul de partiie ntre faza mobil i faza staionar; cei care vor avea o
afinitate mai mare fa de faza mobil vor fi mai apropiai de frontul fazei mobile, iar cei care vor
avea o afinitate mai mare fa de faza staionar vor migra mai puin de-a lungul direciei n care se
deplaseaz faza mobil pe placa cromatografic. Din acest punct de vedere retenia n cromatografia
pe strat subire este asemntoare celei care are loc pe o coloan cromatografic.
Factorul de retenie (notat cu Rf,i) al unui compus (i) se calculeaz cu ajutorul parametrilor de retenie,
descrii n Fig. 23, utiliznd urmtoarea relaie:

Valorile lui Rf,i variaz ntre 0 (analitul nu migreaz) i 0,999 (analitul migreaz odat cu
frontul solventului fazei mobile, fa de care are o mare afinitate/solubilitate).
Cu ajutorul factorului de retenie se poate calcula un alt parametru (descriptor) care s descrie
procesul de retenie, notat cu RM,i i calculat prin relaia:

Din punctul de vedere al mecanismului de separare, cromatografia n strat subire se mparte

ca i cromatografia pe coloana n doua clase principale:
1) separri TLC n faz normal (NP-TLC);
2) separri TLC n faz invers (RP-TLC).
Faza staionar n NP-TLC este un adsorbant anorganic (de exemplu, silicagel, alumina sau
Florisil), sau silicagel chimic modificat cu grupri cian sau diol. In acest mecanism faza mobil este
organic fr urme de ap. Faza staionar i faza mobil n cazul RP-TLC sunt asemntoare
aceluiai mecanism desfurat n cromatografia pe coloan.
Detecia n TLC se face prin spectrometrie de absorbie molecular UV-VIZ (cnd compuii
sunt colorai ori absorb n ultraviolet, sau cnd se aplic reacii de derivatizare cu introducerea unui
cromofor), spectrometrie de emisie molecular UV-VIZ (cnd compuii sunt fluoresceni sau cnd se

64
aplic o reacie de derivatizare cu introducerea sau inducerea unei grupri fluorogene), prin
spectrometrie n infrarou (un fascicol IR este focalizat cu ajutorul unei oglinzi reflectante pe spotul
analitului, iar fascicolul reflectat este direcionat de o alt oglind ctre detectorul spectrometrului),
prin spectrometrie Raman (bazat pe msurarea radiaiei mprtiate), sau spectrometrie de mas (o
poriune a spotului analitului este ionizat cu ajutorul unui fascicul laser, sub vid, i direcionat ctre
separatorul i apoi detectorul de ioni al spectrometrului de mas).

Figura. 23. Parametri cromatografici msurai din separarea TLC a unui amestec (zi msurat din
linia de start pn n centrul spotului analitului i).

65