4.

DOZAREA HEMOGLOBINEIMetode de dozare aşe hemoglobinei:

4.1. Dozarea hemoglobinei ca oxihemoglobină4.2. Dozarea fotometrică a hemoglobinei
ca cianhemiglobină şi cianmethemoglobină4.3. Dozarea spectrofotometrică a
hemoglobinei4.4. Dozarea electroforetică a hemoglobinei
4.1. Dozarea hemoglobinei ca oxihemoglobină:Principiul metodei: 4

Soluţia diluată de amoniac produce hemoliza sângelui şi totodaată împiedică

transformareahemoglobinei în methemoglobină. Oxihemoglobina se dozează în funcţie
de densitatea optică a soluţiei la540 nm(filtru verde).
Tehnica:
0,02 ml sânge se omogenizează cu 5 ml soluţie hidroxid de amoniu 0,1%. Se citeşte
extincţiaamstecului şi se calculează concentraţia hemoglobinei prin interpolare pe curba
de calibrare.Valori normale:♂: 13 – 17 g/ 100ml♀: 12 – 15 g/ 100ml
4.2. Dozarea fotometrică a hemoglobinei ca cianhemiglobină şi cianmethemoglobină:
Această determinare este metoda standard pe plan mondial pentru dozarea hemoglobinei.
Principiul metodei:
Fericianura de potasiu oxidează fierul feros din hemoglobină în fier feric, iar acesta face
ca toatefelurile de hemoglobină să se transforme îm methemoglobină sau hemiglobină,
care pe măsură ce seformează, se tranformă în cianmethemoglobină sau cianhemiglobină,
care se vor doza fotometric.
Tehnica:
0,02 ml sânge venos sau capilar se amastecă cu 5 ml reactiv Kampen-Zylstra, se
omogenizeară ,Ise lasă în repaus 30 de minute. Extincţia se va citi la 540 nm.
Concentraţia hemoglobinei se calculează prin interpolare pe curba de calibrare.
4.3. Dozarea spectrofotometrică a hemoglobinei:
Aceast este o metodă cantitativă de dozare a hemoglobinei.
Principiul metodei:
Derivaţii hemoglobinei, fiind substanţe colorate (prin componenta porfirinică), pot fi uşor
deosebite prin spectrul lor de absorbţie.
Derivaţii hemoglobinei:
a)HbO
2
(oxihemoglobina): are două spectre de absorbţie în zona galben-verde (570-
545nm).Reprezintă 97% din hemoglobină în sângele arterial şi 70-75% în sângele venos.
b)HbH (hemoglobina redusă)c)HbCO (carboxihemoglobina):în mod normal reprezintă
0,5-2% din hemoglobină, iar la fumătoriîn jur de 6.5%.d)MetHb : în mmod normal
reprezintă 0,2-1%.e)HbCO
2
(carbhemoglobina), concentrţia acestuia variază în limite largi, este mai mare în
sângelevenos şi mai mic în sângele arterial.
4.4. Dozarea electroforetică a homoglobinei:Principiul metodei:
Hemoglobina şi derivaţii săi migrează în câmp electrostatic, datorită componentei lor
proteice. Încomparaţie cu proteinograma efectuată din plasmă, la proteinograma efectuată
din ser hemolizat apar benzi în plus în fracţiunile în care migrează diferitele tipuri de
hemoglobină, în special în β
2.
Concentraţiahemoglobinei se
poate determina densitometric.
Tipuri de hemoglobină:
a)HbA
1
: migrează în fracţiunea α
2
,β
2
şi reprezintă 96-98 % din hemoglobină. b)HbA
2
: migrează în fracţiunea α
2
,δ
2,
reprezintă 1-3% din hemoglobină.c)HbF: migrează în fracţiunea α
2
,γ
2
şi reprezintă 0,5- 0,8% din hemoglobină.
Metode de dozare

metoda colorimetrică Sahli

metoda cu cianmethemoglobină

fotometrie

spectofotometrie
Influenta ph-ului in viata cotidiana
Ph-ul este o scara care masoara cat de acida sau alcalina este o substanta.Pentru
masurarea pH-ului in soluri,direct pe camp se fabrica pH-metre de buzunar.Astfel
deaparate a caror greutate nu depaseste 1kg,sunt alimentate cu ajutorul bateriilor si sunt
prevazute cusisteme de electrozi rezistenti care pot fi introdusi direct in sol.Solutiile acide
au pH cuprins intre 0-7Solutiile bazice au Ph curpins intre 7-14Solutiile cu pH=7 nu sunt
nici acide nici bazice,sunt neutre.Caracterul acid sau bazic al unei solutii poate fi pus in
evidenta folosind indicatorii acido-bazicinumiti si indicatori de pH.Un indicator de pH
este o substanta care are o anumita culoare cand segaseste in forma sa de acid si o alta
culoare cand se gaseste in forma de baza conjugata.In practica sefolosesc indicatoare si
Ph-metre,masurarea pH-ului are un rol deosebit de important.PH-ul sangelui este extrem
de important. PH-ul ideal al sangelui este in jur de 7,35 iar organismulface tot posibilul
pentru a mentine acest nivel.Aceasta deoarece o modificare de doar 1-2 a pH-ului
indiferent de directie, ar putea schimba intreagachimie din organism, nu ar mai exista
putere electrica si in scurt timp organimsul ar muri.PH-ul este extrem de important pentru
globulele rosii din sange. Acestea trebuie sa circule princapilare extrem de mici. Pentru a
se putea deplasa acestea sunt nevoite uneori sa patrunda una cateuna prin capilare.
Aceasta este posibil datorita incarcaturii negative pe care globulele rosii o au careface sa
se respinga intre ele, sa ramana separate si sa poata circula liber.Pe masura ce organismul
unui om devine mai acid, balanta biochimica a organismului sedezechilibreaza iar
celulele rosii transmit din ce in ce mai greu oxigenul si nutrientii eficient la toatecelulele.
Aceasta determina un nivel energetic foarte scazut.Majoritatea tinerilor consuma mari
cantitati de alcool (bere sau bauturi distilate) precum situtun,toate acestea asociate cu o
hrana necorespunzatoare cum ar fi : alimentele gen fastfood,foarte multe prajeli,au drept
efect deteriorarea mucoasei stomacale ,astfel sucul gastric foarteacid cu pH sub 7 ajunge
la peretele stomacului si incepe erodarea stomacului.Astfel se ajunge lacomplicatii:
inceput de gastrita iar apoi alte boli mai grave.Din fericire, este foarte simplu sa iti
modifici pH-ul si sa il modifici in mai alcalin. Ceea ce esteimportant este sa delimitezi ce
substante sunt acide si care sunt alcaline. Apoi nu ramane decat saelimini din cele acide
pana cand nivelul pH-ului tau se reechilibreaza.Rinichiul este un organ cu rol foarte
important in reglarea pH-ului.PH-ul urinei are valori normaleintre 4,5-8;pH-ul urinei
variaza in functie de alimentatie: este acid in cazul alimentatiei bogate incarne si bazic in
cazul regimului vegetarian.Stomacul este un organ care prezinta secretii foarte acide (pH
aproximativ1); arsurile pe care lesimtim uneori in stomac sunt cauzate de cresterea
aciditatii.Parul si pielea sunt si ele parti ale organismului si ar trebui sa folosim produse
cosmetice cu pHaproximativ 5,5 deci slab acide pentru a neutraliza alcalinitatea introdusa
de apa sau detergenti.
Daca samponul folosit este foarte acid (pH 1-2) puntile de hidrogen si cele saline nu se
maiformeaza,daca pH-ul este unul bazic dauneaza deasemenea parului.Sapunul cu un pH
necorespunzatoare usuca tenul si irita astfel astfel glandele sebacee.Saliva actioneaza ca
un tampon neutralizand pH-ul acid al cavitatii bucale si astfel
impiedicanddemineralizarea smaltului.Folosirea gumei de mestecat dupa consumul de
dulciuri spre deosebire de clatirea cuapa,stimuleaza secretia salivara,tamponeaza pH-
ul.Amidonul crud din plante coboara pH-ul,in timp ce amidonul preparat termic poate fi
periculos cazaharul.
Influenta pH-ului
Pentru enzimele din organismul uman, pH-ul optim de actiune este pH-ul normal al
mediului in care ele isi manifesta actiunea catalitica (Fig.4.7).
Centrul activ al enzimelor contine grupe ionizabile, acide sau bazice, deci modificarea
pH-ului are ca efect modificarea gradului de disociere si, implicit, modificarea vitezei de
reactie.

Fig.4.7 pH-ul optim de actiune a unor enzime

Pentru enzimele din organismul uman pH-ul optim este intre 5-9, dar exista enzime ce
actioneaza si in afara acestui interval. De exemplu, pepsina actioneaza la pH 1,5-2,
fosfatazele alcaline la pH 9-10, iar fosfatazele acide la pH 4,5-5.
Influenta pH-ului.
Viteza rectiilor enzimatice este influentata in mare masura si de pH-ul mediului in care
actioneaza enzimele.Ca si proteinele,enzimele care sunt proteine sau proteide, pot sa
sufere modificari de solubilitate,incarcare electrica, presiune osmotica, viscozitate la
diferite valori de pH.Modificarile in activitatea enzimelor,sub influenta pH-ului mediului
se datoresc in principal modificarii stabilitatii si gradului de ionizare,fie a enzimelor,a
substraturilor corespunzatoare sau a complexelor enzima-substrat.Sensibilitatea fata de
pH a enzimelor nu se manifesta numai in legatura cu viteza de producere a reactiei pe
care o catalizeaza.S-a dovedit ca insasi stabilitatea enzimelor este afectata de aciditatea
sau alcalinitatea mediului.O enzima oarecare este stabila si prezinta activitate numai in
anumite limite de pH,in cadrul carora se poate stabili un pH optim de activitate.Pentru a
stabili influenta pH-ului asupra activitatii unei enzime se masoara viteza reactiei
enzimatice utilizinu-se solutii tampon cu valori cunoscute.Activitatea enzimei obtinuta la
diferite valori ale pH-ului pe axa absciselor.Se obtine astfel curba caracteristica ce
exprima dependenta vitezei reactiei enzimatice de pH-ul mediului.
Experienta.Substante necesare.
Acid clorhidric 1N
Hidroxid de sodiu 1 N
Apa oxigenata 0,5 N
Iodura de potasiu 10%
Solutie de acid sulfuric (15 ml H2SO4 concentrat la 100 ml apa)
Molibdat de amoniu 1%
Tiosulfat de sodiu 0,1 N
Obtinerea extractului.Materia prima ce contine sursa de enzima a carei activitate o
determinam (10) se mojareaza fin cu 5 g de carbonat de calciuAmestecul obtinut se trece
cantitativ intr-un cilindru gradat de 100 ml si se aduce la semn cu apa distilata.Se agita
puternic si se lasa in repaus,timp de o ora,dupa aceea se filtreaza prin filtru de vata.
d.
Influenţa pH-ului
Toate reacţiile enzimatice sunt puternic influenţate de pH-ul mediului.Reacţia are o viteză
maximă pentru o anumită valoare a pH-ului saupentru un interval foarte strâns de pH,
denumit pH optim. Abateri de laaceste valori produc o scădere bruscă avitezei de reacţie.
Reprezentând graficvariaţiile vitezei în funcţie de pH seobţine o curbă în formă de clopot
îngust(fig. 7.8
).Valoarea pH-ului optim al diverselor enzimecoincide
în general cu pH-ul lichidelor dinorganism unde ele îşi exercită acţiunea.
192

Enzime
De exemp
lu, pH-ul optim al
pepsinei
este 1,5-2,5 realizat în sucul gastric deacidul clorhidric; al
tripsinei
este 8-11, identic cu pH-ul sucului pancreatic.Majoritatea enzimelor vegetale acţionează
bine la un pH în jur de 6-7. Deasemenea, pH-ul optim de activitate al unei enzime are o
valoarecaracteristică numai în condiţii bine precizate. Aceste valori pot suferivariaţii sub
influenţa a numeroşi factori:
- cu temperatura: la 40°C
amilaza
din malţ are pH-ul optim 4,4 iar la60°C - pH-ul optim este de 6,6;
- cu substratul:
maltaza
are pH-ul optim pentru maltoză 6,0 iarpentru metilglucoză 6,7;
- cu originea enzimei:
amilaza
din malţ are pH-ul optim de acţiune5,2; cea din pancreas 7,0; iar cea din ficat 6,0.
La majoritatea enzimelor intervalul de pH în interior
ul căruia îşi manifestăacţiunea se întinde pe câteva unităţi
de pH, de obicei 6-8. Abaterile de laacest
interval conduc la imposibilitatea enzimei de a-şi mai exercitaacţiunea.