Analiza biocompatibilitatii

celule – biomateriale
implantabile

Dr. Elena Iulia Oprita

 Laborator de testare a
biocompatibilitatii biomaterialelor
 Notiuni introductive

Biomaterial - termen folosit pentru materiale

naturale sau sintetice, folosite in scopul
reproducerii functiei tesuturilor.
- Este un substrat inert din punct de vedere
sistemic si farmacologic destinat sa
interactioneze cu sistemele biologice
pentru a directiona, intensifica sau inlocui
functiile diferitelor tesuturi din organismul
uman.
Biomaterialele pot fi clasificate avand in
vedere urmatoarele criterii:
• d.p.d.v al originii lor: naturale,
sintetice si hibride;
• d.p.d.v al compozitiei chimice:
metalice, ceramice, polimerice si
compozite;
• d.p.d.v al reactiilor de interfata:
biotoxice, bioinerte, bioactive si
bioresorbabile;
Biocompatibilitate - termenul este
folosit pentru a defini capacitatea unui
material de a determina un raspuns
corespunzator al tesutului gazda in
cazul unei aplicatii specifice
- reprezinta capacitatea unui
material care este in contact cu tesutul
viu de a nu cauza efecte toxice si
daunatoare.
 Citotoxicitate – calitatea unui biomaterial de a fi
toxic pentru celule
 Clasificarea biomaterialelor
- necitotoxice
- usor citotoxice
- moderat citotoxice
- sever citotoxice
 Teste de citotoxicitate in vitro
- teste pe culturi celulare
 Teste de citotoxicitate in vivo
- teste pe animale de laborator: soareci,
sobolani, iepuri
Testarea biocompatibilitatii in vitro

Metoda culturilor celulare

 Biocompatibilitatea materialelor poate fi testată
într-un mod simplu analizând dacă ele sunt
substrate adecvate pentru creşterea culturilor
celulare.
 Folosind culturile celulare pentru testarea
biocompatibilităţii este posibilă realizarea unei
selecţii preliminare pentru a elimina materialele
care au efecte directe, dăunătoare.
 O serie de sisteme de culturi celulare sunt folosite
în mod frecvent pentru studierea citotoxicităţii in
vitro.
 Cultura primară este un izolat proaspăt de celule
care este cultivat in vitro.

 Culturile de celule primare pot fi obţinute din

fragmente de ţesuturi (os, cartilaj sau piele) sau
din suspensii de celule individuale obţinute prin
tratarea ţesuturilor cu enzime proteolitice
(cartilaj sau tesut adipos).

 Liniile celulare continue sunt derivate din culturile

celulare primare care s-au adaptat creşterii in
vitro.
 Metode de testare a citotoxicitatii in vitro

Teste stabilite si standardizate – EN ISO 10993–5

Evaluarea biologica a dispozitivelor medicale.
Partea 5: Teste pentru citotoxicitatea in vitro

 Metoda contactului direct

 Metoda contactului indirect (extractului)
Metoda contactului direct

• Linii celulare stabilizate –

80% confluenta
• Proba – acopera aproximativ
10% din stratul celular
• Se folosesc: materialul de
testat (proba), un martor de
cultura si 2 martori (pozitiv si
negativ)
• Se testeaza citotoxicitatea la
24 si 48 ore.
- martorul de cultura – cultura de celule
simpla;
- martorul pozitiv – orice material care utilizat
intr-un test de evaluare a citotoxicitatii
influenteaza in mod negativ viabilitatea si
morfologia celulara;
- martorul negativ - orice material care utilizat
intr-un test de evaluare a citotoxicitatii nu are
nici o influenta asupra celulelor
 Scala de citotoxicitate (%)

80% - 100% - necitotoxic

50% – 80% - usor citotoxic
30% – 50% - moderat citotoxic
< 30% - sever citotoxic
Metoda contactului indirect
(extractului)

Obtinerea extractului – materialul de

testat mentinut in mediul de cultura
24h, 37°C.
Se folosesc dilutii;
Se testeaza citotoxicitatea la 24, 48 si
72 ore.
- Blank – mediul de extractie care nu contine
materialul de testat;
- martorul de cultura – cultura de celule
simpla;
- martorul pozitiv – orice material care utilizat
intr-un test de evaluare a citotoxicitatii
influenteaza in mod negativ viabilitatea si
morfologia celulara;
- martorul negativ - orice material care utilizat
intr-un test de evaluare a citotoxicitatii nu are
nici o influenta asupra celulelor
Metode de testare a biocompatibilitatii
in vitro

 Metode de testare a viabilitatii si proliferarii celulare

 Metode de analiza a morfologiei si ultrastructurii celulare

 Metode de determinare a sintezei de proteine

Metode calitative
– Tehnici de microscopie

Metode cantitative
- Tehnici de dozare a proteinelor
- Reducerea sarurilor de tetrazoliu
- Cuantificarea sintezei de ADN
 Metode de testare a viabilitatii si
proliferarii celulare

Coloranti vitali – folositi pentru a identifica pe baza

permeabilitatii membranei celulare
celulele vii, lezate sau moarte

Metode de testare a viabilitatii celulare

Colorarea celulelor vii/moarte in functie de colorantul folosit
- Albastru Tripan si Iodura de propidiu – sunt coloranti
exclusi de celulele viabile, coloreaza celulele moarte.
- Rosu Neutru si Crystal Violet – detecteaza liza
celulara, coloreaza celulele vii care adera la placile de cultura.
Crystal Violet – detecteaza liza celulara, coloreaza celulele vii
care adera la placile de cultura. Celulele lizate se desprind
de suprafata placilor de cultura si nu sunt colorate

Eliberarea de catre celule in mediul de cultura a diferitelor

enzime sau mediatori chimici poate fi afectata de
expunerea la diferite biomateriale, ex: enzima lactat
dehidrogenaza (LDH) este un marker pentru toxicitatea
celulara in testarea biocompatibilitatii.
LDH – enzima citoplasmatica ce catalizeaza reactia de
conversie a acidului lactic in acid piruvic. Prezenta enzimei
LDH in mediul d ecultura a celuleor este un indicator al
degradarii membranei celulare.
 Metoda excluderii cu Albastru Tripan
Hemocitometru
 Metode de testare a proliferarii celulare

 Principalele metode de analiza a proliferarii celulare:

- reducerea sarurilor de tetrazoliu (metoda MTT)
- absorbtia Rosu neutru
- masurarea sintezei de ADN
 Metoda MTT
 Spectrofotometria reprezinta o tehnica de determinare a
absorbtiei radiatiilor luminoase cu o anumita lungime de unda, de
catre o anumita substanta prezenta intr-o solutie.
 Metoda spectrofotometrica bazata pe reducerea sarii de tetrazoliu
(3-(4,5 dimetilthyazol-2-yl)-2,5-diphenyl tethrazolium bromide)
(MTT) de culoare galbena la cristale de formazan de culoare
albastru-violet sub actiunea enzimelor mitocondriale (NADPH
reductaze) din celulele active metabolic. Cantitatea de formazan
generata este direct proportionala cu numarul de celule viabile.
 Metoda este folosita pentru masurarea citotoxicitatii in vitro
induse de un biomaterial.
 MTT este adaugat direct in mediul de cultura al celulelor si dupa o
perioada de incubare (3h), mediul este alcool izopropilic pentru
solubilizarea cristalelor de formazan. Probele rezultate sunt citite
la un spectrofotometru, iar rezultatele obtinute vor fi prezentate
sub forma unui grafic.
 beta-TCP

120

100
Viabilitate celulara (%)

0,5 mg

80
1 mg

60 5 mg

10 mg
40

20

0
24h 48h
Timp (ore)
 Metode de analiza a morfologiei si
ultrastructurii celulare

 Microscopie optica
 Microscopie in contrast de faza
 Microscopie electronica de transmisie (TEM)
 Microscopie electronica de baleiaj (SEM)
 Microscopie de fluorescenta
 Microscopie confocala
 Microscopie optica

Coloratia Hematoxilina - Eozina

Metoda coloraţiei cu hematoxilină - eozină foloseşte succesiv un
colorant nuclear, bazic, hematoxilina şi un colorant citoplasmatic,
acid, eozina.
Rezultatele acestei colorării sunt:
nucleii apar coloraţi cu albastru violet cu hematoxilină (principalii
constituenţi chimici ai nucleului, ADN şi ARN, posedă radicali
fosfat acizi ce reprezintă locuri de ataşare pentru colorantul bazic
– hematoxilina);
citoplasma se colorează în roz cu eozina (cele mai multe proteine
citoplasmatice se comportă la pH-ul respectiv ca baze, expunând
grupările NH+3, care reprezintă locul de ataşare pentru
colorantul acid – eozina).
Fibroblaste dermale dupa 6 zile Fibroblaste dermale dupa 13 zile
de cultivare in suporturi compozite de cultivare in suporturi compozite
COL/TCP COL/TCP
 Metoda contactului direct
Testarea buretelui Colagen/Condroitin sulfat

Martor de cultura Controlul negativ

Control pozitiv Proba

Metoda contactului indirect (extractului)
 Microscopie in contrast de faza
 Avantajul major ale microscopiei in contrast de fază este
acela că celulele vii pot fi examinate în starea lor naturală,
fără ca, în prealabil, să fie omorâte, marcate cu coloranţi şi
fixate în probă. Dinamica proceselor biologice aflate în
desfăşurare poate fi observată şi înregistrată în condiţii
foarte bune de claritate şi contrast.

Osteoblaste umane cultivate 14 Cultura primara osteoblaste de

zile pe particule macroporoase sobolan dupa 3 zile de cultivare
Microscopie electronica de transmisie
(TEM)

Filopodii celulare (osteoblat) care

Celulă de tip osteoblast
realizeaza contacte stranse cu
uman (O) cultivată 6 zile
suportul (burete COL/TCP)
cu Biostite® (burete
colagen – S)
 Microscopie electronica de baleiaj
(SEM)
Imagini SEM ale
osteoblastelor de
sobolan cultivate în
suport calciu-
fosfat/chitosan.

Infiltrarea celulei în
macroporul suportului
calciu-fosfat/chitosan;
Fixarea celulară la baza
porului (săgeţi);
Celulă în interiorul porului;
Interacţii celulă - celulă în
interiorul porului (săgeţi)

Spre deosebire de TEM, SEM furnizeaza imagini tridimensionale ale

suprafetelor probelor cercetate
 Microscopia de fluorescenta
In mod natural, componentele celulare manifesta
fluorescenta, insa prea slaba pentru a putea fi observata
corespunzator la microscop.
In general, preparatul este marcat (“colorat”) specific cu
compusi fluorescenti (florocromi) care prezinta o afinitate
scazuta, nespecifica pentru moleculele biologice, dar ele
pot fi cuplate chimic cu anticorpi purificati specifici pentru
orice macromolecula dorita.
Un complex fluorocrom – anticorp cand este adaugat la
culturile celulare se va lega la anticorpii selectati care apoi
lumineaza sub actiunea lungimii de unda excitate.
 Testul Live/Dead
Se bazeaza pe colorarea simultana a celulelor vii si moarte prin doi
flurocromi: Etidiu si Calceina.
Calceina coloreaza citoplasma celulelor vii in verde, iar ethidiu nucleul
celulelor moarte in rosu.

Celule stem mezenchimale cultivate in gel de colagen

Analiza viabilitatii osteoblastelor umane cultivate in suport
COL-TCP prin marcare fluorescenta cu DAPI

DAPI - fluorocrom care

coloreaza in albastru
nucleul celulelor vii.
 Sinteza markerilor specifici celulari

Culturi de celule stem Celule stem mezenchimale

mezenchimale exprima umane injectate in burete
VCAM-1 (marker COL/TCP pozitive pentru
specific pentru celule osteocalcin (marker specific
stem mezenchimale) pentru diferentiere osoasa).
 Microscopie confocala

Metoda avansata pentru analiza interactiilor celulare cu biomaterialele

Ofera mai multe avantaje comparativ cu tehnicile histologice si SEM

prin diminuarea timpului de analiza, probele nu necesita o pregatirea
excesiva ca in cazul celor doua

Poate fi folosita pentru a analiza morfologia celulelor si distributia in

interiorul unor suporturi implantabile, a studia adeziunile focale, a
analiza localizarea intracelulara a diferitelor componente celulare si a
citoscheletului.
Citoscheletul este un sistem de filamente
sau de fibre microscopice, întâlnit în
citoplasma celulelor eucariote, care
organizează celelalte componente ale
celulei, menţine forma celulară şi este
responsabil cu locomoţia celulei şi cu
mişcarea organitelor intracelulare.
Citoscheletul este compus din trei tipuri
principale de filamente: filamente de actină,
microtubuli şi filamente intermediare.
Morfologia celulara si
organizarea
citoscheletului
osteoblastelor
dupa 18h de cultivare pe
suprafete de Al (A); Nb
(B); Ti (C); V (D)
Celule vii (culoare verde) si celule moarte (nucleul
rosu) cultivate in suportul compozit COL/TCP
Testarea biocompatibilitatii in vivo

Interfata biomaterial-
mediul biologic/celule
este stratul care
separa doua faze
condensate (de obicei
de dimensiuni
moleculare).
Testarea in vivo a buretilor de COL/TCP
 Testarea biocompatibilitatii in vivo

Urmareste:

 Reactia inflamatorie
 Reactia imuna
 Reactia mitogena
 Formarea tumorilor
 Reactia toxica