Lp.

9 Identificarea micobacteriilor
Diagnosticul de laborator al tuberculozei

Obiective: La sfârşitul lucrării practice studenţii trebuie să cunoască:

1. Etapele identificării micobacteriilor
2. Etapele efectuării coloraţiei Ziehl Neelsen
3. Etapele diagnosticului de laborator al tuberculozei pulmonare.
4. Etapele diagnosticului de laborator al tuberculozei renale şi al meningitei tuberculoase.
5. Particularităţile testării sensibilităţii la antituberculoase.

1. Identificarea micobacteriilor: Mycobacterium tuberculosis

 Identificare preliminară
- Caractere microscopice: bacili fini, granulaţi, uneori ramificaţi, aşezaţi în litere unghiulare,
acido-alcoolo-rezistenţi (BAAR), imobili, nesporulaţi, necapsulaţi. Pe frotiul de cultură în mediul
lichid pot fi dispuşi paralel sau în corzi flexuoase.
- Caractere de cultură: sunt bacterii pretenţioase nutritiv (cultivă pe mediul Lőwenstein Jensen,
mediul Middlebrook), cu creştere lentă (primocultura apare după 2-4 săptămâni), aerobi sau
microaerofili. Forma de cultură R: coloniile sunt conopidiforme, rugoase, uscate, grunjoase, de
culoare crem bej.
 Identificare de certitudine:
- Identificare biochimică: produce catalază inactivată la 68°C, produce niacină, reduce
nitraţii, degradează zaharurile oxidativ, rezistent la hidrazida acidului thiofen-2-carboxilic
(cu titlu informativ)
- Identificare antigenică: detecţie prin imuncromatografie a antigenului proteic MPT64,
detecţia ESAT-6 (early secreted antigenic target protein 6 - proteina antigenică țintă
secretată timpuriu)
- Identificarea acizilor graşi din peretele bacterian prin gaz cromatografie
- Identificare genotipică – tehnici de biologie moleculară (sonde de acizi nucleici/PCR)

2. Coloraţia Ziehl Neelsen (coloraţie diferenţială: împarte bacteriile în acido-alcoolo-rezistente

şi ne-acido-alcoolo-rezistente)
 Etape:
1. Colorarea - fucsină fenicată Ziehl; se încălzeşte lama până colorantul emite vapori. Se repetă
încălzirea cu intermitenţă timp de 3-5 minute; după răcire se spală cu apă.
2. Diferenţierea: soluţie alcool etilic - acid clorhidric; se decolorează până când frotiul rămâne
alburiu după spălare cu apă.
3. Recolorare: albastru de metilen, 30 secunde, apoi se spală.
 Rezultate: BAAR sunt roşii iar bacteriile neacido-alcoolo-rezistente şi leucocitele sunt
albastre.
 Controlul de calitate: se colorează Ziehl Neelsen şi se examinează două frotiuri: unul
dintr-o suspensie de bacili neacido-alcoolo-rezistenţi iar celălalt dintr-o suspensie de
bacili acido-alcoolo-rezistenţi. Pe primul frotiu vedem numai bacili albaştri iar pe al
doilea numai bacili roşii.

3. Etapele diagnosticului de laborator al tuberculozei pulmonare

A. Prelevarea şi transportul produselor patologice.

1
- Se prelevă, de regulă, spută (3 probe consecutive, recoltate la 8-24 ore interval, cel puţin una
fiind prima proba matinală).
Alternative: aspirat traheo-bronşic, lichid de spălătură bronşică sau spălătură gastrică, lichid
pleural (pleurezie tuberculoasă).
- Se transportă la laborator în mai puţin de o oră.
- Refrigerarea probelor care nu sunt examinate într-o oră.
B. Decontaminarea chimică a sputei se face cu o soluţie de NaOH 4% .
C. Examenul microscopic:
 Examinarea unui frotiu de spută colorat Ziehl Neelsen (se examinează 100 câmpuri,
obiectiv 100X).
Rolul examenului microscopic:
- Identifică genul bacteriilor, dar nu şi specia;
- Depistează rapid bacilii tuberculozei;
- Depistează BAAR care nu cultivă în condiţiile oferite.
Interpretare:
- Bacterioscopia pozitivă are întotdeauna semnificaţie clinică;
- Bacterioscopia negativă nu exclude diagnosticul de tuberculoză dată fiind sensibilitatea
redusă a microscopiei.

Număr de bacili/câmp Rezultat

0/100 câmpuri Absenţi BAAR
1-3/100 câmpuri Se examinează 300 câmpuri
4-9/100 câmpuri Se comunică numărul
10-99/100 câmpuri Slab pozitiv (+)
1-9/câmp Moderat pozitiv (++)
>10 câmp Intens pozitiv(+++)

Fig 1. Frotiu spută colorat Ziehl-Neelsen, exam 1000x.

Categorie microscopică: Mycobacterium spp.
Legenda: rosu - BAAR; albastru - bacterii neacido-alcoolo-rezistente, leucocite
https://www.thermofisher.com/blog/proteomics/mycobacterium-tuberculosis-using-quantitative-proteomics-to-
understand-virulence/

2
D. Izolarea pe medii de cultură: Lőwenstein Jensen, agar Middlebrook - incubare la 37ºC şi
urmărire săptămânal timp de 3 luni.
- sisteme automate de cultivare de tip BACTEC (detecţie radiometrică a izotopului 14C) şi
MB/BacT (detecţie colorimetrică a CO2) scurtează timpul de detecţie a culturii.
Interpretare
Prezenţa culturii - confirmă diagnosticul.
Absenţa culturii - nu exclude diagnosticul, deoarece pot exista leziuni închise care elimină
intermitent cantităţi mici de bacili (de aceea se fac culturi repetate) sau tulpinile sunt mai
pretenţioase nutritiv.

Fig. 2. Cultură pe mediul Lőwenstein Jensen

https://openi.nlm.nih.gov/detailedresult.php?img=PMC1310521_1476-0711-4-18-5&req=4

E. Identificarea M. tuberculosis.

Fig. 3. Detecția Ag. MPT64

https://www.google.ro/search?q=antigenului+proteic+MPT64

F.Testarea sensibilităţii la antituberculoase

4. Etapele diagnosticului de laborator al tuberculozei renale şi al meningitei tuberculoase

Tuberculoza renală
- Prelevare: 3 probe de urinǎ (probă curată, prinsă în zbor, din jet mijlociu), prelevate
dimineaţa, în zile consecutive, în volum de 50 ml fiecare.
- Transport şi conservare: aceleaşi precauţii ca şi pentru urocultura cantitativǎ.

3
 - Examen citobacterioscopic al urinei: piurie prezentă, bacteriurie cu bacterii condiţionat
patogene absentă (frotiu urină colorat Gram)
- Concentrarea probelor prin centrifugare.
- Decontaminarea chimicǎ a sedimentului urinar cu o soluţie NaOH 4%.
- Examen microscopic al frotiului din sediment urinar colorat Ziehl – Neelsen. Prezenţa
BAAR nu stabileste diagnosticul de tuberculoză renală, deoarece în proba recoltatǎ pot fi
prezente şi micobacterii saprofite (M. smegmatis, M. phley)
- Izolarea bacteriei prin însămânţarea sedimentului urinar pe mediul Löwenstein – Jensen.
- Identificarea bacteriei izolate în cultură.
- Antibiograma
Meningita tuberculoasă
←
- prelevăm LCR în tub de centrifugă steril, cu capac
←
- transport imediat la laborator
←
- examen macroscopic: LCR clar
←
- examen citologic cantitativ: 50-500 ecn/mm3
←
- examen citologic calitativ: predomină limfocitele
←
- examen bacterioscopic frotiul sediment LCR colorat Ziehl – Neelsen: prezenţi BAAR
←
- examen biochimic supernatant LCR: glicorahia (20-40 mg/dl), proteinorahia (100-200
mg/dl), clorurorahia (< 600 mg/dl)
←
- însămânţare sediment LCR pe mediul Löwenstein – Jensen cu urmărirea apariţiei culturii
până la 3 luni de incubare
←
- identificarea bacteriei izolate
←
- antibiograma

5. Particularităţile testării sensibilităţii la antituberculoase

- antibiograma - variantă a metodei diluţiilor (metoda concentraţiilor absolute, metoda
proporţiilor, metoda punctelor de ruptură)
- mediul Lőwenstein Jensen suplimentat cu antituberculoase
- antituberculoase de linia I: izoniazidă, rifampicină, etambutol, streptomicina, pirazinamida
- antituberculoase de linia a-II-a: etionamida, cicloserina, capreomicina, fluorochinolone
(ofloxacina), aminoglicozide (kanamicina), rifabutin, viomicina, acid para-aminosalicilic (PAS).
- metoda automatizată BACTEC (radiometrică)
- metode moleculare – evidenţierea genelor de rezistenţă – RIF – gena rpoB
- HIN – gena inhA

Tulpina MDR (multidrog rezistentă) – rezistenţă simultană la RIF şi HIN cu/fără rezistenţă la
alte antituberculoase de linia I.

În sală se găsesc:
- frotiuri de spută colorate Ziehl-Neelsen
- sputocultură pe mediul Löwenstein – Jensen
- antibiogramă pentru M. tuberculosis
- frotiuri de spută fixate, necolorate
- baterie coloraţie Ziehl-Neelsen