LP. 9. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE.

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR ÎN INFECȚIA HIV/SIDA.

Obiective:
1. Cunoasterea principalelor virusuri cu tropism hepatic şi prezentarea metodelor specifice şi
nespecifice de diagnostic.
2. Cunoasterea diagnosticului specific al hepatitelor cu transmitere predominant enterală: VHA,
VHE (metode directe, indirecte, semnificaţia markerilor virali).
3. Cunoasterea diagnosticului specific al hepatitelor virale cu transmitere predominant
parenterală: VHB, VHD, VHC (metode directe, indirecte, semnificaţia markerilor virali, algoritm
de diagnostic).
4. Diagnosticul de laborator în infecția HIV/SIDA.

1. Hepatite virale = boli sistemice care afectează ficatul

Virusurile hepatitei → hepatotropism obligatoriu
 VHA, VHE = nude, ARNm.c. (+), încadrate însă în familii diferite
→ transmitere predominant pe cale digestivă
→ cauzează hepatite acute autolimitate, care nu se cronicizează
niciodată
 VHB, VHC = învelite (cu genom ADN, parţial dublu catenar, respectiv ARN
mc (+)
→ transmitere predominant parenterală, dar şi pe cale sexuală, şi
de la mamă la copil;
→ infecţii persistente → evoluţie spre hepatită cronică, ciroză,
cancer hepatic
 VHD = mic virus ARN
→ defectiv (infectează numai asociat VHB, de la car eîmprumută
AgHBs)
 VHG (GB virus C) – virus ARN cu transmitere parenterală, probabil implicat
în cronicizare
 Alte virusuri: F (determină hepatite grave, fulminante), TTV (virus ADN
transmis prin transfuzii, probabil implicat în cronicizare).
Alte virusuri cu tropism hepatic (ocazional): VEB, VCM, VHS, v. febrei galbene
→ afectarea hepatică este secundară

Diagnosticul de laborator – teste nespecifice (ALAT, ASAT, bilirubină, fosfatază alcalină, etc..)
– teste specifice
 directe – detectare antigene/genom/ evidenţiere virioni (ME)/izolare
 indirecte – detectare Ac IgM/IgG

2. Diagnosticul specific al hepatitelor cu transmitere predominant digestivă

Diagnosticul hepatitei determinate de VHA:

 Direct = disponibil in cercetare
Virusul este prezent în sânge şi materii fecale cu 2 săptămâni anterior debutului bolii şi 1-2
săptămâni după apariţia icterului;
- izolarea VHA: dificilă, cu producerea unor cantităţi reduse de virus
- evidenţierea virionilor în materii fecale prin ME şi identificarea prin IME.
 Serologic = depistarea Ac anti-VHA prin ELISA
- IgM – persistă 2-4 luni
- IgG – persistă toată viaţa
1
 Semnificaţie Ac anti-VHA/IgM Ac anti-VHA/totali (IgM+IgG)

infecţie acută/recentă + +

trecere prin boală cu – +

imunizare

Diagnosticul hepatitei determinate de VHE:

 Direct = inaccesibil pentru practica de rutină

- evidenţierea ARN/VHE prin RT-PCR (în ser, MF) – sensibilitate scăzută (50%)
- evidenţierea virionilor în MF prin IME – cercetare
- identificare de Ag virale în probe de ţesut hepatic prin IF (nu este indicată în faza acută)
 Indirect = evidenţiere Ac anti-VHE/IgM sau IgG prin ELISA sau WB (IgM, dificil de
interpretat, pot persista mai multe luni).

3. Diagnosticul specific al hepatitelor cu transmitere predominant parenterală

Diagnosticul hepatitei determinate de VHB:

 Direct
- evidenţiere antigenelor VHB în ser prin ELISA: Ag HBs, Ag HBe
- evidenţiere ADN/VHB prin PCR, cu teste suplimentare
* genotipare - prin Real Time PCR (s-au descris 8 genotipuri; A-H, importante pentru
diagnostic, deoarece există diferenţe evolutive şi de răspuns la tratament); în România
predomină genotipul D;
* secvenţiere pentru detectarea mutaţiilor, care explică fenotipuri evolutive diferite,
comparativ cu tulpinile sălbatice;
- evidenţiere Ag HBc şi AgHBs în hepatocite, prin teste de imunohistochimie
 Indirect = evidenţiere Ac anti-HBs, anti-HBe, anti-HBc – prin ELISA

Semnificaţia markerilor în HVB:

AgHBs = infecţiozitatea sângelui în

- infecţie acută (poate lipsi, când există mutaţii în regiunea S a genomului)
- infectie cronică, ciroză, cancer heptatic
- coinfectie/suprainfectie cu VHD
- purtător inactiv de AgHBs (purtator de AgHBs, de regulă cu niveluri moderate ale
acestuia, fără a prezenta leziuni hepatice sau teste biochimice anormale)
- uneori, rezultat fals pozitiv
Ag HBe = contagiozitate crescută prin sânge şi secreţii
Ac anti-HBc → IgM = infecţie acută/recentă
reapar în acutizările formelor cronice
→ IgG = rol anamnestic (în practică există truse pentru anti-HBc totali (IgM şi IgG)
Ac anti-HBs = imunitate la reinfecţie
Ac anti-HBe = potenţial infecţios redus al sângelui → evoluţie favorabila (excepţie tulpinile
„mediteraneene” – prezinta mutaţii la nivelul segmentului genomic C şi preC, avand drept
consecinţă absenţa sintezei AgHBe, fără a fi afectată expresia AgHBc şi replicarea virală)
ADN/VHB = replicare activă/infectivitate

2
 Tabel: interpretarea markerilor serici în HVB

AgHBs Ag anti- anti-HBc/ anti- anti- Diagnostic

HBe HBc/IgM totali HBs HBe
+ + Incubaţie
+ + + + Hepatită acută cu VHB

+ + Purtător inactiv
(>6 (>6 luni) (+ transaminaze normale, viremie
luni) scăzută sau absentă)

+ + + Hepatopatie cronică
(>6 (>6 (>6 luni) (+ creşterea ALAT > 2,5 ori)
luni) luni)
+ + + Trecere prin boala cu imunizare

+ Status post-vaccinare

Diagnosticul hepatitei determinate de VHD

! doar la pacienţii Ag HBs (+): „purtători sănătoşi” (noul termen, purtător inactiv), infecţii acute
sau cronice determinate de VHB

Coinfecţia = infectarea simultană cu VHB+VHD Suprainfecţia = suprapunerea VHD pe un teren

→ evoluţie severă în faza acută AgHBs (+)
→ de regulă nu se cronicizează → evoluţie fulminantă frecventă
→ forme cronice foarte frecvente (75%)
 Diagnostic direct: pe lângă prezenţa AgHBs
- detectare antigenului delta (ELISA; prezenţă f scurtă, 1-2 săptămâni)
- detectare ARN genomic (RT-PCR)
 Diagnostic serologic = detectare, prin ELISA, a Ac anti-VHD/IgM, IgG sau totali

Diagnosticul hepatitei determinate de VHC

 Direct
 evidenţiere ARN/VHC prin tehnici de biologie moleculară (RT-PCR)
- teste calitative → confirmă boala în cazul rezultatelor serologice echivoce
→ evidenţiază infecţia cu VHC precoce, la 1-2 săptămâni de la contactul infectant
→ certifică debarasarea de virus (sunt mai sensibile decât testele cantitative)
- teste cantitative → măsoară încărcătura virală
→ monitorizarea terapiei
Teste de genotipare (s-au descris 6 genotipuri; 1-6, cu mai multe subtipuri: 1a, 1b, 2a, 2b, etc.)
importante pentru diagnostic, deoarece există diferenţe evolutive şi de răspuns la tratament; în
România predomină genotipul 1b (de regulă, neresponsiv la tratament).

 evidenţiere Ag de miez, prin ELISA

- testul se pozitivează la 2 zile după PCR
- util pentru a surprinde perioada „ferestrei imunologice”
- util în centrele de transfuzii pentru a decela persoanele aflate în perioada anterioară
seroconvesiei sau a cazurilor rare, la care Ac anti-VHC apar tardiv sau niciodată.

3
 Indirect = evidenţierea de Ac prin:
 teste tip screening (ELISA)

 teste de confirmare (RIBA - Recombinant Immunobinding Assay)

- similar WB, dar antigenele sunt obţinute prin recombinare şi sunt fixate la egală distanţă
pe banda de nitroceluloză
- poate specifica tipurile de Ac (anti C-100-3, C 22-3, C 33c; ultimele 2 tipuri de Ac apar cel mai
precoce în infecţia acută, fiind util în aprecierea prognosticului)
- Interpretare:
 prezenţa a cel puţin două categorii de Ac – test pozitiv
 nicio bandă (Ac absenţi) – rezultat negativ
 o bandă (o categorie de Ac) – rezultat „indeterminat” (se apelează la IF sau
RT-PCR sau/şi se repetă testarea după 2-3 luni)

Algoritm de diagnostic

ELISA

Ser reactiv

Teste de confirmare

RIBA

indeterminat
negativ (o singură categorie de Ac) pozitiv

ELISA peste 2-3 luni RT-PCR

4
 Diagnosticul de laboralor al infecţiei HIV/SIDA

Se vor face precizări legate de structura HIV, etapele replicarii virale si evolutia naturala a bolii.

1. Diagnosticul direct – detectia virusului in diferite prelevate, permite diagnosticul inainte

de seroconversie (in primele 2-4 saptamani dupa expunere).
Colectarea şi transportul probelor
-sânge (atât pentru diagnosticul direct cât şi pentru cel indirect)
-LCR, salivă, lacrimi, urină, secreţii vaginale, produse de biopsie (intestin)
Probele se stochează la -20-70º C.

Metode de diagnostic direct :

- evidentierea Ag p24 în ser (ELISA)
- evidentierea ARN viral plasmatic (prin RT-PCR) sau evidenţierea ADN proviral limfocitar (prin
PCR)
- izolarea virusului prin cocultivare pe culturi de limfocite umane stimulate – în cercetare

2. Diagnosticul indirect (serologic)

Posibil dupa seroconversie (dupa 4=6 saptamani de la contactul infectant)
a) Teste de triaj (screening)
-Teste rapide tip immunodot

5
Avantaje : sunt rapide, cu mare sensibilitate, nu necesită personal calificat sau aparatură
electronică
Dezavantaje: trebuie confirmate (specificitate redusa)
-Teste de tip imunoassaay (IA) – ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), ELFA (enzyme
linked fluorescent assay), MEIA (microparticle enzyme immunoassay).
Avantaje- teste cu sensibilitate foarte buna (pot da si rezultate fals pozitive) si cu specificitate
buna
Rezultate fals (+) –contaminarea preparatului obţinut pe culturi cu material faţă de care apar Ac
non HIV); posibilitate practic inexistenta (nu se mai obtin antigenele prin cultivarea HIV pe
culturi de limfocite – se obtin prin recombinare)
Rezultate fals (-) – când testul se efectuează înaintea seroconversiei
- la pacienţii imunosupresaţi
- tardiv, în stadiul SIDA de boala

b)Teste de confirmare
-Western Blot –evidenţiază categoria de Ac anti HIV prezenţi
Interpretare : criteriile de pozitivitate sunt stabilite de standardele nationale/internationale
Pozitiv- prezenţa a cel puţin 2 din cele 3 benzi majore: env (gp 160/120, gp 41), +/- gag
(p24) +/- pol (p 55)
Negativ : absenţa benzilor
Indeterminat : benzi prezente, dar nu se întruneşte criteriul de pozitivitate.
- Imunofluorescenta

Algoritm de diagnostic :

ELISA 1 ser nereactiv negativ

reactiv

ELISA 2 si 3 ser nereactiv negativ

Ser reactiv I proba

Se obţine a II-a probă

ELISA 4 si 5 ser nereactiv negativ

Ser repetat reactiv

Test de confirmare ser nereactiv negativ

ser reactiv HIV pozitiv
nedeterminat

Diagnostic direct test de confirmare Urmărire (testare peste 6 luni)

(Ag p24, PCR) (a II-a metodă)

6
Algoritm de hemosupraveghere (pentru triajul obligatoriu al sangelui la donare) :

ELISA 1 ser ne-reactiv sangele poate fi donat

Ser reactiv

Excludere de la donare

Stadializarea clinico-epidemiologică a pacientului confirmat seropozitiv (examen clinic,

paraclinic, imunologic - prin determinarea numărul limfocitelor CD4/mmc, virologic – nivelul
viremieni plasmatice).
Criteriile pentru stadiul SIDA de boala sunt clinice (anumite infectii predictive pentru SIDA –
infectii cu Pneumocystis, Criptococcus, Mycobacterium, candidoza esofagiana sau sistemica,
infectie herpetica recurenta sau sistemica, sarcom Kaposi, encefalopatie) si paraclinice (numar de
celule CD4 pozitive <200/mmc)

Monitorizarea eficienţei terapiei antiretrovirale ( numar CD4/mmc, nivelul viremiei

plasmatice ARN/HIV, teste de rezistenta la antiretrovirale)